Este projeto teve como objetivo principal realizar um estudo proteômico diferencial aplicado às amostras de casca do caule de plantas cítricas sadias e infectadas pela morte súbita dos citros. Subsequentemente, a identificação de proteínas diferentemente expressas será de grande importância, uma vez que estas poderão servir não somente como candidatos a biomarcadores para a doenças, mas também auxiliarão no melhor compreensão da doença. À partir dos géis bidimensionais obtidos para amostras de porta-enxerto (limão cravo e limão volkameriano) e copa (laranja valência) foi possível verificar que existem dois conjuntos de proteínas sensivelmente sub-expressas em plantas doentes. Um desses conjuntos, constituído por 13 spots, apresenta valores de pI entre 4,5 e 5,2 e MM aproximadamente igual a 30 kDa. No outro conjunto, esse composto por 9 spots, valores de pI variando entre 6,1 e 9,6 e MM em torno de 20 kDa são observados. Por meio das técnicas de MALDI-TOF-TOF e LC-ESI-MS/MS, inúmeros spots foram inequivocamente identificados, incluindo os spots correspondentes às regiões diferentemente expressas. Os 13 spots correspondentes a região com valores de pI entre 4,5 e 5,2 e MM ~ 30 kDa foram todos identificados como sendo constituídos por três isoformas de quitinases. Por outro lado, os spots referentes a região com pI entre 6,1 e 9,6 e MM ~ 20 kDa foram identificados como proteína putativa similar a miraculina 2. A justificativa para o fato de diversos spots terem recebido a mesma identificação é atribuída às inúmeras e diferentes modificações pós-traducionais, comumente verificadas em plantas. Entretando, o aspecto mais relevante relacionado a essas identificações é o fato de que ambas as proteínas são conhecidas marcadoras de resistência de defesa em plantas e assim sendo, a priori, espera-se-ia que estivessem sendo super expressas em plantas doentes. Porém, um comportamento inverso foi verificado, o que reforça as evidências de que as quitinases não agem apenas como marcadores de defesa em plantas, possuindo assim outras funções. Além disso, no total, outras 19 proteínas puderam ser identificadas. / The main goal of this project was to perform a differential proteomic analysis of bark tissues of healthy and CSD (citrus sudden death)- affected citrus plants. Subsequently, the identification of differently expressed proteins will be of great importance since they can be used not only as biomarkers for CSD but also as basic information for improving the knowledge about the disease. According to the 2D gels, obtained for bark tissues of both rootstock (rangpur lime and volkamerian lemon) and scion samples, there are two sets of proteins remarkably under expressed in CSD-affected samples. One of these sets is composed by 13 proteins, which presents MW around 30 kDa and pI ranging from 4.5 to 5.2. The other set includes 9 proteins with pI ranging from 6.1 to 9.6 and MW around 20 kDa. By using two mass spectrometry approaches (MALDI-TOF-TOF and LC-ESI-MS/MS), several proteins have been unequivocally identified, including the differentially expressed ones. Thirteen spots have been identified as a mixture of three chitinase isoforms. These spots are relative to the region with pI ranging from 4.5 to 5.2 and MW ~ 30 kDa. On the other hand, the 9 spots referent to the region with MW ~ 20 kDa and pI between 6.1 and 9.6 were identified as putative miraculin-like 2 protein. Several spots have been identified as the same protein most probably due to the occurrence of different post-translational modifications. The most valuable point regarding the identity of these proteins is the fact that they are well-known plant pathogen-related proteins and then they should be over expressed in affected plants. However, the opposite behavior was verified, which may indicate that chitinases and putative miraculin-like 2 protein perform unknown functions, besides the established ones. In addition, other 19 constitutive proteins have been identified.

Controlar a proliferação celular de tumores é um objetivo que vem sendo perseguido há décadas, com moderado sucesso na maioria dos casos. Dentre os diversos tipos de tumores que atingem a humanidade, alguns gliomas são considerados os mais fatais, por haver pouca ou nenhuma alternativa de tratamento efetivo. Agentes que apresentam propriedades anti-tumorais, como glicocorticóides (GC) e a forma all-trans do ácido retinóico (ATRA) são utilizados como adjuvantes no tratamento de alguns tipos de glioma. Entretanto, apesar de serem moléculas bastante conhecidas, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação como anti-tumoral. Para endereçar este problema, nosso laboratório se propôs a isolar e caracterizar genes regulados por estes agentes, utilizando modelos celulares, como as linhagens C6 e ST1 de glioma de rato, e as linhagens T98G e A172 de glioma humano. A linhagem C6 apresenta características de células transformadas e tumorais em cultura, e responde a GC, ou ATRA, com inibição de crescimento e achatamento celular. A linhagem ST1, variante derivado da C6, é hiper-responsiva ao tratamento com GC e, aparentemente, mais responsiva ao tratamento com ATRA, passando por um processo de completa reversão fenotípica tumoral-normal, devido ao expressivo aumento do tempo de dobramento, diminuição da densidade de saturação, recuperação da dependência de fatores de crescimento presentes no soro fetal bovino e da dependência de ancoragem para proliferação e perda do potencial tumorigênico, além de sofrer alterações morfológicas, como um maior achatamento celular e reorganização em feixes paralelos, que a aproximam do fenótipo normal. No presente trabalho buscou-se alterações moleculares induzidas por ATRA em células ST1, para melhor compreender a cascata de eventos desencadeada por ação deste fármaco. Em paralelo foram realizados estudos da ação de ATRA sobre as células T98G, buscando-se correlacionar os dados obtidos em modelo celular murino com modelos humanos. Para tanto, duas metodologias de estudo foram aplicadas: a) análise proteômica através de eletroforese bidimensional de proteínas (2D-PAGE), acoplada à espectrometria de massa (MALDI-TOF), para gerar perfis de expressão protéica na ausência e na presença de ATRA, permitindo comparação e identificação de proteínas moduladas no processo; b) construção de vetores plasmideais e retrovirais para super-expressar ou bloquear a expressão de um inibidor de serina protease de rato (serpinb6), descrito previamente no laboratório como estando potencialmente envolvido no processo de reversão fenotípica de ST1 induzido por ATRA. A abordagem proteômica permitiu a identificação de sete proteínas potencialmente reguladas por ATRA no modelo celular ST1, como as proteínas envolvidas em proliferação celular (c-Fos e SCGF), as proteínas de citoesqueleto (actina e tubulina), as proteínas envolvidas em estresse celular (GRP78 e Hsc70) e a proteína TCTP, classicamente reprimida em processos de reversão do fenótipo tumoral. O uso de construções plasmideais e retrovirais permitiu a obtenção de populações celulares que super-expressam serpinb6 e a análise de fenótipo destas células indicou que serpinb6 também pode ter função citoprotetora em células ST1, o que a coloca junto com as proteínas GRP78 e Hsc70 identificadas, evidenciando a importância desta classe de proteínas no processo estudado. / Control of tumor cell proliferation is an objective that has been pursued for decades, with modest or no success in the majority of the cases. Among the several kinds of tumors that develop in humans, some gliomas are considered the most fatal, due to the lack of alternatives for effective treatment. Anti-tumor agents, such as glucocorticoids (GC) or all-trans retinoic acid (ATRA) are used in combination with other drugs in some glioma cases. However, besides being very known molecules, their anti-tumor mechanism is not completely understood. In order to address this problem, our laboratory decided to isolate and characterize genes regulated by these agents, using cellular models, such as the C6 and ST1 rat glioma cell lines and the T98G and A172 human glioma models. The C6 cell line is fully transformed and tumoral in culture and responds to GC or ATRA treatment, showing growth inhibition and cell flattening. The ST1 variant is hyper-responsive to the treatment with GC and, apparently, more responsive to the treatment with ATRA, when compared to C6. Upon treatment with these agents, it undergoes a complete tumoral to normal phenotypic reversion, characterized by an increase in doubling time, decrease of saturation density in culture, recovery of dependence of serum factors for proliferation and anchorage for colony formation, besides inhability to form tumors in nude mice and morphological changes. Here we present the efforts undertaken towards better understanding of the molecular changes induced by ATRA in ST1 cells. Aiming at the correlation of the data obtained from a rat model with human models, all the studies were performed in parallel with the T98G human glioma cell model. To this end, two study methodologies were applied: a) proteomic analysis through bidimensional electrophoresis coupled to MALDI-TOF identification, to generate protein expression profiles in the presence and absence of ATRA, allowing comparison and identification of proteins modulated in the process; b) construction of plasmid and retroviral vectors to overexpress or block the expression of a serine protease inhibitor (serpinb6), previously described in the laboratory as being potentially involved in the process of tumoral to normal phenotypic reversion promoted by ATRA in ST1. The proteomics approach allowed the identification of seven proteins potentially regulated by ATRA in ST1, such as the proteins involved in cell proliferation (c-Fos and SCGF), cytoskeleton organization (actin and tubulin), cellular stress (GRP78 and Hsc70) and the tumor related protein TCTP, classically repressed in tumoral to normal reversions, and related to the three groups of proteins mentioned above. By using plasmid and retroviral vectors it was possible to obtain recombinant cell populations over-expressing serpinb6. The phenotype analysis of these populations indicated that serpinb6 can also have cell protection effects in ST1, which would classify it together with GRP78 and Hsc70 as an anti-stress protein highlighting the importance of this protein class in the process studied.

O complexo salivar da sanguessuga H. depressa é composto pelas glândulas salivares e probóscide. Análises bidimensionais (2D) mostraram que a maioria das proteínas apresentam pI entre 3.5 à 9.5 e MM entre 10 à 105 kDa. O mapa 2D do complexo salivar apresentou 352 spots totais, sendo 249 exclusivos da saliva (corado por nitrato de prata) e 219 spots totais (corado por Coomassie Blue). As proteínas foram identificadas após sequenciamento tandem MS (proteoma) pela complementariedade às sequências traduzidas do cDNA (transcriptoma). As proteínas mais abundantes foram: antiagregante plaquetário; miohemeritrina e anidrase carbônica. Estas proteínas devem exercer um papel na digestão ou anticoagulação do sangue durante a alimentação. A zimografia também identificou uma protease gelatinolítica (45 kDa). Porém, lefaxin (inibidor de FXa) e hementerina (fibrinogenolítico e inibidor de agregação plaquetária) não foram identificados por estas técnicas biotecnológicas, o que mostra a necessidade de técnicas adicionais para a completa elucidação da constituição desta amostra. / The salivary complex from H. depressa leech is composed of salivary gland and proboscis. Two-dimensional (2D) analysis showed that majority of proteins have pI from 3.5 to 9.5 and MW from 10 to 105 kDa. The 2D gel of salivary complex showed 352 total spots, 249 of them were from saliva (silver stained) and 219 total spots (Coomassie Blue stained). Proteins were identified after tandem MS sequencing (proteome) and complementar analysis of translated sequences from cDNA (transcriptome). The most abundant proteins were: antiplatelet protein; myohemerytrin; carbonic anhydrase. These proteins may have a role in digestion or antihemostatic system during blood feeding. The zymographic assay identified a gelatinolytic protein (45 kDa). But, lefaxin (inhibitor of Fxa) and hementerin (fibrinogenolytic and antiplatelet function) were not identified by these biotechonolgical techniques, showing that additional techniques are necessary for complete knowledge about the composition of this sample.

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celulares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez. / There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed, embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.

A soja geneticamente modificada tolerante ao herbicida glifosato tem sido a cultura derivada da engenharia genética mais cultivada atualmente no mundo. Como todo alimento GM a soja tem sido alvo de investigação em relação a sua Biossegurança. Novas estratégias têm sido desenvolvidas e aplicadas neste campo de pesquisa, sendo que métodos rápidos e eficientes de análise proteômica têm sido utilizados para avaliação e monitoramento da segurança e inocuidade alimentar, indicando mudanças no perfil protéico entre variedades convencionais e GM. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os mapas protéicos de amostras de soja convencionais e suas derivadas geneticamente modificadas tolerantes ao herbicida glifosato, utilizando técnicas de análise proteômica com ênfase para inocuidade alimentar. Foram utilizadas seis amostras de soja, sendo três convencionais parentais e três derivadas GM, cultivadas entre 2004-2005, em Goiás. O extrato bruto protéico foi submetido à análise por eletroforese unidimensional e bidimensional. A eletroforese 2D, foi realizada utilizando tiras com gradiente de pH de 3-10 e 4-7. As imagens dos mapas protéicos das seis variedades, produzidas em replicatas, foram analisadas pelo software ImageMaster 2D Platinum. O potencial alergênico do extrato protéico bruto foi avaliado para todas as variedades utilizando soro de pacientes alérgicos à soja através de immunoblotting. Nos resultados obtidos observou-se a presença das principais frações protéicas da soja pela eletroforese unidimensional sem alteração significativa entre as amostras parentais e GM, exceto para uma banda de 115 kDa presente nas amostras parentais, mas ausente nas amostras GM. A partir da análise por eletroforese 2D foram identificadas as formas peptídicas correspondentes às frações de β-conglicinina e glicinina bem como diversas outras proteínas encontradas na soja como o inibidor de tripsina e a lipoxigenase. Através do software foi possível observar que um spot apresentou diferença estatística entre as amostras analisadas, expresso em maior concentração nas amostras GM do que nas parentais. Nos testes de alergenicidade, os extratos protéicos das variedades GM demonstraram reatividade similar em relação as suas respectivas variedades parentais. A proteína de 115 kDa foi sequenciada e identificada como a proteína precursora da cadeia α da β-conglicinina e o spot das amostras GM que apresentou diferença estatística significativa foi identificado como a proteína precursora de G4 glicinina. A diferença observada entre as variedades parentais e GM para as subunidades α de β-conglicinina e G4 glicinina pode ter ocorrido devido a variações normais observadas entre diferentes variedades de soja. Os resultados demonstram a viabilidade de aplicação das ferramentas proteômicas na identificação de alterações de perfis protéicos de amostras de soja parentais e GM. Pelos dados obtidos podemos concluir que as diferenças apresentadas não comprometem a inocuidade alimentar das amostras de soja GM em relação a suas respectivas variedades parentais. / Genetically modified soya-tolerant to the herbicide glyphosate culture has been derived from the more cultivated genetic engineering in the world today. As GM soya beans whole food has been investigated in relation to your biosafety. New strategies have been developed and applied research in this field, and fast and efficient methods of analysis proteomics have been used for assessment and monitoring of food security and safety, indicating changes in own protein profile between conventional and GM varieties. The aim of this work was to assess the maps soy protein samples of conventional and genetically modified their derived to the herbicide glyphosate-tolerant, using Proteomics analysis techniques with emphasis on food safety. Six samples were used for conventional soya, three and three derived from GM parental, grown between 2004-2005. The crude protein extract own was subjected to analysis by electrophoresis one-dimensional and two-dimensional. 2D electrophoresis using Strip was held with pH gradient of 3-10 and 4-7. Protein maps images of six varieties produced in replicates have been analysed by the 2D Platinum software ImageMaster. The potential allergenic in crude protein extracts was evaluated for all varieties using allergic patient serum soya by immunoblotting. In the results obtained noted the presence of the main protein fractions of soya by one-dimensional electrophoresis without significant change between parental and GM samples, except for a band of 115 parental kDa present in the sample, but absent in GM samples. From the analysis by 2D electrophoresis peptides forms were identified corresponding to fractions of β-conglicinina and glicinina as well as several other proteins found in soy as trypsin inhibitor and lipoxygenase. Through the software has been possible to observe that a spot presented statistical difference between the samples tested, expressed in greater concentration in the samples GM in parenting. In tests of allergenicity, GM varieties protein extracts showed similar reactivity in respect of their parental varieties. 115 KDa protein was sequenced and identified as the protein precursor of α subunit of β-conglicinina and the spot that GM samples presented significant statistical difference was identified as the G4 glicinina protein precursor. The difference between parental and GM varieties for subunits α of β-conglicinina and G4 glicinina may have occurred due to normal variation between different varieties of soy. The results demonstrate the viability of applying the tools Proteomics in identification of protein profiles changes of soya samples parental and GM. By data obtained can be concluded that the differences do not compromise the safety of food GM soybean samples with regard to their parental varieties.

Atualmente a contaminação ambiental é um problema mundial. A contaminação do solo por metais pesados tem aumentado nos últimos anos, estando associada à demandas de tecnologias que exigem esses elementos contaminantes. O cádmio (Cd) é um elemento normalmente encontrado em baixas concentrações na natureza, sendo altamente tóxico para microrganismos, plantas e animais. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo analisar as modificações no perfil protéico de duas cultivares de tomateiro, cv. Calabash Rouge (CR) e cv. Pusa Ruby (PR), submetidas a 50 ?M de CdCl2, em sistema de hidroponia. Diferentes métodos de extração de proteínas para as análises de eletroforese bidimensional (2- DE) foram conduzidas (Fenol; TCA/Acetona; Tris-base; Tris/TCA). O método TCA/Acetona foi o mais eficiente, apresentando maior rendimento total protéico (mg gMF-1), padronização e abundância de proteínas, e alta resolução no perfil protéico. Após a exposição das plantas ao Cd, foram realizadas análises de taxa de crescimento, índice de tolerância, quantificação do conteúdo de Cd, malondialdeído (MDA) e H2O2 nos tecidos vegetais. Os resultados indicaram que plantas submetidas a 50 ?M CdCl2 acumularam Cd em seus tecidos, e mostraram-se mais estressadas comparadas as plantas controle, evidenciado por alterações em aspectos morfológicos principalmente na cultivar CR. Na presença de Cd o conteúdo de MDA exibido no tecido foliar da cv. PR foi menor comparado a cultivar CR, o que pode indicar, de forma indireta, maior eficiência do sistema antioxidante da cv. PR. O conteúdo de H2O2 apresentou aumento em ambos tecidos e cultivares na presença de Cd. O índice de tolerância confirmou que a cv. PR é mais tolerante ao Cd em comparação a cv. CR. Análises de eletroforese bidimensional (2-DE) indicaram alterações no perfil protéico das duas cultivares avaliadas quando expostas ao Cd. Assim, a identificação de spots diferencialmente expressos pode revelar novas proteínas relacionadas à tolerância e sensibilidade ao Cd e outros metais pesados em plantas cultivadas. / Environmental contamination is currently a global problem. Soil contamination by heavy metals has increased in more recent years, associated to demands of technologies that require these contaminant elements. Cadmium (Cd) is an element usually found in low concentrations in nature, being very toxic for microorganisms, plants and animals. Thereby, this study aimed to identify changes in protein profile of two cultivars of tomato, cv Calabash Rouge (CR) e cv Pusa Ruby (PR), under 0 and 50 mM of CdCl2 in hydroponics system. Different protein extraction methods for two-dimensional electrophoresis (2-DE) were performed (Phenol, TCA /Acetone; Tris base, Tris /TCA). The TCA /Acetone method was the most effective for root and leaf tissues, obtaining the highest protein yield (mg GMF-1), standardization, abundance and high-resolution of protein profile. After plant exposition to Cd, we performed analysis of growth rate, tolerance index, measurement of Cd content, measurements of malondialdehyde (MDA) and H2O2 content in plant tissues. The results showed that the plants submitted to 50 mM of CdCl2 accumulated Cd in their tissues, presenting more stress than the control plants, which was reflected in morphological symptoms, especially in cv CR. In the presence of Cd the MDA content displayed in cv. PR leaf tissue was lower than cv CR, which may indicate, indirectly, an antioxidant system more efficient in cv PR. The H2O2 content showed an increase in both tissues and cultivars under Cd presence. The tolerance index confirmed that the cv. PR is more tolerant to Cd, compared to cv. CR. Two dimensional electrophoresis (2-DE) analyses were performed and demonstrated alterations in protein profile of the two cultivars when exposed to Cd. Thus, the identification of differentially expressed spots may show new proteins related to tolerance and sensitivity to Cd and other heavy metals in plants.

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celulares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez. / There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed, embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.

A modulação da resposta inflamatória uterina equina recebe atenção, devido a um distúrbio imunológico, que parece ocorrer em uma população de éguas, classificadas como suscetíveis à endometrite. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da corticoterapia aplicada na presença e na ausência de inflamação uterina sobre a proteômica e a concentração de óxido nítrico no líquido endometrial de éguas suscetíveis à endometrite. Éguas foram sincronizadas com 5 mg de prostaglandina F2α e após a verificação dos sinais de estro foram submetidas a quatro tratamentos. O primeiro foi o Controle, que não recebeu nenhum tipo de tratamento. O segundo foi o GC, onde as éguas receberam aplicação de um glicocorticóide, a cada 12 horas, por três dias consecutivos. O terceiro foi o Infectado, onde as éguas receberam uma infusão intrauterina de Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) e o quarto foi o GC + Infectado, onde as éguas receberam a aplicação do glicocorticóide e a infusão intrauterina descrita acima. Doze horas após o final de cada tratamento, amostras de líquido endometrial puro e de lavados uterinos foram coletadas para análise proteômica e determinação de óxido nítrico, respectivamente. O primeiro artigo relata os dados preliminares da análise proteômica, com a contagem das bandas protéicas e a observação de 33 bandas protéicas no Controle, 54 no GC, 51 no Infectado e 72 no GC + Infectado. A corticoterapia pode induzir o aparecimento de um número maior de bandas protéicas, pois os géis com as maiores contagens foram nos tratamentos onde ela foi aplicada. No segundo artigo, foi realizada a identificação das bandas protéicas significativas, em relação à densidade óptica relativa e à frequência. A corticoterapia provocou uma alteração na proteômica do líquido endometrial, caracterizada pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação, com as maiores alterações observadas quando a corticoterapia foi aplicada na presença do processo infeccioso. A infusão de Streptococcus zooepidemicus provocou alterações na proteômica do líquido endometrial, caracterizadas pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação. Os resultados do estudo indicam que a corticoterapia provoca alterações imunológicas no endométrio equino, não apenas como depressiva, mas estimuladora da defesa local, através de uma ação imunomoduladora. No terceiro artigo, foi realizada a determinação da concentração de óxido nítrico, não sendo observada diferença significativa nos quatro tratamentos. Portanto, a corticoterapia provoca alterações proteômicas no líquido endometrial de éguas suscetíveis em estro, onde a presença de um estímulo inflamatório causado pela infusão intrauterina bacteriana induz a uma maior alteração, do que a ausência. A infecção do lúmen uterino provoca alterações proteômicas no líquido endometrial e a corticoterapia não influencia a concentração de óxido nítrico de éguas em estro. / The modulation of the equine uterine inflammatory response recieves much attention, due to an immunological disorder, which appears to happen in a population of mares, classified as suscetipble to endometritis. The aim of this study was to verify the effect of corticotherapy applied in the presence and in the absence of uterine inflammation on the proteomics and nitric oxide concentration of the endometrial fluid of mares susceptible to endometritis. Mares were synchronized with 5 mg prostaglandin F2α and after the observation of the signs of estrus were submitted to four treatments. The first was the Control, which did not recieve any kind of treatment. The second was the GC, where mares recieved the administration of a glucocorticoid, each 12 hours, for three consecutive days. The third was the Infected, where mares received an intrauterine infusion of Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) and the fourth was the GC + Infected, where mares received the administration of glucocorticoid and intrauterine infusion as described above. Twelve hours after the end of each treatment, pure endometrial fluid and uterine flushings were collected for proteomic analysis and nitric oxide determination, respectively. The first article reports the preliminary data of the proteomic analysis, where protein band counts were done, being observed 33 protein bands in Control, 54 in GC, 51 in Infected and 72 in GC + Infected. Corticotherapy can induce the appearance of a higher number of protein bands, because the gels with the highest counts were in the treatments where it was applied. In the second article, the identification of the significative protein bands was done, regarding the relative optic density and frequency. Corticotherapy provoked an alteration in the endometrial proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins, with the major alterations observed when corticotherapy was applied in the presence of an infectious process. Streptococcus zooepidemicus infusion provoked alterations in the endometrial fluid proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins. Results from this study indicate that corticotherapy provokes immunological alterations in the equine endometrium, not only as depressor, but enhancer of local defense, through an immunomodulatory action. In the third article, the nitric oxide concentration was determined, with no significative diference observed in the four treatments. So, corticotherapy provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid of susceptible mares in estrus, where the presence of an inflammatory stimulus caused by intrauterine bacterial infusion induces a major alteration, than the absence. Uterine lumen infection provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid and corticotherapy does not influence nitric oxide concentration in mares in estrus.

SILVA, Michelle Moura. Proteínas do plasma seminal de touros Bos Indicus e associações com parâmetros seminais. 2011. 71 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Zootecnia, Fortaleza-CE, 2011 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-08-09T13:06:10Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_mmsilva.pdf: 1145339 bytes, checksum: d51993cff038075c4bea680c81c0cb00 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-08-09T13:06:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_mmsilva.pdf: 1145339 bytes, checksum: d51993cff038075c4bea680c81c0cb00 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T13:06:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_mmsilva.pdf: 1145339 bytes, checksum: d51993cff038075c4bea680c81c0cb00 (MD5) Previous issue date: 2011 / This research aimed to describe the two-dimensional electrophoresis map of bull seminal plasma of adult Bos indicus, Brahman, and the determination of statistical associations between proteins of seminal plasma and semen parameters of these bulls. Semen samples from 56 bulls were collected and seminal plasma was obtained by centrifugation and subjected to two-dimensional electrophoresis. The gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using PDQuest application. The bulls were divided into groups of high and low sperm motility and high and low percentage of morphologically normal sperm cells. The most abundant proteins in seminal plasma of bulls Bos indicus and detected in all 56 gels showed similarity to espermadesinas and BSPs. The expression of spots with pI values ​​kDa protein equivalent to aSFP, BSPs, clusterin, albumin and osteopontin were significantly different between groups of animals with contrasting parameters of sperm motility and morphology. The associations found between such protein spots and semen parameters suggest the possibility of their use as molecular markers of potential fertility of animals. / A realização desta pesquisa teve por objetivos a descrição do mapa eletroforético bidimensional do plasma seminal de touros adultos Bos indicus, raça Brahman, bem como a determinação das associações estatísticas entre proteínas do plasma seminal e parâmetros seminais destes touros. Amostras de sêmen de 56 touros foram coletadas e o plasma seminal foi obtido através de centrifugação e submetido à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados por meio do aplicativo PDQuest. Os touros foram divididos em grupos de alta e baixa motilidade espermática e alto e baixo percentual de células espermáticas morfologicamente normais. As proteínas mais abundantes no plasma seminal dos touros Bos indicus e detectadas em todos os 56 géis apresentaram semelhança com espermadesinas e BSPs. A expressão de spots com valores de kDa e pI equivalentes aos das proteínas aSFP, BSPs, clusterina , albumina e osteopontina foram estatisticamente diferentes entre os grupos de animais com parâmetros contrastantes de motilidade e morfologia espermáticas. As associações encontradas entre tais spots protéicos e os parâmetros seminais sugerem a possibilidade do uso destes como marcadores moleculares da fertilidade potencial dos animais.

A modulação da resposta inflamatória uterina equina recebe atenção, devido a um distúrbio imunológico, que parece ocorrer em uma população de éguas, classificadas como suscetíveis à endometrite. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da corticoterapia aplicada na presença e na ausência de inflamação uterina sobre a proteômica e a concentração de óxido nítrico no líquido endometrial de éguas suscetíveis à endometrite. Éguas foram sincronizadas com 5 mg de prostaglandina F2α e após a verificação dos sinais de estro foram submetidas a quatro tratamentos. O primeiro foi o Controle, que não recebeu nenhum tipo de tratamento. O segundo foi o GC, onde as éguas receberam aplicação de um glicocorticóide, a cada 12 horas, por três dias consecutivos. O terceiro foi o Infectado, onde as éguas receberam uma infusão intrauterina de Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) e o quarto foi o GC + Infectado, onde as éguas receberam a aplicação do glicocorticóide e a infusão intrauterina descrita acima. Doze horas após o final de cada tratamento, amostras de líquido endometrial puro e de lavados uterinos foram coletadas para análise proteômica e determinação de óxido nítrico, respectivamente. O primeiro artigo relata os dados preliminares da análise proteômica, com a contagem das bandas protéicas e a observação de 33 bandas protéicas no Controle, 54 no GC, 51 no Infectado e 72 no GC + Infectado. A corticoterapia pode induzir o aparecimento de um número maior de bandas protéicas, pois os géis com as maiores contagens foram nos tratamentos onde ela foi aplicada. No segundo artigo, foi realizada a identificação das bandas protéicas significativas, em relação à densidade óptica relativa e à frequência. A corticoterapia provocou uma alteração na proteômica do líquido endometrial, caracterizada pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação, com as maiores alterações observadas quando a corticoterapia foi aplicada na presença do processo infeccioso. A infusão de Streptococcus zooepidemicus provocou alterações na proteômica do líquido endometrial, caracterizadas pelo aumento e diminuição na densidade óptica relativa e na frequência de proteínas da fase aguda da inflamação. Os resultados do estudo indicam que a corticoterapia provoca alterações imunológicas no endométrio equino, não apenas como depressiva, mas estimuladora da defesa local, através de uma ação imunomoduladora. No terceiro artigo, foi realizada a determinação da concentração de óxido nítrico, não sendo observada diferença significativa nos quatro tratamentos. Portanto, a corticoterapia provoca alterações proteômicas no líquido endometrial de éguas suscetíveis em estro, onde a presença de um estímulo inflamatório causado pela infusão intrauterina bacteriana induz a uma maior alteração, do que a ausência. A infecção do lúmen uterino provoca alterações proteômicas no líquido endometrial e a corticoterapia não influencia a concentração de óxido nítrico de éguas em estro. / The modulation of the equine uterine inflammatory response recieves much attention, due to an immunological disorder, which appears to happen in a population of mares, classified as suscetipble to endometritis. The aim of this study was to verify the effect of corticotherapy applied in the presence and in the absence of uterine inflammation on the proteomics and nitric oxide concentration of the endometrial fluid of mares susceptible to endometritis. Mares were synchronized with 5 mg prostaglandin F2α and after the observation of the signs of estrus were submitted to four treatments. The first was the Control, which did not recieve any kind of treatment. The second was the GC, where mares recieved the administration of a glucocorticoid, each 12 hours, for three consecutive days. The third was the Infected, where mares received an intrauterine infusion of Streptococcus zoopepidemicus (1x109/mL) and the fourth was the GC + Infected, where mares received the administration of glucocorticoid and intrauterine infusion as described above. Twelve hours after the end of each treatment, pure endometrial fluid and uterine flushings were collected for proteomic analysis and nitric oxide determination, respectively. The first article reports the preliminary data of the proteomic analysis, where protein band counts were done, being observed 33 protein bands in Control, 54 in GC, 51 in Infected and 72 in GC + Infected. Corticotherapy can induce the appearance of a higher number of protein bands, because the gels with the highest counts were in the treatments where it was applied. In the second article, the identification of the significative protein bands was done, regarding the relative optic density and frequency. Corticotherapy provoked an alteration in the endometrial proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins, with the major alterations observed when corticotherapy was applied in the presence of an infectious process. Streptococcus zooepidemicus infusion provoked alterations in the endometrial fluid proteomics, characterized by an increase and a decrease on the relative optic density and frequency of inflammatory acute phase proteins. Results from this study indicate that corticotherapy provokes immunological alterations in the equine endometrium, not only as depressor, but enhancer of local defense, through an immunomodulatory action. In the third article, the nitric oxide concentration was determined, with no significative diference observed in the four treatments. So, corticotherapy provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid of susceptible mares in estrus, where the presence of an inflammatory stimulus caused by intrauterine bacterial infusion induces a major alteration, than the absence. Uterine lumen infection provokes alterations in the proteomics of the endometrial fluid and corticotherapy does not influence nitric oxide concentration in mares in estrus.