O endotélio é uma monocamada de células achatadas, poligonais e interligadas que recobrem a superfície posterior da córnea, sendo fundamental na manutenção da transparência desta estrutura. Embora as chinchilas (Chinchilla lanigera) sejam utilizadas em pesquisas oftálmicas, não existem dados referentes ao endotélio da córnea nesta espécie. Portanto, objetivou-se avaliar a densidade celular, a paquimetria, a área celular média e a morfologia do endotélio da córnea de chinchilas em diferentes faixas etárias. Foram estudados 60 bulbos oculares de 30 chinchilas, machos ou fêmeas, de diferentes faixas etárias. As chinchilas foram subdivididas em três grupos com 10 animais cada, designados por: G I (animais com idade entre dois a quatro meses); G II (animais com 11 meses de idade) e G III (animais com quatro anos de idade). A densidade celular endotelial média nos animais dos grupos G I, G II e G III foi de respectivamente 3385,39 ± 507,53, 2565,51 ± 220,46 e 1812,82 ± 117,92 células/mm2. A área celular média foi de respectivamente 301,51 ± 43,94, 392,46 ± 33,34 e de 553,79 ± 35,70 μm2 para G I, G II e G III. Os resultados apontam decréscimo da densidade, do pleomorfismo, e aumento da área celular média com o aumento da idade. A espessura da córnea aumentou em animais mais velhos. Conclui-se que o endotélio da córnea de chinchilas sofre alterações com o avanço da idade. / The corneal endothelium is a monolayer of interconnected flattened polygonal cells that cover the back surface of the cornea, it is essential for the maintenance of its transparency. Due to the complete lack of data on the endothelial cells of chinchilla (Chinchilla lanigera) and its possible use as an animal model in ophthalmic research, the objective was to evaluate the cellular density, pachymetry, the average cell area and morphology of the corneal endothelium of chinchillas in different age groups. It was studied 60 eyes of 30 chinchillas, male or female, of different ages. Chinchillas were divided into three groups with 10 animals each, designated by: G I (animals aged two to four months), G II (animals with 11 months) and G III (animals with four years of age). The mean endothelial cell density in the animals of G I, G II and G III were respectively 3385,39 ± 507,53, 2565,51 ± 220,46 and 1812,82 ± 117,92 cells/mm2. The average cell area was respectively 301,51 ± 43,94, 392,46 ± 33,34 and 553,79 ± 35,70 μm2 for GI, G II and G III. The results indicate a decrease in density, pleomorphism, and increased in average cell area with increasing age. Corneal thickness increased in older animals. The corneal endothelium of chinchillas changes with advancing age.

Orientador: Joyce Maria Anichino-Baizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:05:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alessio_AlineMorandi_D.pdf: 8973520 bytes, checksum: 3a7a6ff893220f5bdd3d1d52da276f91 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As células endoteliais participam da hemostasia com efeitos pró e antitrombóticos, que podem ser estimulados por uma lesão endotelial. A presença de células endoteliais na circulação pode ser considerada um novo marcador de integridade vascular, como já descrito em várias patologias tais como: doenças cardiovasculares, doenças infecciosas, doenças imunes, transplantes, anemia falciforme. Os objetivos do nosso estudo foram: padronizar a identificação e quantificação das células endoteliais circulantes (CECs) e das células endoteliais progenitoras (CEPs) em um grupo de pacientes com trombose venosa profunda (TVP) ao diagnóstico (aguda, 1ª coleta) e após no mínimo 6 meses (2ª coleta), em um grupo de TVP crônica e em um grupo controle; padronizar um modelo animal de TVP induzida por lesão endotelial para avaliar as CECs e CEPs no sangue periférico e no trombo venoso. O grupo de TVP aguda foi composto por 9 pacientes [F: 7; M: 2; 45 anos (26 - 54 anos)], sendo recrutados 6 indivíduos para uma 2ª coleta [F: 5; M: 1; 47,5 anos (27 - 55 anos)], no grupo de TVP crônica foram incluídos 10 pacientes [F: 6; M: 4; 44,5 anos (28 - 56 anos)] e no grupo controle 11 voluntários [F: 9; M: 2; 29 anos (21 - 52 anos)]. A identificação das CECs e CEPs no sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. No modelo animal, a TVP foi induzida por lesão endotelial com uma solução de FeCl3 a 15%. Após a indução da TVP as CECs e CEPs foram avaliadas no sangue periférico nos tempos: 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 24 horas, 48 horas e 72 horas. O trombo venoso formado na veia cava inferior (VCI) foi avaliado pela coloração de Verhoff van Gienson e a presença de CECs e CEPs por imunofluorescência. Houve uma diferença estatística no número das CECs (P=0.001, CD31+CD144+CD45dimCD133-; P<0.001, CD31+CD146+CD45dimCD133-; P=0.002, CD31+VEGFR2+CD45dimCD133-) entre os grupos estudados, com um aumento importante nos pacientes com TVP aguda. Os grupos de TVP crônica e TVP 2ª coleta mostraram um aumento significativo de CECs em relação aos controles. Não houve diferença estatística no número das CEPs (CD34+VEGFR2+CD45dimCD133-) entre os grupos estudados, porém observou-se um aumento no grupo de TVP aguda. No modelo animal, a oclusão total da VCI foi verificada entre 15 minutos e 1 hora. Após 24 horas ocorreu uma diminuição progressiva da área do trombo formado [85,4% (24h); 65,4% (48h); 51,3% (72h)], e não foram observadas CECs e CEPs no mesmo. No sangue periférico, no tempo de 48 horas houve um aumento importante de CECs e CEPs quando comparado com os outros tempos estudados (P=0.001, Sca1-VEGFR2+CD45dim; P=0.004, CD34-VEGFR2+CD45dim; P<0.001,Sca1+VEGFR2+CD45dim; P<0.001, CD34+VEGFR2+CD45dim). Os resultados observados em camundongos e humanos sugerem que as CEPs podem ser recrutadas da medula óssea para a circulação, participando do processo de reparo endotelial. O aumento de CECs na fase em que se inicia o processo de recanalização no modelo animal, sugere que apesar da lesão endotelial inicial, as mesmas somente são liberadas quando o fluxo começa a ser restabelecido. Neste estudo concluímos que as CECs podem constituir um marcador de dano vascular. / Abstract: Endothelial cells participate in hemostasia and have pro and anti -thrombotic effects which can be stimulated by an endothelial lesion. The presence of endothelial cells in circulation can be considered a novel marker of vascular integrity, as described in several pathologies, such as: cardiovascular disease, infectious disease, immune diseases, transplants, and sickle cell anemia. The aims of our study were to: standardize the identification and quantification of circulating endothelial cells (CECs) and progenitor endothelial cells (EPCs) in a group of patients with Deep Vein Thrombosis (DVT) at diagnosis (acute, 1st collection) and after a minimum of six months (2nd collection), in a group with chronic DVT and in a control group; standardize an animal model with DVT induced by endothelial lesion in order to evaluate CECs and EPCs in peripheral blood and in venous thrombosis. The group of DVT was composed of 9 patients [F: 7; M: 2; 45 years old (y.o.) (26 - 54 y.o.)], of which six individuals were recruited for the 2nd collection [F: 5; M: 1; 47.5 y.o. (27 - 55 y.o.)]; in the chronic DVT group 10 patients were included [F: 6; M: 4; 44.5 y.o. (28 - 56 y.o.)]; and in the control group 11 volunteers were included [F: 9; M: 2; 29 y.o. (21 - 52 y.o.)]. The identification of CECs and EPCs in peripheral blood was carried out by flow cytometry. DVT was induced in the animal model by endothelial lesion using a FeCl3 solution at 15%. After DVT induction, CECs and EPCs were evaluated in peripheral blood at: 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 24 hours, 48 hours and 72 hours. The venous thrombus formed in the inferior cava vein (ICV) was evaluated using Verhoff van Gienson stain and the presence of CECs and EPCs was evaluated using immunofluorescence. There was a statistical difference in the number of CECs (P=0.001, CD31+CD144+CD45dimCD133-; P<0.001, CD31+CD146+CD45dimCD133-; P=0.002, CD31+VEGFR2+CD45dimCD133-) between the groups studied, with a significant increase in acute DVT patients. The chronic DVT and 2nd collection DVT groups demonstrated a significant increase in CECs in relation to the controls. There was no statistical difference in the number of EPCs (CD34+VEGFR2+CD45dimCD133-) among the groups studied, however an increase in the acute DVT group was observed. In the animal model, total ICV occlusion was observed between 15 minutes and 1 hour. After 24 hours a progressive decrease in the area of the formed thrombus occurred [85.4% (24h); 65.4% (48h); 51.3% (72h)], and no CECs or CEPs were observed. After 48hours, there was a significant increase in CECs and EPCs in peripheral blood when compared to other periods studied (P=0.001, Sca1-VEGFR2+ CD45dim; P=0.004, CD34-VEGFR2+CD45dim; P<0.001, Sca1+VEGFR2+CD45dim; P<0.001, CD34+VEGFR2+CD45dim). The results observed in mice and human beings suggest that EPCs can be recruited to circulation from the bone marrow, participating in a process of endothelial repair. The increase of CECs during the phase when the re-channeling process begins in the animal model, suggests that despite the initial endothelial lesion, CECs are liberated when the flow is reestablished. In the present study we concluded that CECs can represent a vascular damage marker. / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Ciências

As doenças cardiovasculares ainda são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. E a aterosclerose é uma das principais precursoras de vários desfechos clínicos como isquemias e infarto do miocárdio. As placas ateroscleróticas se desenvolvem preferencialmente em regiões de bifurcação ou curvatura dos vasos, onde o shear stress (SS) encontra-se diminuído ou perturbado. A expressão de proteínas pró-aterogênicas em regiões de baixo SS e ateroprotetoras em regiões de SS alto foram relatadas na literatura, porém o mecanismo completo carece de elucidação. Este trabalho teve por objetivo integrar proteômica e metabolômica para um melhor entendimento das alterações moleculares que acontecem nas células endoteliais em situações de alto e baixo SS, que podem resultar no desenvolvimento de lesões e placas ateroscleróticas. Para esta finalidade, células endoteliais foram submetidas a alto e baixo SS em sistema cone plate, seguido de análise proteômica e metabolômica por espectrometria de massas. Nossos dados demonstraram que o metabolismo de lipídio e metabolismo de modificações pós-traducionais de proteínas (N-glicosilações) estavam diminuídos em baixo SS. Em relação ao metabolismo de lipídio, foi identificada diminuição na concentração de ácidos graxos e na expressão de enzimas e proteínas transportadoras de lipídios em células sob baixo SS. O receptor de LDL, proteína importante para a homeostase do colesterol, foi identificado em menor concentração na membrana, bem como com alteração no seu perfil de glicosilação em células após baixo SS. As células submetidas a baixo SS e, portanto, aquelas com perfil pró-aterogênico, quando tratadas com estatina para o aumento da expressão de LDLR, aproximaram seu fenótipo ao de células submetidas a alto SS, adquirindo parte de um fenótipo ateroprotetor, com recuperação dos níveis de aminoácidos, lipídios, açúcares e ácidos carboxílicos. Os dados deste trabalho sugerem que o metabolismo de lipídios é um processo importante na manutenção do perfil ateroprotetor de células submetidas a alto SS. Além disso, as evidências demonstraram que estatinas apresentam uma atividade protetora, não apenas sistêmica, com diminuição do LDL circulante, mas também no microambiente vascular, contribuindo para o bom funcionamento das células endoteliais / Cardiovascular diseases are the main cause of the mortality and morbidity worldwide. Atherosclerotic plaque development is closely associated to the hemodynamic forces applied to endothelial cells (EC). Among these, shear stress (SS) plays a key role in disease development since changes in flow intensity and direction could stimulate an atheroprone or atheroprotective phenotype. EC under low and/or oscillatory SS (LSS) have upregulation of inflammatory proteins, adhesion and cellular permeability molecules. On the contrary, cells under high/laminar SS (HSS) increase their expression of protective and anti-inflammatory factors. The mechanism behind the SS regulating an atheroprotective phenotype is not completely elucidated. Here we used proteomics and metabolomics to better understand the changes suffered by endothelial cells under LSS and HSS that promote the atheroprone and atheroprotective profile and how these modifications can be connected to atherosclerosis development. Our data showed that lipid metabolism and post translational modification protein metabolism were downregulated in cells under LSS. About lipid metabolism, we found the LDLR, one important protein in cholesterol homeostasis, showed significant alterations both at the quantitative expression level, as well as regarding post-translational modifications. Under LSS, LDLR was seem at lower concentrations and with a different glycosylation profile. Finally, modulating LDLR with atorvastatin led to the recapitulation of an HSS metabolic phenotype in EC under LSS. The phenotype was recovery based on increasing of amino acids, lipids, sugars and carboxylic acids. Altogether, our data suggest lipid metabolism is important in atheroprotective phenotype of endothelial cells under HSS. Statins showed benefits not only systemic, decreasing cholesterol level in blood, but also in vascular environment, contributing for protector phenotype of endothelial cells

A grande procura da humanidade por meios que favoreçam uma vida saudável tem impulsionado as pesquisas por novas substâncias capazes de satisfazer tais necessidades, e entre estas substâncias encontram-se os fitoestrógenos. Processos biológicos relacionados a Doenças Cardiovasculares (DCV) e outras doenças podem ser afetados por essas substâncias presentes em plantas. O fitoestrógeno resveratrol é um polifenol especialmente encontrado na uva e seus derivados, e sua ingestão tem sido associada à baixa taxa de mortalidade por câncer e DCV. Os fitoestrógenos das plantas possuem semelhança estrutural e funcional com o estrógeno, com propriedades que beneficiam o metabolismo celular através de ação antioxidante e antiagregante plaquetária. O endotélio é o principal alvo da ação dos estrógenos. Eles promovem a redução do engrossamento da parede vascular, aceleram o processo de reconstrução do endotélio após injúria vascular e favorecem a angiogênese. Os estrógenos diminuem a expressão de moléculas de adesão em resposta à citocinas e possuem efeito anti-apoptótico nas células endoteliais. Polifenóis são fitoestrógenos com alto potencial antioxidante presentes em frutas, grãos, vegetais, nozes e raízes. Estes compostos vêm sendo amplamente estudados por seus efeitos na supressão de tumores e na prevenção de DCV em modelos animais. Neste estudo, temos como objetivo geral avaliar a ação do resveratrol na produção de óxido nítrico e prostaglandina E2 em modelo in vitro de células endoteliais da linhagem ECV 304, bem como atividade antioxidante. O objetivo específico é determinar a melhor concentração do resveratrol em que se observa uma potente liberação de substâncias vasoativas e maior proteção contra radicais livres, conferindo proteção e prevenção de DCV. / The vast search of humanity for ways that favors a healthy life has driven the researches for substances capable of meeting such needs, and among these substances there are the phytoestrogens. Biological processes related to Cardiovascular Disease (CVD) and other illness can be affected by these substances present in plants. The phytoestrogen resveratrol is a polyphenol specially found in grapes and derivates, and its ingestion has been associated to low mortality rates by cancer and CVD. The plants phytoestrogens are similar structurally and functionally with estrogens, with properties that benefit cellular metabolism through their antioxidant and antiplatelet action. The endothelium is estrogen´s major target. They reduce thickening of the vascular wall, accelerate the reconstruction process of vascular endothelial after injury and promote angiogenesis. The estrogens decrease the expression of adhesion molecules in response to cytokines and have antiapoptotic effect on endothelial cells, and promotes raising in nitric oxide (NO) production. Polyphenols are phytoestrogens with high antioxidant effect present in fruits, grains, vegetables, nuts and roots. These compounds have been extensively studied due to their effect on tumors suppression and CVD prevention in animal models. In this study, we evaluated resveratrol´s action in nitric oxide production and prostaglandin E2 in in vitro model of endothelial cells ECV304, as well as it´s antioxidant activity. The specific objective is to determine the best concentration of resveratrol in which observes a potent liberation of vasoactive factors and the best anti free radical activity, leading to protection and prevention of CVD.

Orientador: Marta Helena Krieger / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T08:07:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Negreti_AmandaAlvim_M.pdf: 4855920 bytes, checksum: 587474864a97f3d14df8bf3c945ee76b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O óxido nítrico (NO) é um agente biológico multifuncional que vem sendo alvo de diversos estudos. A sua capacidade de promover a reendotelização ou inibir a formação da neointima após injúria vascular é reconhecida nos últimos anos devido a sua eficácia em atuar na proliferação e na migração de células endoteliais, bem como na sua capacidade de inibir a adesão e agregação plaquetária. A neointima intra-stent pode ser combatida com o desenvolvimento de stents eluidores de drogas (SED). Os nitrosilos complexos de rutênio se destacam dentre os doadores de NO, devido a sua capacidade de liberar o NO de forma controlada e incorporados a veículos. Este estudo se propôs padronizar as condições de cultivo das células endoteliais umbilicais humana (HUVEC) "saudáveis", verificar a margem de segurança do composto trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, nomeado Ru(cyclam)NO, em células HUVEC por meio de ensaios de citotoxicidade, verificar sua capacidade de promover proliferação/migração celular e a inibição da adesão de plaquetas humanas, e, também verificar a biocompatibilidade deste composto quando incorporados em plataformas de aço. Expressão de proteínas fenotípicas da célula endotelial foi utilizada para padronização de cultivo de HUVEC. A concentração de 0,5mM foi definida como ótima nas condições experimentais. A ação do composto foi caracterizada pelas respostas de manutenção da proliferação (incorporação de timidina triciada - 3HT) e no aumento da migração celular (ensaio transwell), entretanto foi capaz de reduzir as ações estimulatórias do fator de crescimento epidermal (EGF). A citotoxicidade do complexo e das plataformas de incorporação foi determinada por ensaio de redução do 3-brometo de 4,5-dimetil-2-tiazolil-2,5-difenil-tetrazólio (MTT). Em relação ao nitroprussiato de sódio (SNP) a toxicidade induzida pelo composto nas concentrações de 0,5mM a 2,0mM foi reduzida, mesmo na maior concentração após 24 horas de exposição (MTT: 59% ± 4,42). O complexo mostrou ser capaz de reduzir a adesão ao fibrinogênio de plaquetas humanas ativadas ou não. A biocompatibilidade total das plataformas de inox, matriz de siloxano e matriz de siloxano incorporado com Ru(cyclam) foram demonstradas pelo ensaio de redução de MTT e a funcionalidade pelo ensaio de migração transwell. A margem de segurança do Ru(cyclam)NO e de suas respectivas plataformas de imobilização foram caracterizadas como baixa e ausente citotoxicidade. As avaliações funcionais evidenciaram que o Ru(cyclam)NO manteve a proliferação celular, estimulou a migração das HUVEC e inibiu a adesão de plaquetas humanas. Estas evidências constituem-se de pontos fundamentais para se obter a reendotelização / Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifunctional biological agent that has been the subject of several studies. In recent years, its ability to promote re-endothelialization or inhibit neointimal formation after vascular injury is recognized due to its efficacy in stimulates proliferation and migration of endothelial cells, as well as its ability to inhibit platelet adhesion and aggregation. The in-stent neointimal can be prevented with the development of drug-eluting stents (DES). Nitrosyl ruthenium complexes highlighted from the NO donors, due to their ability to release NO in a controlled manner and incorporated into vehicles. This study aimed to: 1) standardize the cultivation conditions of " healthy " human umbilical endothelial cells (HUVEC); 2) verify the safety margin of the compound trans - [Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, named Ru(cyclam) O, in HUVEC cells by cytotoxicity assay; 3) determine its ability to promote proliferation/migration cell and inhibition adhesion of human platelets; and also 4) verify biocompatibility of this compound when incorporated in slides. Phenotypic expression of the endothelial cell protein was used to standardize cultured HUVEC. A concentration of 0.5 mM was set to the optimal experimental conditions. The Ru(cyclam)NO action was characterized by responses of the proliferation maintenance (tritiated thymidine incorporation - 3HT ) and migration cell increased (transwell assay), however was able to reduce the stimulatory actions of epidermal growth factor (EGF). The cytotoxicity of the compound and its incorporation slides was determined by reduction of 3- bromide, 4,5-dimethyl -2-thiazolyl -2 ,5 -diphenyl tetrazolium bromide (MTT). In relation to sodium nitroprusside (SNP), Ru(cyclam)NO showed reduced toxicity from 0.5 mM to 2.0 mM, even at the highest concentration that was 59% ± 4.42 of the cell viability. The Ru(cyclam)NO was shown to reduce adhesion to fibrinogen of human platelets activated or not. The total biocompatibility of stainless slide with siloxane matrix and siloxane matrix incorporated with Ru(cyclam)NO were demonstrated by MTT reduction assay and their functionality by transwell migration assay. The safety margin of Ru(cyclam)NO and their respective slide incorporated were characterized as low or absent cytotoxicity, respectively. Functional evaluations showed that the Ru(cyclam)NO maintained cell proliferation and stimulated the migration of HUVEC, well as well, inhibited adhesion of human platelets. These obtained evidences are key points to get the re-endothelialization / Mestrado / Fisiologia / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Cristina Pontes Vicente, Patrícia Muniz Mendes Freire de Moura / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:13:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_TaniaMariaRocha_D.pdf: 3499853 bytes, checksum: 2767ae0d1bab61dda96ce4765cd63588 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As células progenitoras endoteliais (EPCs) estão envolvidas em neovasculogênese e na manutenção da homeostase vascular, sua deficiência pode ter papel na patogênese da hipertensão. Este estudo teve como objetivo analisar o perfil de expressão das EPCs circulantes e diferentes fatores de risco cardiovascular em mulheres hipertensas, na pré-menopausa, em comparação com mulheres normotensas saudáveis. Realizou-se um estudo caso-controle com 45 mulheres voluntárias, faixa etária de 30 a 50 anos (41 ± 6) no Ambulatório do Pronto Socorro Cardiológico de Pernambuco. As EPCs definidas como CD45-/CD34+/KDR+ foram coletadas em sangue venoso periférico e analisadas por citometria de fluxo. As mulheres foram classificadas como controles (CT) saudáveis normotensas com PAS (pressão arterial sistólica) < 130 mmHg e PAD (pressão arterial diastólica) < 85 mmHg (n=15), com hipertensão primária: a) Leve (HL) PAS=140-159mm Hg e PAD=90-99 mmHg (n=15) e b) Severa (HS) PAS > 180 mmHg e PAD > 110 mmHg (n=15). Os grupos foram entrevistados quanto aos hábitos de fumo, prática de exercícios físicos e Índice de Massa Corporal (IMC), sendo aferido o nível da PA em repouso. Realizou-se análise nos prontuários dos resultados dos exames séricos de colesterol total, lipoproteínas de alta densidade-colesterol (HDL-c), lipoproteínas de baixa densidade-colesterol (LDL-c), triglicerídeos e glicemia de jejum, no mês da coleta das amostras sanguíneas. Os resultados comprovaram redução significativa ao número de EPCs no HL (74%) e HS (88%) versus CT; e redução de 67% no HS versus HL, evidenciando relação inversa entre o número de células e o estágio da hipertensão. O grupo HS apresentou aumento de 49% de células CD45+ demonstrando padrão inflamatório e redução de 61% de CD45-/CD34+. Quanto aos níveis séricos verificou-se: HDL-c [HL (52±7); HS (48±5)]; LDL-c [HL (130±8); HS (143±15)]; triglicerídeos [HL (138±19); HS(153 ±40)]; glicemia de jejum [HL(95±7);HS(121±39)] e IMC [HL(31±4);HS(29±3)]; revelando que 67% das mulheres com hipertensão severa apresentavam síndrome metabólica (SM). O desenvolvimento da hipertensão e da SM foi diretamente correlacionado com a diminuição das EPCs. Portanto, a contagem de EPCs pode ser considerada um marcador biológico adequado para indicar a gravidade do estado hipertensivo em mulheres / Abstract: Endothelial progenitor cells (EPCs) are involved in neovasculogenesis and maintenance of vascular homeostasis and their impairment may have a role in the pathogenesis of hypertension. This study aimed analyzes the expression profile of circulating EPCs and different cardiovascular risk factors in hypertensive premenopausal women compared with healthy normotensive women. A case-control study was conducted enrolling 45 women volunteers, aged from 30- 50 years (41 ± 6) in Ambulatory of the Cardiologic Emergency Hospital of Pernambuco. EPCs numbers were determined by flow cytometry in peripheral blood as the CD45-/CD34+/KDR+ cells. The women were classified as healthy normotensive controls (CT) with SBP (systolic blood pressure) <130 mmHg and DBP (diastolic blood pressure) < 85 mmHg (n=15), and with essential hypertension; a) mild (MH), SBP=140-159 mmHg and DBP=90-99 mmHg (n=15); and b) severe (SH), SBP>180 mmHg and DBP>110 mmHg (n=15). The group were interviewed regarding smoking habits, physical exercise and body mass index (BMI), and measured the level of blood pressure at quiescent. An analysis in records of test results cholesterol, high density lipoprotein-cholesterol (HDL-c), low density lipoprotein-cholesterol (LDL-c), triglycerides and fasting glucose in the month of collection of blood samples. The results found a significant reduction in circulating EPCs numbers in MH (74%) and SH (88%) when compared to the CT and reduction of 67% in SH when compared to MH, an inverse relationship between the number of cells and the stage of hypertension. SH group showed an increase of 49% CD45+ cells demonstrating inflammation and reduction of 61% CD45-/ CD34+ cells. Regarding the biochemical serum was found: HDL-c [MH (52±7); SH (48±5)]; LDL-c [MH (130±8); SH (143±15)]; triglycerides [MH (138±19); SH (153±40)]; fasting glucose [MH (95±7); SH (121±39)] and BMI [MH (31±4); SH (29±3)]; revealing that 67% of women with severe hypertension had metabolic syndrome (MS). Development of hypertension and the parameters related to MS are directly correlated with a decrease of circulating EPCs. Therefore, the EPCs counting may be considered a suitable biological marker to follow up the evolution of the hypertensive state in women / Doutorado / Biologia Celular / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Os riscos provocados pela Terapia de Reposição Hormonal, levaram à busca de novas terapias, como os fitoestrógenos. São substâncias com ação estrogênica e propriedades que podem retardar a formação de placas ateroscleróticas. Isoflavonas são os fitoestrógenos mais estudados e são encontradas na soja, no red clover e em outras plantas. Avaliamos os efeitos dos fitoestrógenos extraídos da soja Glycine max: genisteína, formononetina, biocanina A e daidzeína; a mistura entre eles (Mix1); o extrato padronizado de red clover (Menoflavon 40mg) e uma segunda mistura com os fitoestrógenos extraídos da Glycine max nas concentrações encontradas no Menoflavon (Mix2), na expressão de moléculas de adesão de leucócitos, VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina, em cultura de células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVEC), assim como na linhagem modificada de célula endotelial, ECV304, estimuladas com LPS. Resultados: foram padronizados os tempos e concentrações de exposição ao LPS no cultivo de HUVEC de 1ug durante 12 horas de exposição para as três moléculas de adesão; e no cultivo de ECV304 para a expressão de VCAM-1, de 500ng durante 12 horas, para ICAM-1 de 1ug durante 18 horas, para E-selectina 100ng durante 18 horas na superfície celular e 200ng durante 24 horas no sobrenadante de culturas de ECV304, permitindo que este tipo celular seja utilizado como modelo de inflamação. Os fitoestrógenos reduziram VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina na superfície celular assim como as formas solúveis dessas moléculas, tanto em ECV304 como em HUVEC, sendo efetivos como agentes preventivos e também para tratamento da aterosclerose. A mistura entre os fitoestrógenos não apresentou maior eficiência na redução das moléculas de adesão na superfície celular, mas apresentou diferenças significativas na produção das formas solúveis. Tanto em ECV304, quanto em HUVEC os fitoestrógenos extraídos do red clover e os extraídos da soja Glycine max reduziram as moléculas de adesão na superfície celular e no sobrenadante, sendo que o Menoflavon, apresentou maior efetividade na redução das moléculas de adesão que os fitoestrógenos extraídos da soja Glycine max, em HUVEC. Ocorreram interações entre os fitoestrógenos e o 17 estradiol, tanto em ECV304 quanto em HUVEC, principalmente quando este se encontrava em baixas concentrações, sugerindo proteção para mulheres na menopausa. Esses efeitos dos fitoestrógenos ocorreram via receptor de estrógeno, como demonstrado pela inibição de suas ações por ICI. Conclusão: tanto os fitoestrógenos extraídos da soja Glycine max quanto os extraídos do red clover apresentaram efeitos anti-aterogênicos, podendo atuar como cardioprotetores para mulheres pós-menopausa. / The risks of hormone replacement therapy have led to a search for new alternatives such as the use of phytoestrogens, plant compounds with estrogen-like biological activity. Isoflavones are the phytoestrogens most extensively studied and can be found in soy, red clover and other plants. Due this estrogen-like activity phytoestrogens can have some effect on atherosclerosis. We evaluated the effects of the phytoestrogens extracts from Glycine max soy: genistein, formononetin, biocanin A and daidzein; a Mix between them (Mix1); a standardized red clover extracts (Menoflavon 40mg) and a second Mix using phytoestrogens from Glycine max with same Menoflavon concentrations (Mix2) on adhesion molecules expression, VCAM-1, ICAM-1 and E-selectin by endothelial cell HUVEC, and by endothelial cell line ECV304, stimulated with LPS. Results: were standardized time and concentration to LPS exposure, being 1ug during 12 hours for the three adhesion molecules expression on HUVEC, and 500ng during 12 hours for VCAM-1 expression, 1ug during 18 hours for ICAM-1 expression and 100ng during 18 hours for E-selectin expression on cell surface as well as 200ng during 24 hours to E-selectin increase on culture supernadant, on ECV 304 cell line. The phytoestrogens decreased VCAM-1, ICAM-1 and E-selectin levels on cell surface and on culture supernadant in HUVEC and ECV304, being useful as preventive agents as well as treatment agents. Mix1 were not most effective than isolated phytoestrogens on cell surface, but presented decreased results on soluble forms. Menoflavon presented more effectiveness than Glycine max on HUVEC. Phytoestrogens interacted with 17 oestradiol mainly, in low concentrations (10pg), showing protection for post menopausal women. These phytoestrogens effects happened by oestrogen receptor activation, this was demonstrated through phytoestrogens inhibition by ICI. Conclusions: the phytoestrogens from Glycine max as well as phytoestrogens from red clover presented antiatherogenic effects, mainly when 17 estradiol is low, being usefull for postmenopausal women.

Óxido nítrico (NO) obtido a partir de fonts exógenas estimula a via de sinalização Ras/MAP cinases ERK1/2 em células endoteliais de coelho (RAEC). A ativação desta via também envolve a transativação do receptor de EGF (EGFR) mediada por ERK1/2 (Oliveira, 2003). Agora, nós avaliamos os efeitos de NO gerado endogenamente por bradicinina e \"shear stress\" sobre a fosforilação de resíduos de tirosina em EGFR e no processo de angiogênese; Nós encontramos que após estímulo com bradicinina (1 M) ou \"shear stress\" (16 dynes/cm2) a isoforma endotelial de NO sintetase (eNOS) foi ativada em células RAEC e HUVEC. Além disso, o aumento na produção de NO correlaciona-se com um aumento na fosforilação em resíduos de tirosina de EGFR conforme verificado por imunoprecipitação e western blot. Para determinar a capacidade angiogênica da via de sinalização NO-EGFR, nós usamos um ensaio in vitro baseado em Matrigel®. Em adição nós analisamos as vias de sinalização envolvidas no processo. Nós mostramos que bradicina e \"shear stress\" induz a formação de estruturas semelhantes a capilares em células HUVEC cultivadas em Matrigel®. Células HUVEC expressando um mutante de EGFR com atividade de tirosina cinase defective não forma estruturas semelhantes a capilares após estímulo com bradicinina ou \"shear stress\". Reunidos, estes achados nos sugerem que a ativação da via de NO e EGFR é necessária na promoção de angiogênese em células HUVEC / Nitric oxide (NO) obtained from exogenous sources stimulated the Ras/MAP kinases ERK1/2 signaling pathway in rabbit endothelial cells (RAEC). Activation of this pathway also involved the transactivation of the EGF receptor (EGF-R) mediated by ERK1/2 (FRBM 35:381; 2003). Now, we evaluate the effects of endogenously generated NO elicited by bradykinin and fluid laminar \"shear stress\" on tyrosine phosphorylation of the EGF receptor and in the process of angiogenesis. We found that upon stimulation with bradykinin (1 M) or under shear stress conditions (16 dynes/cm2) the endothelial isoform of NO synthase was activated in RAEC and in human endothelial cells (HUVEC). Furthermore, increase in NO production correlated with enhanced phosphorylation of tyrosine residues of the EGF-R as seen by immunoprecipitation and western blot analysis. To determine the importance of the NO-EGFR signaling pathway in angiogenesis, we used the Matrigel®-based in vitro assay for angiogenesis. In addition, we analyzed the signaling pathway involved in the process. We showed that bradykinin and shear stress induced the formation of capillary-like structures in HUVEC cultures grown in Matrigel®. HUVEC expressing a mutant of the EGF-R lacking tyrosine kinase activity did not form capillary-like structures upon stimulation with bradykinin or shear stress conditions. Taken together, these findings suggest that the activation of the NO-EGFR signaling pathway is necessary to promote angiogenesis in HUVEC

Neste estudo foram avaliados os efeitos das serinoproteinases PA-BJ e giroxina, isoladas dos venenos das serpentes Bothrops jararaca e Crotalus durissus terríficus, respectivamente, sobre células endoteliais (CEs) em cultura. Os resultados obtidos demonstraram que essas toxinas, nas concentrações utilizadas, não afetaram a viabilidade e a integridade das CEs. Por outro lado, induziram a liberação de PGI2, que foi significativamente reduzida por inibidores não seletivos e seletivos das ciclooxigenases -1 e -2 (COX-1 e -2), mas não afetaram a expressão protéica constitutiva das mesmas. Adicionalmente, foi demonstrado que o antagonista de receptores PAR-1, o SCH 79797, não alterou a liberação de PGI2, induzida pelas toxinas. Em conclusão, essas toxinas, em concentrações não citotóxicas, induziram a liberação de PGI2 a partir de CEs, de modo dependente da ativação das COX-1 e -2. Por outro lado, o receptor PAR-1 não parece ser importante para este efeito, nessas células. / In this study, the effects of PA-BJ and gyroxin, isolated from Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus snake venoms, respectively, on endothelial cells in culture were investigated. Results showed that neither PA-BJ nor gyroxin affected the integrity of monolayers nor modified ECs viability in the periods of incubation tested. In contrast, these serine proteinases increased the release of prostacyclin from ECs. This effect was inhibited by both non-selective and selective COX-1 and COX-2 inhibitors, but these toxins did not affect the protein expression of COX-1 and -2. Inhibition of the catalytic activity of PA-BJ and gyroxin or pre-incubation of ECs with PAR-1 antagonist did not abrogate the ability of these toxins to induce PGI2 release. These findings demonstrate that these serine proteinases are able to stimulate production of prostacyclin by ECs by a mechanism dependent on stimulation of COX-1 and COX-2 enzyme activity. Moreover, neither enzyme activity of both serine proteinases nor the receptor PAR-1 contribute for this effect on endothelium.

Infecções por Plasmodium sp. podem levar a um quadro respiratório grave, com complicações pulmonares denominadas lesão pulmonar aguda e síndrome do desconforto respiratório agudo (LPA/SDRA). Inflamação aguda, lesão do endotélio alveolar e do parênquima pulmonar, disfunção e aumento da permeabilidade da barreira alvéolo-capilar e, consequente, formação de edema, caracterizam esta síndrome. O modelo experimental, que utiliza o parasita murino Plasmodium berghei ANKA e camundongos da linhagem DBA/2, é empregado no estudo de mediadores imunológicos e fatores que propiciam o estabelecimento das lesões pulmonares associados à LPA/SDRA. Diversos estímulos podem atuar diretamente no aumento da permeabilidade endotelial por meio da desestabilização dos microtúbulos, rearranjo dos microfilamentos de actina e contração das células endoteliais, via sinalização de Rho-GTPases, causando disfunção da barreira endotelial. Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar as alterações do citoesqueleto em células endoteliais primárias pulmonares de camundongos DBA/2 (CEPP-DBA/2), as vias de sinalização das principais Rho-GTPases e o estresse oxidativo, causados pela presença de eritrócitos parasitados com esquizontes de P. berghei ANKA (EP-PbA). As CEPP-DBA/2 foram estimuladas com TNF, VEGF ou IFN&#947;, em diferentes tempos de exposição, seguido da incubação com EP-PbA. Assim, foram realizados ensaios de imunofluorescência para análise do rearranjo de microfilamentos de actina e da desestabilização de microtúbulos. As vias de sinalização das Rho-GTPases foram avaliadas por Western blot, para as expressões proteicas de RhoA, Cdc42 e MLC. Além disso, ensaio fluorométrico foi realizado para detectar a produção de espécies reativas de oxigênio, resultantes do estímulo com eritrócitos parasitados. CEPP-DBA/2 estimuladas por EP-PbA, VEGF, TNF ou IFN&#947;, em associação ou não, apresentaram alterações morfológicas nos microfilamentos de actina e aumento dos espaços interendoteliais. Imagens de imunofluorescência também mostram desestabilização de microtúbulos e desfosforilação de FAK, causadas por EP-PbA. Os ensaios de permeabilidade validam que os eritrócitos parasitados com formas maduras de P. berghei induziram aumento da permeabilidade microvascular nas CEPP-DBA/2. Além disso, estas células, estimuladas com EP-PbA, demonstraram elevada produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que pode estar contribuindo com o desenvolvimento de estresse oxidativo e com a injúria endotelial, assim como, com o aumento da permeabilidade vascular. O mais interessante é que estas alterações endoteliais podem estar relacionadas ao aumento da razão RhoA/Cdc42, da expressão proteica de MLC fosforilada e do sinal de ativação de RhoA. Em conjunto, estes resultados mostram envolvimento dos eritrócitos parasitados com esquizontes de Plasmodium berghei ANKA na desorganização do citoesqueleto e na disfunção da barreira alvéolo-capilar, via RhoA/Rho-kinase, o que pode estar contribuindo com a patogênese da LPA/SDRA associada à malária. / Infections by Plasmodium sp. can lead to a serious respiratory condition with pulmonary complications, named acute lung injury and acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS). Acute inflammation, alveolar endothelium and lung parenchyma injuries, dysfunction and increased permeability of the pulmonary alveolar-capillary barrier and consequent formation of edema characterize this syndrome. Several stimuli can directly increase endothelial permeability through actin microfilaments rearrangement, via Rho- GTPases signaling, leading to endothelial barrier dysfunction. DBA/2 mice infected with Plasmodium berghei ANKA develop ALI/ARDS similar to that observed in humans. The purpose of this research was to assess cytoskeletal changes in DBA/2 mice primary microvascular lung endothelial cells (PMLEC), verify the signaling pathways of the Rho- GTPases and analyze the oxidative stress on these cells in the presence of P. berghei ANKA-infected red blood cells (PbA-iRBC). PMLEC were stimulated by TNF, VEGF or IFN&#947; followed by incubation with PbA-iRBC. Immunofluorescence assays were performed to analyze actin microfilaments rearrangement and microtubules destabilization. Western blot for RhoA, Cdc42 and MLC proteins were conducted to assess alterations in signaling pathways of Rho-GTPases. In addition, a fluorimetric assay was performed to detect the production of reactive oxygen species resulting from PbA-iRBC stimulus. P. berghei ANKA, VEGF, TNF and IFN&#947; stimuli, in association or not, caused morphological disturbances in actin microfilaments of PMLEC and an increase of intercellular spaces. Moreover, immunofluorescence images showed microtubules destabilization and FAK dephosphorylation in these cells, caused by PbA-iRBC. The permeability assay showed that PbA-iRBC induced an increase of microvascular permeability in PMLEC. In addition, PMLEC stimulated by PbA-iRBC, showed elevated production of ROS, which may be contributing to oxidative stress and increasing the damage of endothelial cells, as well as an increase of vascular permeability. Interestingly, these endothelial changes may be related to the increased RhoA/Cdc42 protein expressions ratio, augmented protein expression of phosphorylated MLC and RhoA activation signal. Taken together, these data demonstrate the involvement of P. berghei ANKA-infected red blood cells in cytoskeleton disorganization and alveolar-capillary barrier dysfunction, through of RhoA / Rho-kinase signaling pathway, which may contribute to ALI/ARDS pathogenesis.