HOLANDA, Andréa Gifoni Siebra de. Estudo comparativo dos efeitos da metilcelulose a 2% e 4% sobre as células endoteliais corneanas de pacientes submetidos à facoemulsificação. 2012. 100 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-04-27T12:20:41Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_agsholanda.pdf: 1810568 bytes, checksum: 7807864bad2bdcc40559f31c9a217b11 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-04-27T12:21:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_agsholanda.pdf: 1810568 bytes, checksum: 7807864bad2bdcc40559f31c9a217b11 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-27T12:21:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_agsholanda.pdf: 1810568 bytes, checksum: 7807864bad2bdcc40559f31c9a217b11 (MD5) Previous issue date: 2012 / Modern cataract surgery in normal corneas, independent of the surgical technique used, causes a mean 10 to 20% loss of endothelial cells. Viscoelastic substances were developed with the function of maintaining the natural spaces of the eye and providing mechanical protection to the intraocular structures during surgery. The objective of this study was to perform a comparative analysis of the effect of two viscoelastic compositions, methylcellulose 2% and 4%, in corneal endothelial protection against secondary damage to the phacoemulsification procedure. We performed a prospective, randomized, double-blind study with senile cataract patients, submitted to phacoemulsification surgery with intraocular lens (IOL) implant. All patients were submitted to a complete ophthalmological assessment, including specular microscopy. After initial assessment, the patients were randomized into two groups: in Group A (n=63) we used methylcellulose 2%, and in Group B (n=63) methylcellulose 4%. There was no statistically significant difference for the parameters analyzed between groups before surgery. However, at 30 days after surgery, mean density of endothelial cells (DCE) was 2128.78±277.55 cells/mm² in Group A and 2395.79±262.16 cells/mm² in Group B, representing a 15.15 and 6.76% loss of endothelial cells in Groups A and B, respectively. Mean DCE was significantly reduced (p<0.05), in both the inter- and inter-group analysis on the 1st, 15th, and 30th day after surgery. ECC increased on the 1st day after surgery in group A, this datum was statistically significant (p<0.05). There was no statistical difference for the other parameters assessed. In this study, we conclude that, despite the advantages of methylcellulose 4% over 2% in regards to the reduction of endothelial cell loss after phacoemulsification, both viscoelastic substances are similar in relation to clinical parameters such as central corneal thickness, coefficient of variation in cell size and percentage of hexagonal cells, which reflect corneal preservation and maintain adequate physiological conditions for proper endothelial function. However, due to the slight difference in cost between the two products and the benefits of methylcellulose 4% on endothelial cell preservation, this may be considered a choice product in routine cataract surgery, as indications for phacoemulsification are increasingly early, due to patients’ visual demands, promoting, in this manner, healthier corneas in the long term. / Com a cirurgia de catarata moderna realizada em córneas normais, independente da técnica cirúrgica utilizada, há uma perda celular endotelial média de 10 a 20%. Substâncias viscoelásticas foram desenvolvidas com a função de manter os espaços naturais do olho e conferir proteção mecânica às estruturas intraoculares durante a cirurgia. O objetivo deste estudo foi realizar uma análise comparativa do efeito de duas formulações viscoelásticas, metilcelulose a 2% e 4%, na proteção do endotélio corneano contra o dano secundário à facoemulsificação. Foi realizado um estudo prospectivo, randomizado e duplo cego com pacientes portadores de catarata senil, submetidos à cirurgia de facoemulsificação com Implante de Lente Intraocular (LIO). Todos os pacientes foram submetidos a uma avaliação oftalmológica completa, incluindo microscopia especular. Após o exame inicial, os pacientes foram randomizados em dois grupos: no grupo A (n=63) foi utilizada a metilcelulose 2% e no grupo B (n=63) a metilcelulose 4%. A média da Densidade de Células Endoteliais (DCE) mostrou-se significativamente reduzida (p<0,05), tanto na análise intra como na intergrupo no 1º, 15º e 30º dias de pós-operatório, representando uma perda de células endoteliais de 15,26% e 6,79% nos grupos A e B, respectivamente. A Espessura Central da Córnea (ECC) mostrou-se aumentada no 1º dia pós operatório (DPO) no grupo A, sendo este dado estatisticamente significante (p<0,05). Houve aumento no Coeficiente de Variação da tamanho celular (CV) e diminuição no Percentual de Células Hexagonais (6 A), no entanto, sem significância estatística para esses dois parâmetros. Concluímos que, à despeito das vantagens da metilcelulose a 4% em relação à diminuição de perdas de células endoteliais após facoemulsificação, ambos os viscoelásticos são semelhantes em relação a parâmetros clínicos como ECC, CV e 6A, os quais refletem a manutenção de condições fisiologicamente adequadas para o bom funcionamento do endotélio. No entanto, devido à pequena diferença de custo entre os dois produtos e os benefícios da metilcelulose 4%, esta pode ser considerada um produto de escolha em cirurgias de catarata de rotina, uma vez que as indicações de facoemulsificação estão sendo cada vez mais precoces, devido às exigências visuais dos pacientes, promovendo, desta forma, córneas mais saudáveis por longo prazo.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-07T19:51:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2564154 bytes, checksum: ee2fe00d1c7a56d422a883011419d135 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T19:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2564154 bytes, checksum: ee2fe00d1c7a56d422a883011419d135 (MD5) Previous issue date: 2002-09-09 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Foram isoladas células endoteliais de veia umbilical bovina (BUVECs) com a finalidade de determinar a expressão de moléculas de adesão como ICAM-1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina na fisiopatologia de B. bovis num estudo in vitro. Posteriormente esta expressão foi confirmada, num estudo in situ, em tecidos (cérebro, pulmão e rim) de animais que morreram após inoculação com amostra patogênica de Babesia bovis (BbovUFV1 7 a passagem). Eritrócitos dos animais infectados foram testados quanto à capacidade de aderir em BUVECs determinando a cinética de adesão. Os mesmos testes de adesão foram realizados em BUVECs estimuladas com plasma de animais infectados com B. bovis e sobrenadante de cultura de PBMC bovino estimulado com peptídeo sintético proveniente da RAP-1 de B. bovis contendo citocinas quantificadas (IFN-γ, TNF-α e IL-12). Houve aumento significativo na adesão de eritrócitos de animais inoculados em BUVECs estimuladas com plasma e sobrenadante de PBMC. Entretanto, adesão foi observada somente para eritrócitos não parasitados, sugerindo que antígenos livres de B. bovis no soro marcam eritrócitos não parasitados, ou ainda uma possível expressão de uma isoforma de VESA-1 não aderente. Aderência não foi observada nos testes com amostras dos animais negativos. As células estimuladas com plasma de animais infectados e com sobrenadante de PBMC mostraram imunomarcação positiva muito mais intensa de ICAM-1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina que as células que não receberam estímulo. Igualmente no estudo in situ foi observado aumento na expressão de ICAM- 1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina em tecidos como cérebro, pulmão e rim dos bovinos infectados com B. bovis em comparação ao grupo controle. Estes resultados sugerem que as interleucinas, liberadas na fase aguda da babesiose, estimulam a expressão das moléculas de adesão relacionadas à fisiopatologia da babesiose causada por B. bovis, fato demonstrado in vitro pela expressão das moléculas em BUVECs e a citoaderência de eritrócitos. Estes achados demonstram similaridades na fisiopatologia de B. bovis e do Plasmodium falciparum. / Endothelial cells from bovine umbilical vein (BUVECs) were isolated with the purpose of determining the expression of ICAM-1, VCAM, PECAM- 1, E-selectin and thrombospondin in the physiopathology of Babesiosis caused by B. bovis. Later, this expression was confirmed by in situ study, using tissue samples (brain, lung and kidney) of animals that died after inoculation with a pathogenic strain of B. bovis (BbovUFV1 7th passage). Erythrocytes of infected animals were tested in order to observer capacity of binding to BUVECs and its adhesion kinetics. The same adhesion tests were made on BUVECs stimulated with plasma of animals infected with B. bovis and culture supernatant of bovine PBMC, stimulated with the synthetic peptide RAP-1 of B. bovis containing quantified cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-12). There was a significant increase in the adhesion of erythrocytes of animals inoculated in BUVECs stimulated with plasma and supernatant of PBMC. However, adhesion was observed only on non-parasitised erythrocytes, suggesting that free antigens of B. bovis in the serum can prime erythrocytes non-parasitised, or still a possible expression of an isoform of VESA-1 non adherent. Adherence was not observed in the tests with samples of the negative animals. Cells stimulated with infected animals xiiiplasma and with supernatant of PBMC showed stronger expression of ICAM- 1, VCAM, PECAM-1, E-selectine and thrombospondin, them cells that didn't receive stimuli. In the same way, it was observed strong expression of ICAM- 1, VCAM, PECAM-1, E-selectine and thrombospondin in tissue samples of brain, lung and kidney in bovines infected with B. bovis, when comparing to the control group. These results suggest that Interleukins, liberated in the acute phase the Babesiosis, stimulate the expression of adhesion molecules related to the physiopathology of Babesiosis caused by B. bovis, as demonstrated by the expression of molecules in BUVECs and erythrocytes cytoadhesion. These date demonstrate physiopathologycal similarities between B. bovis and Plasmodium falciparum.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:42:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcio_cipitelli_ioc_mest_2014.pdf: 2535966 bytes, checksum: c480c7ecf9d9f5dabc625d7c2fd0a32c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Quimiocinas são citocinas envolvidas em processos inflamatórios e homeostásicos. Estudos in vitro vêm demonstrando a influência desses mediadores na alteração da permeabilidade endotelial na infecção pelo vírus dengue (DENV). Dengue é uma doença de amplo espectro clínico, variando desde uma infecção assintomática a casos graves, com manifestações hemorrágicas e/ou extravasamento plasmático e, em menor frequência, ao óbito de pacientes. O objetivo de nosso projeto foi avaliar o envolvimento de quimiocinas séricas presentes em pacientes infectados pelo DENV na alteração da permeabilidade transendotelial, utilizando células endoteliais primárias num sistema in vitro. Para isso realizamos estudo populacional para obtenção de amostras de sangue de casos suspeitos de dengue durante epidemia de 2013 e de indivíduos sadios. Após confirmação laboratorial, foi realizada classificação clínica dos casos segundo a OMS 2009. No soro dos pacientes e controles foi realizada quantificação dos níveis das citocinas TNF-\03B1, IL-1\03B2 e IL-10 e das quimiocinas CXCL8/IL-8, CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10 CCL5/RANTES e CX3CL1/Fractalcina por ELISA ou LUMINEX. Para os ensaios de permeabilidade, foram feitos cultivo e manutenção de células endoteliais primárias HMVEC-d para padronização do ensaio, através da medida da resistência elétrica transendotelial (TEER). Na tentativa de avaliar a contribuição das quimiocinas na medida do TEER, foram adicionados sobre monocamada de HMVEC-d com 80% de confluência em sistema Transwell, 20% de soro de pacientes pré-tratados ou não com bloqueadores de CCL4/MIP-1\03B2, CXCL10/IP-10, CX3CL1/Fractalcina, CCL5/RANTES e IgG e feito uma cinética. Brevemente, foram confirmados 181 pacientes, com predominância do DENV-4, distribuídos segundo a OMS em: 125 febre do dengue sem sinais de alarme (FD), 54 FD com sinais de alarme (FDSA) e 2 dengue grave (FDSA/Grave) De forma interessante, a infecção pelo DENV-4 sugeriu características clínicas e laboratoriais mais brandas comparadas a epidemias por outros sorotipos. Independentemente da gravidade, os pacientes DENV-4 apresentaram altos níveis de TNF-\03B1, IL-10, CCL2/MCP-1, CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 e CX3CL1/Fractalcina, mas não de IL-1\03B2 e CCL5/RANTES comparado aos controles saudáveis. Nossa estratégia para avaliar a capacidade de alterar a permeabilidade das monocamadas de HMVEC-d foi agrupar os pacientes em dois grupos, altos (n=5) e baixos (n=5) produtores de TNF-\03B1, IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8. Surpreendentemente, os níveis séricos de TNF-\03B1, IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8 parecem não influenciar a medida do TEER. Dos 10 pacientes, 4 não alteraram a medida do TEER e 6 alteraram em algum momento da cinética. O bloqueio das quimiocinas parece não ter influenciado a medida do TEER nas condições estabelecidas. Análises de correlação indicaram uma tendência dos níveis séricos de IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8 e CX3CL1/Fractalcina protegerem a monocamada das alterações, enquanto essa proteção parece ter sido mais efetiva em relação aos níveis séricos CCL5/RANTES. O conjunto desses dados nos indica que o DENV-4 parece levar a uma dengue na forma mais branda nos pacientes, aliado a uma redução de parâmetros clínico-laboratoriais associados à gravidade. Citocinas e quimiocinas estão presentes em altos níveis séricos nestes pacientes e parecem ser autorreguladas. Dentre os mediadores inflamatórios, quimiocinas como CCL5/RANTES parece influenciar de forma impactante a alteração da permeabilidade de células endoteliais, o que não foi confirmado pelos ensaios de bloqueio, mas pela correlação direta dos níveis séricos de CCL5/RANTES com a medida do TEER / Chemokines are cytokines involved in homeostatic and inflammatory processes . In vitro studies have demonstrated the influence of these mediators in the alteration of endothelial permeability in Dengue virus (DENV) infection. Dengue is a wide clinical spectrum disease, ranging from an asympto matic infection to severe cases with hemorrhagic manifestations and / or plasma extravasation that could result in death of patients. The aim of our project was to evaluate the involvement of serum chemokines present in patients infected with DENV in chang ing the transendothelial permeability using primary endothelial cells in vitro system. To population - based study conducted to obtain blood samples from suspected dengue cases during the epidemic of 2013 and the control group. After laboratory confirmation, clinical classification was made of the cases according to the WHO 2009. In the serum of patients and controls was performed quantification of levels of the cytokines TNF - α, IL - 1β and IL - 10 and chemokines CXCL8/IL - 8, CCL2/MCP - 1, CXCL10/IP - 10, CCL5/RANTES and CX3CL1/Fractalkine by ELISA or LUMINEX. For the permeability tests were made cultivation and maintaining prim ary endothelial cell (HMVEC - d) and measuring transendothelial electrical resistance (TEER). In order to assess the contribution of chemokines i n the extent TEER were added to monolayer HMVEC - d at 80% confluence in Transwell System, 20% serum from patients pretreated or not with blocking CCL4/MIP - 1β, CXCL10/IP - 10, CX3CL1/Fractalkine, CCL5/RANTES and IgG made kinetics. Briefly, 181 patients were co nfirmed, with a predominance of DENV - 4, distributed according to the WHO in: 125 dengue fever without warning signs (FD), 54 FD with alarm signals (FDSA) an d 2 severe dengue (FDSA/Severe) . Interestingly, infection with DENV - 4 suggested clinical and laborat ory characteristics milder compared to epidemics by other serotypes. Regardless of gravity, DENV - 4 patients presented high levels of TNF - α, IL - 10, CCL2/MCP - 1, CXCL8/IL - 8, CXCL10/IP - 10 and CX3CL1/Fractalkine, but not IL - 1β and CCL5/ RANTES compared to healt hy controls. Our strategy to assess the capacity change the permeability of monolayers HMVEC - d was to group the patients into two groups, high (n = 5) and low (n = 5) TNF - α producers, IL - 1β and CXCL8 / IL - 8. Surprisingly, the serum levels of TNF - α, IL - 1β and CXCL8/IL - 8 did not significantly influence the measurement of TEER. Of the 10 patients, 4 did not alter the extent TEER and 6 changed at some point in kinetics. Blocking chemokine did not influ ence the measurement of TEER on the established conditions. Correlation analysis indicated a trend of serum levels of IL - 1β patients and CXCL8/IL - 8 and CX3CL1/Fractalkine protect monolayer of changes, while this protection appears to have been more effective with respect to serum CCL5/RANTES. These data suggest th at the DENV - 4 appears to lead to dengue in milder form in patients, combined with a reduction of clinical and laboratory parameters associated with severity. Chemokines and cytokines are present in high serum levels in these patients and seem to be autorre gulated. Among inflammatory mediators, such as chemokine CCL5/RANTES impactful seems to influence the change in permeability of endothelial cells, which was not confirmed by blocking assays, but for the direct correlation of serum levels of CCL5/RANTES wit h the measure of TEER

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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenheria Química / Made available in DSpace on 2012-10-26T11:44:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310455.pdf: 2080034 bytes, checksum: 993b07bab45f8503528bdf92a77cbdb5 (MD5) / Pesquisadores estão buscando soluções baseadas na adequação do microambiente físico para controlar respostas biológicas. Estudos recentes sugerem que alterações no microambiente influenciam substancialmente o comportamento das células endoteliais e apenas recentemente propriedades topográficas foram incorporadas como um componente essencial para a engenharia de tecidos vasculares. A celulose bacteriana (CB) tem sido investigada como biomaterial. A CB sintetizada pela bactéria Gluconacetobacter hansenii em condições de cultura estáticas forma uma membrana na interface entre o ar e o meio de cultivo. A membrana é constituída de uma superfície pelicular lisa (SP-BCM) formada na interface ar; seguida por uma região tecidual esponjosa (ST-BCM) que se estende até a outra superfície de interface com o meio de cultivo. Em condições agitadas de cultura bacteriana foram obtidas macroestruturas de CB meta-vascularizada. Adesão, viabilidade, proliferação, migração e morte celular das células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) foram avaliados em função das características de superfície da CB (ST-BCM e SP-BCM ). As HUVECs aderem em ambas as superfícies da CB, apresentando-se morfologicamente arredondas na ST-BCM e espraiadas na SP-BCM. As HUVECs permaneceram viáveis em ambas as superfícies da membrana de CB após 20 dias de cultura, mas em maior quantidade na ST-BCM possivelmente pela capacidade de penetração, das HUVECs através desta superfície. Após três dias de cultura, houve declínio de viabilidade celular em ambas as superfícies da CB, sendo mais pronunciada na SP-BCM. A morte celular foi experimentalmente identificada como necrose, mas acredita-se que necrose secundária seja a causa da morte celular. Após caracterização do comportamento das HUVECs nas superfícies da CB as macroestruturas de CB foram endotelizadas. A endotelização dos meta-vasos da macroestrutura da CB foi alcançada após 30 dias de cultivo das HUVECs no interior dos vasos. A macroestrutura de celulose bacteriana mostrou ser uma plataforma promissora para o desenvolvimento de tecidos ou órgãos vascularizados, por permitir a endotelização, que compreende uma das etapas mais críticas dos processos in vitro / Researchers have focused on solutions for adequacy of the physical microenvironment to control biological responses. Recent studies suggest that changes in the microenvironment greatly influence the behavior of endothelial cells and topographic properties have only recently been incorporated as an essential component of vascular tissue engineering. Bacterial cellulose (BC) synthesized by the bacterium Gluconacetobacter hansenii in static culture conditions as a membrane at the air/medium interface has been investigated as a biomaterial. The CB membrane obtained consists of a smooth peel surface (SP-BCM) formed at the interface with air, followed by a spongy tissue surface (ST-BCM), which extends to the other surface of interface with the medium. Under agitation conditions into the bacterial culture medium were obtained meta-vascularized BC macrostructures. Cell adhesion, viability, proliferation, migration and cell death of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) regarding their interaction with the surface properties of the membrane of BC (SP-BCM and ST-BCM) were evaluated. The HUVECs adhere to both surface of the BC and displays a morphologically rounded shape in the ST-BCM but an elongated feature as in SP-BCM. HUVECs remained viable in both surfaces of BC membrane even after 20 days of culture, but in higher quantities in the ST-BCM possibly due to the HUVECs capacity for invading that surface. After a 3-day period of culture, cell viability decrease in both BC surfaces, mainly on SP-BCM. Cell death was identified as necrosis, but interestingly its feature suggests that cell death was due to a secondary necrosis. After characterization of HUVEC lineage behavior on the both surfaces of BC membrane, the macrostructure was endothelized. The endothelization process of meta-vessels inside of BC macrostructure was attained after a period of 30 days of HUVECs-culture. The BC macrostructure properties has shown promising as a 3D-platform for development of vascular tissues or organs, by allowing endothelization, which comprises one of the most critical events of in vitro cell processes

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 324044.pdf: 2594337 bytes, checksum: 07471dd5db5dbfb3c45335c21797e8d2 (MD5) Previous issue date: 2013 / Inúmeros estudos relacionados à formação de vasos sanguíneos abordam ocorrência de atividade moduladora exercida por produtos naturais no microambiente das células endoteliais. A própolis vem sendo investigada como uma candidata à modulação angiogênica. Entre seus constituintes químicos, encontram-se ácidos fenólicos, ésteres, flavonóides, terpenos, beta-esteróides, aldeídos aromáticos, sesquiterpenos e estilbeno-terpenos, entre outros grupos, sendo que sua composição pode variar de acordo com a fonte botânica do exsudato coletado, bem como das condições ambientais. O extrato hidroalcoólico de própolis coletado no outono/2010 no planalto serrano (município de São Joaquim) teve a sua ação investigada na viabilidade celular, na capacidade de proliferação, na função migratória e na tubulogênese de células endoteliais de veia umbilical humana. Esse extrato apresentou teores elevados de ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido clorogênico e seus ésteres como o ácido isoclorogênico A e ácido isoclorogênico C) e do flavonoide quercetina. O extrato (100 - 200 µg/ml) produziu citotoxicidade e diminuição dos mecanismos de proliferação, migração e tubulogênese. Ele também foi capaz de reverter o efeito proliferativo do fator de crescimento vascular endotelial nas células endoteliais. A atividade da metaloproteinase-9 não foi alterada com 200 µg/ml do extrato. Porém, esta mesma concentração inibiu a atividade proliferativa da proteína quinase C e promoveu um efeito aditivo na inibição do efeito proliferativo da enzima cicloxigenase 1 e 2. Além disso, a administração do composto puro quercetina isoladamente (40 µM) ou em associação com o extrato (200 µg/ml), inibiu a proliferação celular. No ensaio de morte celular, evidenciou-se uma tendência à ação pró-necrótica do extrato. Quando o extrato de própolis foi administrado, in vivo, em membranas extra-embrionárias de Gallus domesticus, observou-se significativa inibição dos processos de vasculogênese e angiogênese. Os resultados desses ensaios in vitro e in vivo evidenciam o efeito modulador do extrato hidroalcoólico de própolis outonal catarinense na formação de vasos sanguíneos indicando aplicação em condições patológicas caracterizadas e sustentadas por uma angiogênese excessiva.<br> / Abstract : A number of studies regarding the formation of blood vessels approach the occurrence of modulatory activity exerted by natural products in the microenvironment of endothelial cells. Propolis has been investigated as a candidate for angiogenic modulation. Among the chemical constituents of that complex matrix are phenolic acids, esters, flavonoids, terpenes, beta-steroids, aromatic aldehydes, terpenes, sesquiterpenes, stilbenes and others groups, and its composition may vary according to the botanical source of exudates collected as well as, the environmental conditions. Hydroalcoholic propolis extract collected at autumn/2010 in Santa Catarina State (São Joaquim county) was investigated regarding its action on the cell viability, proliferation and migration, and also on the tubulogenesis of human umbilical vein endothelial cells. This extract has showed a high content of phenolic acids (gallic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid and its ester derivates isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C) and the flavonoid quercetin. Propolis extract displayed cytotoxic activity (100 - 200 µg/ml) and decreased the mechanisms of proliferation, cell migration, and vascular tubulogenesis. The propolis extract was also able in to reverse the proliferative effects of vascular endothelial growth factor on endothelial cells. Activity of metalloproteinase-9 was not influenced by 200 µg/ml extract. However, this treatment inhibited the proliferative activity of protein kinase C and promoted an additive effect in the inhibition of proliferative effect carried by cyclooxygenase 1 and 2. Moreover, the pure compound quercetin when administered alone (40 µM) or in association with the extract inhibited the cell proliferation. Cell death assay showed a tendency a pro-necrotic action by the extract under study. When administered in vivo in extra-embryonic membranes of Gallus domesticus, the propolis extract promoted a significant inhibition of the vasculogenesis and angiogenesis. Taken together, the in vitro and in vivo findings evidence the modulatory effects of propolis extract studied on the blood vessels formation, and suggest application in morbidities characterized and sustained by excessive angiogenesis.

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O hormônio melatonina produzido pela glândula pineal no período de escuro, participa na regulação circadiana de processos, fisiológicos e fisiopatológicos envolvendo vasos sanguíneos. Alguns destes estudos sugerem que as células endoteliais, que revestem os vasos sanguíneos são alvo para a melatonina circulante e medeiam a regulação do tônus vascular, em condições fisiológicas, e da interação neutrófilo-endotélio, em resposta a um estímulo injuriante. O óxido nítrico produzido pelas células endoteliais é um dos responsáveis por grande parte dos eventos vasculares, e a melatonina inibe a produção de óxido nítrico em diversos modelos. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da melatonina na produção de óxido nítrico induzido por bradicinina em células endoteliais em cultura. Para tanto, utilizamos uma técnica de cultura primária de células endoteliais de rato e através de um marcador fluorescente de óxido nítrico intracelular, mensuramos a fluorescência em microscópio confocal. Foi verificado que a melatonina e seu precursor N-acetilserotonina inibem a produção de óxido nítrico induzido por bradicinina e este efeito não ocorre pela inibição do aumento de cálcio que induz a produção de óxido nítrico. O análogo de receptores MT2 (4P-PDOT) e MT3 (5-MCA-NAT) não provocaram qualquer alteração sobre o aumento de óxido nítrico induzido por bradicinina, e a utilização do antagonista de receptores MT1 e MT2 (luzindol) não reverteu o efeito inibitório da melatonina. Portanto, nossos dados indicam que o efeito da melatonina sobre a atividade da NOS constitutiva não é mediado por receptores de membrana. Considerando que a melatonina é capaz de ligar-se à calmodulina, inibindo desta maneira a atividade da NOS endotelial constitutiva, poderíamos sugerir que este seria o mecanismo de ação. No entanto, é preciso ressaltar que tal atividade não é comprovada para a N-acetilserotonina, assim, apesar de ser este um possível mecanismo de ação, há a necessidade de demonstrar que a N-acetilserotonina está se ligando a calmodulina extraída de células endoteliais. Em resumo, neste trabalho mostramos que a melatonina em concentrações compatíveis com o pico noturno encontrado na circulação, pode modular eventos vasculares no organismo, através da inibição da produção de óxido nítrico em células endoteliais induzida por bradicinina. / Melatonin, the hormone synthesized by the pineal gland at night, signalizes darkness and modulates, in a circadian basis, blood vessels activity. Previous studies suggest that endothelial cells are the target for circulating melatonin and mediate changes in vascular tone and leukocyte-endothelial adherence properties. Melatonin effects can be mediated by several pathways, such as G protein-coupled receptors (MT1 and MT2 receptors), a putative membrane receptor, most probably an enzyme-binding site (MT3 receptor), and several intracellular mechanisms, including calmodulin binding and inhibition of constitutive and induced nitric oxide synthase. The aim of the present study was to characterize melatonin effect on the production of nitric oxide by bradykinin-stimulated endothelial cells in culture. Nitric oxide production was measured in real time at cellular level by detecting fluorescent stimulation of the probe DAF by confocal microscopy. After determining the ideal conditions for recording cumulative dose-response curves for bradykinin (1 – 100 nM) the effect of pre-incubated (1 min) melatonin and analogs was evaluated. Melatonin and its precursor, N-acetylserotonin, but not the selective ligands for receptors MT2 (4P-PDOT) and MT3 (5-MCA-NAT) receptors inhibited bradykinin-stimulated nitric oxide production. This effect was not blocked by the classical antagonist of MT1 and MT2 receptors, luzindol; excluding therefore the participation of membrane receptors. Taking into account that melatonin inhibits calmodulin activation of several enzymes, including constitutive nitric oxide synthase in brain and cerebellum, it could be suggested a similar mechanism for endothelial cells. However, this hypothesis is discussed taking into account that N-acetylserotonin was shown to do not bind neural cells calmodulin. In addition, here we discuss the relevance of the present finding according to physiological and physiopathological roles of endothelial nitridergic system. This analysis point melatonin modulation of constitutive nitric oxide synthase activity as a putative mechanism for explaining melatonin control of vascular tone.

A melatonina é produzida pela glândula pineal somente durante o escuro e atinge rapidamente a circulação, além disso, outros tecidos e células são capazes de produzir melatonina. As células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes alvos para as ações da melatonina. O entendimento dos mecanismos de ação pelos quais a melatonina desenvolve seus efeitos sobre as células endoteliais, possibilitaria o uso desta indolamina e de seus análogos como uma importante ferramenta farmacológica. No presente trabalho, demonstramos que a melatonina em concentrações compatíveis com as encontradas na circulação durante o pico noturno de produção pela pineal, atua sobre as células endoteliais inibindo a produção de NO proveniente da enzima constitutiva (eNOS), enquanto altas concentrações de melatonina, que podem ser atingidas por exemplo pela produção por células imunocompetentes ativadas, inibem a produção induzida de NO mediada pela iNOS. A melatonina (1 nM) inibe a produção constitutiva de NO induzida por agonistas que atuam através da ativação de receptores acoplados à proteína G (histamina, carbacol e ATP/P2Y), e este efeito deve-se à inibição do aumento de [Ca2+]i por liberação de estoques intracelulares, sendo independente da ativação de receptores de melatonina. A melatonina inibe os efeitos decorrentes da produção de NO induzida por bradicinina como a produção de GMPc por células endoteliais e a vasodilatação de arteríolas \"in vivo\". A melatonina inibe a produção de NO induzida por LPS também de maneira independente da ativação de seus receptores, porém, em concentrações muito maiores (1-10 µM) do que a necessária para inibir a produção constitutiva. Estes efeitos devem-se à inibição da expressão da enzima iNOS por impedir a translocação do NF-kB ao núcleo. A vasodilatação de aortas induzida por LPS também é inibida por melatonina. Podemos concluir até o momento que as células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes sensores para as ações da melatonina e podem auxiliar no melhor entendimento do conceito \"eixo imune-pineal\". Os estudos sobre os mecanismos pelos quais a melatonina atua em condições fisiológicas e fisiopatológicas são essenciais para se conhecer o potencial terapêutico da melatonina. / Melatonin, the darkness hormone, produced at night by the pineal gland, is also synthesized in a non-rhythmic manner by other cells. Pineal and extra-pineal melatonin reaches endothelial layer, and the understanding of its mechanism of action will improve the possibilities of using this indolamine and derivates as pharmacological tools. Here we showed that melatonin, in concentrations compatible to nocturnal melatonin surge impairs the activity of eNOS, while much higher concentrations, which can be attained by activated immune competent cells, impair the induction of iNOS synthesis. As a consequence of inhibiting eNOS we showed that melatonin inhibits vasodilation of the microcirculation induced by bradykinin. The inhibitory effect of melatonin is observed only when eNOS is activated by triggering G protein-coupled receptors (bradykinin B2, muscarinic and P2Y purine receptors). Activation of eNOS by calcium-channel operated receptors (P2X) is not blocked by melatonin. Inhibition of the transcription of iNOS results in inhibition of the LPS-induced vasodilation of rat aorta. As a matter of fact, here we show that LPS effect is dependent on the endothelial layer. The mechanism of action of melatonin in inhibiting iNOS transcription is due to block of the NF-kB pathway. Our work contributed to unravel the role of endothelium cells as targets for melatonin and as a key player in the \"immune-pineal axis\". The understanding of the concentrations ranges reached by endogenous production, i.e., the discrimination between the levels achieved during physiological and physiopathological responses, are essential for using these substances as analogous therapeutical tools.