Células germinativas embrionárias são células pluripotentes derivadas das células germinativas primordiais que surgem no período do desenvolvimento embrionário. Sendo precursoras na maturação dos gametas sendo para a proliferação e formação de novas gerações de células germinativas. Estudos em modelos animais com células troncos embrionárias pluripotentes têm sido realizados com sucesso no tratamento de muitas doenças genéticas, principalmente em modelos caninos devido a homologia com humanos. Portanto, objetivamos estabelecer um estudo da biologia das células erminativas caninas para futuras pesquisas, visando sua viabilidade terapêutica. Foram utilizadas fêmeas de cães sem raça definida (SRD), foram submetidas à ovario-salpinge-histerectomia, oriundas de campanhas de castração realizadas por associações e/ou organizações não governamentais na cidade de Pirassununga. Os embriões coletados foram analisados através de um cronograma histológico e também mensurados através da medida Crown-Rump(CR), em seguida em condições ésteres micro-dissecados na região paramesonéfrica próximo a região dos somitos. Os fragmentos foram isolados e colocados em cultivo com meio apropriado para o desenvolvimento e propagação das células germinativas primordiais (PGCs). Obteve-se sucesso nos cultivos com embriões em idades gestacionais próximas a 24 á 32 dias de gestação, nos quais demonstraram uma morfologia arredondada, pequena. Na microscopia eletrônica de varredura e transmissão observamos tamanhos variados entre as células aderidas umas as outras, mostrando um núcleo bem evidente e em seu citoplasma observou-se diversos tipos de organelas celulares, principalmente mitocôndrias. A análise imunohistoquímica revelou a presença de marcadores Oct4, sugerindo a presença de células pluripotentes e germinativas. Imunofenotípicamente as células através da citometria de fluxo revelou baixa expressão para o marcadore Oct4 enquanto que para os marcadores CD 34, C-Kit houve expressão.RT-PCR mostrou expressão do marcador para pluripotencialidade Oct4 e Sox2 e pela técnica de Western Blotting identificou a expressão da proteína específica para Oct4. Portanto estes achados sugerem com sucesso o estabelecimento de cultivo e proliferação e desenvolvimento das células germinativas primordiais caninas. / Embryonic germ cells are pluripotent cells derived from primordial germ cells which arise during embryonic development. These cells are precursors in the maturation of gametes and for proliferation and formation of new generations of germ cells. Studies using animal models for pluripotent embryonic stem cells have been conducted successfully in the treatment of many genetic diseases, especially using canine models, due the homology between canine and humans. Therefore, we aimed to establish a study of canine biology of germ cells for future research, aiming viability therapy. For this study, we used female mongrel dogs (SRD), which underwent ovary- salpingo- hysterectomy, arising from castration campaigns run by associations and/or NGOs in Pirassununga city. The embryos collected were analyzed using histology methods following the timeline and measure by measuring Crown-Rump (CR) then in an environment without contaminants (sterile) the embryos were micro-dissected focusing in the paramesonephric region near the region of somite where the germ cells are. The fragments were isolated and placed in culture with a specific media for the development and spread of primordial germ cells (PGCs). Success was achieved in cultures with embryos at a gestational age close to 22 to 30th days of gestation, in which the cells showed a rounded morphology and small. In electron microscopy and transmission analyses, sizes were observed between the cells attached to each other, showing a conspicuous nucleus and in the cytoplasm was observed several types of cell organelles, especially mitochondria. Immunohistochemical analysis revealed the positive immunolabeling for Oct4, suggesting the presence of pluripotent cells and germ cells. The analyses using immunophenotyping by flow cytometry showed low expression for Oct4 while for CD34 and C-kit markers had positive expression. RT-PCR showed expression of the pluripotency markers Oct4 and Sox2. By the technique of Western Blotting identified protein expression specific for Oct4. Thus these findings suggest the successful establishment of culture, proliferation and development of primordial germ cells canine.

O objetivo deste experimento foi determinar a sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificado em palhetas na presença de uma haste metálica .Blastocistos Mus domesticus domesticus coletados no quarto dia após a fecundação, foram avaliados morfologicamente e divididos aleatoriamente em três grupos. Os embriões do grupo controle foram transferidos para gotas de meio KSOM e cultivados in vitro por 48 horas. Os embriões selecionados para criopreservação foram expostos a uma solução crioprotetora constituída por PBSm + de 10% etileno-glicol + 10% propileno-glicol, para promover uma desidratação das células embrionárias. Após foram transferidos para a solução de vitrificação que continha 20% etilenoglicol + 20% propilenoglicol diluídos em PBSm, e mantidos durante 25 segundos, sendo imediatamente imersos em nitrogênio submetido à vácuo. As taxas de sobrevivência embrionária revelaram uma maior eficiência da técnica com a inserção da peça metálica (56,21% - 86/153) em relação ao método convencional (18,84% - 26/138). Concluímos assim que a presença da peça metálica em contato com a amostra propiciou maior taxa de sobrevivência dos embriões submetidos à vitrificação envasados em palhetas de 0,25 mL. / The aim of this experiment was determine the Mus domesticus domesticus blastocysts survival rates after vitrification in straws containing a metallic stick, that allows to increase the temperature changes among the nitrogen and the embryo sample. Day 4 Mus domesticus domesticus blastocysts were collected from superovulated donnors and after morphologically evaluation were randomly divided in three groups. The embryos select as control group were transferred to KSOM medium drops and in vitro cultured during 48 hours. The crioperservation selected embryos were first exposed to a cryoprotective solution (modified PBS + 10% ethylene-glycol and 10% propylene-glycol) to promote embryo cell dehydration and after exposed during 25 seconds to the vitrification solution composed by modified PBS + 20% ethylene-glycol and 20% propylene-glycol, and immediately plunged into slush liquid nitrogen. The embryo survival rate in group vitrified in the straws containing the metallic stick (56,21% - 86/153) was significantly different from the observed in the group loaded in original straws (18,84% - 26/138). In conclusion, the presence of the metallic stick in contact with the sample was efficient to enhance more suitable survival rates after vitrification of Mus domesticus domesticus blastocysts loaded in 0,25 mL straws.

O desenvolvimento de protocolos eficientes para a vitrificação de embriões mamíferos ainda é um desafio para os especialistas em reprodução. Soluções crioprotetoras de baixa toxicidade associadas a técnicas seguras de envase são fatores fundamentais, para proporcionarem uma eficiente identificação e controle sanitário das amostras. Dois experimentos foram realizados para determinar a taxa de sobrevivência de embriões Mus domesticus domesticus envasados em palhetas convencionais (0,25 mL), na presença de uma haste metálica de ouro, empregando soluções crioprotetoras descritas para a vitrificação em microvolume. No experimento 1, avaliou-se a toxicidade da solução de desidratação (SD: PBSm + 10% EG + 10% PROH + 0,5 M sacarose), expondo-se os embriões por diferentes tempos: 1 (T1), 3 (T2) ou 10 min (T3). A toxicidade da solução de vitrificação (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) foi determinada pela exposição dos embriões durante 25, 60 ou 180 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. No experimento 2, avaliou-se a utilização do macrovolume (palhetas com a haste de ouro) e microvolume (micropipetas de vidro - GMP) na vitrificação dos blastocistos expostos à SV por 25 seg, previamente desidratados por 1 ou 3 min. Os dados foram analisados pelo teste Qui-Quadrado (P<0,05). No experimento 1, não foi observada diferença estatística entre as taxas de eclosão dos embriões desidratados: T1=68,0% (38/56), T2=72,0% (36/50), T3=71,0% (39/55) e o grupo controle, (74,0% - 48/65). No entanto, houve diferença significativa (P<0,05) na taxa de eclosão em relação ao tempo de exposição dos embriões à SV. Os embriões desidratados por 1 ou 3 min e expostos à SV por 25 seg proporcionaram maiores taxas de re-expansão (79,0% vs 84,0%) e de eclosão (58,0% vs 72,0%), em relação aos tempos de exposição de 60 e 180 seg. No experimento 2, após a vitrificação dos embriões envasados nas palhetas com a haste de ouro, a taxa de eclosão dos blastocistos previamente desidratados por 1 min foi de 16,0% (10/64) e de 4,0% (2/57) quando previamente desidratados por 3 min. Por outro lado, os embriões envasados nas GMP, e previamente desidratados por 3 min, foram os que apresentaram maior taxa de eclosão (60,0% - 52/86). A vitrificação de embriões utilizando soluções crioprototetoras descritas para microvolume não foi eficiente na crioproteção dos blastocistos envasados em palhetas convencionais com a haste de ouro. / The development of efficient vitrification protocols for mammalian embryos still is a challenge for reproductive biologists. Low toxicity cryoprotectant solutions and safe vitrifications procedures that allow sample identification and sanitary control are fundamental factors. Two experiments were conducted to determine the survival rate of vitrified Mus domesticus domesticus embryos loaded into straws containing a metallic piece (manufactured in gold), using cryoprotectant solutions described for microvolume vitrification procedures. In Experiment 1, the toxicity of the dehydratation solution (SD: PBSm +10% EG + 10% PROH + 0,5 M sucrose) was evaluated using three different embryo exposure times: 1 (T1), 3 (T2) or 10 min (T3), in addition as well as the toxicity of the vitrification solution (SV: PBSm + 20% EG + 20% PROH) was also tested upon embryo exposure for 25, 60 or 180 sec, previously dehydration for 1 or 3 min. In Experiment 2, the use of macrovolume (straw with a stem of gold) or microvolume (glass micropipettes – GMP) was evaluated for the vitrification of blastocysts after exposure to SV for 25 sec and previous dehydration for 1 or 3 min. Data were analized by the Chi-square test (P<0,05). In Experiment 1, statistical differences were not observed between hatching rates of dehydrated embryos: T1=68.0% (38/56), T2=72.0% (36/50), T3=71.0% (39/55) and control group embryos, (74.0% - 48/65). However, a significant difference (P <0,05) was observed between hatching rates after embryos exposure to the SV. Embryos dehydrated for 1 or 3 min and exposed for 25 sec to the SV showed higher re-expansion (79.0% vs. 84.0%) and hatching rates (58.0% vs. 72.0%) than embryos exposed to SV for 60 or 180 sec. In Experiment 2, after vitrification of the embryos loaded into straws containing a metallic piece showed a hatching rate of 16.0% (10/64) when previouslly dehydrated for 1 min, and 4.0% (2/57) when for 3 min. On the other hand, embryos loaded into GMP, previouslly dehydrated for 3 min, showed a higher hatching rate, (60.0% - 52/60). Embryo vitrification using a cryoprotectant solution described as suitable for microvolume was not efficient to cryoprotect blastocysts loaded into macrovolume straws containing a metallic piece.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-06-25T13:29:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1372442 bytes, checksum: 3068f373d5ea48eec7b669ecf2b0ed43 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-25T13:29:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1372442 bytes, checksum: 3068f373d5ea48eec7b669ecf2b0ed43 (MD5) Previous issue date: 2009-05-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi substituir as soluções de manipulação de embriões bovino em uso na rotina de TE por meios mais simples e estáveis e, que possam ser armazenados em temperatura ambiente. Na primeira etapa experimental, foram utilizados embriões de camundongas nos estádios de blastocisto inicial (Bin), mórula compacta grau I (McI) e II (McII), distribuídos aleatoriamente em três tratamentos, de acordo com o meio de manutenção: T1 - PBS modificado (Controle); T2 (MD1) e T3 (MD2). Os embriões foram mantidos durante quatro horas no meio de manutenção e, posteriormente cultivados em meio TCM 199. Após o término do tempo de cultivo, os embriões de cada tratamento foram separados aleatoriamente em amostras para avaliação da taxa de clivagem e morfometria, aspectos ultra-estruturais, detecção de apoptose celular e quantificação de expressão gênica de Hsp70.3. A taxa de desenvolvimento dos embriões após manutenção por quatro horas nos meios de manipulação foi inferior (P<0,05) para os embriões do Controle, quando comparada com os embriões do MD1 e MD2, diferença esta não observada (P>0,05) após o cultivo in vitro. Contudo, os embriões McII do MD2 tiveram um maior desenvolvimento (P<0,05), quando comparado com embriões do Controle e MD1, indicando o efeito benéfico do enriquecimento do meio MD2. Não foi verificada diferença (P>0,05) entre tratamentos no diâmetro celular, nuclear, nucleolar, na relação núcleo:nucléolo, no número de células e na percentagem de células apoptóticas. Quanto à expressão gênica de Hsp70.3, foi verificado diferença entre tratamentos (P<0,001), em embriões Bin, McI e McII após manutenção e, posterior cultivo in vitro. Na segunda etapa experimental, foram testados dois meios de manipulação utilizados para coleta e manipulação de embriões, MD1 e MD2 e como controle o PBS modificado, usualmente empregado nas rotinas de TE nas diferentes espécies animais. A transferência dos embriões bovino foi realizada a fresco, ou seja, os embriões coletados de uma determinada doadora foram inovulados no período máximo de quatro horas nas receptoras. Foram coletados e transferidos apenas os embriões de qualidade I e II. Foram utilizados 58 receptoras de embriões, distribuídas aleatoriamente em três tratamentos: T1 – PBS modificado (Controle); T2 (MD1) e T3 (MD2). As taxas de gestação observadas foram: Controle = 47,4% (9/19); MD1= 47,4% (9/19) e MD2 = 55,0% (11/20). Estes resultados demonstram que o uso de diferentes meios de manipulação não influenciou nas taxas de gestação (P>0,05). Deste modo, conclui-se que os meios de manipulação MD1 e MD2 podem ser utilizados nas rotinas de TE, em substituição a solução PBS modificado. / This work aimed substitutes the usually used manipulation solution of bovine embryos on ET routines for more simple and stable medias which could be stored at room temperature. In the first experimental stage, the mice embryos used in the experiment were all at early blastocyst (Bin), compact morula grade I (McI) and II (McII), randomly assigned in three treatments: T1 – modified PBS (Control); T2 (MD1) and T3 (MD2). In each treatment the embryos were kept in manipulation media for four hours. Finishing the manipulation period, the embryos were classified according the development stage and quality. Following, embryos were cultured in modified TCM 199. After the culture period, the embryos were being evaluated accordingly quality and development stage. Following were randomly selected embryo in each treatment and separated in samples to cleavage rate and morphometric, ultra- structural evaluation, cellular apoptosis and genetic expression quantification of Hsp70.3. The development rate for Bin, McI and McII after maintenance for four hours in manipulation media between was lower for Control (P>0.05) when compared with MD1 and MD2. However, after in vitro culture, was not observed difference (P>0.05) on embryo development rate among Control, MD1 and MD2. Moreover, McII from MD2 had a higher development (P<0.05), when compaired with Control and MD1, indication a beneficial effect when MD2 is supplemented. It was not verified difference (P>0.05) among the treatments in relation the nucleus, nucleolus, cell diameter and on total cell number cellular and apoptosis rate. In relation of embryo morphometry (diameter), there was no difference (P>0.05) between the treatments, using embryos Bin, McI and McII after maintenance followed by in vitro culture. Otherwise, genetic expression of Hsp70.3 had difference in Bin, McI and McII after maintenance followed by in vitro culture among the treatments (P<0.001). In the second experimental stage, it was tested three different manipulation media, which were used to recovery and manipulation of the embryos. The control treatment used was the modified PBS, usually used in ET routines in different animal species. The bovine embryos were transferred freshly, i.e., they were recovered from a identified donor and transferred within less than four hours to the recipient cow. Just embryos at quality I and II were recovered and transferred. Were used 58 recipient cows randomly assigned for one of the three treatments: T1 – modified PBS (Control); T2 (MD1) and T3 (MD2). As result we observed the following pregnancy rates: Control = 47.4% (9/19); MD1 = 47.4% (9/19) and MD2 = 55.0% (11/20), which did not differ among them (P>0.05). Therefore, the manipulation media MD1 and MD2 can be used on ET routines to substitute the PBS modified solution. / Termo de autorização não encontrado, numeração das páginas em algarismos romanos difere da numeração do índice. E-mail enviado aos interessados em 25-06-2018.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:02:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1087_1.pdf: 2161443 bytes, checksum: 9e8dad7886f8344b77fbfadf70df15d1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho buscamos identificar o que talvez pudesse ser considerado por muitos como razões pouco usuais ou contraditórias para o grande número de conflitos que se agregaram no entorno da (in)constitucionalidade da utilização de embriões humanos nas pesquisas que visam a obtenção de linhagens de células-tronco embrionárias no Brasil. Para tanto, desfizemo-nos de acordos tácitos como o que transformava a Igreja Católica no principal algoz destes estudos, para nos indagar sobre quais outras entidades poderiam estar envolvidas com igual força política, em todos estes imbróglios. Nossa suposição era a de que tão importante quanto os discursos da Igreja Católica no fomento a tais controvérsias se revelaria o papel desempenhado pelos próprios cientistas brasileiros, quando analisada a comunicação por eles estabelecida com a população leiga ao longo do processo que levou à aprovação final pelo Supremo Tribunal Federal do Artigo 5º da Lei de Biossegurança brasileira, em fins de Maio de 2008. Assim, por intermédio de um vasto banco de dados e o auxílio teórico da Antropologia Simétrica, pudemos apreender que, de fato, o diálogo entre ciência e sociedade fora bastante exíguo, muito aquém do que a importância destas pesquisas poderia representar para a pesquisa e a saúde pública locais e, do mesmo modo, inferior à necessidade de tais pesquisadores cooptarem a população em prol de seus estudos (o que, certamente, facilitaria a obtenção de recursos, etc.). Mais do que isso, pudemos entender que subjaz a essa notória dificuldade de intercâmbio entre cientistas e não cientistas, o demasiado apego às concepções modernas de ciência e, consequentemente, à manutenção de dualismos cartesianos tais como: laboratório x sociedade; sujeito x objeto, fato x valor e natureza x cultura. Por conseguinte, pudemos interpretar que, afora o vitalismo religioso circundante, um certo vitalismo proveniente do próprio coração da ciência brasileira pode ter sido, paradoxalmente, a maior fonte para tantas controvérsias

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-15T16:26:17Z No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T12:26:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na última década a produção in vitro de embriões tornou-se uma técnica de grande importância na reprodução de bovinos. No gado de leite, ela tem sido bastante utilizada com destaque para as raças Gir e Holandesa. Dentre outras características, essas duas raças apresentam diferenças relacionadas à fisiologia reprodutiva, com reflexo no potencial de produção de embriões no sistema in vitro. Sabendo da importância de ambas as raças para o rebanho brasileiro, é primordial entender as bases fisiológicas destas diferenças e buscar ferramentas para avaliação da qualidade e viabilidade de oócitos e embriões. O objetivo desse trabalho foi caracterizar o fenótipo “doadora” com base na produção de embriões e avaliar alguns genes como possíveis marcadores de produção nestas raças. Para isso, inicialmente foram analisados dados de um laboratório comercial de produção in vitro de embriões. Posteriormente, foi realizada a caracterização molecular e avaliação da expressão relativa de genes candidatos, utilizando-se a técnica de PCR em Tempo-Real, em amostras de células da granulosa cultivadas provenientes de animais com diferentes perfis de produção de embriões. Uma maior produção de complexos cumulus-oócito (COC) total e viáveis foi observado em doadoras da raça Gir. Da mesma forma, animais da raça Gir apresentavam maior taxa de conversão e maior produção total de embriões, independente da raça do touro utilizado para fertilização. Entretanto, nas duas raças não houve diferença na produção de COC entre animais com diferentes taxas de conversão COC/embrião. Não houve diferença nas expressão dos genes (BAX, INHA, IGFIR, LHR, STAR) entre animais com alta ou baixa produção de embriões, assim como entre raças. No entanto, o gene PRDX1 estava sobre-expresso em doadoras da raça Holandesa caracterizadas como de alta produção de embriões. Esses resultados confirmam a maior produção de COC em animais da raça Gir, quando comparados aos animais da raça Holandesa, assim como, a maior produção total de embriões no sistema in vitro, mas sugerem que nas duas raças a eficiência na produção de embriões não é determinada pela produção total de COC. A avaliação da expressão gênica de células da granulosa obtidas de cultivos para a produção in vitro de embriões não possibilitou a caracterização de marcadores com potencial para predição da produção de embriões das doadoras. / In the last years the in vitro production of embryos became a technique of great importance in the reproduction of cattle. In the dairy cattle, it has been widely used with spotlight for the Gyr and Holstein breeds. Among other features, this two breeds exhibit differences related to reproductive physiology and reflects on the potential of production of embryos in the system in vitro. Knowing the importance of both breed for the Brazilian herd, it is critical to understand the physiological basis of these differences and search tools to evaluate the quality and viability of oocytes and embryos. The aim of this study was to characterize the phenotype "donor" based on embryo production and evaluate some genes as potential markers for production in these breeds. To do this initially, data from in vitro production of embryos from a commercial laboratory were analyzed. Subsequently, the molecular characterization and evaluation of the relative expression of candidate genes was performed in samples of granulosa cells from culture of animals with different profiles of production embryos using the Real-time PCR. A higher production of total and viable oocyte-cumulus complexes (COC) was observed in donor Gyr. Likewise, animals Gyr had a higher conversion rate and higher total production of embryos, independent of breed of sire used for fertilization. However, in the two breeds there was no difference in the production of COC between animals with different conversion rates COC / embryo. There was no differences in the expression of genes (BAX, INHA, IGFIR, LHR, STAR) between animals with high or low production of embryos, as well as between breeds. However, the PRDX1 gene was overexpressed in donor Holstein characterized as high production of embryos. These datas confirm the higher production of COC in Gyr breed animals when compared to Holstein cows, as well as the highest total production of embryos in vitro system, but suggest that the two breeds efficiency in the production of embryos is not determined by the total production of COC. The assessment of gene expression of granulosa cells obtained from cultures for in vitro production of embryos did not allow the characterization of potential markers for predicting embryo production of donors.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-10-20T12:29:30Z No. of bitstreams: 2 Tese - Barbara Rosa Foizer Ribeiro - 2015.pdf: 8591460 bytes, checksum: a17bdd2f1dea853625ed739a5f8712a5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: A citação está com problemas: RIBEIRO, Barbara Rosa Foizer. Contaminação microbiológica em placas de cultivo de embriões humanos e a interferência no sucesso da reprodução assistida. 2015. 139 f. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2015. Falta o traço antes da Universidade ... on 2015-10-20T14:43:17Z (GMT) / Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-10-21T09:05:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Barbara Rosa Foizer Ribeiro - 2015.pdf: 8591460 bytes, checksum: a17bdd2f1dea853625ed739a5f8712a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-21T10:13:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Barbara Rosa Foizer Ribeiro - 2015.pdf: 8591460 bytes, checksum: a17bdd2f1dea853625ed739a5f8712a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-21T10:13:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Barbara Rosa Foizer Ribeiro - 2015.pdf: 8591460 bytes, checksum: a17bdd2f1dea853625ed739a5f8712a5 (MD5) Previous issue date: 2015-03-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction: Human reproduction laboratories perform quality control because procedures directly influence results and because certain materials, such as the vagina, follicular fluid and semen cannot be sterilized. The embryo culture dishes should be free of contamination to protect both the mother and the fetuses. Objectives: To investigate the prevalence of microbial contamination of human embryo culture dishes, identify the microorganisms implicated and evaluate the impact of contamination on the success of assisted reproduction. Methods: A total of 470 samples of culture media were obtained from Goiânia, Goiás State after the embryos were transferred to the mother’s uterus, between May 2009 and March 2014. The culture medium was inoculated into BHI broth, and the positive samples were isolated and identified. Data from medical records were collected and analyzed, and regression analyses were performe during SPSS-17.0 software. Results: There was a 6.32% prevalence of contamination. The main fungal pathogens, which resulted in live births, were Candida sp (20%), and the bacterial pathogens, which did not result in live births, were Bacillus sp (16%), E. coli (10%) and Staphylococcus sp (10%). The chance of not getting pregnant was 2.57 (OR, p=0.043, CI=1.06-6.24) times higher in the infected group, the group uncontaminated. Perinatal outcome of live births was 2 (6.6%) in infected and 118 (27%) in uncontaminated, with a significant difference in the logistic regression, p = 0.026, OR = 5.13, CI =1.39-18.97. The infected group had 4.37 (OR, p=0.094, CI=1.58-12.04) times greater chance of pregnancy loss than the group not contaminated. Female factors were the most common infertility factors, and they differed significantly between the contaminated and uncontaminated groups (p=0.02); tubal factor infertility (p<0.001, OR=4.18, CI=1.94-9.01) showed a highly significant difference between the contaminated and uncontaminated groups. A significant difference in poor embryos (Grade C and D) was observed between the groups (p=0.013, OR=3.54 and 95% CI). Conclusion: Microbiological contamination increases the number of embryos poor and the chance of pregnancy loss, and decreases pregnancy rates and perinatal outcome of births. / Introdução: O controle de qualidade é exigência primária em laboratórios de Reprodução Humana, a realização correta dos procedimentos influem diretamente nos resultados e na proteção materno fetal, principalmente porque a vagina, o líquido folicular e o sêmen não podem ser esterilizados. Objetivos: Investigar a prevalência de contaminação microbiológica nas placas de cultivo de embriões humanos, identificar o microrganismo e avaliar a interferência da contaminação no sucesso em reprodução assistida. Metodologia: coletou-se 470 amostras do meio de cultura das placas de cultivo de embriões humanos, após a transferência para o útero materno, em dois laboratórios de reprodução humana na cidade de Goiânia-GO, no período de maio de 2009 a março de 2014. Os meios de cultivo foram inoculados em caldo BHI e as amostras positivadas foram isoladas e identificadas. Os dados dos prontuários foram coletados, analisados e os testes de regressão e ODDS RATIO aplicados com o pacote estatístico SPSS-17.0. Resultados: Houve uma prevalência de 6,32% de contaminação, sendo os principais microrganismos fúngicos: Candida sp (20%) Penicilium sp (13,34%), Aspergillus sp (10%) e bacterianos: Bacillus sp (16%) E. coli (10%), Staphyloccocus sp (10%). A chance de não engravidar foi maior no grupo contaminado (OR=2,57, p=0,043, IC=1,03-6,41). O resultado perinatal de nascidos vivos foi de 2 (6,6%) no contaminado, e 118 (27%) no não contaminado, com diferença significativa na regressão logística, p=0,026, OR= 5,13, IC=1,39-18,97. O grupo contaminado teve maior chance de perda gestacional que o grupo não contaminado (p=0,094, OR=4,37 e IC=0,78- 24,59). O fator de esterilidade mais encontrado foi o tubário (p<0,001, OR=4,18, IC=1,94-9,01), diferença altamente significativa do grupo contaminado para o não contaminado. Diferença significativa para embriões ruins (classe C e D) entre os grupos (p=0,013; OR=3,54 e IC=1,31-9,58). Conclusão: A contaminação microbiológica em 6,32% de prevalência, com maior incidência de Candida sp, Penicilium sp, Bacillus, Aspergillus sp, E.coli e Staphyloccocus sp, aumenta o número de embriões ruins e a chance de perda gestacional, e diminui as taxas de gestação e o resultado perinatal.

Tendo em vista a possibilidade de que a adição de ácidos graxos ao meio de cultivo embrionário aumente a sobrevivência ao congelamento, a proposta deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de quatro ácidos graxos isoladamente ao meio de cultivo, dois do grupo ômega 6 (ácido linoléico e ácido linoléico conjugado) e dois do grupo ômega 3 (ácido eicosapentaenóico e ácido docosahexaenóico), na produção de embriões, no número de células, na quantidade de lipídeos, na taxa de re-expansão da blastocele após 48 horas de cultivos pós-descongelamento, na taxa de eclosão pósdescongelamento e na taxa de gestação. Para tal, os oócitos bovinos colhidos de ovários de vacas abatidas foram maturados, fecundados e cultivados in vitro em atmosfera de 5% CO2 em ar, à 38,8°C e máxima umidade. No cultivo, foi adicionado isoladamente um destes ácidos graxos, e foram avaliadas a taxa de clivagem, e a produção de embriões no sétimo e oitavo dia de cultivo. No sétimo dia, os blastocistos expandidos foram congelados com 1,5M de etileno glicol. Eles permaneceram nesta solução por 9 minutos antes de serem envasados e seguirem para a maquina de congelamento numa taxa de resfriamento de 0,5°C/minuto até chegarem à temperatura de -32°C. Dos embriões que foram congelados, alguns seguiram para o descongelamento e voltaram para o cultivo in vitro para avaliação da reexpansão e taxa de eclosão pós-descongelamento. Outros foram transferidos para receptoras sincronizadas para avaliação da taxa de gestação. Outros grupos de embriões permaneceram até o oitavo dia de cultivo e foram corados com Hoechst 33342 para contagem dos núcleos, e corados com Nile Red para avaliação do conteúdo total de lipídeos. Em geral, a adição isolada de ácidos graxos do grupo ômega 6 (CLA e LA) na produção in vitro de embriões bovinos aumentou a taxa de sobrevivência ao congelamento (criotolerância), no entanto, não houve um aumento no número de células, nem diferença no conteúdo total de lipídeos nos embriões analisados. A taxa de gestação também não diferiu estatisticamente entre os grupos testados in vivo, porém foi observado um aumento de 200% na taxa de gestação dos embriões cultivados na presença de CLA. Novos estudos devem ser desenvolvidos para comprovar o efeito do aumento da criotolerância e melhorias nas taxas de gestações dos embriões, além de estudos da composição de lipídeos nos embriões e membranas. / In the view of the possibility that the addition of fatty acids in the embryo growing medium increase the survival rate after cryopreservation, this study was proposed to evaluate the effect of the addition of four fatty acids in culture medium, two of the omega 6 group (linoleic acid and conjugated linoleic acid) and two of the omega 3 group (eicosapentainoic acid and docosahexaenoic acid), in the rate of production of blastocysts, blastocyst cell number, blastocyst amount of lipids , re-expansion of blastocele rate after 48 hours of culture post-thaw, post-thaw hatching rate and pregnancy rate. The oocytes obtained by punction of slaughterhouse cows were matured in vitro, fertilized in vitro and cultured in vitro in an atmosphere of 5% CO2 in air, to 38,8°C and maximum moisture. Fatty acids were supplemented individually and cleavage rate and production of embryos in the seventh and eighth days of culture were assessed. On seventh day, the expanded blastocysts were frozen with 1.5M of ethylene glycol. They remained in this solution for nine minutes before introduction in a straw followed and then in a freezing machine with a chilling rate of 0,5°C/minute until temperature of -32°C. Frozen embryos were then divide in two groups: one was thawed and returned to in vitro culture in other to assess the reexpansion and post-hatching rate, and other was transferred to synchronized recipients to assess the pregnancy rate. Another unfreezed group of embryos were stained with Hoechst 33342 for counting the nuclei, or stained with Nile Red to estimate the lipids contents. In general, the addition of fatty acids omega 6 group (LA and CLA) increased the survival rate to the freezing (cryotolerancy), however, there was no increase in the number of cells, or difference in the lipids contents. In the CLA treated embryos, the pregnancy rate of the freezed embryos did not differ from groups tested in vivo, but there was a 200% increase in the pregnancy rate. Further studies should be developed to prove the improvements in the rates of pregnancies of omega 6 treated embryos, besides a study of the composition of lipids of embryos and membranes should be conducted.

Três experimentos foram realizados para testar a hipótese de que a resposta superestimulatória de doadoras Nelore (Bos indicus) com tratamentos iniciados próximo à ovulação durante a primeira onda de crescimento folicular seria maior ou comparável àquela decorrente de tratamentos convencionais. Os animais foram aleatoriamente alocados em três grupos. As doadoras dos Grupos 1 - Onda 1 s/P4 e 2 - Onda 1 c/P4 foram superestimuladas na primeira onda de crescimento folicular, e as do Grupo 3 - SincBE+P4/P4 quatro dias após a sincronização da emergência folicular com estradiol e progesterona. Os animais receberam dispositivo intravaginal de Progesterona (CIDR) associado a 50mg de Progesterona e 2,5mg de Benzoato de Estradiol (IM) no Dia 0. Os animais dos Grupos 1 e 2 receberam PGF2&alpha; no Dia 5 e 12,5mg Armour de LH (Lutropin) 24 horas após a remoção do CIDR (Dia 9), e no Dia 11 iniciou-se o tratamento superovulatório. As doadoras do Grupo 2 receberam um novo CIDR juntamente com a primeira dose de FSH (Dia 11). Todos os animais foram superestimulados com 133mg NIH-FSH-P1 de Folltropin diluídos em 10ml, em duas aplicações diárias de 1ml, por cinco dias. No último dia de tratamento, junto com o FSH foram aplicadas doses luteolíticas de PGF2&alpha; nos Grupos 2 e 3 o CIDR foi removido na ultima aplicação. Todas as doadoras receberam 25mg de LH 24 horas após a ultima dose de FSH e foram inseminadas 12 e 24 horas após o LH. Os embriões foram coletados e avaliados pelo mesmo veterinário sete dias após a inseminação. No primeiro experimento, as quantidades de embriões transferíveis não foi significativamente diferente entre os grupos 2 e 3 (8,0 ± 1,8 x 6,6 ± 2,0), e ambas foram maiores que as do 1 (0,2 ± 0,2; P<0,05). Como não houve diferença entre os Grupos 2 e 3 nos parâmetros analisados, o Grupo 3 foi excluído dos outros dois experimentos. No segundo experimento, as doadoras receberam os mesmos tratamentos dos Grupos 1 e 2, mas foram abatidas 12 horas após receberem 25mg de LH (Dia 16) e tiveram seus ovários removidos e levados para o laboratório, para classificação. Os oócitos foram aspirados e avaliados quanto à maturação pela expansão do COC. Os animais que não receberam dispositivo de P4 durante o tratamento superovulatório apresentaram maior número de oócitos não maturados (6,4 ± 2,7 x 1,2 ± 0,9; P< 0,05). O terceiro experimento foi semelhante ao segundo, com a diferença de que os animais foram inseminados 12 horas após o tratamento com 25mg de LH, e tiveram as estruturas coletadas 7 dias após a IA. Os resultados desse experimento confirmaram os do primeiro, no qual animais sem suplementação exógena de P4 durante o tratamento superovulatório apresentaram menor número de embriões transferíveis que o grupo com P4 (0,0 ± 0,0 x 3,9 ± 1,1; P<0,05). Os resultados obtidos retificam a hipótese, demonstrando que a superovulação durante a primeira onda de crescimento folicular em novilhas Nelore é eficiente somente com suplementação exógena de P4 / Three experiments were design to test the hypothesis that superovulatory (SPO) response of Nelore (Bos indicus) donors to treatments administered during the first follicular wave, initiated at the expected time of ovulation, will elicited a higher or a comparable response to traditional protocols. In the first experiment, cows were randomly allocated into 1 of 3 treatment groups. Cows in Group Wave 1 without P4 e Group Wave 1 with P4 were superstimulated during the first follicular wave and cows in the Control Group were superstimulated after synchronized follicular wave emergence using estradiol and progesterone. All cows received a CIDR device and an injection of 50mg of P4 and 2.5mg EB on Day 0. Cows in Groups Wave 1 with P4 and Wave 1 without P4 were also treated with PGF2&alpha; on Day 5 and 12,5mg Armour of pLH (Lutropin) 24 h after CIDR removal (Day 9), to synchronize ovulation. The SPO treatments were initiated on Day 11; donor cows in Group Wave 1 with P4 also received a new CIDR device at the time of the first FSH injection. All donors in three groups were superstimulated with a total dose of 133mg NIH-FSH-P1 of Folltropin-V, divided into twice daily injections of the same dosage (13,3mg diluted in 1ml) over 5 days. On the last day of FSH treatment, all animals received PGF2&alpha; after each FSH injection and cows in Group Wave 1 with P4 and Control Group had their CIDR removed at the time of the last FSH injection. All cows received 25 mg of pLH 24h after the last FSH treatment and were AI 12 and 24h later. Ova/embryo collection and evaluation was done 7d after, aIl by the same veterinarian. Results indicate that there was no difference in the numbers of transferable embryos in CIDR treated donor cows when SPO treatments were initiated at the time of emergence of either the first follicular wave Group Wave 1 with P4 (8.0 ± 1.8) or following synchronization of follicular wave emergence with BE + P4, control Group (6.6 ± 2.0), but both were greater than when SPO treatments were initiated at the first follicular wave without the use of a CIDR device, Wave 1 without P4 (0.2 ± 0.2; P<0,05). Since there were no differences between Groups Wave 1 with P4 and control on all the end points, this group was dropped from the others experiments. A second experiment was performed in order to evaluate the quality of oocyte recovered after animals were treated under the same protocol of Groups Wave 1. The SPO treatments were the same described previously, however 12h after the injection of 25mg of pLH animals were slaughtered and their ovaries were taken to an IVF lab. Follicles were aspirated and the oocyte was evaluated and those with an expanded COC were considered mature. Animals in Group Wave 1 without P4 showed a greater (P<0,05) number of immature oocyte (6.4 ± 2.7) than Group Wave 1 with P4 (1.2 ± 0.9). The third experiment was performed to confirm the results of the first experiment. The treatments were similar as the second experiment, however, animals were AI 12 and 24h after the 25mg of pLH and had ova/embryos collection and evaluation 7 d after by the same veterinarian. Results of this experiment confirmed the first experiment presenting a greater (P<0,05) number of transferable embryos in Group Wave 1 with P4 (3.9 ± 1,1) when compared to Group Wave 1 without P4 (0.0 ± 0.0). The results did not support the hypothesis, showing that exogenous P4 is necessary in order to superovulate Nelore during the first follicular wave

Objetivou-se avaliar os efeitos de diferentes fontes de ácidos graxos essenciais, ômega 3 e ômega 6, e o tempo de suplementação sobre a qualidade oocitária e embrionária em novilhas Bos taurus. Foram selecionadas 24 novilhas da raça Holandesa, divididas em três grupos experimentais os quais receberam as seguintes dietas: 1) Controle (CT) composto por dieta basal de aproximadamente 2,5% de extrato etéreo; 2) Grão de Soja (GS) composto por uma dieta com aproximadamente 4,5% de extrato etéreo, obtido com a inclusão de 11,5% de grão de soja cru e integral na matéria seca (MS) da dieta, sendo fonte de ômega 6; 3) Semente de Linhaça (SL), composto por uma dieta com aproximadamente 4,5% de extrato etéreo, baseada na inclusão de 6,0% de semente de linhaça na MS da dieta, sendo fonte de ômega 3. Os animais foram arraçoados em grupos, de acordo com o consumo de matéria seca do dia anterior de forma a ser mantido porcentual de sobras diárias, entre 5 e 10% do consumo. Foi avaliada, por ultrassonografia, a atividade ovariana de todos os animais durante todo período de coleta. Foram realizadas aspirações foliculares precedidas de sincronização da emergência de onda de crescimento folicular em seis períodos, -30, 0, 30, 60, 90 e 120 dias, os oócitos recuperados foram classificados de acordo com sua morfologia. Foram considerados como viáveis e, consequentemente aproveitados para FIV somente os oócitos classificados como graus I, II e III, os demais foram descartados. Os animais foram pesados para mensuração de ganho médio de peso diário, e amostras de fluido folicular do folículo dominante e sangue foram coletadas concomitante às aspirações foliculares a fim de se avaliar os parâmetros metabólicos como glicose, colesterol total, colesterol HDL, colesterol VLDL, colesterol LDL, triglicerídeos e ureia, Houve efeito de tempo para o número de oócitos classificados em Grau I, número e taxa de embriões. Na avaliação dos contrastes ortogonais, foi observado efeito para o contraste 1 (CT vs GS+SL) quando se analisou a taxa de embriões viáveis, onde a dieta CT apresentou menor desempenho. Não foi observado efeito significativo dos tratamentos para ganho de peso diário e peso corporal das novilhas, onde o ganho de peso médio diário (GPD) entre os tratamentos foi de 1072 gramas para os animais do grupo controle, 972 gramas para o grupo tratado com grão de soja e 840 gramas para suplementação com semente de linhaça. Houve efeito de tempo para a pesagem dos animais alimentados com as dietas experimentais, em que foi observado um aumento significativo de peso dos animais. Para o ganho de peso diário (GPD) foi observado efeito para o contraste 1, em que os animais tratados com a dieta controle apresentaram maiores ganho de peso que os animais alimentados com dietas suplementadas com lipídeos. As duas fontes lipídicas avaliadas não diferiram entre si. Houve efeito de tempo para todas as variáveis do perfil metabólico sanguíneo analisadas ao longo de todo período experimental. Foi observado efeito de interação entre tempo e dieta para a variável glicose. Na análise dos contrastes foi observado efeito para o C1 (controle vs grão de soja + semente de linhaça) onde os animais que consumiram dieta controle apresentaram em média 152,29 mg/dL de glicose em relação aos que consumiram dietas suplementadas com fontes de ácidos graxos (GS e SL) (141,74 + 144,78) respectivamente. Houve efeito estatístico para interação entre tempo e dieta para os níveis de ureia. Na análise do fluído folicular foi observado interação entre tempo e dieta para as variáveis colesterol total e ureia. Foram observados efeitos significativos de dieta, interação tempo dieta e contraste 1 (CT vs GS + SL) quando se analisou a quantidade de triglicerídeos no fluído folicular. Portanto a suplementação prolongada com fontes de ácidos graxos insaturados na alimentação de novilhas não apresenta melhorias consideráveis na qualidade oocitária e embrionária dos animais, aumentando apenas a taxa de embriões viáveis, mas com prejuízos sobre o perfil metabólico e ganho médio de peso vivo. / This study aimed to evaluate the effects of different sources of essential fatty acids, omega 3 and omega 6, and the time of supplementation on oocyte and embryo quality in Holstein heifers. Will be selected 30 heifers Bos taurus, evenly divided into three groups which will receive the following diets: 1) Control (CT) basal diet composed of approximately 2,5% ethereal stratum; 2) Soya Bean (GS) consists of a diet with approximately 4,5% of ethereal layer based on inclusion of 12% of raw soybean and complete the concentrate, a source of omega 6; 3) Flax Seed (SL) composed of a diet with approximately 4,5% ethereal stratum based on inclusion of 6,0% of flaxseed in the concentrate, a source of omega 3. The animals are hand fed into groups according to the dry matter intake inside the day in order to be kept remains percentage of the diets on a daily basis between 5 and 10%. Will be evaluated by ultrasound ovarian activity of all animals throughout the collection period. Be preceded by follicular aspiration performed synchronization emergency follicular wave into six periods, - 30, 0, 30, 60, 90 and 120 days, the oocytes retrieved will be ranked according to their morphology, by measuring the amount of layers and compacting cumulus cells and homogeneity of the ooplasm. Are considered viable and therefore only the recovered oocytes for IVF classified as grade I, II and III, the other is discarded. Follicular fluid samples of the dominant follicle and the concomitant blood will be collected follicular aspiration in order to evaluate the metabolic and hormonal parameters such as glucose, total cholesterol, HDL cholesterol, VLDL cholesterol, LDL cholesterol, triglycerides, and urea. As expected outcome of the present study suggest that supplementation with fat has beneficial effects on follicle, the oocyte quality, the quality of in vitro embryo production and metabolic and hormonal profile of dairy heifers. There was a time effect on the number of oocytes classified as Class I, number and rate of embryos. In assessing orthogonal contrasts, effect was observed for the first contrast (CT vs GS + SL) when analyzing the rate of viable embryos, where the CT diet showed lower performance. There was no significant treatment effect on daily weight gain and body weight of heifers, where the average daily gain weight (GPD) between treatments was 1072 grams for the control group, 972 grams for the group treated with grain of soybeans and 840 grams for supplementation with flaxseed. There was a time effect for weighing animals fed experimental diets, it was observed a significant increase in initial weight to the final weight of the treated animals. In assessing orthogonal contrasts, effect was observed for the first contrast (CT vs GS + SL) for the GPD (daily weight gain) in the animals treated with the control diet showed higher values for average found weight gain, compared to diets with added lipid. However, when we analyzed the contrast 2 (GS vs SL) was not observed statistical effect of the tested variables. There was a time effects for all variables examined the metabolic profile of blood throughout the experimental period. There was a significant interaction effect between time and diet to the variable glucose. In the analysis of contrasts effect was observed for C1 (control versus soybean grain, flaxseed) where the animals fed the control diet had an average of 152.29 mg / dL glucose compared to those fed diets supplemented with acid sources fatty (GS and SL) (141.74 + 144.78) respectively. There was no effect for interaction between time and diet for urea. In the analysis of follicular fluid was observed interaction between time and diet for the variables Total cholesterol and urea. Diet Significant effects were observed, time and diet interaction Contrast 1 (CT vs. GS + SL) where it is examined the amount of triglycerides in the follicular fluid. Therefore prolonged supplementation sources of unsaturated fatty acids in the diet of heifers not considerably improvements in oocyte and embryo quality animal, only increasing the rate of viable embryos, but with losses on the metabolic profile and average live weight gain.