Le développement et l’homéostasie cellulaire de la prostate impliquent le contrôle strict des voies de signalisation induites par les androgènes et les facteurs de croissance. Ces diverses voies sont profondément altérées dans le cancer de la prostate, notamment lors des stades les plus avancés. Dans ce travail, une lignée immortalisée à partir de l’épithélium de prostate humaine, la lignée RWPE-1, a été utilisée pour étudier certains signaux régulant la prolifération cellulaire, ainsi que les connexions entre les voies de signalisation correspondantes. La prolifération des cellules RWPE-1 est sous la dépendance de l’EGF (Epidermal Growth Factor) qui intervient physiologiquement dans le développement épithélial. Les récepteurs apparentés à l’EGF-R sont également impliqués dans la prolifération au cours de la progression tumorale. La prolifération des cellules RWPE-1 en réponse à l’EGF est strictement dépendante de la voie ERK1/2, qui est donc considérée comme un point d’intégration des signaux. L’utilisation d’inhibiteurs du récepteur aux androgènes a permis de montrer le rôle essentiel qu’il joue dans l’activation d’ERK1/2 en réponse à l’EGF. Le récepteur aux androgènes s’associe avec plusieurs molécules de signalisation dans les cellules RWPE-1. Je démontre ici pour la première fois une association entre le récepteur aux androgènes et la kinase Raf-1, activatrice de la voie ERK1/2. Ainsi, le récepteur aux androgènes contrôlerait directement un processus essentiel à la prolifération épithéliale selon un mode d’action non-génomique. Par ailleurs, j’ai montré que la réponse proliférative des cellules RWPE-1 à l’IL-6 requiert l’activation de la voie ERK1/2, et l’activité kinase de l’EGF-R, suggérant la transactivation de ce récepteur par l’IL-6. L’utilisation de divers inhibiteurs chimiques a permis de démontrer que les métalloprotéases de la famille ADAM (a disintegrin and metalloprotease), notamment ADAM17, sont impliquées dans ce processus. Ainsi, l’activation de protéines ADAM par l’IL-6 conduirait au clivage d’un ligand membranaire de l’EGF-R, aboutissant à l’activation de la voie ERK1/2. Ce nouveau mécanisme pourrait être impliqué dans les situations inflammatoires conduisant à une prolifération excessive de l’épithélium prostatique, prélude à la transformation tumorale. En conclusion, les voies de signalisation étudiées sont fortement connectées dans les cellules épithéliales normales. Les deux nouveaux mécanismes décrits ici aboutissent à l’activation des kinases ERK1/2, point d’intégration et de convergence des voies de signalisation dans les cellules épithéliales de prostate normale. / Prostate development and cell homeostasis involve strict control of androgen and growth factors induced signaling pathways. These signaling pathways are deeply altered in prostate cancer, especially during late stages. In this work, the RWPE-1 immortalized cell line derived from human prostate epithelium has been used to study the signaling pathways regulating cell proliferation and their crosstalk. Optimal RWPE-1 proliferation is dependent on EGF (Epidermal Growth Factor), that also controls normal epithelial development. EGF-R family is also involved in cancer cell proliferation. EGF-dependent RWPE- 1 cell proliferation relies strictly on the ERK1/2 pathway which is then seen as a signal integrating node. Specific inhibitors showed essential role of androgen receptor in EGF mediated ERK1/2 activation. Androgen receptor is associated with several signaling molecules in RWPE-1 cells. I show here for the first time the physical interaction between the androgen receptor and the ERK1/2 activating kinase Raf1. Then, the androgen receptor could directly regulate an essential pathway for epithelial cells proliferation through a non-genomic mechanism. In addition, I showed that IL-6 dependent RWPE-1 cells proliferation requires both ERK1/2 and EGF-R kinase activities, suggesting an IL-6 mediated transactivation of EGF-R. By using several inhibitors, I showed that ADAM (a disintegrin and metalloprotease) family metaloproteases, especialy ADAM17, are involved in this process. IL-6-mediated ADAM proteins activation could lead to the cleavage of a membrane bound EGF-R ligand, leading to ERK1/2 pathway activation. This new mechanism could be involved in the inflammatory situations inducing hyperproliferation of the prostate epithelium, the first step of the transformation process. To conclude, the signaling pathways I studied are strongly connected in normal epithelial cells. The two new mechanisms described in this study lead to ERK1/2 kinases activation, an integrating node of signaling pathways in normal prostate epithelial cells.

<p>The human endometrium undergoes dramatic changes in morphology and function during the menstrual cycle. Recurrent angiogenesis (the formation of new blood vessels) is of utmost importance for oxygen supply and nourishment of the rapidly growing endometrial tissue. </p><p>The importance of some growth factors known to stimulate new blood vessel formation both in vivo and in vitro in non-uterine tissues, for endometrial angiogenesis, was studied. Further, the possible relationship between the patterns of expression of some angiogenic growth factors and bleeding disturbances during the use of a progestin-only intrauterine contraceptive device was analyzed. Different ways of determining changes in the endometrial vascular density during the menstrual cycle were also evaluated. </p><p>The expression of the angiogenic growth factors vascular endothelial growth factors (VEGF) A, B, C, and D, fibroblast growth factor 2 (FGF-2), and epidermal growth factor (EGF) and their receptors was analyzed using immunohistochemistry.</p><p>VEGF-A, -B and -C, FGF-2 and EGF and their receptors were all found to be expressed in normal human endometrium, especially in and/or around blood vessels, supporting the hypothesis that these peptides most probably contribute to the regulation of angiogenesis and blood vessel function in normal human endometrium.</p><p>There were differences in expression of some of the studied ligands and receptors in endometrium from users of an LNG-IUS with and without bleeding disturbances. We conclude that changes in the expression of these growth factors and receptors might be involved in the formation of fragile and dysfunctional blood vessels that subsequently give rise to bleeding disturbances.</p><p>The three different methods that were applied for calculating endometrial blood vessel density showed similar results and none of them indicated any significant changes during the menstrual cycle. Angiogenesis thus seems to occur mainly by blood vessel elongation and the angiogenic activity is probably related to changes in endometrial thickness and coiling of the spiral arteries.</p>

The human endometrium undergoes dramatic changes in morphology and function during the menstrual cycle. Recurrent angiogenesis (the formation of new blood vessels) is of utmost importance for oxygen supply and nourishment of the rapidly growing endometrial tissue. The importance of some growth factors known to stimulate new blood vessel formation both in vivo and in vitro in non-uterine tissues, for endometrial angiogenesis, was studied. Further, the possible relationship between the patterns of expression of some angiogenic growth factors and bleeding disturbances during the use of a progestin-only intrauterine contraceptive device was analyzed. Different ways of determining changes in the endometrial vascular density during the menstrual cycle were also evaluated. The expression of the angiogenic growth factors vascular endothelial growth factors (VEGF) A, B, C, and D, fibroblast growth factor 2 (FGF-2), and epidermal growth factor (EGF) and their receptors was analyzed using immunohistochemistry. VEGF-A, -B and -C, FGF-2 and EGF and their receptors were all found to be expressed in normal human endometrium, especially in and/or around blood vessels, supporting the hypothesis that these peptides most probably contribute to the regulation of angiogenesis and blood vessel function in normal human endometrium. There were differences in expression of some of the studied ligands and receptors in endometrium from users of an LNG-IUS with and without bleeding disturbances. We conclude that changes in the expression of these growth factors and receptors might be involved in the formation of fragile and dysfunctional blood vessels that subsequently give rise to bleeding disturbances. The three different methods that were applied for calculating endometrial blood vessel density showed similar results and none of them indicated any significant changes during the menstrual cycle. Angiogenesis thus seems to occur mainly by blood vessel elongation and the angiogenic activity is probably related to changes in endometrial thickness and coiling of the spiral arteries.

Utilizing various systems such as cell-based assays but also multicellular organisms such as Drosophila melanogaster and C.elegans, for example, the endocytic system has been shown to consist of a network of biochemically and morphologically distinct organelles that carry out specialized tasks in the uptake, recycling and catabolism of growth factors and nutrients, serving a plethora of key biological functions (Mellman, 1996). Different classes of endosomes were found to exhibit a characteristic intracellular steady state distribution. This distribution pattern observed at steady state results from a dynamic interaction of endosomes with the actin and the microtubule cytoskeleton. It remains unclear, however, which microtubule-based motors besides Dynein control the intracellular distribution and motility of early endosomes and how their function is integrated with the sorting and transport of cargo. The first part of this thesis research outlines the search for such motor. I describe the identification of KIF16B which functions as a novel endocytic motor protein. This molecular motor, a kinesin-3, transports early endosomes to the plus end of microtubules, in a process regulated by the small GTPase Rab5 and its effector, the phosphatidylinositol-3-OH kinase hVPS34. In vivo, KIF16B overexpression relocated early endosomes to the cell periphery and inhibited transport to the degradative pathway. Conversely, expression of dominant-negative mutants or ablation of KIF16B by RNAi caused the clustering of early endosomes to the peri-nuclear region, delayed receptor recycling to the plasma membrane and accelerated degradation. These results suggest that KIF16B, by regulating the plus end motility of early endosomes, modulates the intracellular localization of early endosomes and the balance between receptor recycling and degradation. In displaying Rab5 and PI(3)P-containing cargo selectivity, a remarkable property of KIF16B is that it is subjected to the same regulatory principles governing the membrane tethering and fusion machinery (Zerial and McBride, 2001). Since KIF16B can modulate growth factor degradation, we propose that this motor could have also important implications for signaling. Importantly, KIF16B has provided novel insight into how intracellular localization of endosomes governs the transport activity of these organelles. The second part of this thesis describes the proof-of-principle of a genome-wide screening strategy aimed at gaining insights into the next level of understanding: How the spatial distribution of organelles is linked to their function in an experimental system which features cellular polarity, for example, a tissue or organ. The suitability of C. elegans as a model organism to identify genes functioning in endocytosis has been demonstrated by previous genetic screens (Grant and Hirsh 1999; Fares and Greenwald, 2001). Offering excellent morphological resolution and polarization, the nematode intestine represents a good system to study the apical sorting of a transmembrane marker. The steady state localization of such a marker is likely the result of a dynamic process that depends on biosynthetic trafficking to the apical surface, apical endocytosis and recycling occurring through apical recycling endosomes. Therefore, mis-sorting of this marker upon RNA-mediated interference will be indicative of a failure in one of the aforementioned processes. Furthermore, since it is still largely unclear why apical endosomes maintain their polarized localization, this screen will also monitor the morphology of this endocytic compartment using a second marker. Following image acquisition based on an automated confocal microscope, data can be analyzed using custom-built software allowing objective phenotypic analysis. The successful establishment of the proof-of-principle marks the current state-of-the-art of this large-scale screening project.

Les glandes salivaires sont des glandes mixtes : la salive (produit exocrine) estimpliquée dans le maintien de l'homéostasie buccale alors que les secrétions endocrines (ex :facteurs de croissance) ont un rôle physiologique (gamétogénèse, ostéogenèse,hypertension...) Chez les mammifères, elles affichent un dimorphisme sexuel qui laisseentrevoir une sensibilité éventuelle à des xeno-hormones.Ce mémoire présente l'action de la génistéine (phyto-oestrogène) et/ou de la vinclozoline(anti-androgène) sur la glande submandibulaire (SM) de rat lors d'une exposition précoce viala mère (gestation-lactation) et lors d'une exposition pendant la période de croissance (dusevrage à l'âge adulte). Les glandes SM, prélevées au stade immature et jeune adulte, ont faitl'objet d'une analyse histologique et d'une étude de marqueurs moléculaire des fonctionsendocrines et exocrines associées aux processus gustatifs. L'exposition précoce ralenti ledéveloppement de la glande SM et augmente sélectivement la préférence au sucré des malesimmatures mais pas des adultes ; l'analyse moléculaire révèle une action sélective sur lesfonctions exocrines corrélée à celle sur les préférences, ainsi qu'une action sur les fonctionsendocrines (facteurs de croissances) qui s'inverse avec l'âge. L'exposition à partir du sevrageperturbe seulement les mâles qui présentent des altérations des structures sécrétrices coupléesà des modifications d'expression des récepteurs hormonaux et facteurs de croissance, maisaussi au taux sérique de l'EGF.Cette étude identifie la glande submandibulaire comme cible de perturbateurs endocriniens etpose la question des conséquences physiologiques à terme

Novel biocompatible nanoprobes for optical imaging of Epidermal Growth Factor receptor (EGFR) were created. 5 and 18 nm gold nanoparticles (AuNPs) and 5 and 45 nm diameter silver nanoparticles (AgNPs) were conjugated to EGF protein via ?-lipoic acid. AgNPs were not previously attached to EGF. TOF-MS confirms EGF-linker formation. ELISA verifies the linked-EGF activity alone and with EGF-NPs. Core-shell silver-gold nanoparticles (AgAuNPs) gave similar results. TEM staining with uranyl acetate exhibits a bright ring, smaller than EGF, around nanoparticles. Dark field microscopy shows localized, intense cytoplasmic scattering, possibly lipid droplets, in cancer cells incubated with or without nanoprobes. Following injection, mice organs were harvested for EGF-NP immune response determination. Sterilization likely inactivated EGF before ICP-MS. Intense surface enhanced Raman scattering (SERS, 632.8 nm) follows MgSO4 induced EGF-AgNPs aggregation. Pelleted EGF-AgNP tagged cancer cells lack SERS indicative intensity contrast. AgAuNPs could provide increased stability, brighter SERS, and reduced silver biocompatibility concerns.

SCH-64874 (5) is a fungal metabolite that inhibits the epidermal growth factor receptor (EGFR), a high-profile oncology target, with an IC50 of 1.0µg/mL. It is of particular interest because it is unlikely to inhibit the protein’s intramolecular kinase domain (as typical chemical EGFR inhibitors do), and may act instead by obstructing the receptor’s ligand binding and/or dimerisation processes. / In this work, the epipolythiodiketopiperazine family of natural products is reviewed, leading to a discussion of the probable biosynthetic pathways by which these complex molecules are produced in nature. A laboratory synthesis based on this proposed biosynthesis was subsequently proposed and undertaken. / The oxidation of aromatic systems was investigated, which led to the synthesis, for the first time, of complex functionalised arene oxides such as 178. The regioselective epoxidation of 178 was accessed by derivatisation as the Diels-Alder adduct 180. Subsequent epoxidation and manipulation led to the amino alcohol 195b, possessing the exo-epoxide endo-alcohol stereochemistry shown. / This stereochemical assignment was based on detailed NMR analysis of the product, and also on AM1 semi-empirical molecular modelling and Ab initio molecular orbital calculations, which were used to evaluate the relative stabilities of the cyclisation products.

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Le virus de l'hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladie chronique du foie et de carcinome hépatocellulaire. Les options thérapeutiques pour traiter l'hépatite chronique sont limitées par des coûts élevés, des effets secondaires et une résistance virale. L'entrée du HCV est la première étape d'interaction entre le virus et la cellule hôte. Elle est requise pour l'initiation, la propagation et le maintien de l'infection, ce qui en fait une cible prometteuse pour les traitements antiviraux. L’entrée du HCV nécessite l'interaction coopérative de plusieurs facteurs cellulaires, y compris CD81 et claudine-1 (CLDN1). Nous avons récemment identifié un rôle pour le récepteur à l’EGF (EGFR) et le récepteur à l’ephrine A2 (EphA2) dans l'entrée du HCV par la régulation de la formation du complexe de co-récepteurs CD81-CLDN1, ce qui suggère que la signalisation de ces récepteurs joue un rôle dans l'entrée du virus. Nous avons voulu identifier les mécanismes moléculaires de signalisation de l’EGFR requis pour l'entrée du HCV et avons identifié HRas comme un transducteur de signalisation clé de l'hôte. Des études d'imagerie ont révélées que la signalisation de HRas peut moduler la diffusion et le trafic membranaire de CD81, ce qui permet l’assemblage du complexe de récepteurs. De plus, HRas s’associe avec les récepteurs de l'hôte CD81 et CLDN1 et des facteurs d’entrée du HCV inconnus jusque là: l’intégrine beta1 et Rap2B. Le HCV profite donc de la signalisation de HRas pour l'entrée cellulaire. Ces données améliorent notre compréhension des mécanismes moléculaires de l'entrée du HCV induite par l’EGFR et ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement d'antiviraux. / Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease and hepatocellular carcinoma worldwide. Therapeutic options to treat chronic viral hepatitis are limited by high costs, side effects and viral resistance in most patients. HCV entry is the first step of interaction between the virus and the host cell. It is required for the initiation, propagation and maintenance of infection, making it a promising target for antiviral therapy. HCV entry requires the cooperative interaction of several cellular factors, including CD81 and claudin-1 (CLDN1). We have recently identified a role for EGF receptor (EGFR) and ephrin receptor A2 (EphA2) in HCV entry by regulating the formation of the co-receptor complex CD81-CLDN1, suggesting that the signaling of these receptors might play a role in viral entry. However, the precise mechanisms of regulation are unknown. We wanted to identify the molecular mechanisms of EGFR signaling required for the HCV entry process. We identify HRas as key host signaling transducer for HCV entry. Advanced imaging studies have revealed that HRas signaling can modulate the lateral diffusion and membrane trafficking of CD81. A modified diffusion of CD81 allows the assembly of the receptors complex. In addition, HRas associates with tetraspanin microdomains containing the host receptors CD81 and CLDN1 and HCV entry factors previously unknown: the integrin beta1 and Rap2B. HCV therefore exploits HRas signaling for cellular entry. These data improve our understanding of the molecular mechanisms of HCV entry induced by EGFR and open new perspectives for the development of antivirals targeting signaling pathways.

Les maladies rénales chroniques sont devenues un enjeu majeur de santé publique. Qu’elle qu’en soit la cause initiale, la MRC est caractérisée par une réduction néphronique progressive, aboutissant au remplacement des néphrons sains par un tissu fibreux et au déclin de la fonction rénale. Les mécanismes de progression de la MRC sont encore mal compris, mais il a été suggéré que le développement des lésions tubulo-interstitielles joue un rôle essentiel dans le déclin de la fonction rénale. Deux éléments physiopathologiques cruciaux dans le développement de ces lésions sont représentés par (i) l’activation de la voie du récepteur à l’EGF (epidermal growth factor) (EGFR), et (ii) la protéinurie et ses conséquences pour les cellules tubulaires. Les médiateurs communs à ces deux phénomènes ne sont pas connus. Mon travail de thèse a consisté à caractériser une protéine commune à ces deux voies d’activation, ie la lipocaline2 (Lcn2), petite protéine de transport de fer, en étudiant ses voies d'activation et ses conséquences physiopathologiques. Nous montrons que le rôle pathologique de la voie de l’EGFR est gouverné par la surexpression de Lcn2. En effet, dans le contexte de réduction néphronique chirurgicale, (i) les animaux invalidés pour Lcn2 sont protégés du développement des lésions, et (ii) les souris exprimant un dominant négatif de l’EGFR dans le tubule rénal présentent une diminution de l’expression de Lcn2. Nous montrons également que l’invalidation de Lcn2 permet de ralentir la progression de la MRC dans un modèle de polykystose rénale dépendante de l’EGFR, les souris jck (juvenile cystic kidney). Parallèlement, nous montrons que la protéinurie induit également l’expression de Lcn2 dans les cellules tubulaires rénales dans différents modèles expérimentaux. De plus, nous montrons le rôle majeur de Lcn2 dans la progression de la MRC protéinurique, l’invalidation de Lcn2 limitant le développement des lésions rénales et la mortalité des animaux protéinuriques. Si le rôle délétère de Lcn2 est démontré dans différents modèles de néphropathie chronique, nous montrons que les voies moléculaires impliquées dans l’activation de Lcn2 et le rôle de cette protéine dépendent du contexte cellulaire. Nous prouvons que Lcn2 est un médiateur de l'effet mitogénique de l'EGFR, phénomène essentiel de la progression de la MRC, et nous montrons que l’activation de Lcn2 via l’EGFR est dépendante du facteur HIF1α. Cependant, nous démontrons également que l'expression de Lcn2 dans le contexte de protéinurie est dépendante du facteur ATF4 activé par le stress du reticulum endoplasmique (ER), et que Lcn2 est un médiateur de l'apoptose dépendante du stress de l'ER. Enfin, nous prouvons que l’inhibition pharmacologique du stress de l'ER permet une réduction de l’expression de Lcn2 dans les cellules tubulaires, et surtout, un ralentissement du déclin de la fonction rénale des animaux protéinuriques. Nous démontrons également l’importance de ces résultats chez les patients atteints de MRC. Nous identifions NGAL, l'analogue humain de Lcn2, comme un biomarqueur de progression dans la polykystose rénale dominante, et nous montrons qu’elle est fortement surexprimée dans le tissu rénal de patients protéinuriques. L’ensemble de ce travail permet de montrer que Lcn2 est un nouveau médiateur essentiel de multiples néphropathies chroniques. Lcn2 est impliquée dans l’effet mitogénique de l’EGFR ou la réponse apoptotique associée à la protéinurie durant la MRC. Nous ouvrons également de nouvelles perspectives thérapeutiques avec l'utilisation d'inhibiteurs du stress de l'ER dans les néphropathies protéinuriques humaines / Chronic kidney disease (CKD) is now a major public health concern. Whatever the initial kidney injury, CKD is characterized by progressive nephron reduction and kidney function decline. Tubulointerstitial lesions are an essential component of CKD progression, and are mediated by two crucial pathophysiologic elements: epidermal growth factor receptor (EGFR) activation, and proteinuria responsible of tubular cell damage. The aim of this study was to describe a common mediator of both these pathways, ie lipocalin2, an iron carrier protein, by identifying its activation pathways and its pathophysiologic consequences. We show the deleterious effects of the EGFR pathway during nephron reduction is mediated by the activation of Lcn2, which controls the mitogenic effect of EGFR. In fact, after nephron reduction, animals invalidated for Lcn2 are protected from lesions developpement. Moreover, a similar protective effect is seen in jck (juvenile cytic kidney) mice invalidated for Lcn2, a model of polycystic kidney disease EGFR-dependant. Otherwise, we show proteinuria induces Lcn2 expression in tubular cells of different experimental models, and Lcn2 invalidation slows lesion developpement and reduces mortality of proteinuric mice. We demonstrate that the Lcn2 role and activation pathways are dependant of these different models. We show Lcn2 is a mediator of the mitogenic effect of the EGFR, and Lcn2 activation is dependant of HIF1α stabilisation. However, we also show ATF4 is an activator of Lcn2 during endoplasmic reticulum (ER) stress induced by proteinuria in tubular cells. In this context, Lcn2 controls ER stress-induced apoptosis. Pharmacologic inhibition of ER stress in proteinuric animals decreases Lcn2 overexpression, and slows renal function decline. In patients suffering from CKD, we demonstrated NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin), the human analog of Lcn2, appears as a critical biomarker of autosomal dominant polycystic kidney disease progression. NGAL is also highly overexpressed in tubular cells in kidney biopsies of proteinuric patients. This work demonstrates Lcn2 is an essential mediator of multiple pathophysiologic components of CKD progression. Moreover, we open new therapeutic perspectives with the use ER stress modulators in proteinuric CKD