O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil proteico do plasma seminal equino utilizando eletroforese bidimensional de gel de acrilamida (2D-PAGE) e determinar se algumas das proteínas presentes estavam relacionadas com a congelabilidade do sêmen. O plasma seminal foi coletado de dez garanhões, de alta e baixa congelabilidade de sêmen, provenientes do Haras Estatal da Baixa Saxônia, na cidade de Celle, na Alemanha e rotineiramente utilizados em programas de inseminação artificial. Vinte e cinco bandas proteicas foram encontradas nos géis bidimensionais (12%) e sete delas foram identificadas por MALDI-MS. Das 25 proteínas encontradas nas amostras de plasma seminal dos garanhões, duas bandas proteicas apresentaram densidade óptica superior (P<0,05) nas amostras de garanhões de alta congelabilidade o sêmen: as bandas 5 (80-85 kDa, pI 7,54), que foi identificada como CRISP3 e a 45 (18,2 kDa, pI 5,0-5,2) identificada como HSP-2. Contrariamente a banda 7 (75,4 kDa, pI 6,9 – 7,4), identificada como lactoferrina, a 15 (26,7 kDa, pI 5,51) identificada como calicreína, a 25 (25 kDa, pI 7,54) como CRISP3 e a 35 (13,9 kDa, pI 3,8 – 4,2) que foi identificada como HSP-1, apresentaram valores de densidade óptica superior (P<0,05) nos reprodutores de baixa congelabilidade do sêmen. As proteínas foram identificadas através de espectometria de massa MALDI-MS. As evidências encontradas neste experimento mostram que existem diferenças no perfil proteico dos reprodutores de alta e baixa congelabilidade do sêmen, sugerindo as proteínas CRISP3 e a HSP-2 como possíveis marcadores da alta congelabilidade de sêmen de garanhões. / The objective of this study was to evaluate protein profile of equine seminal plasma using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and to find if any of these proteins were related to semen freezability. Seminal plasma was collected from 10 stallions of high and low semen freezability routinely used in AI programs from the State Stud of Lower Saxony and Artificial Insemination Center. Twenty five protein spots were identified from the 2 D gel (12%), seven of which were present in all samples. Of the 25 proteins found in the research stallions, two spots showed superior relative content (P<0.05) in seminal plasma samples collected from stallions with high semen freezability: the spots 5 (80-85 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 45 (18.2 kDa, pI 5.0-5.2) was identified as HSP-2. Conversely, the spot 7 (75.4 kDa, pI 6.9 – 7.4) was identified as lactoferrin, 15 (26.7 kDa, pI 5.51) was identified as kallikrein, 25 (25 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 35 (13.9 kDa, pI 3.8 – 4.2) was identified as HSP-1, showed superior relative protein content (P<0.05) on seminal plasma samples from stallions with low semen freezability. The proteins were identified by MALDI-MS. There were differences in the seminal plasma protein profile between stallions with high and low semen freezability. It may be suggested that CRISP3 and HSP-2 may be considered possible seminal plasma markers of high semen freezability.

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: A esporotricose é uma micose subcutânea aguda ou crônica causada por fungos termodimórficos do complexo de espécies de Sporothrix schenckii e pode acometer tanto animais como seres humanos. A doença tem distribuição mundial e no Brasil se tornou endêmica, sendo S. schenckii e S. brasiliensis as duas espécies patogênicas maisrelacionadasà transmissão zoonóticaassociada principalmente ao gato. O tratamento convencional com antifúngicos é demorado e tem muitos efeitos adversos, especialmente em pacientes com imunocomprometidos. Logo, nos últimos anos tem-se focado a atenção sobre os componentes da parede celular de espécies do complexo Sporothrixque possam estar envolvidos na sua virulência, para serem utilizados como potenciais alvos antigênicos nodiagnóstico e terapêutica contra a esporotricose. Recentemente, nosso grupo de trabalho demonstrou que um soro obtido em camundongos imunizados com um extrato de proteínas da superfície celular (PSC) de S. schenckii foi imunorreativo contra a enolase contida nesse extrato e uma outra proteína de função desconhecida. A capacidade desse soro de potencializar a fagocitose e inibir a adesão do fungo aos fibroblastos in vitro, e ainda a proteção por transferência passiva em animais infectados pelo fungo foi atribuída à sua atividade ligante de enolase.Diante disto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da enolase na adesão de S. schenckii ATCC 16345 e S. brasiliensis (Ss250 e Ss256) a fibroblastos assim como suas propriedades imuno... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sporotrichosis is an acute or chronic subcutaneous mycosis caused by thermodimorfic fungi from the Sporothrix schenckii species complex that can affect both humans and other animals. The disease is amply distributed worldwide and endemic in Brazil, with S. schenckii and S. brasiliensis being the two pathogenic species most associated to the zoonotic transmission which, in turn, involves mainly the domestic cat. The conventional antifungal therapy takes long and has adverse effects, especially in immunocompromised patients. In light of this, attention has been focused in recent years on the cell wall components of species from the Sporothrix complex that could be involved in their virulence, so that they could be used as potential antigenic targets in the diagnosis and therapy of sporotrichosis. Recently, we showed that a serum obtained from mice which had been immunized with a S. schenckii cell surface protein (CSP) extract reacted with enolase, found in the extract, and another protein of unknown function. The capacity of this serum to enhance phagocytosis and inhibit adhesion of the fungus to fibroblasts in vitro, as well as the protection afforded upon its passive transference into infected mice, was attributed to its enolase-binding activity. In face of the above, this study aimed to assess both the immunogenic properties and the role played by enolase in S. schenckii ATCC 16345 and S. brasiliensis (Ss250 and Ss256) adhesion to fibroblasts. The S. schenckii enolase (rEno)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil proteico do plasma seminal equino utilizando eletroforese bidimensional de gel de acrilamida (2D-PAGE) e determinar se algumas das proteínas presentes estavam relacionadas com a congelabilidade do sêmen. O plasma seminal foi coletado de dez garanhões, de alta e baixa congelabilidade de sêmen, provenientes do Haras Estatal da Baixa Saxônia, na cidade de Celle, na Alemanha e rotineiramente utilizados em programas de inseminação artificial. Vinte e cinco bandas proteicas foram encontradas nos géis bidimensionais (12%) e sete delas foram identificadas por MALDI-MS. Das 25 proteínas encontradas nas amostras de plasma seminal dos garanhões, duas bandas proteicas apresentaram densidade óptica superior (P<0,05) nas amostras de garanhões de alta congelabilidade o sêmen: as bandas 5 (80-85 kDa, pI 7,54), que foi identificada como CRISP3 e a 45 (18,2 kDa, pI 5,0-5,2) identificada como HSP-2. Contrariamente a banda 7 (75,4 kDa, pI 6,9 – 7,4), identificada como lactoferrina, a 15 (26,7 kDa, pI 5,51) identificada como calicreína, a 25 (25 kDa, pI 7,54) como CRISP3 e a 35 (13,9 kDa, pI 3,8 – 4,2) que foi identificada como HSP-1, apresentaram valores de densidade óptica superior (P<0,05) nos reprodutores de baixa congelabilidade do sêmen. As proteínas foram identificadas através de espectometria de massa MALDI-MS. As evidências encontradas neste experimento mostram que existem diferenças no perfil proteico dos reprodutores de alta e baixa congelabilidade do sêmen, sugerindo as proteínas CRISP3 e a HSP-2 como possíveis marcadores da alta congelabilidade de sêmen de garanhões. / The objective of this study was to evaluate protein profile of equine seminal plasma using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and to find if any of these proteins were related to semen freezability. Seminal plasma was collected from 10 stallions of high and low semen freezability routinely used in AI programs from the State Stud of Lower Saxony and Artificial Insemination Center. Twenty five protein spots were identified from the 2 D gel (12%), seven of which were present in all samples. Of the 25 proteins found in the research stallions, two spots showed superior relative content (P<0.05) in seminal plasma samples collected from stallions with high semen freezability: the spots 5 (80-85 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 45 (18.2 kDa, pI 5.0-5.2) was identified as HSP-2. Conversely, the spot 7 (75.4 kDa, pI 6.9 – 7.4) was identified as lactoferrin, 15 (26.7 kDa, pI 5.51) was identified as kallikrein, 25 (25 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 35 (13.9 kDa, pI 3.8 – 4.2) was identified as HSP-1, showed superior relative protein content (P<0.05) on seminal plasma samples from stallions with low semen freezability. The proteins were identified by MALDI-MS. There were differences in the seminal plasma protein profile between stallions with high and low semen freezability. It may be suggested that CRISP3 and HSP-2 may be considered possible seminal plasma markers of high semen freezability.

Submitted by Bruna Rodrigues (bruna92rodrigues@yahoo.com.br) on 2016-09-15T18:05:05Z No. of bitstreams: 1 TeseMSF.pdf: 7415366 bytes, checksum: 7d7fc64462037eda551e93c80b1c66ab (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:53:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMSF.pdf: 7415366 bytes, checksum: 7d7fc64462037eda551e93c80b1c66ab (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:53:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMSF.pdf: 7415366 bytes, checksum: 7d7fc64462037eda551e93c80b1c66ab (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T19:53:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMSF.pdf: 7415366 bytes, checksum: 7d7fc64462037eda551e93c80b1c66ab (MD5) Previous issue date: 2015-09-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Lead (Pb) is a heavy metal widely distributed in the environment, but it does not have any physiological role in the body. Due to its widespread use in the industry, it provides direct contamination of occupationally exposed people and, indirectly, through pollutants for the general. Thus, Pb contamination has become a public health problem. Studies have linked adverse health effects at low levels of Pb in the blood, even at concentrations below 10μg/dL. The effects range from cognitive impairment in children and peripheral neuropathy in adults, but there is little knowledge about its effects in the liver. It has been reported that iron (Fe) has a protective effect that can help in reducing the absorption of Pb in the body. In this sense, the aim of this study was to evaluate the protein profile and morphology in the liver of rats intoxicated by lead acetate (Pb(C2H3O2)2) submitted simultaneously to supplementation with iron sulfate (FeSO4) at 20 mg/Kg body weight. For this, 36 weanling male rats were divided into 6 groups (n=6) and treated for 6 weeks. The control group received deionized water; the first experimental group received deionized water and a solution of FeSO4 every two days; two experimental groups received 100 mg/L Pb(C2H3O2)2 in the drinking water and one of them was supplemented with FeSO4 every two days; two groups received 400 mg/L Pb(C2H3O2)2 in the drinking water, and one of them was supplemented with FeSO4 every two days. After euthanasia, blood samples and liver were collected for the analysis of Pb concentration by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS). Also, liver samples were collected for proteomic analysis using two-dimensional electrophoresis associated with MS (2D-PAGE-MS) and histomorphological analysis. The concentration of Pb in the blood and liver showed a dose-response effect with a reduction in 40-50% Pb in the groups supplemented with Fe (not significant). Histomorphological changes were observed in all intoxicated groups. Proteomic analysis identified 247 proteins with altered expression in relation to the control group. It was observed a decrease in antioxidant enzymes such as superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase. The reduction of these enzymes leads to an increase of free radicals in the liver tissue and consequently to an in increase the levels of lipid peroxidation. The peroxidation affects the secretion of lipoproteins, mainly their release from the Golgi complex, which may have contributed to the changes observed in other proteins. The presence of Pb in some spots was confirmed by atomic absorption analysis, and this may have resulted in conformational changes that activate the protein degradation machinery. Based on the results, the present study highlights the deleterious role of Pb in the liver even at low dosage, and although Fe was associated with a reduced absorption of Pb, the results suggest that it should not be used as a prevention strategy to reduce the intoxication by Pb, since itself led to changes in the pattern of protein expression. / O chumbo (Pb) é um metal pesado amplamente distribuído em nosso meio, porém não possui papel fisiológico no organismo. Devido ao seu emprego em diversos setores industriais, proporciona contaminação direta de pessoas ocupacionalmente expostas e, indiretamente, na forma de poluentes à população geral. Por isso tornou-se um problema de saúde pública. Estudos correlacionam efeitos adversos à saúde com níveis baixos de Pb no sangue, até em concentrações abaixo de 10μg/dL. Seus efeitos vão desde o comprometimento cognitivo em crianças a neuropatia periférica em adultos, mas pouco se sabe sobre seus efeitos no fígado. Tem sido relatado que o ferro (Fe) tem um efeito protetor, que pode ajudar na diminuição da absorção do Pb pelo organismo. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil proteico e o aspecto morfológico no fígado de ratos intoxicados por acetato de chumbo (Pb(C2H3O2)2), submetidos simultaneamente à suplementação com sulfato ferroso (FeSO4) na dose de 20 mg/Kg de peso corporal. Para isso, 36 ratos machos recém-desmamados foram divididos em 6 grupos (n=6) e tratados por 6 semanas. O grupo controle recebeu água deionizada; o primeiro grupo experimental recebeu água deionizada e uma solução de FeSO4 a cada dois dias; dois grupos experimentais que receberam 100 mg/L de Pb(C2H3O2)2 na água de beber, sendo um deles suplementados com FeSO4 a cada dois dias; dois grupos que receberam a dose de 400 mg/L de Pb(C2H3O2)2 na água de beber, onde para um deles foi administrado simultaneamente FeSO4 a cada dois dias. Após a eutanásia, amostras de sangue e fígado foram coletadas para a análise de concentração de Pb por espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS). Também foram coletadas amostras de fígados para análise proteômica por meio de Eletroforese bidimensional associada a espectrometria de massas (2D-PAGE-MS) e para análise histomorfológica. A concentração de Pb no sangue e fígado, apresentou um efeito dose-resposta com uma redução em torno 40-50% de Pb nos grupos suplementados com Fe (não significativo). Alterações histomorfológicas foram observadas em todos os grupos intoxicados. Pela da análise proteômica foram identificadas 247 proteínas com expressão alterada em relação ao grupo controle. Foi constatada a diminuição de enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. A redução dessas enzimas leva ao aumento de radicais livres no tecido hepático, e consequentemente ao aumento nos níveis de peroxidação lipídica. A peroxidação prejudica a secreção de lipoproteínas, principalmente a liberação a partir do complexo de Golgi, o que pode ter contribuído para alterações observadas em outras proteínas. A presença de Pb em alguns spots foi confirmada através da análise por absorção atômica, e isso pode ter resultado em alterações conformacionais que ativam a maquinaria de degradação proteica. Com base nos resultados, o presente estudo reforça o papel deletério do Pb no tecido hepático, mesmo em baixa dosagem, e apesar de o Fe ter sido associado à redução da absorção de Pb, os resultados sugerem que não deve ser utilizado como estratégia de prevenção para reduzir a intoxicação pelo Pb, já que o mesmo também levou a alterações no padrão de expressão proteica.

Orientador: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Resumo: A pitiose, cujo agente etiológico é o oomiceto Pythium insidiosum, é umadoença que acomete diversas espécies animais, incluindo-se a humana, sendomais prevalente em equinos. A doença é de difícil diagnóstico e tratamento.Estudos sobre a caracterização proteica de P. insidiosum são escassos. Oobjetivo deste estudo foi determinar o perfil proteico de Pythium insidiosum pormeio da estratégia espectrometria de massas e bioinformática, a fim deidentificar fatores de virulência. Para isso, foi padronizada uma técnica deextração de proteínas totais de P. insidiosum, as quais foram quantificadas. Apartir do protocolo de extração de proteínas foi obtido o perfil das proteínasexpressas pelo oomiceto P. insidiosum por meio da análise por eletroforesebidimensional. Os géis analisados apresentaram 186 spots com massamolecular de 12 a 89 KDa, e ponto isoelétrico entre 4-7, destes 103 foramrecortados e sequenciados. Um total de 36 proteínas foram identificadas eagrupadas de acordo com suas funções, seis delas foram classificadas comoproteínas relacionadas à virulência - β 1,3 glucano sintetase, Hsp 70, enolase,peroxirredoxina 2, proteína G e proteassoma unidade β. Os resultados dopresente trabalho contribuirão para o melhor entendimento dos mecanismospatogênicos de P. insidiosum, bem como para novos estudos no campoterapêutico e diagnóstico. / Abstract: Pythiosis, whose etiologic agent is the oomycete Pythium insidiosum, is a disease that affects several animal species, including human, being more prevalent in horses. The disease has difficult diagnosis and treatment. Studies on protein characterization of P. insidiosum are scarce. The objective of this study was to determine the protein profile of Pythium insidiosum by mass spectrometry and bioinformatics strategies aiming to identify virulence factors. To this end, an extraction was standardized technique of total proteins of P. insidiosum, which were quantitated. From the protein extraction protocol it was obtained the profile of proteins expressed by the oomycete P. insidiosum through analysis by two-dimensional electrophoresis. The gels had 186 spots analyzed with molecular weight 12-89 kDa and an isoelectric point of 4-7, 103 of these were cut and sequenced. A total of 36 proteins were identified and grouped according to their functions, six of them were classified as proteins related to virulence - β 1,3 glucan synthase, Hsp 70, enolase, peroxiredoxin 2, G protein and the proteasome β unit. The results of this work will contribute to better understanding of the pathogenic mechanisms of P. insidiosum as well as for further studies in the therapeutic field and diagnosis. / Mestre

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil proteico do plasma seminal equino utilizando eletroforese bidimensional de gel de acrilamida (2D-PAGE) e determinar se algumas das proteínas presentes estavam relacionadas com a congelabilidade do sêmen. O plasma seminal foi coletado de dez garanhões, de alta e baixa congelabilidade de sêmen, provenientes do Haras Estatal da Baixa Saxônia, na cidade de Celle, na Alemanha e rotineiramente utilizados em programas de inseminação artificial. Vinte e cinco bandas proteicas foram encontradas nos géis bidimensionais (12%) e sete delas foram identificadas por MALDI-MS. Das 25 proteínas encontradas nas amostras de plasma seminal dos garanhões, duas bandas proteicas apresentaram densidade óptica superior (P<0,05) nas amostras de garanhões de alta congelabilidade o sêmen: as bandas 5 (80-85 kDa, pI 7,54), que foi identificada como CRISP3 e a 45 (18,2 kDa, pI 5,0-5,2) identificada como HSP-2. Contrariamente a banda 7 (75,4 kDa, pI 6,9 – 7,4), identificada como lactoferrina, a 15 (26,7 kDa, pI 5,51) identificada como calicreína, a 25 (25 kDa, pI 7,54) como CRISP3 e a 35 (13,9 kDa, pI 3,8 – 4,2) que foi identificada como HSP-1, apresentaram valores de densidade óptica superior (P<0,05) nos reprodutores de baixa congelabilidade do sêmen. As proteínas foram identificadas através de espectometria de massa MALDI-MS. As evidências encontradas neste experimento mostram que existem diferenças no perfil proteico dos reprodutores de alta e baixa congelabilidade do sêmen, sugerindo as proteínas CRISP3 e a HSP-2 como possíveis marcadores da alta congelabilidade de sêmen de garanhões. / The objective of this study was to evaluate protein profile of equine seminal plasma using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and to find if any of these proteins were related to semen freezability. Seminal plasma was collected from 10 stallions of high and low semen freezability routinely used in AI programs from the State Stud of Lower Saxony and Artificial Insemination Center. Twenty five protein spots were identified from the 2 D gel (12%), seven of which were present in all samples. Of the 25 proteins found in the research stallions, two spots showed superior relative content (P<0.05) in seminal plasma samples collected from stallions with high semen freezability: the spots 5 (80-85 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 45 (18.2 kDa, pI 5.0-5.2) was identified as HSP-2. Conversely, the spot 7 (75.4 kDa, pI 6.9 – 7.4) was identified as lactoferrin, 15 (26.7 kDa, pI 5.51) was identified as kallikrein, 25 (25 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 35 (13.9 kDa, pI 3.8 – 4.2) was identified as HSP-1, showed superior relative protein content (P<0.05) on seminal plasma samples from stallions with low semen freezability. The proteins were identified by MALDI-MS. There were differences in the seminal plasma protein profile between stallions with high and low semen freezability. It may be suggested that CRISP3 and HSP-2 may be considered possible seminal plasma markers of high semen freezability.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2778_1.pdf: 2467213 bytes, checksum: 266474e44dd114081ad37ccb2d4e5ff1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estímulos atuantes durante períodos fetal e neonatal desencadeiam modificações fisiológicas e metabólicas permanentes no indivíduo, fenômeno bastante estudado em Nutrição através de manipulação nutricional. Para pesquisa de alterações biomoleculares, o soro sanguíneo é fonte potencial de biomarcadores protéicos. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da desnutrição protéica neonatal sobre o perfil proteômico do soro sanguíneo de ratos adultos. Foram utilizados 8 ratos Wistar, machos, adultos, que foram divididos em 2 grupos, de acordo com a dieta disponibilizada do 1º ao 21º dia de vida (período de lactação): grupo nutrido (GN), formado por filhotes cujas mães receberam dieta com 17 % de caseína e grupo desnutrido (GD), no qual as mães alimentaram-se de dieta com 8 % de caseína. No período de reposição nutricional, a partir do desmame (22º dia), os filhotes passaram a receber dieta padrão normoprotéica. Os animais foram pesados diariamente durante aleitamento e, posteriormente, em dias alternados. Na idade adulta, a partir do 90º dia de vida, os animais foram anestesiados e submetidos à punção cardíaca para coleta de sangue (4mL). Após coagulação, este foi centrifugado, a camada de soro coletada e acondicionada a -20ºC. Alíquotas foram inicialmente diluídas (1:10) para análise eletroforética monodimensional pela tecnologia lab-on-a-chip, utilizando os kits Agilent Protein 80 e 230. Para análise bidimensional, proteínas presentes em 50 &#956;L de soro foram precipitadas em acetona, ressolubilizadas em solução (200 &#956;L) contendo uréia (7 M), tiouréia (2 M) e CHAPS (2 %), sendo 100 &#956;L da solução de proteínas reservados para 1ª dimensão (fitas de 13 cm, pH 3-10). A 2ª dimensão foi realizada em géis de poliacrilamida (10 %) que foram corados com Azul de Coomassie. Os spots detectados foram analisados em software específico. Para análise dos dados, utilizaram-se os testes t-Student e Mann-Whitney, considerando-se p&#8804;0,05. Animais GD apresentaram valores de peso corporal menores do que GN a partir do 5º dia de vida (GN: 12,55±3,35g e GD: 10,41±2,03g, p=0,0262), condição que permaneceu até o 90º dia (p<0,0007). Além disso, na idade adulta, apresentaram menor quantidade de faixas de pesos moleculares detectadas e aumento de concentração de proteínas de peso 32,92 a 32,34 kDa (GN: 6,3 ng/&#956;L e GD: 7,45 ng/&#956;L, p=0,041) no perfil monodimensional. Na análise bidimensional, observaram-se alterações aparentes nos tipos e intensidade de alguns spots. A desnutrição protéica neonatal ocasionou déficit permanente de peso corporal até 90º dia de vida e, no animal adulto, provocou modificações nos perfis proteômicos das amostras de soro analisadas. Em decorrência da administração de uma dieta hipoprotéica durante período crítico de desenvolvimento, modificações no proteoma podem ser correlacionadas a alterações metabólicas que, potencialmente, estejam associadas ao desenvolvimento de patologias no indivíduo adulto

Orientadores: Adriana Franco Paes Leme, Jaime Aparecido Cury / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-15T11:01:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moi_GiselePedroso_D.pdf: 2006152 bytes, checksum: 72847b022c4acfc83ace6ff86cc98e37 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A cárie dental é uma doença biofilme-dependente e os carboidratos fermentáveis presentes na dieta são considerados os fatores ambientais chaves envolvidos em sua iniciação e desenvolvimento. Algumas hipóteses baseadas na estrutura, composição e cinética dos íons no biofilme têm sido sugeridas para explicar a maior cariogenicidade do biofilme dental formado na presença de sacarose. Dentre estas, a expressão diferencial de proteínas bacterianas e presença ou ausência de proteínas salivares no biofilme formado na presença e ausência de sacarose tem sido sugerida. A sacarose promove alterações na composição protéica da matriz extracelular (MEC) do biofilme dental e não foram detectadas proteínas ligadoras de cálcio pela eletroforese bidimensional (2-DE) no biofilme formado em sua presença. A ausência destas proteínas na matriz do biofilme poderia ajudar explicar a sua cariogenicidade. Para avaliar se as alterações no perfil de proteínas da MEC são sacarose-dependentes ou ainda, se a presença de seus monossacarídeos poderia interferir similarmente neste perfil, um estudo in situ, boca-dividida foi realizado em duas fases de 14 dias. Este modelo experimental possibilitou que as proteínas salivares e bacterianas estivessem presentes no mesmo ambiente, simulando a condição natural da formação do biofilme dental. Cada fase experimental foi realizada em triplicata pelo mesmo voluntário. Assim, um voluntário utilizou um dispositivo palatino contendo 16 blocos de esmalte, sendo oito de cada lado, para acúmulo de biofilme. Foi gotejada extra-oralmente uma solução da sacarose 20% (0,58 M), água destilada e deionizada (H2Odd) e uma mistura de uma solução de glicose 10,45% (0,29 M) com frutose 10,45% (0,29 M) sobre 8 blocos de esmalte dental 8 vezes/dia. No 14º dia, o biofilme dental foi coletado, as proteínas da MEC do biofilme dental foram extraídas e analisadas por duas abordagens diferentes: (1) 2-DE seguidos pela cromatografia líquida acoplada com a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) e (2) a mistura complexa das proteínas extraídas da MEC do biofilme foram analisadas por LC-MS/MS. Entre as proteínas diferencialmente expressas (p<0,05) estavam às proteínas ligadoras de cálcio e as proteínas indutoras de prolactina. Estas proteínas possuem um papel peculiar no potencial cariogênico do biofilme, uma vez que são responsáveis pela manutenção da saturação iônica do biofilme e agregação, respectivamente. Os resultados sugerem que as mudanças do perfil protéico da ECM do biofilme dental não são atribuídas exclusivamente à sacarose, uma vez que seus monossacarídeos são capazes de promover alterações na composição protéica do biofilme, sugerindo que este perfil seja dependente dos carboidratos fermentáveis presentes na dieta. / Abstract: Dental caries is a biofilm-dependent oral disease, and fermentable dietary carbohydrates are the key environmental factors involved with its initiation and development. Some hypotheses based on the structure, composition and ion kinetic aspects of biofilm have been suggested to explain the cariogenicity of biofilm formed in the presence of sucrose. Among them, the differential expression of bacteria proteins and the presence and absence of salivary proteins in biofilm formed in the presence and absence of sucrose has been suggested. Sucrose promotes changes in the extracellular matrix protein (ECM) of dental biofilm composition and the undetectable levels of calcium-binding proteins by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) in biofilm formed in its presence provide further insight into the unique cariogenic properties of this dietary carbohydrate. To evaluate whether these changes are sucrose-dependent, an in situ and split-mouth study was conducted during 2 phases of 14 days. Under these conditions, salivary and bacterial proteins are in the same environment, which is able to mimic natural condition of biofilm formation. Each experimental phase was performed in three distinct times with the same volunteer. A volunteer wore a palatal appliance containing 16 enamel blocks, being 8 in each side for dental biofilm accumulation. 20% (0.58 M) sucrose solution, distilled and deionized water (H2Odd) and mixture containing 10.45% (0.29 M) glucose and 10.45% (0.29 M) fructose solution were extraorally dripped onto 8 blocks 8 times/day. On the 14th day, dental biofilms were collected, ECM proteins were extracted and analyzed by two different approaches: (1) 2-DE followed by liquid chromatography coupled with mass spectrometry in tandem (LC-MS/MS) and (2) whole extract proteins were also analyzed by LC-MS/MS. Among the differential expressed proteins (p<0.05) were the calcium-binding and prolactin-induced proteins. Particularly, these proteins have a unique role in the cariogenic potential of biofilm considering their properties of keep biofilm saturation and bacterial aggregation, respectively. Data show that protein profile changes in ECM of dental biofilm are not exclusively attributed to sucrose, since its monosaccharides are able to modify biofilm protein composition, suggesting that the biofilm proteomic profile is dietary carbohydrate-dependent. / Doutorado / Cariologia / Doutor em Odontologia

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O pinhÃo manso (Jatropha curcas L.), pertencente à famÃlia Euphorbiaceae, à uma planta oleaginosa com grande potencial para a produÃÃo de biocombustÃvel devido à riqueza de lipÃdios em suas sementes. Ele tambÃm apresenta toxicidade devido à presenÃa de Ãsteres de forbol. Nesse contexto, o objetivo deste estudo à realizar o isolamento de plastÃdios, local de sÃntese de Ãcidos graxos e de Ãsteres de forbol, presentes no endosperma de sementes em desenvolvimento de J. curcas. Experimentos preliminares atravÃs de anÃlises morfolÃgica, histolÃgica e histoquÃmica foram realizados para determinaÃÃo do estÃgio do desenvolvimento da semente mais adequado para o isolamento de plastÃdios presentes no endosperma. Estas anÃlises revelaram que a deposiÃÃo de lipÃdios e proteÃnas no endosperma se inicia por volta do 30o DAA. O isolamento de plastÃdios, do endosperma de sementes nesse estÃgio foi realizado por centrifugaÃÃo em gradiente descontÃnuo de PBF-Percoll (10%, 22%, 35%). A fraÃÃo enriquecida de plastÃdios foi obtida a partir da banda formada na interface da camada de 22-35%. AnÃlises por microscopia eletrÃnica de varredura e de transmissÃo foram realizadas para confirmar a eficiÃncia do protocolo empregado na purificaÃÃo dos plastÃdios. Mapas bidimensionais foram estabelecidos, os âspotsâ detectados nos mesmos serÃo identificados por espectrometria de massa, o que possibilitarà a identificaÃÃo das proteÃnas plastidiais envolvidas na sÃntese dos Ãcidos graxos e dos Ãsteres de forbol no endosperma de sementes de J. curcas. / Jatropha (Jatropha curcas L.), belonging to the Euphorbiaceae family, is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the richness of lipids in their seeds. It also presents toxicity due to the presence of phorbol esters. In this context, the objective of this study is the isolation of plastids, the site of synthesis of fatty acids and phorbol esters, present in the endosperm of developing seeds of J. curcas. Preliminary experiments by testing morphology, histology and histochemistry was performed to determine the stage of seed development most suitable for the isolation of plastids present in the endosperm. These analyzes revealed that the deposition of lipids and proteins in the endosperm starts around the 30th DAA. The isolation of plastids, the endosperm of the seeds in this stage was performed by gradient centrifugation PBF-Percoll discontinuous (10%, 22%, 35%). The enriched fractions of plastids has been obtained from the band formed in the interface layer of 22-35%. Analysis by scanning electron microscopy and transmission were performed to confirm the efficiency of the protocol employed in the purification of the plastids. Two-dimensional maps have been laid, the "spots" detected in the same will be identified by mass spectrometry, which will allow the identification of the plastid proteins involved in the synthesis of fatty acids and phorbol esters in the endosperm of seeds J. curcas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Embora o potencial das sementes de pinhÃo manso como fonte de matÃria prima para a produÃÃo de biodiesel seja amplamente reconhecido, pouco se sabe sobre os padrÃes de deposiÃÃo de Ãleo e proteÃna durante o desenvolvimento da semente. A disponibilidade deste conhecimento serà de fundamental importÃncia para a criaÃÃo de novos genÃtipos que atendam a demanda das indÃstrias do biodiesel. Neste trabalho, foi realizada uma anÃlise proteÃmica inicial do endosperma em desenvolvimento e maduro, objetivando identificar proteÃnas envolvidas no metabolismo de Ãcidos graxos assim como proteÃnas com propriedades alergÃnicas/tÃxicas/antinutricionais que sÃo responsÃveis por tornar o resÃduo da extraÃÃo do Ãleo inadequado para o consumo animal. AtravÃs de eletroforese bidimensional (2DE) foram estabelecidos mapas de referÃncia das fraÃÃes protÃicas do endosperma de sementes em desenvolvimento (ESD) e maduras (ESM), que foram obtidas explorando as propriedades de solubilidade diferencial das proteÃnas do endosperma. Desses mapas de referÃncia, um total 1480 spots foram selecionados (712 âESDâ e 768 âESMâ), retirados dos gÃis 2DE e digeridos com tripsina para posterior anÃlise por espectrometria de massa. Foram utilizados para as buscas, os bancos de dados do NCBInr e um banco de dados local de ESTs de sementes em desenvolvimento e durante a germinaÃÃo de sementes de pinhÃo manso. Um total de 525 spots foram identificados e classificados funcionalmente. Embora a maioria das proteÃnas identificadas fosse relacionadas com funÃÃo de reserva, proteÃnas envolvidas em vias biossintÃticas dos Ãcidos graxos e dos diterpenos foram identificadas, assim como vÃrias proteÃnas relacionadas com metabolismo, inibidores de protease e a proteÃna tÃxica curcina. A taxa de identificaÃÃo relativamente baixa obtida neste estudo pode em parte ser atribuÃda ao fato de nÃo existir bancos de dados extensos para esta espÃcie. Os resultados aqui apresentados representam a primeira anÃlise em profundidade do padrÃo de deposiÃÃo e identificaÃÃo das proteÃnas de sementes de pinhÃo manso e fixam as bases sobre as quais o proteoma completo de sementes de pinhÃo manso poderà ser estabelecido. / Although the potential of the seed Jatropha as a source of raw material for the production of biodiesel is widely recognized, little is known about the deposition patterns of oil and protein during seed development. The availability of this knowledge will be crucial for the creation of new genotypes to meet the demand from the biodiesel industry. In this study, we performed an initial proteomic analysis of the endosperm in developing and mature in order to identify proteins involved in fatty acid metabolism as well as proteins with allergenic properties / toxic / antinutritional that are responsible for marking the residue of oil extraction unsuitable for consumption animal. Through two-dimensional electrophoresis (2DE) were established reference maps of protein fractions from the endosperm of the seed development (ESD) and mature (ESM), which were obtained by exploring the properties of differential solubility of proteins in the endosperm. These reference maps, 1480 spots in total were selected (712 "ESD" and 768 "ESM"), removed from the 2DE gel and digested with trypsin for subsequent analysis by mass spectrometry. Were used for searching the databases NCBInr and a local database of ESTs from developing seeds and during germination of Jatropha. A total of 525 spots were identified and classified functionally. Although most of the proteins identified were related reservation function, proteins involved in biosynthetic pathways of fatty acids were identified and diterpenes, as well as various metabolic-related proteins, protease inhibitors and curcina toxic protein. The relatively low rate of identification obtained in this study may in part be attributed to the fact that there is extensive databases for this species. The results presented here represent the first in-depth analysis of the deposition pattern and identification of proteins from seeds of Jatropha and lay the foundations on which the complete proteome of seeds of Jatropha can be established.