Este trabalho teve por finalidade o desenvolvimento e validação de métodos para análise estereosseletiva de alguns fármacos e metabólitos, bem como a aplicação desses métodos na avaliação do potencial de fungos, principalmente endofíticos, em processos de biotransformação. Os seguintes fármacos foram selecionados para esse estudo: fluoxetina, propranolol, omeprazol, oxibutinina e ibuprofeno. Para determinação simultânea dos enantiômeros da fluoxetina (FLX) e norfluoxetina (NFLX) em meios de cultura de fungos endofíticos, empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por absorção no ultravioleta, em um sistema com duas colunas em série, sendo uma de fase reversa (C18) e outra com fase estacionária quiral (Chirobiotic® V). A fase móvel foi composta por etanol: tampão acetato de amônio 15 mmol L-1, pH 5,90: acetonitrila (77,5: 17,5: 5, v/v/v) e a detecção foi realizada em 227 nm. A extração líquido-líquido foi empregada na preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 12,5 a 3750 ng mL-1 (r 0,996) para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 10%. Nas condições empregadas, os cinco fungos endofíticos estudados não foram capazes de promover a biotransformação da FLX (reação de demetilação). A eletroforese capilar foi empregada para análise enantiosseletiva do propranolol (PROP) e 4-hidroxipropranolol (4-OHPROP). A melhor condição de resolução dos enantiômeros foi encontrada com a aplicação de um planejamento experimental de Box-Behnken: solução de eletrólitos composta por tampão trietilamina / ácido fosfórico (TEA/H3PO4), 25 mmol L-1, pH 9,00, carboximetil--ciclodextrina 4% (m/v) como seletor quiral e análise realizada na voltagem de 17 kV. O método de extração líquido-líquido também foi empregado para preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 0,25 a 10,0 g mL-1 para 4-OHPROP e de 0,10 a 10,0 g mL-1 para PROP, apresentando coeficientes de correlação (r) 0,995 para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 15%. Os cinco fungos endofíticos em estudo se mostraram eficientes na biotransformação estereosseletiva do PROP, com maior formação do metabólito (-)-(S)-4-OHPROP. O fungo Glomerella cingulata (VA1), em especial, apresentou uma concentração de 1,745 g mL-1 do enantiômero (-)-(S)-4-OHPROP depois de 72 horas de incubação, ao passo que a formação do enantiômero (+)-(R)-4-OHPROP não foi observada. A utilização deste fungo em escalas ampliadas pode ser uma fonte promissora de obtenção do metabólito 4-OHPROP na forma enantiomericamente pura. A determinação simultânea de omeprazol (OMZ), 5-hidroxiomeprazol (5-HOMZ) e omeprazol sulfona (OMZ SUL) em meio de cultura Czapek Dox modificado ii tamponado foi realizada empregando um método rápido de análise por cromatografia líquida de ultra eficiência com detector por arranjo de diodos (UPLC / DAD), usando coluna monolítica de fase reversa e eluição por gradiente. OMZ, 5-HOMZ e OMZ SUL foram extraídos das amostras utilizando uma mistura de acetato de etila: t-butil metil éter (9: 1, v/v). A separação foi obtida empregando uma coluna RP 18 Chromolith Fast Gradient endcapped e fase móvel constituída por 0,15% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água (solvente A) e 0,15% (v/v) de TFA em acetonitrila (solvente B). Os tempos de retenção foram de 0,70 min para 5-HOMZ, 0,74 min para OMZ, 0,77 min para OMZ SUL e 0,91 min para o padrão interno (bupropiona, BUP). O método foi linear no intervalo de 0,2 a 10,0 g mL-1 (r 0,995) para todos os analitos. O processo de biotransformação foi realizado durante apenas 24 horas de incubação, por causa de problemas de estabilidade do OMZ. Por esse mesmo motivo, a biotransformação estereosseletiva não foi avaliada. Apenas três fungos apresentaram formação do metabólito 5-HOMZ, e dentre estes, apenas o fungo Botritis cinerea (BC) produziu esse metabólito em concentração superior ao limite de quantificação do método. A formação do metabólito OMZ SUL foi observada para todos os fungos, exceto para Glomerella cingulata (VA1) e Guignardia mangiferae (VA15). Esses fungos podem ser úteis para a obtenção dos metabólitos do OMZ, mas estudos detalhados do comportamento do fármaco nas condições de cultivo são necessários, uma vez que este substrato pode sofrer degradação em meio ácido e na presença de luz. A análise simultânea dos enantiômeros da oxibutinina (OXY) e da N-desetiloxibutinina (DEOB) em meio de cultura Czapek foi obtida empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (HPLC/UV). Os analitos foram separados usando coluna quiral Chiralpak AD e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: etanol: dietilamina (94: 4: 2: 0,05, v/v/v/v) e detectados em 210 nm. Um estudo piloto de biotransformação empregando os mesmos fungos e as condições de biotransformação utilizadas para os demais fármacos mostrou que não houve a formação do metabólito de interesse. Além disso, não houve uma diminuição significativa da concentração de OXY durante o período de incubação, o que poderia ser um indicativo da formação de outros metabólitos não monitorados nas condições de análise. Como a reação de desetilação da OXY para formar a DEOB não foi observada nos experimentos, não foi necessário realizar a validação do método analítico. A separação simultânea do ibuprofeno (IBP), dos enantiômeros do 2-hidroxi-ibuprofeno (2-OH-IBP) e dos estereoisômeros do carboxi-ibuprofeno (COOH-IBP) foi realizada empregando-se uma coluna Chiralpak AS-H e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: TFA (95: 5: 0,1, v/v/v). O solvente extrator usado na extração líquido-líquido foi uma mistura de hexano: acetato de etila (1: 1, v/v). A detecção foi feita por espectrometria de massas (MS/MS), com a fonte de ionização por eletronebulização operada no modo positivo (ESI+). O método foi linear nos intervalos de 0,1 a 20,0 g mL-1 para IBP, de 0,05 a 7,5 g mL-1 para o cada enantiômero do 2-OH-IBP e de 0,025 a 5,0 g mL-1 para cada estereoisômero do COOH-IBP. Os demais parâmetros de validação obtidos para o método apresentaram-se dentro dos limites recomendados pela literatura. Os sete fungos endofíticos estudados se mostraram eficientes na biotransformação do IBP em seu principal metabólito 2-OH-IBP, mas apenas os fungos Nigrospora sphaerica (SS67) e Chaetomium globosum (VR10) iii biotransformaram o IBP de forma enantiosseletiva mais acentuada, observando-se maior formação do metabólito ativo (+)-(S)-2-OH-IBP. A não estereosseletividade observada para os demais fungos pode ser indício de uma possível conversão quiral do fármaco, similar a que ocorre em humanos. A formação dos estereoisômeros do COOH-IBP não foi observada, provavelmente, porque sua rota de formação envolve uma seqüência de reações. Os resultados apresentados nesse trabalho mostram que fungos, particularmente os endofíticos, podem ser uma fonte promissora para obtenção de metabólitos de fármacos, inclusive de forma enantiomericamente pura. / This work aimed the development and validation of suitable methods for the stereoselective analysis of some drugs and metabolites, as well as, the application of these methods to assess the potential of fungi, mainly the endophytic ones, in biotransformation processes. The following drugs were selected for this study: fluoxetine, propranolol, omeprazole, oxybutynin and ibuprofen. The simultaneous determination of fluoxetine (FLX) and norfluoxetine (NFLX) enantiomers in culture media of endophytic fungi was carried out by high-performance liquid chromatography with UV-detection, in a system of two columns coupled in series, in which one of them was a reversed phase (C18) column and the another one was a chiral stationary phase column (Chirobiotic ® V). The mobile phase consisted of ethanol: ammonium acetate buffer, 15 mol L-1, pH 5.90: acetonitrile (77.5: 17.5: 5, v/v/v) and the detection was performed at 227 nm. Liquid-liquid extraction was employed for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 12.5 to 3750 ng mL-1 (r 0.996) for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of method precision and accuracy were lower than 10%. In the studied conditions, the five endophytic fungi used were not able to perform the biotransformation of FLX (demethylation reaction). Capillary electrophoresis was employed for the enantioselective analysis of propranolol (PROP) and 4-hydroxypropranolol (4-OHPROP). The best condition for enantiomer resolution was obtained by applying an experimental design of Box-Behnken: electrolyte solution composed of triethylamine / phosphoric acid (TEA/H3PO4) buffer, 25 mmol L-1, pH 9.00, with 4% (w/v) carboxymethyl--cyclodextrin as the chiral selector and analysis performed at 17 kV. Liquid-liquid extraction was also used for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 0.25 to 10.0 g mL-1 for 4-OHPROP and 0.10 to 10.0 g mL-1 for PROP, presenting correlation coefficients (r) 0.995 for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of precision and accuracy were lower than 15%. All the five endophytic fungi (Phomopsis sp. (TD2), Glomerella cingulata (VA1), Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globosum (VR10) and Aspergillus fumigatus (VR12)) showed effectiveness in the stereoselective biotransformation of PROP, with higher formation of (-)-(S)-4-OH-PROP. The fungus Glomerella cingulata (VA1), in particular, showed a concentration of 1.745 g mL-1 for the enantiomer (-)-(S)-4-OHPROP after 72 hours of incubation, whereas there was no formation of the enantiomer (+)-(R)-4-OHPROP. Therefore, the use of this fungus in large scale may be a promising source to obtain 4-OHPROP in the enantiomerically pure form. A fast analytical method based on ultra-performance liquid chromatography / diode array detector (UPLC/DAD) using a monolithic reversed phase column and gradient elution was developed for the simultaneous determination of omeprazole (OMZ), 5-hydroxyomeprazole (5-HOMZ) and omeprazole sulfone (OMZ SUL) in modified and buffered Czapek-Dox culture medium. OMZ, 5-HOMZ and OMZ SUL were extracted using a mixture of ethyl acetate: methyl t-butyl ether (9: 1, v/v). The separation was achieved using a Chromolith Fast Gradient RP 18 endcapped column with the mobile phase consisting of 0.15% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA) in water (solvent A) and 0.15% (v/v) TFA in acetonitrile (solvent B). Retention times were 0.70 min for 5-HOMZ, 0.74 min for OMZ, 0.77 min for OMZ SUL and 0.91 min for internal standard (bupropion, BUP). The method was linear over the concentration range of 0.2 to 10.0 g mL-1 (r 0.995) for all analytes. The biotransformation process was carried out only within 24 hours of incubation, due to OMZ instability. For the same reason, the stereoselectivity in this process was not evaluated. The formation of the metabolite 5-HOMZ was observed only for three fungi, and among them, only the fungus Botrytis cinerea (BC) produced this metabolite in concentrations higher than the limit of quantification. The formation of OMZ SUL was observed for all fungi, except for Guignardia mangiferae (VA1) and Glomerella cingulata (VA15). The fungi evaluated in this study can be useful to obtain the metabolites of OMZ, but detailed study of the drug stability in culture conditions is required, since this substrate can undergo degradation in acidic conditions and in the presence of light. The simultaneous analysis of oxybutinin (OXY) and N-desethyloxybutinin (DEOB) enantiomers in Czapek culture medium was carried out by liquid chromatography with UV detection (HPLC/UV). The analytes were separated using a Chiralpak AD column employing as mobile phase hexane: isopropanol: ethanol: diethylamine (94: 4: 2: 0.05, v/v/v/v) and detection at 210 nm. A pilot study of biotransformation using the same fungi and conditions employed for the biotransformation of the other drugs showed that the metabolite of interest was not formed. Moreover, the decrease in the concentration of OXY, which could be indicative of the formation of other metabolites not monitored under the conditions of analysis, was not observed. Since the reaction of OXY desethylation to form DEOB was not observed in the experiments, the validation of the analytical method was not required. The method for the simultaneous analysis of ibuprofen (IBP), 2-hydroxyibuprofen (2-OH-IBP) enantiomers and carboxyibuprofen (IBP-COOH) stereoisomers was developed using a Chiralpak AS-H column and a mobile phase consisting of hexane: isopropanol: TFA (95: 5: 0.1, v/v/v). A mixture of hexane: ethyl acetate (1: 1, v/v) was used as solvent extractor for sample preparation. The detection was performed by tanden mass spectrometry (MS/MS) with the electrospray interface operated in the positive mode (ESI+). The method was linear over the concentration range of 0.1 to 20.0 g mL-1 for IBP, 0.05 to 7.5 g mL-1 for each 2-OH-IBP enantiomer and 0.025 to 5.0 g mL-1 for each COOH-IBP stereoisomer. The other validation parameters studied were within the limits established in the literature. The seven studied endophytic fungi showed to be efficient in the biotransformation of IBP to its main metabolite 2-OH-IBP, however, only the fungi Nigrospora sphaerica (SS67) and Chaetomium globosum (VR10) biotransformed IBP enantioselectively, with greater formation of the active metabolite (+)-(S)-2-OH-IBP. The lack of stereoselectivity observed for the other fungi could be caused by a possible chiral inversion process occurring for IBP, in a similar way that happens in humans. The formation of COOH-IBP stereoisomers was not observed probably because the route of formation of this metabolite requires a sequence of reactions. The results presented here show that fungi, particularly the endophytic ones, may be a promising source to obtain the metabolites of drugs, including in their enantiomerically pure form.

A manipulação seletiva de alvos epigenéticos usando pequenas moléculas inibidoras das enzimas histona-desacetilases (HDACs) e DNA metiltransferases (DNMTs) é uma estratégia para estimular a expressão das vias biossintéticas e a produção de novos metabólitos secundários em fungos. Neste trabalho, inibidores de histonadesacetilases (butirato de sódio, ácido hidroxâmico suberoilanilida e ácido valproico) e inibidores de DNA metiltransferases (5-azacitidina, hidralazina, procaína e procainamida) foram suplementados em culturas líquidas e sólidas dos fungos endofíticos Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 e Chaetomium globosum VR10, das linhagens comerciais Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 e Chaetomium globosum ATCC 56726 e do fitopatógeno Botrytis cinerea B0510. O fungo endofítico H. corrugata FLe8.2, em meio PDB, produziu o composto 2-(2-metoxifenil)-4H-piran-4-ona, e sua cultura em meio Czapek suplementada com hidralazina levou ao isolamento de 3-metil-1,2,4-triazolo[3,4-a]-ftalazina. O tratamento de F. oxysporum SS46 e F. oxysporum ATCC MYA 4623 com hidralazina em meio Czapek levou ao isolamento de um novo composto, 2H-[1,2,4]triazino[3,4- a]-ftalazina. Nestas culturas houve biotransformação da hidralazina pelos fungos, provavelmente como mecanismo de desintoxicação. Ainda, a hidralazina teve um efeito inibidor sobre a biossíntese do ciclohexadepsipeptídeo beauvericina em F. oxysporum SS46. Nas culturas de C. globosum VR10 em meio Czapek os inibidores de HDACs e de DNMTs suprimiram a biossíntese de chaetoglobosinas. A adição de ácido valproico na cultura de C. globosum VR10 em meio PDB eliciou a produção da chaetoviridina B. A adição de 5-azacitidina nas culturas de C. globosum VR10 em meio sólido PDA não modificou a produção da chaetoglosina A. A produção de chaetoviridina B por C. globosum ATCC 56726 em meio PDA foi inibida na menor concentração de 5-azacitidina, 50 ?M, e retomada na concentração de 150 ?M. O tratamento de B. cinerea B0510 com ácido hidroxâmico suberoilanilida SAHA levou à biossíntese de um novo composto, ácido 5-benzil-2,3-di-hidroxi-3-isopropil-4- oxotetrahidrofuran-2-carboxílico, o qual também foi isolado da linhagem geneticamente modificada B. cinerea Bc ?STC2. No geral, considerando as linhagens fúngicas estudadas, os resultados mostram que a adição de moduladores químicos que atuam em mecanismos epigenéticos promove mudanças no perfil de metabólitos secundários. / The selective manipulation of epigenetic targets using small molecule inhibitors of histone deacetylase (HDAC) and DNA methyltransferase (DNMT) activities is a strategy to elicit the expression of biosynthetic pathways and production of new secondary metabolites in fungi. In this work, HDAC inhibitors (sodium butyrate, suberohydroxamic acid and valproic acid) and DNMT inhibitors (5-azacitidine, hydralazine, procaine and procainamide) were supplemented in liquid and solid cultures of the endophytic fungi Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 and Chaetomium globosum VR10, of the commercial fungal strains Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 and Chaetomium globosum ATCC 56726 and of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea B0510. The endophytic fungus H. corrugata FLe8.2 produced 2-(2-methoxyphenyl)-4H-pyran-4-one in PDB medium, while in the presence of hydralazine in Czapek medium the fungus produced 3- methyl-1,2,4-triazolo[3,4-a]-phthalazine. Treatment of F. oxysporum SS46 and F. oxysporum ATCC MYA 4623 with hydralazine in a Czapek medium led to the isolation of new compound, 2H-[1,2,4]triazino[3,4-a]-phthalazine. Hydralazine was biotransformed by these three fungi probably as a detoxification strategy. In addition, hydralazine also inhibited the biosynthesis of the cyclodepsipeptide beauvericin by F. oxysporum SS46. HDAC and DNMT inhibitors suppressed chaetoglobosins\' biosynthesis by C. globosum VR10 cultures in Czapek medium. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum VR10 was elicited by acid valproic in PDB medium. The production of chaetogosin A by C. globosum VR10 in PDA medium has not been affected by 5-azacitidine. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum ATCC 56726 in PDA medium was inhibited in the presence of lower concentration 5- azacitidine (50 ?M) and recovered in the higher concentration (150 ?M). Treatment of B. cinerea B0510 with suberohydroxamic acid led to the biosynthesis of the new compound 5-benzyl-2,3-dihydroxy-3-isopropyl-4-oxotetrahydrofuran-2-carboxylic acid, which was also isolated from the genetically modified strain B. cinerea Bc ?STC2. Results showed that chemical compounds that act in epigenetic mechanisms can induce changes in the secondary metabolite profiles in the fungal strains studied in this work.

Microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes, podendo ou não apresentar estruturas externas visíveis. Esta interação endófito-planta é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Embora bactérias do gênero Curtobacterium sejam normalmente estudadas como fitopatógenas, este grupo vem sendo isolado como endófito de diferentes espécies vegetais, tais como citros, trevo, arroz, batata, milho, olmeiro, café e álamo. Tais bactérias vem sendo estudada no controle de doenças em pepino, batata e fumo, na promoção de crescimento, interagindo com bactérias promotoras de crescimento (PGPR) e fitopatógenas. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi estudar a variabilidade genética e fisiológica de Curtobacterium sp. isolados endofiticamente de citros, por meio das técnicas moleculares ARDRA, RAPD, AFLP e sequenciamento do gene 16S rRNA, além de características fisiológicas (coloração da colônia, fitopatogenicidade e perfil enzimático). Além dos isolados endofíticos de citros, foram utilizados isolados endofíticos e fitopatogênicos de diversas culturas proveniente de diferentes regiões do Brasil e outros países. Embora a coloração das colônias seja uma característica altamente variável, foi observada correlação, onde os isolados endofíticos de citros apresentaram coloração variando de alaranjado a róseo, enquanto os outros isolados analisados apresentaram coloração amarelada e creme. A análise por ARDRA possibilitou a formação de 4 ribotipos (A, B, C e D), sendo que todos os fitopatógenos foram agrupados no ribotipo D. As análises de variabilidade por meio do RAPD e AFLP permitiram a separação dos isolados bacterianos em 2 grupos principais, endófitos e fitopatógenos, além de mostrar grande variabilidade dentro do grupo de isolados endofíticos de citros. De acordo com os resultados do sequenciamento do gene 16S rRNA, os isolados endofíticos de citros foram agrupados separadamente das demais espécies analisadas. Os resultados do presente estudo demonstram que os isolados endofíticos de citros apresentam genótipo divergente, sugerindo que estes isolados possam pertencer a uma nova espécie ou subespécie de Curtobacterium. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages, presenting or not visible external structures. This interaction microorganisms-plant is specific to certain species of plants and/or bacteria. Although bacteria from genus Curtobacterium genus are normally studied as phytopathogens, this group has been isolated as endophytes from several plants, such as citrus, potato, rice, maize, coffee, elm trees, red clover and poplar. Also, this bacterium has been associated to disease biocontrol in tobacco, cucumber and potato; influencing host growth or interacting with plant growth-promoting rhizobacteria and other phytopathogenic bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the genetic and physiological variability of citrus endophytic strains of Curtobacterium by physiological traits (colony color, pathogenicity and enzymatic profile), as well as molecular techniques, such as ARDRA, RAPD, AFLP and 16S rRNA gene sequencing. In the present study endophytic and phytopathogenic strains from many different plants and regions around the world were used. Although the colony color is a high variable character, correlation was observed, since phytopathogenic strains presented yellow and ivory colors, while endophytes from citrus presented orange and pink colors. Four ARDRA profile (A, B, C, D) were observed in the evaluated population, being all phytopathogenic strains include in the ribotype D. The RAPD and AFLP analysis allocated the endophytes and phytopathogens in two different major groups, besides a high variability inside citrus endophytes cluster. According to 16S rRNA gene sequence analysis, citrus endophytic were clustered in a different group of others Curtobacterium strains. The results of the present study demonstrated that the citrus endophytic strains is a divergent genotype, suggesting that citrus endophytic strains could belong to a new Curtobacterium species or subspecies.

O presente projeto teve por objetivo a otimização das condições de cultivo do fungo endofítico Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. para incrementar a produção de metabólitos secundários com atividades antibacteriana, antifúngica, antiparasitária e antitumoral. O fungo foi cultivado em meio líquido em duas etapas distintas, primeiramente em 200 mL de meio pré-fermentativo de Jackson por 48 horas a 30 °C sob agitação constante (120 rpm), e posteriormente, reinoculando a massa micelial assepticamente obtida na etapa pré-fermentativa, em 400 mL de meio fermentativo Czapek, seguido de reincubação a 30 °C sob agitação constante (120 rpm). Após filtração do fluido da cultura e partição com solventes orgânicos obteve-se os extratos, aceto etílico, butanólico, etanólico e aquoso. A condição de cultivo padrão, cultivo inicial em meio fermentativo Czapek, foi realizada por 20 dias de incubação. Os extratos provenientes desta condição de cultivo foram avaliados quanto às atividades antibacteriana e antifúngica. O extrato aceto etílico apresentou, nesta condição de cultivo, a melhor atividade antibacteriana com concentração inibitória mínima (CIM) de 270 ?g/mL para Escherichia coli, não sendo observada atividade antifúngica nestes extratos. Após avaliação inicial foram realizadas modificações na condição de cultivo padrão em meio fermentativo, objetivando a otimização da atividade antibacteriana, anteriormente reportada. Avaliou-se as variáveis, período de incubação, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, pH, temperatura e proporção carbono/nitrogênio do meio, respectivamente. Cada variável foi aferida realizando ensaios de CIM dos extratos provenientes dos diferentes cultivos realizados, selecionando a melhor condição para a otimização da variável seguinte. A melhor condição para a produção de metabólitos secundários com atividade antibacteriana foi obtida em 9 dias de incubação utilizando-se sacarose (3,1%) como fonte de carbono e nitrato de sódio (0,1%) como fonte de nitrogênio, em pH 4 a 30 °C com valor de CIM de 90 ?g/mL para Escherichia coli e P. aeruginosa atividade esta superior a detectada sob a condição de cultivo padrão. Para a atividade antifúngica, anteriormente não detectada, a melhor condição de cultivo foi com a utilização de sacarose (3,1%) e nitrato de sódio (0,1%) em pH 4 a 30 °C para Aspergillus fumigatus (CIM de 130 ?g/mL) e sacarose (3,0%) e nitrato de sódio (0,2%), em pH 4 a 30 °C para Candida albicans ( CIM de 140 ?g/mL). A melhor condição de cultivo para a produção de metabólitos secundários com atividade antitumoral foi obtida com a utilização de sacarose (3,0%) como fonte de carbono e nitrato de sódio (0,2%) como fonte de nitrogênio, em pH 4 a 30 °C para as três linhagens tumorais humanas avaliadas (HCT-8, MDA-MB435 e SF295) nas quais detectou-se 100% de inibição de crescimento celular, esta condição foi também responsável pela melhor atividade inibitória da enzima APRT de L. tarentolae, apresentando 66,41% de inibição, indicando possível atividade antiparasitária. A otimização de condições de cultivo do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. mostrou-se relevante para a produção de metabólitos secundários bioativos. / The purpose of the current project was to optimize the conditions of culture of the endophytic fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. in order to increase the production of secondary metabolites with antibacterial, antifungal, antiparasitary and antitumor activities. The fungus was cultivated in a liquid medium in two different steps; first, in 200 mL of Jackson pre-fermentative medium for 48 hours at 30 °C, under constant agitation (120 rpm), and subsequently, reinoculating the mycelial mass aseptically obtained in the pre-fermentative step in 400 mL of Czapek fermentative medium, followed by reincubation at 30 °C under constant agitation (120 rpm). After filtration of the culture fluid and partition with organic solvents, the following extracts were obtained: acetyl ethylic, buthanolic, ethanolic and aqueous. The standard culture condition, initial culture in Czapek fermentative medium, was performed during 20 days of incubation. The extracts obtained from this culture condition were evaluated regarding the antibacterial and antifungal activities. The acetyl ethylic extract presented, in this culture condition, the best antibacterial activity, with a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of 270 ?g/mL for Escherichia coli; antifungal activity was not observed in this extracts. After the initial evaluation, modifications in the standard culture condition in fermentative medium were performed, aiming to optimize the previously reported antibacterial activity. The following variables were assessed: incubation period, carbon source, nitrogen source, pH, temperature and proportion of carbon/nitrogen in the medium. Each variable was evaluated using MIC assays of the extracts obtained from the different cultures performed, allowing the selection of the better condition for the variable optimization. The best condition for the production of secondary metabolites with antibacterial activity was obtained in 9 days of incubation, using sucrose (3.1%) as the carbon source and sodium nitrate (0.1%) as the nitrogen source, in pH 4 at 30 °C, with a MIC value of 90 ?g/mL for Escherichia coli and P. aeruginosa, which was superior to the activity detected under the standard culture condition. For the antifungal activity, previously undetected, the best culture condition was obtained using sucrose (3.1%) and sodium nitrate (0.1%) in pH 4 at 30 °C for Aspergillus fumigatus (MIC of 130 ?g/mL), and sucrose (3.0%) and sodium nitrate (0.2%), in pH 4 at 30 °C for Candida albicans (MIC of 140 ?g/mL). The best culture condition for the production of secondary metabolites with antitumor activity was obtained using sucrose (3.0%) as the carbon source and sodium nitrate (0.2%) as the nitrogen source, in pH 4 at 30 °C, for the three human tumor cell lines assessed (HCT-8, MDA-MB435 and SF295), in which 100% of cell growth inhibition was detected; this condition also accounted for the best inhibitory activity of the enzyme APRT of L. tarentolae, presenting 66,41% of inhibition, indicating possible antiparasitary activity. The optimization of the culture conditions for the fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. proved to be relevant for the production of bioactive secondary metabolites.

O ambiente marinho tem sido reconhecido como uma importante fonte de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, fungos endofíticos associados a algas ganharam importância nas últimas décadas, como alvos alternativos para a pesquisa de produtos naturais. O presente trabalho teve como o objetivo o estudo químico e biológico de duas linhagens de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia radicans. Inicialmente foi realizada a triagem química e biológica (atividade antitumoral e antimicrobiana) dos extratos brutos das duas linhagens selecionadas, linhagens M20 (Hypocrea lixii) e M23 (Eutypella sp), obtidos a partir de cultivos em escala piloto, tanto variando-se os meios de cultivo e bem como períodos de crescimento. O extrato da linhagem M20 cultivada em arroz apresentou potencial citotóxico interessante quando submetido a ensaios utilizando células tumorais HCT-116. Ainda, após a análise química, esta linhagem foi selecionada para o cultivo em escala ampliada, visando o isolamento e elucidação estrutural dos metabólitos secundários presentes neste fungo. O estudo químico em escala ampliada da linhagem M20, espécie Hypocrea lixii, proporcionou o isolamento e identificação de quatro metabólitos: ácido 3-hidroxi-5-metóxi-6-metil-1,3-diidro-isobenzofurano-4- carboxílico (S1), 3,7-dimetóxi-6-metil-1-oxo-1,3-diidro-isobenzofurano-4-carbaldeído (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), além do isolamento de dois metabólitos que ainda não foram completamente elucidados, S2 e S6. Os metabólitos S1 e S3 são metabólitos inéditos como produtos naturais. Além disso, foi possível a identificação de 14 substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas hidrocarbonetos, ácidos graxos, inclusive insaturados, aldeídos, aldeídos ?,?-insaturados e esteróide. As substâncias S1 e S4 foram submetidas à avaliação de atividade biológica (atividade antibacteriana, antifúngica, anticolinesterásica e antitumoral), porém nenhum resultado positivo foi constatado. Foi realizada avaliação da atividade tumoral das frações da linhagem M20, e as frações M20F e M20H apresentaram atividade citotóxica seletiva para linhagens de células tumorais. Em um segundo momento foi realizado o cultivo em escala ampliada da linhagem M23 (Eutypella sp) que proporcionou o isolamento da R-5-metilmeleína (S7). Dessa forma, o estudo químico de fungos endofíticos associados à alga Bostrychia radicans mostrou-se promissor na busca de novas estruturas químicas, visto que já foram isoladas e identificadas duas estruturas inéditas como produtos naturais. / The marine environment has been recognized as an important source of biologically active secondary metabolites. In this context, endophytic fungi associated with algae gained importance in recent decades, as alternative to natural products research targets. The present work had as goal the chemical and biological study of two strains of endophytic fungi associated with red algae Bostrychia radicans. The chemical and biological screening (antimicrobial and antitumor activity) of the crude extracts of two selected strains, M20 (Hypocrea lixii) and M23 (Eutypella sp), were obtained from pilot-scale cultivation, by means of culture media and growth period variation. The M20 strain extract, grown in rice, showed an interesting cytotoxic potential front HCT -116 tumor cells and after chemical analysis, this strain was selected for cultivation on a large scale, with the purpose of secondary metabolites isolation. Chemical studies of M20 species strain Hypocrea lixii, performed on an enlarged scale, afforded the isolation and identification of four metabolites: 3-hydroxy-5-methoxy-6- methyl-1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carboxylic acid (S1), 3,7 dimethoxy-6-methyl-1-oxo- 1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carbaldehyde (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), in addition the isolation of two metabolites which have not yet been fully elucidated, S2 and S6. The S1 and S3 metabolites are novel metabolites as natural products. Furthermore, it was possible to identify 14 compounds by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), including hydrocarbons, fatty acids, besides unsaturated ones, aldehydes, ?,?-unsaturated aldehydes and steroid. The S1 and S4 compounds were subjected to biological activity evaluation (antibacterial, antifungal, antitumor and acetylcholinesterase potential), but without any positive result. Assessment of tumor activity of fractions of the M20 strain was performed, and the M20F and M20H fractions showed selective cytotoxicity to tumor cell lines. In a second step, the M23 strain (Eutypella sp) was grown on a large scale, resulting in the R-5-metilmeleina (S7) isolation. Thus, the chemical study of endophytic fungi associated to Bostrychia radicans algae proved to be promising concerning the search for new chemical compounds discovery, since it yielded two new structures as natural products.

A manipulação seletiva de alvos epigenéticos usando pequenas moléculas inibidoras das enzimas histona-desacetilases (HDACs) e DNA metiltransferases (DNMTs) é uma estratégia para estimular a expressão das vias biossintéticas e a produção de novos metabólitos secundários em fungos. Neste trabalho, inibidores de histonadesacetilases (butirato de sódio, ácido hidroxâmico suberoilanilida e ácido valproico) e inibidores de DNA metiltransferases (5-azacitidina, hidralazina, procaína e procainamida) foram suplementados em culturas líquidas e sólidas dos fungos endofíticos Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 e Chaetomium globosum VR10, das linhagens comerciais Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 e Chaetomium globosum ATCC 56726 e do fitopatógeno Botrytis cinerea B0510. O fungo endofítico H. corrugata FLe8.2, em meio PDB, produziu o composto 2-(2-metoxifenil)-4H-piran-4-ona, e sua cultura em meio Czapek suplementada com hidralazina levou ao isolamento de 3-metil-1,2,4-triazolo[3,4-a]-ftalazina. O tratamento de F. oxysporum SS46 e F. oxysporum ATCC MYA 4623 com hidralazina em meio Czapek levou ao isolamento de um novo composto, 2H-[1,2,4]triazino[3,4- a]-ftalazina. Nestas culturas houve biotransformação da hidralazina pelos fungos, provavelmente como mecanismo de desintoxicação. Ainda, a hidralazina teve um efeito inibidor sobre a biossíntese do ciclohexadepsipeptídeo beauvericina em F. oxysporum SS46. Nas culturas de C. globosum VR10 em meio Czapek os inibidores de HDACs e de DNMTs suprimiram a biossíntese de chaetoglobosinas. A adição de ácido valproico na cultura de C. globosum VR10 em meio PDB eliciou a produção da chaetoviridina B. A adição de 5-azacitidina nas culturas de C. globosum VR10 em meio sólido PDA não modificou a produção da chaetoglosina A. A produção de chaetoviridina B por C. globosum ATCC 56726 em meio PDA foi inibida na menor concentração de 5-azacitidina, 50 ?M, e retomada na concentração de 150 ?M. O tratamento de B. cinerea B0510 com ácido hidroxâmico suberoilanilida SAHA levou à biossíntese de um novo composto, ácido 5-benzil-2,3-di-hidroxi-3-isopropil-4- oxotetrahidrofuran-2-carboxílico, o qual também foi isolado da linhagem geneticamente modificada B. cinerea Bc ?STC2. No geral, considerando as linhagens fúngicas estudadas, os resultados mostram que a adição de moduladores químicos que atuam em mecanismos epigenéticos promove mudanças no perfil de metabólitos secundários. / The selective manipulation of epigenetic targets using small molecule inhibitors of histone deacetylase (HDAC) and DNA methyltransferase (DNMT) activities is a strategy to elicit the expression of biosynthetic pathways and production of new secondary metabolites in fungi. In this work, HDAC inhibitors (sodium butyrate, suberohydroxamic acid and valproic acid) and DNMT inhibitors (5-azacitidine, hydralazine, procaine and procainamide) were supplemented in liquid and solid cultures of the endophytic fungi Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 and Chaetomium globosum VR10, of the commercial fungal strains Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 and Chaetomium globosum ATCC 56726 and of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea B0510. The endophytic fungus H. corrugata FLe8.2 produced 2-(2-methoxyphenyl)-4H-pyran-4-one in PDB medium, while in the presence of hydralazine in Czapek medium the fungus produced 3- methyl-1,2,4-triazolo[3,4-a]-phthalazine. Treatment of F. oxysporum SS46 and F. oxysporum ATCC MYA 4623 with hydralazine in a Czapek medium led to the isolation of new compound, 2H-[1,2,4]triazino[3,4-a]-phthalazine. Hydralazine was biotransformed by these three fungi probably as a detoxification strategy. In addition, hydralazine also inhibited the biosynthesis of the cyclodepsipeptide beauvericin by F. oxysporum SS46. HDAC and DNMT inhibitors suppressed chaetoglobosins\' biosynthesis by C. globosum VR10 cultures in Czapek medium. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum VR10 was elicited by acid valproic in PDB medium. The production of chaetogosin A by C. globosum VR10 in PDA medium has not been affected by 5-azacitidine. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum ATCC 56726 in PDA medium was inhibited in the presence of lower concentration 5- azacitidine (50 ?M) and recovered in the higher concentration (150 ?M). Treatment of B. cinerea B0510 with suberohydroxamic acid led to the biosynthesis of the new compound 5-benzyl-2,3-dihydroxy-3-isopropyl-4-oxotetrahydrofuran-2-carboxylic acid, which was also isolated from the genetically modified strain B. cinerea Bc ?STC2. Results showed that chemical compounds that act in epigenetic mechanisms can induce changes in the secondary metabolite profiles in the fungal strains studied in this work.

Biotransformações são reações de compostos orgânicos realizadas por microrganismos, plantas ou enzimas isoladas. A transformação de um composto em particular pode ser realizada em grupos funcionais com ou sem degradação de seu esqueleto. Neste trabalho foram utilizados fungos endofíticos e de solo na biotransformação da lactona sesquiterpênica enidrina e do diterpeno afidicolina. A enidrina possui atividade antidiabética e anti-inflamatória. A afidicolina possui pronunciada atividade antitumoral, antiviral e leishmanicida. Foram realizados experimentos de biotransformação da enidrina e da afidicolina com os fungos endofíticos Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysorium SS50 e com o fungo de solo Rhizopus stolonifer. A biotransformação da enidrina com fungo endofítico Papulospora immersa SS13 levou à obtenção de um derivado di-hidroxilado, produzido pela abertura do epóxido presente no éster da cadeia lateral desta lactona sesquiterpênica. Este produto só havia sido previamente obtido na literatura por semi-síntese a partir da enidrina. Os experimentos de biotransformação da afidicolina não levaram ao isolamento e identificação de produtos. Reações semi-sintéticas com a afidicolina foram mais eficientes para a obtenção de derivados deste diterpeno. Foram obtidos cinco derivados semi-sintéticos da afidicolina: dois derivados mono-éteres de silício, um di-éter de silício, um derivado tetra-acetilado e um tri-acetilado. Ainda, na purificação dos produtos reacionais isolou-se o produto natural 3-desoxiafidicolina. Todos os derivados afidicolanos foram submetidos ao ensaio frente a Leishmania major. A afidicolina, a 3-desoxiafidicolina e a afidicolina tri-acetilada exibiram as atividades leishmanicidas mais significativas. Foram calculadas as lipofilicidades dos derivados afidicolanos. A maior atividade observada para o derivado tri-acetilado da afidicolina pode estar relacionada com sua maior capacidade de cruzar as membranas celulares. Este trabalho levou ao isolamento de um produto de biotransformação da enidrina e à identificação de novos derivados afidicolanos naturais e semi-sintéticos com atividade leishmanicida. / Biotransformations are reactions of organic compounds made by intact microbial cells, plant cells or enzymes isolated. The transformation of a particular compound can be carried out at functional groups, with or without degradation of the carbonic skeleton. In this work endophytic and soil fungal strains were applied for the biotransformation of the bioactive terpenes enhydrin (sesquiterpene lactone) and aphidicolin (diterpene). Enhydrin shows anti-diabetic and anti-inflammatory activity. Aphidicolin has been reported as an antiviral, antitumoral and leishmanicidal hit. The endophytes Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysporium SS50 and the soil fungus Rhizopus stolonifer have been screened for the biotransformation of enhydrin and aphidicolin. The biotransformation of enhydrin, catalyzed by the endophytic P. immersa SS13, led to the isolation of a dihydroxy-derivative, a product of the sesquiterpene lactone side chain epoxide opening. This product had only been obtained previously by chemical means. The biotransformation experiments using aphidicolin as substrate were not successful in the production of derivatives. The derivatives of aphidicolin were more efficiently prepared through semi-synthetic approaches. Five aphidicolin semi-synthetic derivatives were obtained: two silicon mono-silyl ether derivatives, one silicon bis-silyl ether derivative, one tetra-acetylated derivative and one triacetylated derivative. During the purification of synthetic mixtures, the natural product 3-deoxyaphidicolin was also isolated. All the aphidicolane derivatives have been assayed against Leishmania major. Aphidicolin, 3-deoxyaphidicolin and triacetylated aphidicolin showed the higher leishmanicidal activities. The lipophilicities of aphidicolane derivatives were calculated. The higher activity presented by the triacetylated aphidicolin may be due to its higher ability to cross the cell membranes. This work led to the isolation of one biotransformation product of enhydrin and to the identification of new natural and semi-synthetic leishmanicidal aphidicolanes.

Os microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis. Essa interação microrganismos-planta é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Nas últimas décadas os estudos de microrganismos endofíticos têm sido realizados em diversas plantas hospedeiras, sendo esses estudos direcionados principalmente para a diversidade e características benéficas induzidas, inclusive o controle biológico de doenças. A doença causada pelo fungo Ceratocystis fimbriata é considerada emergente no setor florestal. O Brasil está entre os maiores produtores mundiais de eucalipto e a expansão do setor juntamente com o cultivo clonal tem acarretado o aumento da incidência de patógenos. O surgimento de novas doenças exige estudos relacionados tanto a interação do agente patogênico com hospedeiro quanto de todos os componentes do patossistema. Neste contexto, os microrganismos endofíticos têm sido descritos como potenciais controladores biológicos de doenças. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivos avaliar a interação de C. fimbriata com a comunidade bacteriana associada à Eucalyptus sp. Adicionalmente, foi estudada a possível transferência desses endófitos via sementes e o padrão de colonização de Pantoea agglomerans em plântulas. Foi observado que plantas não infestadas por C. fimbriata apresentaram maior densidade bacteriana no rizoplano (20,66 x 104 UFC.cm2 -1 de raiz), enquanto que para a comunidade endofítica, a maior densidade foi observada em plantas infectadas pelo fungo (25,13 x 104 UFC.g-1 de raiz). As análises por ARDRA possibilitaram a obtenção de 8 e 13 ribotipos nas comunidades endofítica de raiz e do rizoplano, respectivamente. Os ribotipos mais freqüentes foram identificados como Bacillus cereus. As análises de diversidade por meio de DGGE das comunidades do rizoplano e endofítica de raiz mostraram que a infestação pelo fungo interfere na colonização de Eucalyptus. Foi observado também que bactérias endofíticas estão presentes no interior de sementes de Eucalyptus spp. em uma densidade de 0,33 a 1,83 X 102 UFC.g-1, para as espécies E. camandulensis e E. urophylla, respectivamente. A densidade bacteriana endofítica de plântulas obtidas de sementes desinfectadas superficialmente variaram entre 0,27 X 102 a 0,87 X 102 UFC.g-1, para E. citriodora e o híbrido E. robusta x E. grandis, respectivamente. Em algumas espécies de Eucalyptus não foram isoladas bactérias endofíticas das sementes e plântulas. Os resultados mostraram que algumas espécies de bactérias endofíticas podem ser transmitidas verticalmente por sementes. P. agglomerans inoculada nas sementes foi capaz de colonizar as plântulas após a germinação da semente, indicando que esta pode ser uma das formas utilizadas pelos microrganismos para colonizar e se estabelecer na planta hospedeira. Assim, os resultados obtidos neste trabalho mostram ainda que possa existir interação entre a presença de C. fimbriata e a comunidade bacteriana endofítica e do rizoplano de Eucalyptus. Foi possível observar também que estas bactérias endofíticas que são transmitidas por meio de sementes, permitindo que plântulas previamente inoculadas com bactérias benéficas possam ser produzidas antes de serem levadas a campo. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages or visible external structures. This interaction microorganisms-plant is specific to certain species of plants and/or bacteria. In the last few years studies of endophytic microorganisms have been carried out in several plant hosts, being these studies focused mainly to diversity and biotechnological potential, such as biological control of disease. The disease caused by the phytopathogenic fungi Ceratocystis fimbriata is considered emerging by the reforestation companies. Brazil is one of the largest world eucalyptus producers and the increasing of the eucalyptus production associated to clonal reproduction has allowed the increase in pathogen incidence. Studies that evaluate the interaction between pathogens and the microbial community associated to the host plant may allow understanding how disease symptoms come up. Endophytic microorganisms have been described as potential biological control of diseases and therefore, the aims of the present work were to i) study the interaction between C. fimbriata and the bacterial community associated to the Eucalyptus sp.; ii) evaluate the bacterial dissemination by seeds; iii) evaluate the colonization profile of Pantoea agglomerans in seedlings after seed inoculation. It was observed that the highest bacterial density on the rhizoplane (20.66 x 104 CFU.cm2 -1 of root) was observed in C. fimbriata uninfectedplants, while for endophytic community the highest density was observed in C. fimbriata infected plants (25.13 x 104 CFU.g-1 of root). The ARDRA analyses showed that the bacterial community of eucalyptus is composed by 8 and 13 ribotypes on rhizoplane and inside the roots (endophytic), respectively. The most frequent ribotypes were identified as Bacillus cereus. The DGGE analyses of diversity of endophytic and rhizoplane community showed that fungi infection shift the colonization of Eucalyptus associated bacteria. The bacterial community inside Eucalyptus spp. seeds ranged from 0.33 to 1.83 X 102 CFU.g-1, for E. camandulensis and E. urophylla, respectively. After seed germination the endophytic bacterial density in seedlings ranged from 0,27 X 102 to 0,87 X 102 CFU.g-1, for E. citriodora and the hybrid E. robusta x E. grandis, respectively. Although, endophytic bacteria have been isolated from seeds, for some plant species, bacteria were not isolated from seedlings. Also, some bacteria may be vertically transmitted from seed to seedlings, but some is specific for seeds. Seed inoculation of P. agglomerans resulted in seedlings colonized by these bacteria, suggesting that these bacteria could be seed transmitted. The results obtained in the present study show that the fungi C. fimbriata inside the Eucalyptus host can shift the endophytic and rhizoplane bacterial diversity. Also, these endophytic bacteria could be transmitted vertically by seeds, allowing that seeds previously inoculated with beneficial bacteria may result in protected plants before planting in the field.

Os antibióticos vem sendo empregados por décadas no combate as infecções bacterianas mas, muitos deles são usados como agentes antitumorais, imunissupressores, lipocolesterolégicos, inibidores de enzimas e agentes antiparasitários. Os microrganismos, e dentre eles os fungos, são produtores de metabólitos secundáros, com atividades biológicas, cuja produção é regulada para impedir uma superprodução desnecessária. O aumento na produção de uma substância só é conseguido desregulando tal processo o que é pssível através de manipulação genética ou nutricional. O presente projeto teve por objetivo otimizar as condições de cultivo do fungo endofítico Papulaspora immersa para incrementar a produção de metabólitos secundários com atividades antibacteriana, antiparasitária, antifúngica e antitumoral. O fungo foi cultivado em duas etapas: inicialmente em meio pré-fermentativo por 48 horas seguido de transferência da massa micelial obtida para meio fermentativo Czapek e nesta etapa vários parâmetros que alteram as condições de cultivo foram variados. Os cultivos foram realizados assepticamente a 30°C e sob agitação constante e o filtrado das culturas foram particionados com solventes orgânicos obtendo-se os extratos, aceto etílico, butanólico, etanólico e aquoso. Nos estudos iniciais o tempo de cultivo no meio fermentativo foi de 20 dias (condição padrão) e sob esta condição, o extrato aceto etílico apresentou a melhor atividade antibacteriana para Pseudomonas aeruginosa (CIM = 90 g/mL) e não foi detectada atividade frente a Escherichia coli , assim como não foi observada atividade antifúngica para estes extratos. As seguintes variáveis foram testadas nas condições de cultivo no meio fermentativo : período de incubação, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, pH, temperatura e a proporção das fontes carbono/nitrogênio do meio. Cada extrato obtido proveniente das diferentes condições de cultivo foi avaliado para atividade antibacteriana, antitumoral, antifúngica e inibidora das enzimas gGAPDH deTrypanosoma cruzi e APRT de Leishmania tarentolae em ensaios de CIM. O extrato que apresentou a melhor atividade antibacteriana foi obtido das seguintes condições de cultivo: meio suplementado com 3,0% de sacarose; 0,2% de Nitrato de sódio; pH inicial 5,0, após 9 de incubação a 30 °C, ou seja, CIM de 90 g/mL para P. aeruginosa e de 100 g/mL para E. coli. Nestas mesmas condições obteve-se os melhores níveis de atividade antitumoral frente as três linhagens humanas avaliadas (HCT-8, MDA-MB435 e SF295). A melhor atividade inibitória da enzima parasitária APRT de L. tarentolae (79,82 %) foi obtida do extrato aceto etílico proveniente do cultivo em meio fermentativo nas mesmas condições anteriores, porém quando a cultura era incubada a 35°C e não a 30°C. Significativa atividade inibitória sobre esta enzima (79,25 %) foi também obtida de extrato aceto etílico proveniente da mesma condição de cultivo anteriormente citada, porém em pH 4,0 a 30°C, condição na qual a atividade antibacteriana mostrou-se insignificante. Nenhum dos extratos analisados apresentou atividade inibitória significativa para a enzima parasitária gGAPDH de T. cruzi. A otimização das condições de cultivo do fungo Papulaspora immersa demonstrou que 9 dias de cultivo em meio fermentativo eram suficientes para a produção de metabólitos secundários com atividades biológicas e que é possível obter-se uma determinada atividade em maior concentração dependendo por exemplo do pH ou da temperatura em que se cultiva esse fungo. / Due to the increase in the microbial resistance to the current antibiotics, investigations in substances with antimicrobial activities, as well as substances with antiparasite and antitumoral activities, become relevant. Among the important natural sources in the development of new drugs, the secondary metabolites of microorganism have showed promising results, producing different structural components and a great number of biologically active compounds. Endophytic fungi, known for habiting the interior of plants at some point in their life cycle, without causing visible symptoms of diseases, present a high proportion of new isolated substances with biological activity, but are seldom studied for this purpose. The current project aimed to optimize the culture conditions of the endophytic fungus Papulaspora immersa, in order to increase the production of secondary metabolites with antibacterial, antifungal and antitumoral activities. The fungus was cultured in two steps: pre-fermentative medium for 48 hours, aiming to obtain micelial mass, followed by transference to Czapek fermentative medium, and reincubation in different times. The cultures were performed asseptically at 30°C and under Constant agitation. After filtration of the culture fluid and partition with organic solvents, the following extracts were obtained: acethyl ethylic, butanolic, ethanolic and aquous. In the initial studies, the culture was performed in Czapek fermentative medium for 20 days of incubation, the standard culture condition. In this condition, the extract acethyl ethylic showed the best antibacterial activity with Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of 90 µg/mL for Pseudomonas aeruginosa. Antifungal activity was not observed for these extracts. Afterwards, the incubation period, carbon source, nitrogen source, pH, temperature and proportion of carbon/nitrogen sources varied. Each extract obtained from the different culture conditions was evaluated in MIC assays and the best condition was selected. The extract that showed the best antibacterial activity was obtained from the culture in fermentative medium after 9 days of incubation using saccharosis (3.0%) as carbon source and sodium nitrate (0.2%) as nitrogen source, in pH 5.0 at 30 °C with MIC values of 90 µg/mL for P. aeruginosa, and 100 µg/mL for E. coli. The culture condition that resulted in the production of the best antitumoral activity was the same detected for the antibacterial activity. In this condition, the endophytic fungus Papulaspora immersa hás also produced secondary metabolites that demonstrated to be very active against the three human tumoral cell lines evaluated (HCT-8, MDA-MB435 and SF295). The best culture conditions for the production of secondary metabolites with inhibitory activity of the parasitary enzyme APRT of L. tarentolae were obtained from extracts cultured in the same conditions previously described, except for the fact that the incubation temperature was 35°C and presented inhibitory activity of 79.82 %. High inhibitory activity over this enzyme (79.25 %) was also obtained in these same conditions, but with an initial pH of the culture of 4.0 and at 30°C. None of the extracts analyzed present significant inhibitory activity for the parasitary enzyme gGAPDH of T. cruzi. The optimization of the culture conditions of the fungus Papulaspora immersa has demonstrated to be very important for the production of secondary metabolites with biological activities. To conclude, it can be said that the determination of the ideal culture conditions allowed to diminish the incubation time from 20 to 9 days and find the conditions that maximize the content of substances with the different activities in the extracts of P. immerse, such as, for example, the differential synthesis of substances in different pH and temperature values, which shows the importance of the abiothyc variables in the synthesis of secondary metabolites.

In order to continue with the study of natural products from previously isolated endophytes of the Brazilian medicinal plant Lychnophora ericoides, the main goal of this work focused on the metabolic exchange of endophytic microorganisms from this plant. As it has been demonstrated during the last years, elicitation of different molecules is consequence of microbial interactions, mainly due to the need to compete, survive and establish microbial communities in shared environments. Recent mass spectrometry related approaches, such as imaging and molecular networking, in combination with purification and structural elucidation were applied to the current study of the microbial interactions of endophytes. During this study, several chemical families were identified, such as polyene macrocycles, pyrroloindole alkaloids, leupeptins, angucyclines, siderophores, amongst others. Amongst the polyene macrocycles, the well-known antifungal amphotericin B was identified as a biosynthetic product of the endophytic actinobacteria Streptomyces albospinus RLe7. When S. albospinus RLe7 interacted with an endophytic fungus, Coniochaeta sp. FLe4, a red pigmentation was observed. A new fungal compound was detected from microbial interactions. Isolation and structure elucidation of this new compound enabled to demonstrate the elicitation of fungal secondary metabolites by amphotericin B, an actinobacterial metabolite. It was also demonstrated the elicitation of griseofulvin and its analogue dechlorogriseofulvin from another endophytic fungus, FLe9, as a consequence of exposition to amphotericin B. In addition, investigation of the chemical profile of another endophytic actinobacteria, S. mobaraensis RLe3, led to reveal this strain as angucycline-derivatives producer. Besides that, coculturing of this actinobacteria against Coniochaeta sp. FLe4 also demonstrated elicitation of angucycline analogues. In conclusion, this study demonstrated elicitation of natural products from microbial interactions as well as new compounds from endophytes from L. ericoides and contributed to the identification of microbial metabolites / Com o propósito de continuar com os estudos de produtos naturais de microorganismos endofíticos da planta medicinal Brasileira Lychnophora ericoides, o principal objetivo desse trabalho focou-se no estudo da troca metabólica de microorganismos endofíticos dessa planta. Como tem sido demonstrado durante os últimos anos, a elicitação de diferentes compostos é consequência das interações microbianas, principalmente devido à necessidade de competir, sobreviver e estabelecer comunidades microbianas em diversos ambientes naturais. Abordagens recentes de espectrometria de massas, tais como imageamento e molecular networking, junto com purificação e elucidação estrutural foram aplicadas durante o estudo de interações microbianas de endofíticos. Durante este estudo, várias classes químicas foram identificadas, tais como polienos macrocíclicos, alcaloides pirroloindólicos, leupeptinas, anguciclinas, sideróforos, entre outras. Da classe química de polienos macrocíclicos, foi identificada a anfotericina B como produto da biossíntese da actinobactéria endofítica Streptomyces albospinus RLe7. Durante a interação da S. albospinus RLe7 com o fungo endofítico Coniochaeta sp. FLe4, uma pigmentação vermelha foi observada. Um novo composto de origem fúngica foi detectado a partir de interações microbianas. O isolamento e posterior elucidação estrutural do novo composto permitiu demonstrar a eliciação de metabólitos secundários fúngicos pela anfotericina B, metabólito da actinobactéria S. albospinus RLe7. Foi também demonstrada a eliciação de griseofulvina e desclorogriseofulvina a partir de outro fungo endofítico, FLe9, como consequência da exposição à anfotericina B. Adicionalmente, a investigação do perfil químico de outra actinobactéria endofítica, S. mobaraensis RLe3, evidenciou essa linhagem como produtora de compostos da classe das anguciclinas. Além disso, o cocultivo dessa actinobacteria com o fungo endofítico Coniochaeta sp. FLe4 também eliciou análogos de anguciclinas. Em conclusão, neste estudo demonstrou-se a elicitação de produtos naturais a partir das interações microbianas assim como de novos compostos de endofíticos de L. ericoides e contribuiu-se com a identificação de metabólitos microbianos