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Primordial gonocytes (PGCs) in some animals, including fish arise after fertilization in extragonadal region from maternally inherited germline cytoplasm, and migrate to the future gonads region during embryogenesis, where differentiate into gametes. PGCs formation and migration patterns have been studied in several species models, and it is known that these patterns differ from each other. Sturgeons belong to class ray-finned fishes(Actinoptergii), in which the sturgeon phylogenetic position is an out-group to teleost fishes, the sturgeon development pattern is more similar to amphibians than teleost fishes. In this study, we demonstrate an injection technique for sturgeon PGCs visualization by GFP nos1 3'UTR mRNA. We found that the Sterlet(A. ruthenus) PGCs are specified in the vegetative pole of the embryo. Subsequently, we reported the PGCs migration route. The arisen PGCs actively migrated on the yolky cell mass, yolky extension, and after that passively moved to gonadal ridge. This study provides evidence that the PGCsare specified by maternally inherited germplasm, located in the vegetative part of the embryo. Sturgeon PGCs specification was similar to that of anuras, but the migration pattern resembled that of teleost. Furthermore, we successfully isolated PGCs to next needed studies.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, acarretando o uso intensivo de acaricidas. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. Muito esforço tem sido despendido para o desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas e caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato. Nesse sentido, entender melhor os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário pode ajudar na identificação de alvos para o controle desse ectoparasita. Foi sugerida previamente a participação da Tick Heme-binding Aspartic Proteinase (THAP), uma aspártico-endopeptidase dos ovos do carrapato, na degradação da vitelina. Neste trabalho, nós avaliamos a função fisiológica e as características bioquímicas adicionais dessa proteína. Para identificar os sítios e o perfil de transcrição do gene da THAP, o RNA total foi extraído de intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas parcialmente e completamente ingurgitadas e de ovos, e analisado por PCR quantitativo. Esta análise revelou que o gene da THAP é transcrito nos três tecidos, porém maior quantidade de mRNA foi detectada no corpo gorduroso e intestino de fêmeas completamente ingurgitadas, onde o processo de vitelogênese já foi iniciado. Nos ovos, a transcrição do gene da THAP não foi detectada. Para investigar a presença da proteína nos tecidos e ovos foi realizado um westen-blot com soro anti-THAP, que revelou a presença, em pequena quantidade, da proteína na hemolinfa, no intestino e no corpo gorduroso. Maior concentração de proteína foi detectada no ovário de fêmeas completamente ingurgitadas e nos ovos durante todo o desenvolvimento embrionário. Também foi observado que a THAP é sintetizada na forma de pró-endopeptidase e depois do início da embriogênese é convertida à forma ativa por autoproteólise. Uma proteína recombinante (rTHAP) foi produzida pela clonagem da região codificadora no vetor de expressão pET43a e expressão em Escherichia coli. Depois da purificação, a rTHAP apresentou atividade enzimática sobre substrato sintético fluorogênico, sendo especificamente inibida por pepstatina A. Para investigar sua participação na degradação de vitelina (VT), VT purificadas de ovos coletados 1, 7 e 12 dias após a postura foram incubadas com a rTHAP em diferentes pH (3,5; 4,0; 4,5; e 5,0). A análise por SDS-PAGE mostrou que a rTHAP é capaz de hidrolisar VT purificada de ovos coletados 7 dias após a postura em pH 3,5 a 37 ºC. Esta atividade é sensível a heme e inibida por pepstatina A. VT purificadas de ovos coletados 1 e 12 dias após a postura não foram hidrolisadas e em outros pH a atividade da rTHAP não foi eficiente. Nossos resultados sugerem que a THAP é sintetizada principalmente em tecidos extra-ovarianos, estocada nos ovários e incorporada nos oócitos como pró-endopeptidase. Durante a embriogênese, a THAP é ativada a enzima na forma madura desenvolvendo papel no processamento da vitelina do carrapato. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host tick that causes losses to bovine herds, leading intensive use of chemical acaricides. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological methods. Major efforts have been made to develop vaccines against tick; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. In this sense, to understand the processes involved in embryonic development can help in the identification of additional targets to control this ectoparasite. Previously, an aspartic endopeptidase from tick eggs, named THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), was suggested to be involved in vitellin degradation. In this work, we have investigated the physiological role and additional chemical features of this protein. To identify the site and profiles of the THAP transcription, total RNA extracted from midgut, ovary and fat body from partially and fully engorged females and from eggs was analyzed by qRT-PCR. This analysis showed that THAP mRNA was transcripted in these three tissues. However, highest levels of transcriptions were found in fat body and midgut of fully engorged vitellogenic females. In eggs, THAP mRNA transcription was not detected. In order to investigate the presence of THAP protein in the tissues and eggs, an immunoblot analysis was conducted with an anti-nTHAP serum. The THAP protein was detected in the haemolymph, midgut and fat body and, in higher quantity, in the ovary of fully engorged females, and it was present throughout embryo development. The protein is synthesized as a higher molecular mass form (pro-endopeptidase) and after the onset of embryogenesis THAP is converted into an active form by autocatalysis. A recombinant THAP (rTHAP) was produced through cloning in pET43a vector and expression in Escherichia coli. After the purification the rTHAP was active upon fluorogenic substrate in a reaction specifically inhibit by pepstatin A. To investigate rTHAP vitellin-degradation activity, vitellin (VT) purified from 1-, 7- and 12-day-old eggs were incubated with rTHAP in a range of pHs (3.5, 4.0, 4.5 and 5.0). SDS-PAGE analysis showed that rTHAP is able to hydrolyze VT from 7-day-old eggs in pH 3.5 at 37ºC in a reaction that is heme-sensitive and inhibited by pepstatin A. Vitellins from eggs collected on the 1st and 12th days after oviposition were not hydrolyzed and in other pHs rTHAP activity was not efficient. These results suggest that THAP is synthesized in ovary and extra-ovarian site, stocked in ovary and incorporated by vitellogenic oocytes with a pro-endopeptidase. During embryogenesis, THAP was actived to the mature enzyme and play a role in tick vitellin processing.

L'embryon de la Drosophila Melanogaster subit une série des mouvements cellulaires pendant son développement. La gastrulation est le processus qui décrit la différentiation des futurs tissus à l'intérieur de l'embryon. La gastrulation commence par la formation du sillon ventral, un processus connu sous le nom de “Ventral Furrow Invagination”. Pendant ce processus, les cellules de la blastoderme positionnées dans la région ventrale de l'embryon, aplatissent et contractent leur surface apicale jusqu'à ce qu'elles deviennent prismatiques. Ce changement de forme cellulaire aboutit à un enfoncement au niveau de la région ventrale, le sillon ventral, qui est ensuite totalement intériorisé. Nous focalisons notre étude sur les mécanismes qui conduisent à l'invagination. Les questions principales auxquelles ce travail de thèse essaie de répondre sont: “Quel est le rôle de la contraction apicale des cellules ventrales dans l'invagination?” et “Quel est le mécanisme qui conduit à la clôture ventrale, une fois les cellules ventrales intériorisées?”. Nous essayons de répondre à ces questions d'un point de vue biomécanique. Dans ce but, un maillage 3D de l'embryon de la Drosophila Melanogaster a été créé. Basés sur ce maillage, deux modèles biomécaniques “a minima” de l'embryon de la Drosophila ont été créés: un modèle physique discret et un modèle basé sur la Méthode des Eléments Finis. Les résultats des simulations des deux modèles montrent que la géométrie joue un rôle décisif dans l'intériorisation des cellules ventrales. Les deux modèles ont permis de simuler l'intériorisation des cellules ventrales mais se trouvent incapables de simuler la clôture ventrale. Notre hypothèse est que la clôture ventrale peut s'expliquer par l'intéraction des forces développées à l'intérieur de l'embryon, une fois que les cellules ventrales commencent à proliférer. Nous proposons une méthode pour diviser des éléments dans un maillage d'éléments finis et ensuite nous expliquons l'intégration de cette méthode dans le modèle des Eléments Finis pour l'embryon de la Drosophila Melanogaster. / The embryo of the Drosophila Melanogaster undergoes a series of cell movements during its early development. Gastrulation is the process describing the segregation of the future internal tissues into the interior of the developing embryo. Gastrulation starts with the formation of the ventral furrow, a process commonly known as the ventral furrow invagination. During this process, the most ventrally located blastoderm cells flatten and progressively constrict their apical sides until they are wedge shaped. As a result of these cell-shape changes, the blastoderm epithelium first forms an indentation, the ventral furrow, which is then completely internalized. We focus on the study of the mechanisms that drive the invagination. The main questions that gave birth to this thesis are: “What is the role of the apical constriction of the ventral cells in the invagination?” and “Once the ventral cells are internalized, what is the mechanism that drives the ventral closure?” We attempt to answer to these two questions from a biomechanical point of view. For this purpose, a 3D mesh of the embryo of the Drosophila Melanogaster has been created. Based on this mesh, two “a minima” biomechanical models of the Drosophila embryo have been created, a physically based discrete model and a model based on the Finite Element Method. The results of the simulations in both models show that the geometry of the embryo plays a crucial role in the internalization of the ventral cells. The two models efficiently simulate the internalization of the ventral cells but are incapable of reproducing the ventral closure. We hypothesize that the ventral closure can be explained by the interplay of forces developed in the embryo once the internalized ventral cells undergo cell division. We propose an approach to divide elements in a Finite Element Mesh and we integrate it to the Finite Element Model of the Drosophila Melanogaster.

Made available in DSpace on 2015-03-26T12:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2286182 bytes, checksum: 07252744b8ec020f06d0a67c3c49bc67 (MD5) Previous issue date: 2009-11-13 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The study aimed to establish an efficient protocol for somatic embryogenesis of the oil palm, especially all of cultivars explored in Brazil, as well as to acomplish the anatomical caracterization of the embryogenic process. For induction of somatic embryogenesis we used two explants types, leaves segments and female inflorescences, resulting in two experiments. In the first experiment, sections of the 5 mm in immature leaves from two oil palm genotypes (G1001 e G2301) of 1,5 years of age were inoculated in culture medium Y3 (Eeuwens, 1978) supplemented with 0.3% activated charcoal and 2,4-D at four concentrations (800, 1000, 1200 and 1400 µM). Higher percentage of callus induction was obtained in G2301 leaf explants submitted to the concentration 800 µM of 2,4-D. The obtaining of pro-embryogenic masses starting of the calli occurred in medium supplemented with 9 µM 2,4-D added to 1000 µM putrescine or 100 µM spermine. A higher percentage of regeneration of somatic embryos occurred from pro-embryogenic masses that were pre-conditioned and inoculated on regeneration medium supplemented with 0.045 µM 2,4-D and 1000 µM putrescine. The somatic embryos regenerated exhibited characteristic protoderm, procambium strands and shoot meristem and germinated in culture medium Y3 added 0.54 µM ANA and 1000 µM putrescine. The seedlings showed simultaneous development of shoot and root and 70.4% of plants could be successfully acclimatized. In the second experiment, rachillas taken from immature female inflorescences in two developmental stages were inoculated in different culture media (MS and Y3), the supplemented with 475 µM of different auxins (Picloram and 2,4-D) and 0.3% activated charcoal . The development of flowers occurred after 120 days of inoculation in vitro, depending on the developmental stage of the inflorescence and the growing medium. The flowers formed in Y3 culture medium were detached from rachillas and inoculated in the same culture medium with reduced auxin concentrations for 9 µM being combined or not with 1000 µM of putrescine. After 60 days, greater callus formation occurred in flowers grown in medium supplemented with 9 µM Picloram combined with 1000 µM of putrescine. The regeneration of somatic embryos occurred after reduction at 100 times the concentration of auxin in the culture medium, maintaining the same concentration of putrescine. Embryos showed protoderm well defined, delimiting a homogeneous mass of cells corresponding to the ground meristem, interspersed with well-defined procambium strands. By means of histological analysis it was found that the formation occurred from the perivascular regions in the gynoecium and embryo formation occurred from the regions of meristematic callus, following the multicellular pattern. / O trabalho teve como objetivos estabelecer um protocolo eficiente para embriogênese somática do dendezeiro, sobretudo de cultivares exploradas no Brasil, bem como realizar a caracterização anatômica do processo embriogênico. Para a indução da embriogênese somática utilizou-se dois tipos de explantes, segmentos foliares e inflorescências femininas, resultando em dois experimentos. No primeiro experimento, secções de 5 mm de folhas imaturas retiradas de dois genótipos (G1001 e G2301) de dendê de 1,5 ano de idade foram inoculadas em meio de cultura Y3 (Eeuwens, 1978), adicionado de 0,3% de carvão ativado e quatro concentrações de 2,4-D (800, 1000, 1200 e 1400 µM). Maior porcentagem de indução de calos foi obtida em explantes foliares do G2301 submetidos à concentração 800 µM de 2,4-D. A obtenção de massas pró-embriogênicas a partir dos calos ocorreu em meio suplementado com 9 µM de 2,4-D adicionado de 1000 µM putrescina ou 100 µM espermina. Maior porcentagem de regeneração de embriões somáticos ocorreu a partir de massas pró-embriogênicas que passaram pelo pré- condicionamento e foram inoculadas em meio de regeneração adicionado de 0,045 µM 2,4-D e 1000 µM putrescina. Os embriões somáticos regenerados exibiram protoderme característica, cordões de procâmbio e meristema apical e germinaram em meio de cultura Y3 adicionado de 0,54 µM ANA e 1000 µM putrescina. As plântulas obtidas apresentaram desenvolvimento simultâneo de parte aérea e radícula, e puderam ser aclimatizadas, sendo de 70,4% a porcentagem de plantas obtidas. No segundo experimento, ráquilas retiradas de inflorescências femininas imaturas, em dois estágios de desenvolvimento foram inoculadas em diferentes meios de cultivo (MS e Y3), adicionado de 475 µM de diferentes auxinas (Picloram e 2,4-D) e 0,3% de carvão ativado. O desenvolvimento das flores ocorreu após 120 dias da inoculação in vitro, em função do estágio de desenvolvimento da inflorescência e do meio de cultivo utilizado. As flores formadas em meio de cultivo Y3 foram destacadas das ráquilas e inoculadas em mesmo meio de cultivo com redução da concentração das auxinas para 9 µM sendo combinadas ou não com 1000 µM de putrescina. Após 60 dias, maior formação de calos ocorreu em flores cultivadas em meio adicionado de 9 µM Picloram combinado com 1000 µM de putrescina. A regeneração dos embriões somáticos ocorreu após a redução em 100 vezes na concentração de auxina no meio de cultivo, sendo mantida a mesma concentração de putrescina. Os embriões apresentaram protoderme bem definida, delimitando uma massa homogênea de células correspondentes ao meristema fundamental, entremeada por cordões procambiais bem definidos. Por meio da análise histológica verificou-se que a formação de calos ocorreu a partir das regiões perivasculares no gineceu e a formação dos embriões ocorreu a partir das regiões meristemáticas destes calos, seguindo o padrão multicelular.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2068629 bytes, checksum: eb96e9d8515f536c1ff0792a31972219 (MD5) Previous issue date: 2010-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this work, the propagation in vitro of Anthurium andraeanum cv. Eidibel through somatic embryogenesis was investigated, evaluating the induction of the embryogenic cultures (Experiment I); pre-maturation of the somatic embryos (Experiment II); and maturation of the somatic embryos with subsequent regeneration of the plants (Experiment III). In Experiment I, the subdivision of plants of anturio established in vitro was used, to obtain the explant sources. Analyzed in DIC with factorial 5 x 5 x 5, with five explant types (whole leaves were cut across the midrib of leaves; petioles; stem segments with one bud; and root segment without the apex radicular; each explant was cut into pieces of about 1.0 cm); five auxins (Picloram, ANA, AIB, 2.4-D and Picloram) in five concentrations (0.0; 2.5; 5.0; 7.5 and 10.0 μM) and five additional witness, in other words, each explant source added to the treatment without auxin. The repetition was composed by five Petri dishes (90 x 15 mm), containing 25 mL of Pierik medium, and each unit experimental nine explant/placa. Cultures were maintained in growth room, at 25 ± 2 ºC, in the darkness. After 60 days of cultivation, it was evaluated the presence of embryogenic cultures, shoots, roots and mass of the produced callus. The production of the first callus was observed in petioles and stem explants, and its production was in average containing 7.5 μM ANA and 10.0 μM Picloram. In the concentrations of 10.0 μM, there was no different statistics among the treatments with the auxins ANA, 2.4-D and Picloram, being superior to the others. For the production of shoots, the explant with the largest average was the stem segments, in average without the auxins. The proliferation of roots was observed in stem segments and roots explants, mainly in average with AIB. Histochemistry analysis were determined, through the double stained with acetocarmine and Evan's blue and lugol test. However, it was observed in histological cuts that the callus produced in Pierik medium containing 10.0 μM of ANA presented well developed embryos, with protoderm and procambium, with polarization signs. For the proliferation of the embryogenic cultures, the subdivision of the selected callus was accomplished, and inoculated in Petri dishes with Pierik medium containing 10.0 μM of ANA, in five successive subcultures, with 60 days each. In the experiment II, the callus was inoculated, produced in the proliferation of the embryogenic cultures, with about 90 mg weight, in Erlenmeyers of 125 mL, containing 25 mL of average liquid , Pierik and AA2, with different concentrations of 2.4-D (0.00; 4.52; 9.05 μM) and kinetin, (0.00; 0.47; 2.32 μM), analyzed in DIC with factorial 2 x 3 x 3, maintained at growth room at 25 ± 2 ºC, in the darkness, staying under orbital agitation of 100 rpm. After 45 days of cultivation, it was evaluated a mass of the embryogenic callus; production of somatic embryos; production of secondary somatic embryos; oxidation percentage; coloration, texture of the embryogenic callus and development of the somatic embryos produced. The production of somatic embryos was better in Pierik medium with 0.47 μM of kinetin, being observed a smaller production of secondary somatic embryos, smaller oxidation percentage, with friable texture of the callus, being one of the treatments with larger development of the embryos, proven for the histological cuts, in which it was observed embryos in the globular stadium, with polarization signs, even mature embryos, with the presence of primary leaf and meristematic zone. In the Experiment III, the callus produced were inoculated in Erlenmeyers containing 25 mL of liquid and semi-solid medium, Pierik and AA2, suplemented with the kinetin concentrations (0.0; 1.16; 2.32; 4.64 μM), analyzed in DIC with factorial 2 x 2 x 4. Cultures were maintained under a 16 hours of light, photoperiod at 36 μmol m-2 s-1 provided by cool white fluorescent lamps at 25 ± 2 ºC. The liquid medium staying under orbital agitation of 100 rpm. After 45 days of cultivation, it was evaluated the number of callus with mature embryos; percentage of conversion of plants; oxidation percentage; and number of embryos with complete maturation. Pierik medium containing 2.32 μM of kinetin is recommended, in which, it was much better to the number of embryogenic callus with mature embryos, number of embryos with complete maturation and for the best conversion in plants. The plants were acclimatized ex vitro in the bench of the laboratory and transferred, in the end of two months to a greenhouse. The present study evidenced that the induction and proliferation of embryogenic cultures starting from stem segmentswere dependent on the type and concentration of the auxins. For the pre-maturation and maturation of the somatic embryos, it is necessary the retreat or the reduction of the auxin in the medium, adding ideal concentrations of cytokinins, and obtaining high conversion of the somatic embryos in plants, in the final process. / O presente trabalho teve como objetivo estabelecer a propagação in vitro de Anthurium andraeanum cv. Eidibel via embriogênese somática, avaliando a indução das culturas embriogênicas (Experimento I); pré-maturação dos embriões somáticos (Experimento II); e maturação dos embriões somáticos e posterior regeneração das plantas (Experimento III). No experimento I, adotou-se a subdivisão de plantas de antúrio estabelecidas in vitro, para a obtenção das fontes de explante. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado (DIC), em disposição fatorial 53, representados por cinco tipos de explantes (folhas inteiras e seccionadas ao meio; pecíolos; segmentos nodais com uma gema; e segmento de raiz sem o ápice radicular; cada explante com ~ 1,0 cm); cinco auxinas (AIA, ANA, AIB, 2,4-D e Picloram) em cinco concentrações (0,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10 μM) e cinco testemunhas adicionais, ou seja, cada fonte de explante adicionada ao tratamento sem auxina. A repetição foi composta por cinco placas de Petri (90 x 15 mm), contendo 25 mL de meio Pierik, e cada unidade experimental nove explantes/placa, mantidas em sala de crescimento, a 25 ± 2 ºC, no escuro. Após 60 dias de cultivo, avaliou-se a presença de calos embriogênicos, brotos, raízes e massa freca dos calos produzidos. A produção dos primeiros calos foi observada em explantes de pecíolo e segmento nodal, e a sua produção ocorreu, principalmente, nos meios acrescidos de ANA e Picloram, nas concentrações de 7,5 e 10,0 μM, respectivamente. Em 10,0 μM, não houve diferença estatística entre os tratamentos com as auxinas ANA, 2,4-D e Picloram, sendo superiores aos demais. Para a produção de brotos, o explante com a maior média foi o segmento nodal, em meio sem a adição de auxina. Observaram-se a proliferação de raízes em explantes de segmento nodal e radicular, principalmente em meio suplementado com AIB. A partir de análise histoquímica, determinaram-se, por meio da dupla coloração com carmim acético e azul de Evans e teste de lugol, características embriogênicas dos calos. No entanto, observou-se em cortes histológicos que os calos produzidos em meio Pierik acrescido de 10,0 μM de ANA apresentaram embriões bem desenvolvidos, com presença de procâmbio e protoderme, demostrando sinais de polarização. Para a proliferação das culturas embriogênicas, foi adotada a subdivisão dos calos selecionados, e inoculados em placas de Petri com meio de cultura Pierik acrescido de 10,0 μM de ANA, em cinco subcultivos sucessivos, com 60 dias cada. No experimento II, foram inoculados os calos produzidos na fase de proliferação, com cerca de 90 mg, em Erlenmeyers de 125 mL, contendo 25 mL de meio de cultura líquido, Pierik e AA2,com diferentes concentrações de 2,4-D (0,00; 4,52; 9,05 μM) e cinetina, (0,00; 0,47; 2,32 μM), analisados em DIC com fatorial 2 x 3 x 3, mantidos em sala de crescimento a 25 ± 2 ºC, no escuro, permanecendo sob agitação orbital de 100 rpm. Avaliadas aos 45 dias de cultivo, quanto a: massa dos calos embriogênicos; produção de embriões somáticos; produção de embriogênese somática secundária; porcentagem de oxidação; coloração, textura dos calos embriogênicos e desenvolvimento dos embriões somáticos produzidos. A produção de embriões somáticos foi superior no meio Pierik acrescido de 0,47 μM de cinetina, observando-se a menor produção de embriogênese somática secundaria, menor porcentagem de oxidação, com textura friável dos calos, sendo um dos tratamentos com maior desenvolvimento dos embriões, comprovado pelos cortes histológicos, no qual observaram embriões no estádio globular, com sinais de polarização, até embriões maturados, com a presença de folha primária e zona meristemática. No Experimento III, os calos produzidos na fase de pré-maturação foram inoculados, em Erlenmeyers contendo 25 mL de meio líquido e semi-sólido, Pierik e AA2, suplementados com as concentrações de cinetina (0,0; 1,16; 2,32; 4,64 μM), formando um DIC com fatorial 2 x 2 x 4, mantidos em sala de crescimento, a 25 ± 2 ºC, sob fotoperíodo de 16 horas, irradiância luminosa de 36 μmol m-2 s-1. Os meios líquidos permaneceram sob agitação orbital de 100 rpm. Avaliou-se aos 45 dias de cultivo quanto ao número de calos com embriões maturados; porcentagem de conversão em plantas; porcentagem de oxidação; e número de embriões com maturação completa. Recomenda-se o meio Pierik suplementado com 2,32 μM de cinetina, no qual, foi superior para o número de calos embriogênicos com embriões maturados, número de embriões com maturação completa e principalmente pela melhor conversão em plantas. As plantas produzidas foram aclimatizadas ex vitro na bancada do laboratório e transferidas, no final de dois meses, para casa de vegetação. O presente estudo evidenciou que a indução e proliferação de calos embriogênicos a partir de segmentos nodais de antúrio foi dependente do tipo e da concentração das auxinas. Para as fases de pré-maturação e maturação dos embriões somáticos, é necessária a retirada ou a redução da auxina no meio de cultura, adicionando concentrações ideais de citocinina para cada fase, e assim, obtendo máxima conversão dos embriões somáticos em plantas, no final do processo.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Coffee breeding through convention methods, especially hybridization, followed by population selection, progeny evaluation, back-crossings and inter-specific crossings is a time consuming process that can demand for more than 30 years to obtain a new cultivar. It is possible to reduce this time by producing homozygous lines, from di-haploids, obtained from anther culture. This study applied anther culture technique on different Coffea arabica L. cultivars to induce the formation of calli and regenerate di-haploid germlings. The experiments were done in the Vegetable Biotechnology Laboratory of Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Experiment 1: Flower buds of cultivars Mundo Novo LCP-379-19 and Catuaí Vermelho H2077-2-5-44 were collected, disinfested and the anthers were inoculated in MS supplemented with 2.0 mgL-1 de 2,4-D and AAS at de 0.0, 8.0, 16.0, 32.0 or 64.0 mgL-1. Experiment 2: Calli of Catuaí Vermelho 44 were transferred to MS amended with different concentration of BAP (0.0, 2.0, 4.0 or 8.0 mgL-1) and 2,4-D (0.0, 1.0, 2.0 or 4.0 mgL-1). Experiment 3 (1st part): Flower buds of cultivar Catuaí Vermelho 99 were collected, disinfested and the anthers inoculated in MS amended with 2 mgL-1 2,4-D in the absence or presence of 5 mgL-1 silver nitrate together with ETHREL for different days: control (0), 2, 4, 6, or 8 days. (2nd part): After 12 days, the anthers were transferred to a regeneration medium, amended with 0.108 mgL-1 kinetin. A greater anther exposition time to ethylene, or longer inoculation time, favored the oxidation, and the alone ethylene favored formation of calli, Catuaí Vermelho 99 is responsive to intumescence, to calli formation and, also, to direct embryogenesis, in the presence of ethylene; AgNO3 together with ethepon, favored anther intumescence and calli formation; AgNO3 together with 2.0 mg L-1 2,4-D, promoted direct embryogenesis, for Catuaí Vermelho 44, the treatment with 2.0 mgL-1 2,4-D and 0.0 mgL-1 AAS was the one that presented the greatest average of calli formation; for both Mundo Novo and Catuaí Vermelho 44 the increase in AAS concentration decreased the pro-embryo formation in the calli; auxin, by itself, was capable of promoting the formation of friable calli, however the balance of the auxin and the BAP used in the work, had favored the production of friable calli. / O melhoramento genético do cafeeiro por meio de métodos convencionais, principalmente hibridação, seguida da seleção de populações, avaliação de progênies, retrocruzamentos e cruzamentos interespecíficos, é um processo demorado, podendo levar mais de 30 anos para se obter uma nova cultivar. A redução deste tempo é possível por meio da produção de linhagens homozigóticas, oriundas de dihaplóides obtidas através da cultura de anteras. O objetivo foi aplicar a técnica da cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea arabica L. para induzir a formação de calos e regenerar plântulas dihaplóides. Os experimentos foram conduzidos no laboratório de Biotecnologia Vegetal da Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Experimento 1: Botões florais dos cultivares Mundo Novo LCP-379-19 e Catuaí Vermelho H2077-2-5-44 foram coletados, desinfestados e as anteras inoculadas em meio MS suplementado com 2,0 mgL-1 de 2,4-D e AAS nas concentrações de 0,0; 8,0; 16,0; 32,0 e 64,0 mgL-1. Experimento 2: Calos de Catuaí Vermelho 44 foram subcultivados em meio MS acrescido de diferentes concentrações de BAP (0,0; 2,0; 4,0 e 8,0 mgL-1) e 2,4-D (0,0; 1,0; 2,0 e 4,0 mgL-1). Experimento 3 (1ª parte): Botões florais do cultivar Catuaí Vermelho 99 foram coletados, desinfestados e as anteras inoculadas em meio MS acrescido de 2 mgL-1 de 2,4-D na ausência e presença de 5 mgL-1 de nitrato de prata juntamente com etileno por diferentes dias: testemunha, 2, 4, 6, e 8 dias. (2ª parte): Ao final de 12 dias, as anteras foram transferidas para um meio de regeneração, acrescido de 0,108 mgL-1 de cinetina. Um maior tempo de exposição das anteras ao etileno favoreceu a oxidação, e o etileno sozinho favoreceu a formação de calos, a cv. Catuaí Vermelho 99 foi responsiva á formação de calos e também á embriogênese direta, na presença de etileno, o AgNO3 agiu como inibidor de contaminantes e juntamente com etileno, favoreceu a calosidade das anteras da cv. Catuaí Vermelho 99, o AgNO3 juntamente com 2,0 mg L-1 de 2,4-D podem promover embriogênese direta, tanto para Mundo Novo quanto para Catuaí Vermelho 44 o aumento das concentrações de AAS diminuiu a formação de próembrióides nos calos e o 2,4-D sozinho foi capaz de promover a formação de calos friáveis, porém o equilíbrio da auxina e da citocinina (BAP) utilizadas no trabalho, favoreceram a produção de calos friáveis. / Mestre em Agronomia

Nuclear architecture and gene expression in Caenorhabditis elegans Mgr. Jitka Bolková ABSTRACT The parental genomes are initially separated in each pronucleus after fertilization. During the first mitosis this spatial distribution is being disintegrated. In my thesis we used green-to-red phoroconversion of Dendra2-H2B-labeled pronuclei to distinguish maternal and paternal chromatin domains and to track their distribution in space in living Caenorhabditis elegans embryos starting shortly after fertilization. Both of the parental chromatin domains within the nucleus are separated in the zygote and at the 2-cell stage. Intermingling occurs first after chromatin decondensation at the beginning of the cell cycle at the 4-cell stage. To our knowledge, we report to the first live observation of the separation and subsequent mixing of parental chromatin during embryogenesis. Following of the photoconverted chromatin also allowed us to detect a reproducible 180ř rotation of the nuclei during cytokinesis of the zygote. Tracking of fluorescently-labelled P granules and polar bodies showed that the entire embryo rotates during the first cell division. In the second part of the thesis we used the C. elegans model to investigate relationship between nuclear architecture and gene expression. We focused on localization of...

Submitted by Onia Arantes Albuquerque (onia.ufg@gmail.com) on 2018-10-19T15:16:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Silênio Souza Reis - 2018.pdf: 3761275 bytes, checksum: a116ca60c456d780cfa9ea5e3dc8363c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-22T11:16:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Silênio Souza Reis - 2018.pdf: 3761275 bytes, checksum: a116ca60c456d780cfa9ea5e3dc8363c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-22T11:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Silênio Souza Reis - 2018.pdf: 3761275 bytes, checksum: a116ca60c456d780cfa9ea5e3dc8363c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-09-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The low-power LASER is a technology used in the area of ​​health as adjuvant therapy for various diseases. The use of conservative therapies as adjuncts to drug therapy, aim to potentiate therapeutic responses. There are currently some contraindications for the use of LASER in treatments of human patients with open wounds, tumor region and gravid uterus. Thus, zebrafish (D. rerio) is a consolidated organism as an experimental model in the biological, biomedical and environmental areas. The objective of the present work is to evaluate the development of embryos and larvae of zebrafish (D. rerio) exposed to low-power LASER. The LASER III flash with transverse beam output 0,028 cm2, power 100 mW, creep 35, 70 and 140 J / cm2, total energy of 1, 2 and 4 J (Joules), InGaAlP active medium, was used. The data were evaluated according to the normality behavior of Lilliefors using Fisher's exact test, t-test, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis (post hoc-Dunn) and Linear Regression by the ORIGIN 7.0 program. The cumulative mortality rate and hatching in embryos (D. rerio) exposed to the LASER in the red spectrum 660 nm and infrared 830 nm 1, 2 and 4 J from 24 - 24 h to 96 hpf was not statistically significant in relation to the wavelength in energy doses in Joules (p ˃ 0,05), infrared laser 830 nm 4J, did not interfere in the development of embryos and larvae (D. rerio), when exposed from 24 - 24 h for a period of 216 hpf. The cumulative mortality rate in the control group was 23 % higher than in the LASER group and the hatching rate in the LASER group was statistically significant (p ˂ 0,05). The cumulative mortality rate in embryos and larvae (D. rerio) when exposed intensively to LASER was statistically significant, as was the hatching rate (p ˂ 0,05) for 96 hpf. There were no statistically significant differences for larval length between the control group compared to the LASER group 24 - 24 h and intensive LASER (p ˃ 0,05). The rate of heart rate in the LASER group 24 - 24 h was statistically significant in relation to the control group and the intensive LASER group (p ˂ 0,05). The rate of spontaneous movements was statistically significant when compared to the control group and the intensive LASER group (p ˂ 0,05). The rate of edema in the control group was statistically significant in relation to the LASER group 24 - 24 h for 96 hpf (p ˂ 0,05). The rate of edema in the intensive LASER group was not statistically significant; however, as in the LASER group 24 - 24 h, the edema in the control group was higher than in the LASER group. The scarcity of theoretical reference on this theme reinforces the pioneering of this work carried out in vivo. The results of this study highlight the importance of the use of embryos and larvae (D. rerio) as a model system in biological, environmental and biomedical research. Data analysis suggests that contraindications for low-power LASER irradiation in patients during the gestational period should be reviewed. / O LASER de baixa potência é uma tecnologia utilizada na área da saúde como terapia coadjuvante a diversas doenças. A utilização de terapias conservadoras como coadjuvantes a terapia medicamentosa, visam potencializar as repostas terapêuticas. Atualmente há algumas contraindicações para utilização do LASER em tratamentos de pacientes humanos com feridas abertas, região tumoral e útero gravídico. Sendo assim, o zebrafish é um organismo consolidado como modelo experimental nas áreas biológica, biomédica e ambiental. O objetivo do presente trabalho é avaliar o desenvolvimento de embriões e larvas do zebrafish (D. rerio) expostos ao LASER de baixa potência. Utilizou-se o flash LASERIII com saída transversa do feixe 0,028 cm2, potência 100 mW, fluência 35, 70 e 140 J/cm2, energia total de 1, 2 e 4 J(Joules), meio ativo InGaAlP. Os dados foram avaliados segundo o comportamento de normalidade Lilliefors através dos testes Exato de Fisher, teste t, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis (post hoc-Dunn) e Regressão Linear pelo programa ORIGIN 7.0. A taxa de mortalidade acumulativa e eclosão em embriões (D. rerio) expostos ao LASER no espectro vermelho 660 nm e infravermelho 830 nm 1, 2 e 4 J de 24 - 24 h para 96 hpf não foi estatisticamente significativas em relação ao comprimento de onda em doses de energia em Joules (p ˃ 0,05), O LASER infravermelho 830 nm 4J, não interferiu no desenvolvimento de embriões e larvas (D. rerio), quando expostos de 24 - 24 h por um período de 216 hpf. A taxa de mortalidade acumulativa no grupo controle foi 23 % maior que no grupo LASER e a taxa de eclosão no grupo LASER foi estatisticamente significativa (p ˂ 0,05). A taxa de mortalidade acumulativa em embriões e larvas (D. rerio) quando expostos de forma intensiva ao LASER, foi estatisticamente significativa, assim como a taxa de eclosão (p ˂ 0,05) para 96 hpf. Não houve diferenças estatisticamente significativas para comprimento larval entre o grupo controle em relação ao grupo LASER 24 - 24 h e LASER intensivo (p ˃ 0,05). A taxa de batimentos cardíacos no grupo LASER 24 - 24 h foi estatisticamente significativo em relação ao grupo controle e ao grupo LASER intensivo (p ˂ 0,05). A taxa de movimentos espontâneos foi estatisticamente significativa, quando comparada ao grupo controle e ao grupo LASER intensivo (p ˂ 0,05). A taxa de edema no grupo controle foi estatisticamente significativa em relação ao grupo LASER 24 - 24 h para 96 hpf (p ˂ 0,05). A taxa de edema no grupo LASER intensivo não foi estatisticamente significativa, no entanto, assim como no grupo LASER 24 - 24 h, o edema no grupo controle foi maior que no grupo LASER. A escassez de referencial teórico sobre essa temática reforça o pioneirismo desse trabalho realizado in vivo. Os resultados desse estudo ressaltam a importância da utilização de embriões e larvas (D. rerio) como Sistema - modelo em pesquisas biológicas, ambientais e biomédicas. As análises dos dados sugerem que as contraindicações para irradiação com o LASER de baixa potência em pacientes durante o período gestacional sejam revistas.

Diaphorina citri depende dos endossimbiontes presentes em seu bacterioma, as bactérias Carsonella e Profftella, para o fornecimento de nutrientes essenciais ao seu desenvolvimento. D. citri também está associada à bactéria Wolbachia, que infecta inúmeros tecidos desse inseto, incluindo seu bacterioma. Esses simbiontes são transmitidos verticalmente, sendo incorporados ao bacterioma. Neste estudo, são abordados os eventos relacionados à formação do bacterioma, à dinâmica da densidade dos simbiontes durante o ciclo biológico do hospedeiro e à sensibilidade dos simbiontes ao estresse térmico. A morfogênese do bacterioma durante a embriogênese de D. citri foi descrita por meio de histologia e marcação com sondas oligonucleotídicas fluorescentes (FISH) específicas para os simbiontes do bacterioma. No início da embriogênese, as bactérias permanecem agrupadas em uma massa no polo posterior do ovo. Vitelófagos se aderem à massa de simbiontes no início da blastulação, precedendo à formação dos bacteriócitos. O bacterioma transitório resultante possui bacteriócitos que contém o simbionte do sincício (Profftella), localizado externamente aos que contém o simbionte do bacteriócito (Carsonella). Na sequência do desenvolvimento, ocorre a reorganização dos bacteriócitos, evento seguido pela formação da região sincicial. O bacterioma é movido para a região abdominal do embrião durante a catatrepsis, passando ao formato trilobado típico ao final da embriogênese. A densidade dos simbiontes associados ao psílideo dos citros durante o seu desenvolvimento foi determinada por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). A densidade dos diferentes simbiontes, dada pela análise do número de cópias dos genes 16S rRNA (Carsonella e Profftella) e ftsZ (Wolbachia), revelaram o crescimento contínuo dos simbiontes ao longo do desenvolvimento do hospedeiro. As curvas e taxas de crescimento dos simbiontes, estimadas por meio da equação de Gompertz, indicaram relação inversamente proporcional à especificidade das relações simbiontehospedeiro e o tempo para atingir a taxa máxima de crescimento. A densidade de Carsonella foi significativamente menor daquela de Profftella em todos os estágios analisados, apesar da tendência de aumento paralelo. As taxas de crescimento de Wolbachia foram similares às de Carsonella, mas a densidade foi inferior. Nos adultos, a densidade dos três simbiontes foi maior nos machos. Entretanto, esses simbiontes continuaram a apresentar crescimento em fêmeas em atividade de oviposição, mesmo com a sua incorporação aos oócitos, o que diverge da diminuição normalmente observada em outros sistemas. Os simbiontes de D. citri responderam de forma variável ao estresse térmico. Os diferentes simbiontes apresentaram resposta própria aos diversos períodos de exposição às diferentes condições térmicas de estresse. Ainda, foi detectada a influência de um simbionte na capacidade de resposta do outro, demonstrando a existência de mecanismos de comunicação e regulação entre os simbiontes de D. citri. O estudo demonstra a influência do estresse térmico sobre a densidade dos simbiontes e a necessidade de se compreender melhor a biologia das interações insetosimbiontes e a dinâmica das relações com o ambiente. / Diaphorina citri feeds on phloem-sap and depends on bacterial symbionts harbored in the bacteriome as a supplementary source of nutrients lacking in the diet. These bacteria are vertically transmitted, being incorporated into the developing bacteriome. Here, we focus on the events related to bacteriome morphogenesis, symbiont density during host development and the effects of exposure to high temperatures on the establishment of endosymbionts during immature development. The bacteriome morphogenesis during D. citri embryogenesis was investigated by means of histology and fluorescence in situ hybridization analysis (FISH) using symbiont-specific oligonucleotide probes. During early embryogenesis, the bacteria remain aggregated in a symbiont-ball at the posterior pole of the egg. Vitellophages adhere to the symbiont mass during early blastulation, preceding bacteriocyte formation. As a result, the transient bacteriome has the bacteriocytes that harbors the syncytium symbiont (Profftella) arranged externally to those harboring Carsonella. The bacteriome is moved to the embryo abdominal region as a result of katatrepsis, becoming trilobated during the later embryonic development. The infection density of the endosymbionts associated to the Asian citrus psyllid was determined using real-time quantitative PCR (qPCR), throughout the host life cycle. Copy number of genes 16S rRNA (Carsonella and Profftella) and ftsZ (Wolbachia), revealed the continuous growth of symbionts during host development. Growth curves and rates of symbionts estimated using the Gompertz equation indicated an inversely proportional correlation between the degree of symbiont cospeciation with the host and the time to achieve the maximum growth rate. Carsonella density was significantly lower than that of Profftella at all stages analyzed, despite their joint growth trend. The growth rates of Wolbachia were similar to those of Carsonella, but Wolbachia had a lower density. In adults, the density of the three symbionts was higher in males. However, density in reproductive females remained high, despite the incorporation of symbionts in the oocytes. The increased density of symbionts in postreproductive adults contrasts with the decrease observed in other symbiotic systems. The infection density is mutually related to biological effects, but the symbiont may vary the response to heat stress. Density of Profftella and Carsonella was higher than that of Wolbachia, although there were different response patterns related to temperatures and treatment times. Symbionts associated with D. citri have their growth affected by the symbionts. This study demonstrates the effects of the heat shock on symbiont density during nymphal development and illustrates the need of further work the biology of insect-symbiont interactions and the dynamics of its relationships with the environment for a better understading of such associations.