CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Periconia hispidula is an endophytic fungus isolated from dried leaves from semi-arid dunes of Bahia. The fungus was subjected to cultivation by varying nutritional factors in four different culture mediuns: MPD (malt, peptone and dextrose), BD (potato dextrose), BDL (potato, dextrose and yeast) and MntPL (mannitol, peptone and yeast), and analyzing the extracts on different incubation days (7, 14, 21, 28 days). A survey of primary cytotoxic activity was carried out from the extracts against tumor cell line of colon cancer (HCT-116). The MPD extracts - 28 days BDL - 28 days and BD - 21 days showed a promising cytotoxic activity and were preliminarily selected for the chemical study. The chromatographic fractionation of MPD-28 days extract resulted in the isolation of 11 secondary metabolites characterized as {4-chromanone, 6-hydroxy-(R) -methyl- (PS-1)}, {4-chromanone, 6-hydroxy-(S) -methyl- (PS-2)}, {E, 1-(2,5 dihydroxyphenyl) but-2-en-1-one (PS-3)}, {1-(2, 5 dihydroxyphenyl)-butan-1-one (PS-4)}, {Z-methyl-3-(3-hydroxyphenyl) propenoate (PS-5)}, modiolide A (PS-7), fusanolide B (PS-8), stagonolide E (PS-9), {(3R,4R)-3,4-dihydro, 3,4,8- trihdroxy, naphthalen-1(2H)-one (PS-11)}, {(4S) isosclerona (PS-12)}, furtermore PS-10 without structural characterization yet. The BDL-BD-28 days and 21 days extracts presented a chromatographic profile very similar to MPD-28 days extract, thus, the chromatographic fractionations of both extracts were targeted for isolation of substances absent in MPD-28 days. The 3,4 dihydoxy-benzoic acid was isolated just from the BD-extract 21 days, while the fractionation of the extract BDL 28days gave (PS-13 without structural characterization yet) as different. Among the isolated metabolites, {4-chromanone, 6-hydroxy-(S) -methyl- (PS-2)}, fusanolido B and PS10 (probably) showed were new compounds. The isolated compounds were shown to be inactive in cytotoxicity assays against strains of HCT-116 and MC-27 (breast adenocarcinoma). However, the 1- (2,5-dihydroxyphenyl) but-2-en-1-one showed strong inhibition with a MIC of 62.5 Âg/mL to be subjected to antimicrobial test against strains of fungi Candida Krusei (ATCC 142432TM) and Candida albicans (ATCC 10231TM) and CIM of 125 Âg/mL against Candida parapsilosis (ATCC 22019TM), while {4-chromanone, 6-hydroxy-(S) -methyl-}, Z-3-(3-hydroxyphenyl) propenoate methyl, modiolide A, estagonolide E, fusanolido B and 3R,4R-dihydro-3,4,8-trihydroxy-1-(2H) -naftalelone showed moderate activity with MIC of 500 Âg / mL.Usual chromatographic techniques including liquid-liquid partitioning, flash chromatography and high pressure liquid chromatography (HPLC) were used for the isolation of secondary metabolites, while the structural characterization was possible through the use of spectrometric techniques using infrared (IR), mass spectrometry (MS), and uni and bidimensional techniques of nuclear magnetic resonance (NMR), and comparison with literature data. / Periconia hipidula à um fungo endofÃtico isolado de folhas secas provenientes de dunas do semiÃrido do estado da Bahia. O fungo foi submetido ao cultivo atravÃs da variaÃÃo de fatores nutricionais em quatro meios diferentes: MPD (malte, peptona e dextrose), BD (batata, dextrose), BDL (batata, dextrose e levedura) e MntPL (manitol, peptona e levedura), e anÃlise dos extratos em diferentes dias de incubaÃÃo (7, 14, 21, 28 dias). A prospecÃÃo da atividade citotÃxica preliminar foi realizada a partir dos extratos obtidos frente à linhagem de cÃlulas tumorais de cÃncer de cÃlon (HCT-116). Os extratos MPD â 28 dias, BDL - 28 dias e BD - 21 dias apresentaram uma atividade citotÃxica promissora e foram preliminarmente selecionados para o estudo quÃmico. O fracionamento cromatogrÃfico do extrato MPD-28 dias, resultou no isolamento de 11 metabÃlitos secundÃrios caracterizados como {(R), 6-hidroxi-2-metil, 4-cromanona (PS-1)}, { (S), 6-hidroxi-2-metil, 4-cromanona (PS-2)}, {E, 1-(2,5 diidroxi-fenil) but-2-en-1-ona (PS-3)}, {1-(2, 5 diidroxi-fenil)-butan-1-ona (PS-4)}, Z-3-(3 hidroxifenil) propenoato de metila (PS-5), modiolido A (PS-7), fusanolido B (PS-8), estagonolido E (PS-9), {(3R,4R)-3,4diidro,3,4,8 triidroxi,naftalen-1-(2H)-ona (PS-11)}, (4S)-isosclerona (PS-12), alÃm de PS-10 que se encontram em fase de caracterizaÃÃo estrutural. Os extratos BDL-28 dias e BD-21 dias apresentaram um perfil cromatogrÃfico bastante semelhante ao extrato MPD-28 dias, desta forma, os fracionamentos cromatogrÃficos de ambos os extratos foram direcionados para o isolamento de substÃncias ausentes em MPD-28 dias. O Ãcido 3,4 diidroxi-benzÃico (PS-6) foi isolado apenas do extrato BD-21 dias, enquanto que o fracionamento do extrato BDL 28d forneceu PS-13 (em fase de caracterizaÃÃo estrutural) como diferente. Dentre os metabÃlitos isolados, os compostos (2S)-6-hidroxi-2-metil-4-cromanona, fusanolido B apresentaram carÃter inÃdito na literatura. Os compostos isolados mostraram-se inativos em ensaios de atividade citotÃxica frente a cepas de HCT-116 e MC-27 (adenocarcinoma de mama). No entanto, o composto 1-(2,5-diidroxifenil)-but-2-en-1-ona apresentou elevada inibiÃÃo com CIM de 62,5 Âg/mL ao ser submetido à ensaio antimicrobiano frente a cepas de fungos Candida Krusei (ATCC 142432TM) e Candida albicans (ATCC 10231TM) e 125 Âg/mL frente à Candida parapsilosis (ATCC 22019TM), enquanto que o (2R)-6-hidroxi-2-metil-4-cromanona, Z-3-(3-hidroxifenil)-propenoato de metila, o modiolido A, o estagonolido E, o fusanolido B e a 3,4-diidro- 3,4,8-triidroxi-1(2H)-naftalelona apresentaram moderada atividade com CIM de 500 Âg/mL. TÃcnicas cromatogrÃficas usuais, incluindo partiÃÃo lÃquido-lÃquido, coluna de sÃlica flash e cromatografia de alta eficiÃncia (CLAE) foram utilizadas para o isolamento dos metabÃlitos secundÃrios, enquanto que a caracterizaÃÃo estrutural foi possÃvel atravÃs do uso de tÃcnicas espectromÃtricas utilizando infravermelho (IV), espectrometria de massa (EM) e ressonÃncia magnÃtica nuclear (RMN) com experimentos uni e bidimensionais, alÃm de comparaÃÃo com dados da literatura.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de três ecossistemas sobre, a ocorrência de fungos rizosféricos, endofíticos e epifíticos. As áreas de estudo estão localizadas em uma propriedade rural, situada na cidade de Venâncio Aires, RS. Os fungos endofíticos e epifíticos foram isolados de amostras de raízes de guajuvira, (Patagonula americana L.), coletadas na mata (área 1), de uva-do-japão (Hovenia dulcis Thunb.), na área intermediária (área 2) e de fumo ou de milho, na lavoura (área 3) e, os fungos rizosféricos isolados de solo coletado junto as raízes dos vegetais citados. As amostras foram coletadas nos meses de janeiro, maio, setembro e novembro de 2004 e 2005. Os fungos foram identificados segundo características morfológicas com auxílio de chaves de identificação. As áreas 2 e 3 foram mais similares com relação aos fungos rizosféricos e epifíticos, enquanto, que, as áreas 1 e 2 foram mais similares com relação aos fungos endofíticos. A diversidade dos fungos isolados das três áreas não diferiu ao longo dos dois anos de coleta. A presença de Fusarium spp., em vegetais sem sintomas de doença indica que, as mesmas podem ser raças avirulentas ou patógenos latentes em equilíbrio com o hospedeiro e o ambiente. A presença de fungos antagonistas, principalmente Trichoderma spp. também, são responsáveis por esse equilíbrio, o qual ocorre nas três áreas. / The present paper aimed at assessing the effect of three ecosystems, on the occurrence of rhizospheric, endophytic and epiphytic fungi. The study areas are located in a farm in Venâncio Aires, Rio Grande do Sul. Samples were collected in the months of January, May, September and November 2004 and 2005. The endophytic and epiphytic fungi were isolated from samples of guajayvi roots (Patagonula americana L.), picked in the forest (area 1), of Japanese raisin tree (Hovenia dulcis Thunb.), in the intermediate area (area 2), and tobacco or corn, in the cultivated area (area 3) and rhizospheric fungi isolated from soil. The fungi were identified according to morphological characteristics, with the help of identification keys. Areas 2 and 3 were more alike concerning rhizospheric and epiphytic fungi; Areas 1 and 2, in turn, were more alike concerning endophytic fungi. The diversity of the isolated fungi from these three areas did not change during the two years of collection. The abundance of fungi with phytopathogenic potential such as the Fusarium spp. and Macrophomina phaseolina, mostly as endophytic in area 3 shows the influence of the host on them. The presence of antagonistic fungi, principally Trichoderma spp. also, are responsable for this equilibrium, which occured in the three areas.

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-12-07T20:08:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Adriana Spirotto Stein Mesquita.pdf: 3914675 bytes, checksum: a98f72f70f2e72b3c17fddd0248824e7 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-01-19T17:58:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Adriana Spirotto Stein Mesquita.pdf: 3914675 bytes, checksum: a98f72f70f2e72b3c17fddd0248824e7 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-01-19T17:59:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Adriana Spirotto Stein Mesquita.pdf: 3914675 bytes, checksum: a98f72f70f2e72b3c17fddd0248824e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-19T17:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Adriana Spirotto Stein Mesquita.pdf: 3914675 bytes, checksum: a98f72f70f2e72b3c17fddd0248824e7 (MD5) Previous issue date: 2015-09-15 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The endophytic microrganisms, particularly bacteria and fungi live in the plants, including thein roots apparently cause no harm. Bacteria and fungi are potentially useful in agriculture and industry, particularly in the food and pharmaceutical industries, as they produce different chemical classes and can participate in various industrial biotechnological processes. Among the compounds produced by bacteria, lipopeptides belong to a class that has attracted great interest for its antifungal, antibiotic and surfactant among others. In this stud 50 strains were selected of Amazonian endophytic bacteria for antimicrobial evoluction and the production of lipopeptides by ESI-ITMS2. Of these, 25 strains produced lipopeptides, six plant isolated from Gustavia genus, nine Macrophyte, five Duguetia, one Pothomorpha, two Rollina and one Bryophyllum. The fragmentation analysis by ESI-MS2 in negative mode identified eight extracts the lipopeptide surfactin homologs of C11 - C18, including C11, C17 and C18 not been reported in the literature. In biological assays paired cultures, 48 strains showed mycoparasitism antimicrobial activity against Gram-negative bacteria P. aeruginosa and E. coli, 27 strains against Gram-positive bacteria S. aureus, E. faecalis, 29 strains against and 28 against C. albicans, also presenting competition activity against E. faecalis 21 strains and C. albicans strains against 23 S. aureus strains and 2 against P.aeruginosas and E. coli. No strain with antibiotic activity observed. In assessing the bioactivity of lipopeptide extracts, 13 of the extracts strains showed antibiosis against S. aureus, P. aeruginosa and C.albicans. / Os microrganismos endofíticos, especialmente bactérias e fungos, são assim denominados por viverem no interior das plantas, habitando inclusive suas raízes, sem lhes causar aparentemente nenhum dano. As bactérias e os fungos são potencialmente úteis na agricultura e na indústria, particularmente na alimentícia e farmacêutica, pois produzem inúmeras classes de substâncias e podem participar de processos biotecnológicos industriais diversos. Entre as substâncias produzidas por bactérias, os lipopeptídeos são uma classe que tem atraído grande interesse por suas atividades antifúngica, antibiótica e surfactante entre outras. No presente trabalho foram selecionadas 50 linhagens de bactérias endofíticas amazônicas para serem avaliadas por ensaios antimicrobianos e quanto à produção de lipopeptídeos por ESI-ITMS2. Destas, 25 linhagens produziram lipopeptídeos, sendo seis isoladas de planta do gênero Gustavia, nove de Macrofita, cinco de Duguetia, uma de Pothomorpha, duas de Rollina e uma de Bryophyllum. As análises de fragmentação por ESI-MS2 no modo negativo dos extratos lipopeptídicos identificaram oito homólogos da surfactina de C11 - C18, entre os quais o C11, C17 e C18 ainda não foram relatados na literatura. Em ensaios biológicos de culturas pareadas, 48 linhagens apresentaram atividade antimicrobiana de microparasitismo contra as bactérias Gram-negativas P. aeruginosa e E. coli, 27 linhagens contra as bactérias Gram-positiva S. aureus, 29 linhagens contra E. faecalis e 28 contra C. albicans, apresentando também atividade de competição frente a 21 linhagens contra E. faecalis e C. albicans, 23 linhagens contra S. aureus e 2 linhagens contra P.aeruginosa e E. coli. Não foi observada nenhuma linhagem com atividade antibiótica. Na avaliação da bioatividade dos extratos lipopeptídicos, 13 extratos destas linhagens apresentaram antibiose frente a S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Natalia Carvalhaes de Oliveira.pdf: 1211975 bytes, checksum: 414976b584307f085c0610f71d63bb94 (MD5) Previous issue date: 2009-03-16 / Endophytic microorganisms live inside plants showing no apparently damage for the host, often assisting in survival of plants, helping its growth with production of phytohormones, phosphates solubilization, nitrogen fixation and enzymes production, or they can metabolize organic contaminants, like petroleum and derivates. This work aimed to isolated and identified endophytic microorganisms of plants present in impacted areas, as well as test their ability in petroleum and its derivatives degradation, identify bacteriocin production, to test their nitrogen fixation capability, phosphate solubilization, indol-acetic acid (IAA) and enzymes production. Plant samples were collected, in an area impacted with asphaltic and mud, were superficially disinfected using 70% ethanol, sodium hypochlorite and sterile distilled water. After macerated and fragmented, the samples were incubated at 30°C for about 72 hours, when growth of microorganisms was observed in culture media: Nutrient Agar, TSA (Tryptone Soya Agar) and King medium. The verification of petroleum and derivatives degradation capacity was performed in ELISA plates, exposing the bacteria to a solution of Minimal Medium, the dye DCPIP solution (2,6-dicloroindofenol sodium salt) and petroleum or derivative tested (burning oil, lubricating oil, diesel oil and gasoline). A positive reading for degradation was observed by discoloration of DCPIP. Among nine bacteria tested, three showed degradative activity in different fractions of petroleum, diesel oil and gasoline, and others showed different profiles. This result shows the potential of these microorganisms for application in bioremediation processes. The production of IAA was tested on TSA medium supplemented with tryptophan and only one sample was positive, while none was considered phosphate solubilizing. Testing the nitrogen fixing, samples were inoculated for a free nitrogen culture media, showing growth after 24 hours of incubation (positive results), however it s isolated did not show positive results in the acetylene reduction test, which confirms activity of the enzyme nitrogenase. The samples showed different profiles for the production and activity of bacteriocins against the clinical isolates tested. There were no detected activity of endoglucanase, cellulolytic and pectinolytic enzymes, but esterases, ß-glucosidases, proteases and amylases were positive. Some isolates were identified from the sequencing of 16S DNA, whose sequence was compared to database (GenBank), and then diagnosed as Bacillus cereus, Staphylococcus pasteuri and Pseudomonas sp. The endophytic bacteria isolated from Cerrado plants confirmed their potential for use in bioremediation, plant growth promotion and diverse enzyme production, with potential for use in pharmaceutical, food, textiles, among others. / Microrganismos endofíticos vivem no interior de plantas sem causar danos aparentes no hospedeiro, muitas vezes auxiliando na sobrevivência do vegetal, auxiliando seu crescimento com produção de fitormônios, solubilização de fosfatos, fixação de nitrogênio e produção de enzimas, ou metabolizando alguns compostos contaminantes orgânicos, como petróleo e/ou derivados. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar microrganismos endofíticos de vegetais presentes em áreas impactadas, assim como testar sua capacidade de degradação de petróleo e alguns derivados, identificar seu perfil para a produção de bacteriocinas, capacidade de fixação de nitrogênio, solubilização de fosfatos, produção de ácido indol-acético (AIA) e enzimas. Amostras vegetais foram coletadas em uma área impactada com lama asfáltica e desinfectadas superficialmente utilizando etanol 70%, hipoclorito de sódio e água destilada esterilizada. Depois de fragmentadas e maceradas, as amostras foram incubadas à 30o C por cerca de 72 horas, quando se observou crescimento de microrganismos nos meios de cultura: Agar nutriente, meio TSA (Tryptone Soya Agar) e meio de King. A verificação da capacidade de degradação de petróleo e derivados foi realizada em placas de ELISA, expondo a bactéria a uma solução contendo meio de cultura Mínimo, solução do corante DCPIP (sal de sódio de 2,6-dicloroindofenol) e petróleo ou derivado testado (óleo queimado, óleo lubrificante, óleo diesel e gasolina). A leitura positiva para degradação foi observada pela descoloração do DCPIP. Entre nove bactérias testadas, três apresentaram atividade degradativa em diferentes frações de petróleo, óleo diesel e gasolina, e as demais apresentaram variados perfis. Este resultado mostra a potencialidade desses microrganismos para aplicação em processos de biorremediação. A produção de AIA foi testada em meio TSA acrescido com triptofano e somente uma amostra apresentou resultado positivo, enquanto nenhuma foi considerada solubilizadora de fosfatos. Para teste de fixação de nitrogênio os isolados foram inoculados em meios livres de nitrogênio, apresentando crescimento após 24 horas de incubação, no entanto não apresentaram resultados positivos no teste de redução do acetileno, que confirma atividade da enzima nitrogenase. As amostras apresentaram variados perfis para a produção e atuação das bacteriocinas frente aos isolados clínicos testados. Não foi detectada atividade das enzimas endoglucanase, celulolítica e pectinolítica, mas sim de esterases, ß- glucosidases, proteases e amilases. Alguns isolados foram identificados a partir do sequenciamento da região 16S DNA, cuja sequência foi comparada a um banco de dados (GenBank) e então diagnosticados como Bacillus cereus, Staphylococcus pasteuri e Pseudomonas sp. Foi confirmada a caracterização de bactérias endofíticas isoladas de plantas de Cerrado com potencial para utilização em biorremediação, promoção de crescimento vegetal e diversa produção enzimática, com potencialidades para utilização em indústria farmacêutica, alimentícia, têxtil, entre outras.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriana.pdf: 2128343 bytes, checksum: a126c0f543395afa8dcd9b4112191c0f (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Among the species of known insects (approximately 900 thousands), at about 2% is considered eusocial, because they live in truly advanced societies. The leaf-cutting ants belong to eusocial insects group and reached the major level of the instinct through the cultivation of fungi. Nowadays, they seems to be the unique animal group that have developed an advanced agriculture, based on their symbiosis with fungi, that appeared at about 50 million years ago, long before human being had appeared and become cultivator. Cutting leaves that serves as substrate to fungi cultivation for feed, ensure a high economic value to leaf-cutting ants, especially when they compete with men. So, the aim of this work was to perform a study about the microorganisms communities associated to the fungi garden of the leaf-cutting ants, Atta sexdens, evaluating the possibility to control them by the antagonistic activity of endophyte microorganisms from Amazon plants. To enable these assays, 13 leaf-cutting ants colonies (at about 5 monts of age) containing all classes (queen, soldiers, males and workers) were collected and transferred to the Laboratório de Microrganismos LABGEMMA of the Universidade Federal do Amazonas UFAM. From these anthill, associated microorganisms were isolated, cultivated, identified (by molecular and classical methods) and preserved at appropriated conditions. The antagonisms assays were performed by the method of paired culture, using endophytic microorganisms as inhibitors of those anthill associated. In vivo assays were performed with lab assembled anthills, to evaluate the potential for biological control against them. The main isolated and identified anthills associated microorganisms were: Leucoagaricus gongylophorus; Bionectria ochroleuca; Aspergillus flavus; Trichoderma longibrachiatum; Fusarium solani, yeasts and gram positive and gram negative bacteria. Antagonisms assays against L. gongylophorus, T. longibrachiatum, A. flavus and one of the anthill yeasts were promissing as an alternative method to the anthills biological control. / Calcula-se que entre as espécies de insetos conhecidas (cerca de 900 mil), próximo de 2% são ditas eussociais, pois vivem em sociedades verdadeiramente avançadas. As formigas cortadeiras estão inseridas no grupo dos insetos eussociais e atingiram o que pode se chamar de apogeu do instinto por meio da agricultura de fungos. Até o momento, parece ser o único grupo de animais, além do homem, que desenvolveu uma agricultura avançada, que se baseia na simbiose mutualística com os fungos e surgiu há mais de 50 milhões de anos, ou seja, muito antes de o homem existir e se tornar agricultor. O fato de esses insetos cortarem folhas que servem de substrato para o cultivo do fungo do qual se alimentam as torna de grande importância econômica, sobretudo quando competem conosco. Dentro desse contexto, objetivou-se realizar um estudo sobre a microbiota associada ao jardim de fungos das formigas cortadeiras Atta sexdens, avaliando-se a possibilidade de controlá-los por meio da atividade antagonista de microrganismos endofíticos provenientes de plantas da Amazônia. Para viabilizar esses ensaios foram coletadas, em campo, treze colônias de formigas com aproximadamente cinco meses contendo todas as castas (rainha, soldados, machos e operárias) e encaminhado ao Laboratório de Microrganismos LABGEMMA da Universidade Federal do Amazonas UFAM. A partir desses formigueiros, os microrganismos associados foram isolados, cultivados, identificados (por métodos clássicos e moleculares), e preservados em meios e condições apropriadas. Os ensaios de antagonismo foram realizados pelo método de cultivos paralelos, in vitro , utilizando-se microrganismos endofíticos como agentes inibidores dos microrganismos associados aos formigueiros. Foram realizados ainda ensaios in vivo , utilizando-se formigueiros montados em laboratório, para avaliar o potencial dos endófitos no controle biológico dos formigueiros. Os principais microrganismos isolados e identificados como associados aos formigueiros foram: Leucoagaricus gongylophorus; Bionectria ochroleuca; Aspergillus flavus; Trichoderma longibrachiatum; Fusarium solani, leveduras e bactérias gram negativas e positivas. Os ensaios de antagonismo contra L. gongylophorus, T. longibrachiatum, A. flavus e contra uma das leveduras do formigueiro, foram promissores como métodos alternativos para o controle biológico dos formigueiros.

Árvores evolutivas de espécies de Peperomia baseadas nas regiões de ITS e matK foram confrontadas com perfis metabólicos de extratos brutos obtidos por RMN 1H, HPLC-DAD e LC-ESI-MS. A análise de clusters (HCA) e a análise discriminante de componentes principais (DAPC) suportaram em parte os agrupamentos observados por ITS e matK. As principais classes de metabólicos secundários observadas foram policetídeos, meroterpenos, cromenos, fenilpropanoides e amidas, sendo que foram ainda isolados um policetídeo (malabaricona D) de P. megapotamica; o fenilpropanoide elemicina e a lignana tetraidrofurânica diyangambina de P. rotundifolia; e as flavonas 5,6,7-trimetoxiflavona e 4\',5,6,7- tetrametoxiflavona de P. sincorana. As PKS tipo chalcona sintase (CHS) de peperomias, diferiram daquelas de famílias filogeneticamente próximas como Myristicaceae (Virola) e Lauraceae (Aniba). Como muitos meroterpenos de espécies de Peperomia possuem como núcleo básico o ácido orselínico, produto típico de líquens e bactérias, o gene ácido orselínico sintase (OSAS) foi investigado nas plantas e nos 27 fungos endofíticos isolados de espécies de Peperomia (identificados pelas sequências de ITS1-5.8S-ITS2). Foram amplificadas pelo menos uma PKS (NR, HR e PR) em cada uma das linhagens e AOS em várias delas (UR1, UC3, UF1, UF2, UF3, UF4, GC3, NR1, NC1, NC2, NF1, AR1, AC1, AC4, OC1 e OF1). A homologia de 60% da OSAS amplificada de UR1 com a sequência de Streptomyces viridochromogenes é sugestivo de transferência horizontal de bactéria para fungos. / Phylogenetic tree of Peperomia species based on ITS and matK were compared to the metabolic profiling of crude extracts using 1H NMR, HPLC-DAD and LC-ESI-MS. Cluster analysis (HCA) and discriminant analysis of principal componentes (DAPC) supported significantly the clustering observed by ITS and matK. The major classes of secondary metabolites were polyketides, meroterpenes, chromenes, phenylpropanoids and amides and besides, one polyketide (malabaricone D) of P. megapotamica; the phenylpropanoid elemicin and the tetrahydrofuran lignan diyangambin from P. rotundifolia; and the flavones 5,6,7- trimethoxyflavone and 4\',5,6,7-tetramethoxyflavone were isolated from P. sincorana. The PKS chalcone synthase type (CHS) from peperomia, differed from phylogenetically related families Myristicaceae (Virola) and Lauraceae (Aniba). Since several meroterpenes from Peperomia species have the orsellinic acid as an aromatic core, typical of liquens and bacteria, the orsellinic acid (OSAS) was investigate in the plants and 27 endophytes isolated from Peperomia (identified based on ITS1-5.8S-ITS2 sequences). At least one PKS (NR, HR and PR) were isolated from each strains and AOS were isolated from several strains (UR1, UC3, UF1, UF2, UF3, UF4, GC3, NR1, NC1, NC2, NF1, AR1, AC1, AC4, OC1 and OF1). The 60% of homology observed for OSAS amplified from UR1 with that of Streptomyces viridochromogenes is suggestive of a horizontal transferring from bacteria to fungi.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os fungos endofíticos do tipo dark septate podem ser promotores de crescimento vegetal. No entanto, ainda são poucos os estudos com este grupo de fungos. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar fungos DSEF obtidos a partir de plantas de Oryza glumaepatula coletadas em ambientes amazônicos. As raízes das plantas de doze amostras de O. glumaepatula foram seccionadas, desinfestadas e dispostas em placas com o meio ágar-malte suplementado com Cloranfenicol e Sulmametazol mais Trimetropina. Os isolados obtidos foram avaliados quanto às características de dark septate e armazenados em água destilada e água destilada adicionada de glicerol. Todos os isolados fúngicos considerados DSEF foram reinoculados em plantas de O. glumaepatula, sendo 5 inoculados em O. sativa e, também, caracterizados geneticamente através da amplificação e sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2. O meio de cultura ágar-malte foi eficiente para a obtenção de DSEF, obtendo-se 46 isolados. O armazenamento em água destilada e em água destilada adicionada de glicerol mostrou-se eficiente para a manutenção das culturas fúngicas por pelo menos 12 meses. Todos 46 isolados fúngicos reinoculados foram capazes de colonizar raízes O. glumaepatula e 5 destes isolados foram capazes de colonizar O. sativa, não desencadeando sintomas de patogenicidade. A análise genética dos isolados mostrou que estes fungos apresentam baixa similaridade entre eles e não possuem similaridade com fungos DSEF já descritos e presentes no banco de dados do Genbank, indicando que a metodologia empregada permitiu a obtenção de espécies fúngicas diversas e que a espécie O. glumaepatula abriga alta diversidade deste grupo de fungos. / The endofophytic fungi such as dark septate or DSEF can be promoters of plant growth. However, there are few studies com this group of fungi. The objective of this study was to characterize DSEF fungi obtained fron plants collected in enviroments Oryza glumaepatula Amazon. The plant roots of twelve O. glumaepatula samples were sectioned, disinfected, and placed in plates with agar-malte medium added of chloramphenicol and trimethoprim sulmametazol more. The isolates were evaluated in relation of dark septate characteristics and stored in distilled water, and in distilled water added of glycerol. All fungal isolates considered DSEF were reinoculated in plants of O. glumaepatula, and inoculated in 5 in Oryza sativa and also genetically characterized by amplifying and sequencing the region ITS1-5.8S-ITS2. The agar-malte medium was efficient to isolate DSEF, resulting in more than 46 isolates. The distilled water and also distilled water added of glycerol were efficient to maintain the fungus culture at least 12 months. All 46 fungal isolates were reinoculated to colonize roots O. glumaepatula and 5 of these isolates were able to colonize O. sativa, not trigger symptoms of pathogenicity. Genetics analysis of isolates showed that these fungi have low similarity between them and have no similarity to fungi DSEF already described and present in the database of Genbank, indicating that the methodology allowed the acquisition of several fungal species and the species O. glumaepatula houses high diversity of this group of fungi.

A biodiversidade microbiana de diferentes ecossistemas tem incentivado estudos químicos e biológicos com micro-organismos dos mais variados habitats, os quais têm conduzido à obtenção de moléculas bioativas com aplicações na medicina, indústria química e agricultura, proporcionando melhorias na qualidade de vida ao homem. O presente trabalho teve como objetivos a bioprospecção por actinobactérias endofíticas e seus metabólitos, além do estudo da via biossintética dos sesquiterpenos aristoloquenos produzidos pelo fungo fitopatogênico Botrytis cinerea. No estudo de bioprospecção foram isoladas 41 linhagens de actinobactérias endofíticas de duas espécies de Asteraceae (Thitonia diversifolia e Lychnophora ericoides). A identificação através do sequenciamento de DNAr indicou predominância do gênero Streptomyces. As linhagens foram cultivadas em meio de arroz e os extratos etanólicos submetidos aos ensaios de citotoxicidade frente a células tumorais e antimicrobiano. Um total de 58,5% dos extratos apresentou atividade em pelo menos um dos ensaios realizados. Foram selecionadas as linhagens Streptomyces cattleya RLe 4 e Streptomyces sp. RLe 8 para cultivo em escala ampliada, isolamento e identificação de metabólitos bioativos. O isolamento dos compostos foi realizado através de diferentes técnicas cromatográficas e a identificação estrutural foi baseada em dados de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C e espectrometria de massas. De S. cattleya RLe 4 foram isolados quatro compostos: 2-hidroxibenzamida, desferrioxamina E, 1-(3\',4\'-dimetoxifenil)-1-propanona e 1-(3\',4\'-dimetoxifenil)-1-etanona. Dos extratos de Streptomyces sp. RLe 8 foram isolados dez compostos: benzamida, 3- hidroxibenzamida, 3-hidróxi-4-metoxibenzamida, 4-hidróxi-3-metoxibenzamida, 3,4- dimetoxibenzamida, 2-fenilacetamida, dois isômeros de 3,4-diidro-3,4,6,8-tetraidróxi-1(2H)- naftalenona, 2,3-diidro-2,2-dimetil-4(1H)-quinazolinona e desferrioxamina B. O composto 2,3-diidro-2,2-dimetil-4(1H)-quinazolinona apresentou elevada atividade frente as células de câncer de cólon (HCT-8) e glioblastoma (SF295), com 93,9 % e 87.0 % de inibição, respectivamente. O outro enfoque da tese envolveu a otimização da produção de sesquiterpenos aristoloquenos por linhagens de B. cinerea, seguido de estudo biossintético destes produtos naturais através de experimentos de incorporação de precursores isotopicamente enriquecidos com 2H (deutério) e 13C (carbono treze). As análises dos dados obtidos de RMN de 2H e de 13C do sesquiterpeno majoritário indicaram que a biossíntese desta substância ocorre pela via do mevalonato (MVA). Os resultados também sugeriram o possível envolvimento da via do metil-eritritolfosfato ou 1-desoxi-D-xilulose-fosfato (MEP/DPX) na biossíntese deste sequiterpeno. Estes resultados podem contribuir para o planejamento racional de fungicidas seletivos com aplicação na agricultura. O trabalho desenvolvido mostrou o grande potencial de actinobactérias endofíticas para a obtenção de moléculas bioativas e que estudos usando precursores isotopicamente marcados fornecem informações precisas acerca da origem biossintética de produtos naturais. / The microbial biodiversity from different ecosystems has incited chemical and biological studies with microorganisms from several habitats, leading to the isolation of bioactive natural products with applications in medicine, chemical industry and agriculture, and thus contributing to a better quality of life. This thesis aimed the biopropecting on endophytic actinobacteria and their natural products, and also the biosynthetic study of aristolochene sesquiterpenes in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea. A total of 41 actinobacterial strains were isolated of two Asteraceae species (Thitonia diversifolia and Lychnophora ericoides) for the bioprospecting study. The rDNA sequencing showed predominancy of Streptomyces genus. All the strains were cultured on rice medium, and the ethanolic extracts were screened in cytotoxity and antimicrobial assays. As a result, 58.5% of the extracts showed activity in al least one bioassay. The strains Streptomyces cattleya RLe 4 and Streptomyces sp. RLe 8 were selected for scale up cultures, isolation and identification of bioactive compounds. Different chromatographic methods were applied for the isolation of compounds, and structural analysis were based on 1H and 13C nuclear magnetic resonance and mass spectrometry data. Four compounds were isolated from S. cattleya RLe 4: 2- hydroxybenzamide, desferrioxamine E, 1-(3\',4\'-dimethoxyphenyl)-1-propanone, and 1-(3\',4\'- dimethoxyphenyl)-1-etanone. Ten compounds were isolated from Streptomyces sp. Rle 8: benzamide, 3-hydroxybenzamide, 3-hydroxy-4-methoxybenzamide, 4-hydroxy-3- methoxybenzamide, 2-phenylacetamide, two isomers of 3,4-dihydro-3,4,6,8-tetrahydroxy- 1(2H)-naphthalenone, 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-4(1H)-quinazolinone, and desferrioxamine B. Compound 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-4(1H)-quinazolinone showed high antiproliferative activity against colon cancer cells (HCT-8) and glioblastoma cells (SF295), with 93.9 and 87.0% of inhibition, respectively. The second focus of the thesis involved the optimization of aristolochene sesquiterpenes production by two strains of B. cinerea, followed by the biosynthetic study through feeding experiments with 2H (deuterium) and 13C isotopically labeled precursors. The 2H and 13C NMR obtained data showed that the biosynthesis of the sesquiterpene proceeds by the mevalonate pathway (MVA). The results also suggested the possible participation of the non mevalonate pathway, methylerytritol phosphate ou 1-deoxy- D-xylulose phosphate (MEP/DXP), in the biosynthesis. These results might contribute to the rational design of selective fungides with application in agriculture. This thesis showed the endophytic actinobacteria as promising sources of bioactive natural products, and also showed that the isotopically labeled feeding experiments give reliable information about the natural products biosynthetic pathways.

O interesse na obtenção de novos fármacos a partir de micro-organismos endofíticos vem crescendo, uma vez que esta é uma fonte ainda pouco explorada. Além disso, o estudo das interações entre plantas e micro-organismos tem sido amplamente discutido ao longo dos últimos anos. No presente trabalho, o fungo endofítico Drechslera ravenelii (SS33), isolado das folhas de Smallanthus sonchifolius (yacon), foi cultivado sob diferentes condições fermentativas, objetivando a determinação das melhores condições para produzir metabólitos secundários com atividades antimicrobiana e/ou citotóxica. Para tal avaliaram-se dois parâmetros: meio fermentativo e tempo de incubação. Os meios fermentativos líquidos utilizados foram Czapek e caldo de batata (PDB), sob agitação (120 RPM), cultivados por 216 e 480 horas. Também foi desenvolvida cultura por fermentação em substrato sólido, meio de arroz-aveia, durante 720 horas. Todos os cultivos foram realizados em temperatura de 30 ºC e precedidos por pré-fermentação. Dos cultivos em meio líquido foram obtidas frações em diclorometano e em acetato de etila. Já dos cultivos provenientes do meio fermentativo sólido foram obtidas frações em n-hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol. Dessa forma, obtiveram-se 12 frações que foram concentradas em rotaevaporador até a secura, pesadas e identificadas. As frações tiveram sua atividade antimicrobiana avaliada através de duas técnicas: técnica da bioautografia e técnica da microdiluição em microplaca (determinação da Concentração Inibitória Mínima), utilizando-se como indicadores biológicos as cepas Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. A avaliação da atividade citotóxica foi realizada pela técnica do MTT, utilizando-se três linhagens de células tumorais MB435 (melanoma humano), HCT-8 (cólon humano) e SF-295 (glioblastoma humano). As frações tiveram também seus perfis químicos avaliados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Após observação dos resultados obtidos, concluiu-se que a fração diclorometânica, proveniente do meio fermentativo sólido, foi a que apresentou maior rendimento, manejo mais simples e perfil cromatográfico mais interessante, quando comparada às outras frações obtidas dos meios sólido e líquido. Desse modo, foi realizada ampliação da escala fermentativa em meio sólido e a fração diclorometânica obtida foi submetida a processos cromatográficos visando o isolamento das substâncias majoritárias. Assim, foram isoladas a substância 1 (não identificada) e a substância 2, identificada como terpestacina, um sesterpeno incomum com conhecida atividade na inibição da formação de sincícios pelo vírus HIV. A terpestacina foi isolada pela primeira vez do fungo Drechslera ravenelii no presente estudo. A substância 2 não apresentou atividade antimicrobiana quando submetida ao ensaio da microdiluição em microplaca e apresentou atividade citotóxica discreta, frente a três linhagens de células cancerígenas humanas. / The interest in obtaining new drugs from endophytic microorganisms is growing, since this is a source still little exploited. In addition, the study of the interactions between plants and microorganisms has been widely discussed over the past few years. In this work, the endophytic fungus Drechslera ravenelii (SS33), isolated from the leaves of Smallanthus sonchifolius (yacon), was grown under different conditions, targeting the determination of the best conditions to produce secondary metabolites with antimicrobial and/or cytotoxic activities. For that, two parameters were evaluated: culture medium type and incubation time. The liquid media used were Czapek and Potato Dextrose Broth (PDB), swirling (120 RPM), cultivated for 216 and 480 hours, respectively. The fungus has also been culture by fermentation in solid substrate, rice-oats medium, during 720 hours. All crops were conducted in temperature of 30 °C and preceded by pre-fermentation. The obtained liquid mediums were submitted to liquid partition to furnish dichloromethane and ethyl acetate fractions. The solid medium was submitted to extraction to furnish the fractions in n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate and n-butanol, in sequence. |Then, the 12 fractions obtained were dried, cumbersome and identified. The antimicrobial activity of the fractions was evaluated through two techniques: bioautography and Microdiluition method (Minimum Inhibitory Concentration-MIC), and for that, the biological indicators used were Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. The cytotoxic activity evaluation was performed by MTT test, using three tumor cell lines: MB435 (human melanoma), HCT-8 (human colon) and SF-295 (human glioblastoma). The chromatographic profiles of the fractions were evaluated by High Performance Liquid Chromatography. Analysis of the results allowed to conclude that the dichloromethane fraction from the solid medium gave greater yield, was easier to manager and more displayed an interesting chromatographic profile when compared to other fractions obtained from both solid and liquid media. Thus, the fungus was cultivated in a larger scale in solid medium and the dichloromethane fraction obtained was subjected to chromatographic processes aiming the isolation of the major compounds. Thus, two compounds were isolated the substance 1 (unidentified) and the substance 2, witch was identified as terpestacin, an uncommon sesterpene, which inhibits the formation of syncytia in the course of HIV infection. The terpestacin was isolated for the first time from the fungus Drechslera ravenelii in this study. The compound 2 did not presented antimicrobial activity when subjected to the microdilution test and it displayed discreet cytotoxic activity in three human cancer cell lines.

Foram isolados 37 fungos endofíticos de Viguiera arenaria (VA1 a VA37), sendo 32 oriundos de folhas e 5 de raízes. Os fungos foram classificados por métodos de biologia molecular, sendo Glomerella cingulata a espécie predominante. Os fungos foram cultivados em culturas fermentativas em duas etapas, em pequena escala, para obtenção dos extratos em AcOEt, BuOH e MeOH. Os extratos em AcOEt foram avaliados em ensaios antimicrobianos, citotóxicos frente a células leucemia T humana (JURKAT) e frente às enzimas GAPDH de Trypanosoma cruzi e APRT de Leishmania tarentolae. Diversos extratos apresentaram atividades biológicas significativas. Os perfis químicos dos extratos em AcOEt foram avaliados através de CLAE-UV e RMN 1H. Os fungos VA1 (Glomerella cingulata) e VA17 (Fusarium sp.), selecionados após as triagens química e biológica, foram cultivados em escala ampliada. A partir do extrato AcOEt do fungo VA1 foram isoladas duas substâncias, nectriapirona (I) e tirosol (II). A nectriapirona apresentou atividade citotóxica significativa contra células de leucemia T humana (linhagens JURKAT) e melanoma (linhagens B16F10). Ergosterol (III) foi isolado do extrato micelial metanólico do fungo VA1. A partir do extrato micelial metanólico do fungo VA5 (G. cingulata), cultivado em pequena escala, foi isolado o manitol (IV). Após do cultivo em escala ampliada do fungo VA17 (Fusarium sp.) foram isolados três derivados dicetopiperazinícos, um oriundo do extrato AcOEt, substância V, ainda não relatada na literatura, e dois do extrato micelial MeOH, fusaperazina B (VI) e substância VII, também inédita na literatura. O isolamento das substâncias foi realizado através de técnicas cromatográficas, como CC, CCDP e CLAE. As estruturas químicas foram elucidadas com auxílio de técnicas espectroscópicas (RMN 1H e 13C, HMQC, HMBC, NOE-diff) e espectrométricas (ESI-MS). Experimentos de modelagem molecular foram realizados com a fusaperazina B (VI), que corroboraram com os dados de NOE-diff, indicando que a conformação dobrada do anel dicetopiperazínico é a mais predominante. Foi ainda realizada avaliação do perfil químico dos extratos obtidos em pequena escala dos fungos classificados como G. cingulata, via CLAE e RMN 1H, verificando-se diferenças químicas significativas, o que pode sugerir variabilidade genética entre as linhagens. O tirosol (II) foi detectado na maioria dos extratos de G. cingulata. / A total of 37 endophytic fungi were isolated from Viguiera arenaria (VA1 to VA37), 32 from the leaves and 5 from the roots. Endophytes were classified by means of molecular biology methods, and Glomerella cingulata was the predominant species. The endophytes were cultured in a two step fermentative process in small scale to give the EtOAc, BuOH and MeOH extracts. The EtOAc extracts were submitted to antimicrobial assays, citotoxic assays against human leukemia T cells (JURKAT) and assays against two enzymes, GAPDH from Trypanosoma cruzi and APRT from Leishmania tarentolae. Several extracts showed promising activities in the bioassays. The chemical profiles of the EtOAc extracts were obtained through HPLC and 1H NMR. Endophytes VA1 (Glomerella cingulata) e VA17 (Fusarium sp.) were cultured in large scale after chemical and biological screenings. Nectriapyrone (I) and tirosol (II) were isolated from the EtOAc extract from VA1. Nectriapyrone showed high citotoxicity against leukemia T human cells (JURKAT) and melanoma cells (B16F10). Ergosterol (III) was isolated from the micelial MeOH extract of VA1. Mannitol (IV) was isolated from the micelial MeOH extract from the fungus VA5 (G. cingulata). Extracts from VA17 (Fusarium sp.), obtained in large scale, yielded three diketopiperazine derivatives. A novel derivative was isolated from the EtOAc extract (compound V). Two derivatives were obtained from the micelial MeOH extract, fusaperazine B (VI) and a new diketopiperazine (VII). The isolation of the compounds was carried out using chromatography techniques (column, prep. TLC, and HPLC) and the identification was achieved by spectroscopic (1D and 2D NMR) and spectrometric methods (ESI-MS). Molecular modeling experiments were carried out with fusaperazine B (VI), showing that the diketopiperazine ring is predominantly in the folded conformation, in agreement with NOE-diff experiments. Significant differences were observed in the HPLC profiles and 1H NMR spectra of the extracts from the G. cingulata strains, which might be related to genetic variability among the strains. Tirosol (II) was detected in the majority of G. cingulata extracts