A jararagina, isolada do veneno de Bothrops jararaca, possui efeito pró-inflamatório caracterizado por edema, liberação de citocinas e migração celular. Neste estudo, demonstramos o aumento na expressão gênica da quimiocina IL-8, moléculas de adesão (E-Selectina, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, Angiopoetina-2 e MMP-10 em HUVECs estimuladas com jararagina. Também investigamos o efeito da jararagina na expressão protéica de moléculas de adesão e da quimiocina IL-8. A molécula de adesão PECAM-1 foi expressa na superfície das HUVECs em todos os tratamentos e intervalos de tempo analisados. Entretanto não observamos aumento da expressão de E-selectina e VCAM-1 após estímulo com a jararagina. A jararagina também não induziu a liberação de IL-8. Nossos resultados sugerem que a jararagina se liga nas células endoteliais, mas o receptor celular envolvido neste efeito ainda não está claro. Este trabalho contribui com a literatura na medida em que elucida a participação de importantes genes dentro do contexto inflamatório desencadeado pela jararagina em células endoteliais. / Jararhagin, from Bothrops jararaca venom, causes a local reaction manifested by edema, cytokine release and inflammatory cells recruitment. In this study we evaluated by real time PCR the expression of 9 genes involved in inflammatory response, triggered by jararhagin in HUVECs. Our results showed a significant increase in the gene expression of chemokine IL-8, adhesion molecules (E-selectin, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, angiopoietin-2 and MMP-10. We also investigated the effect of jararhagin on expression of adhesion molecules in the surface of HUVECs by flow cytometry. We did not observe increased expression of E-selectin and VCAM-1 molecules on the surface of HUVECs compared with control. Jararhagin did not increase the release of soluble chemokine IL-8 in HUVECs supernatant. Our results suggest that jararhagin binds to endothelial cells, but the cellular receptor involved in this effect remains unclear. This work contributes to the literature highlighting the participation of important genes within the inflammatory context triggered by jararhagin on endothelial cells.

O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus e seus componentes desencadeiam importantes efeitos biológicos que envolvem direta e/ou indiretamente, componentes do sistema circulatório. Contudo, não há estudos específicos na literatura sobre os efeitos do veneno crotálico ou de suas toxinas, em células endoteliais. As células endoteliais constituem a camada de revestimento interna dos vasos sanguíneos, denominada endotélio. Este tecido é metabolicamente ativo, com função protetora do sistema cardiovascular e desempenha papel central na regulação da função circulatória, através do controle da coagulação, permeabilidade e do tônus vascular. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt), do seu componente majoritário, a crotoxina (CTX) e de suas subunidades, fosfolipase A2 (CB) e crotapotina (CA), sobre células endoteliais, em cultura, quanto à: i) viabilidade e proliferação celular; ii) integridade das monocamadas; iii) produção de óxido nítrico, de prostaciclina e mecanismos envolvidos neste efeito. Os resultados obtidos demonstram que o veneno de Crotalus durissus terrificus afetou a viabilidade e a integridade de células endoteliais em cultura, de modo tempo-dependente e apenas na maior concentração, sugerindo sua baixa toxicidade sobre as células endoteliais. A subunidade CB, mas não a CTX nem a crotapotina, reproduziu os efeitos causados pelo VCdt. Em concentrações não citotóxicas, tanto o veneno quanto as toxinas não alteraram a proliferação celular nem a produção basal de óxido nítrico pelas células endoteliais. Por outro lado, o veneno e a subunidade CB, mas não a CTX nem a CA causaram aumento significativo da produção de prostaciclina, via COX-1 e COX-2, sendo que a expressão protéica da isoforma COX-2 foi induzida por estes agentes. Além disso, foi demonstrado que a fosfolipase citosólica é relevante para o aumento da produção de prostaciclina, induzido pela CB. Adicionalmente, foi demonstrado que a atividade catalítica da subunidade CB é essencial para os efeitos descritos. Isto reforça a sugestão de que a subunidade fosfolipásica, isoladamente, possa contribuir para os efeitos do veneno total no endotélio. Nesse sentido, se houver alguma fração desta enzima na sua forma livre, no veneno total, sugere-se que ela contribua, de modo significativo, para os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus no endotélio. / Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) and their components induces systemic effects, which interfere with blood vessel system. Endothelial cells (EC) are central elements for haemostasis, regulating blood vessel-wall permeability, blood fluidity and adhesion properties of circulating leukocytes. However, there is no available data on the effects of this venom and its components on endothelial cells. In this study, the effects of CdtV, crotoxin (CTX) which is formed by two distinct subunits named crotapotin (CA) and phospholipase A2 (CB), on endothelial cells in vitro were investigated, analyzing EC viability and proliferation, EC monolayers integrity, release of both nitric oxide and prostacyclin (PGI2). CdtV, at the highest concentration, time-dependently decreased the viability of EC and the integrity of cell monolayers. The CB subunit, but not CTX nor CA, reproduced the effects caused by crude venom. In contrast, neither EC proliferation nor release of oxide nitric were affected by non-cytotoxic concentrations of CdtV or isolated toxins. However, at the same experimental condition, both CdtV and CB increased the prostacyclin release by endothelium through activation of COX-1 and -2 enzyme systems. Moreover, these toxins upregulated protein expression of COX-2 isoform, but did not alter constitutive expression of COX-1. On the other hand, neither CTX nor CA affected basal production of PGI2. Inhibition of cytosolic PLA2 (cPLA2) by AACOCF3 significantly reduced PGI2 increments caused by both CdtV and CB implying that cPLA2 cooperates for the synthesis of PGI2 induced by them. Inhibition of the catalytic activity of CB abrogated its ability to induce the release of PGI2, thus suggesting the importance of the phospholipase A2 enzyme activity for this effect. These findings provide evidence that CdtV and CB can directly activate EC and up-regulate cyclooxygenase pathways for production of prostacyclin, an important mediator of vasodilation and inflammation. Moreover, CB through its catalytic activity may significantly contribute for the stimulatory effect of CdtV in EC. Therefore, these findings indicate novel regulatory mechanisms for both CdtV and venom secretory PLA2 in endothelial cells.

Dissulfeto isomerase protéica (PDIA1 ou PDI) é uma chaperona e ditiol-dissulfeto oxido-redutase residente do reticulo endoplasmático (RE). PDI é essencial à regulação da proteostase por ter função no enovelamento oxidativo de proteínas e na via de degradação associada ao RE (ERAD). Além disso, PDI interage fisicamente e regula a atividade de NADPH oxidases, e fora da célula é um regulador redox essencial à atividade de proteínas extracelulares. Este pool epi/pericelular da PDI (pecPDI) regula função de proteínas de membrana/secretadas, como integrinas, glicoproteínas gp120 do virus HIV e outras, com múltiplas funções que incluem: trombose, ativação plaquetária, adesão celular, infecção viral e remodelamento vascular. A rota de externalização da PDI permanece obscura, e seu conhecimento pode indicar mecanismos dos efeitos (fisio)patológicos da PDI. A secreção da PDI pela rota RE-Golgi foi sugerida em células endoteliais infectadas pelo vírus da dengue, células pancreáticas e tireoideanas. No entanto, uma varredura sistemática das possíveis rotas de externalização da PDI não foi previamente realizada. Neste estudo, mostramos que células endoteliais (EC) externalizam constitutivamente, por rotas distintas, dois pools de PDI, de superfície celular e solúvel, enquanto na EC não estimulada PDI não foi detectada significativamente em micropartículas. PDI externalizada corresponde a ca.1,4% do pool total de PDI celular. Tanto a PDI de superfície celular como a solúvel foram majoritariamente secretadas pela via de secreção não-convencional do tipo IV independente de GRASP. Contudo, a via de secreção clássica também contribui para externalização basal da PDI de superfície celular, mas não da solúvel basal ou estimulada por PMA, ATP e trombina indicando que todas envolvem escape do Golgi. Além disso, a externalização constitutiva da PDI de superfície em célula muscular lisa vascular também ocorre por via independente de Golgi. Externalização da PDI não foi detectavelmente mediada pela secreção não-convencional do tipo I, II, III, lisossomos secretórios, endossoma de reciclagem e transporte ativo (dependente de ATP) em EC. Considerando que chaperonas são vias essenciais de resposta a estresses, investigamos o efeito de estresse do RE e choque térmico na pecPDI. Estresse do RE não altera a PDI de superfície celular, mas aumenta PDI solúvel. Ambos os pools de PDI não foram alterados por choque térmico, embora a recuperação desse estresse diminua a secreção de PDI. Estes dados sugerem que a liberação de PDI é um processo regulado, dependente da natureza do estresse. Bloqueio da síntese de proteínas com cicloheximida não altera pecPDI, indicando que PDI recém-sintetizada não é preferencialmente externalizada e que o tráfego da PDI independe de outras proteínas recém-sintetizadas. Um aspecto importante do estudo foi indicar uma resiliência da pecPDI à modulação individual de distintas vias secretoras, consistente com uma estrita auto-regulação e possibilidade de vias sinérgicas e complementares. Estes resultados indicam que a externalização da PDI de superfície e PDI secretada possam ser externalizadas por mecanismos independentes. Estes processos compõem um processo regulado estritamente, consistente com papel homeostático da pecPDI / Protein disulfide isomerase (PDIA1 or PDI) is dithiol-disulfide oxireductase chaperone resident in the endoplasmic reticulum (ER). PDI is essential for proteostasis, due to its support of oxidative protein folding and ER-associated protein degradation (ERAD). In addition, PDI associates with NADPH oxidase(s) and regulate its activity, while outside of the cell, PDI redox-dependently modulates extracellular proteins. This epi/pericellular PDI (pecPDI) pool is known to regulate membrane/secreted proteins such as integrins, HIV glycoprotein gp120 and others, with functions that involve thrombosis, platelet function, cell adhesion, viral infection and vascular remodeling. PDI externalization route remains enigmatic and its elucidation can help understand some (patho)physiological PDI effects. An ER-Golgi route for PDI secretion has been as described on dengue virus-infected endothelial cells pancreatic and thyroid) cells. However, none of these papers addressed PDI secretion routes in a systematic fashion. Here, we show that endothelial cells (EC) constitutively externalize, through different routes, two PDI pools, a cell-surface and a secreted one, while in nonstimulated ECs PDI was not significantly detected in microparticles. Externalized PDI corresponds to < 2% of total cellular PDI pool. Both cell-surface and soluble PDI were predominantly externalized through unconventional type IV GRASP-independent pathway(s). However, the classical secretory pathway also contributes to basal cell-surface, but not soluble, PDI externalization, as PMA, ATP or thrombin-stimulated secretion also involve Golgi bypass. Furthermore, constitutive cell-surface PDI externalization in vascular smooth muscle cells also occurs in a Golgi-independent way. PDI externalization was not detectably mediated by non-conventional type I, II and III secretion routes, secretory lysosomes, recycling endosomes and ATP dependent active transport in EC. Since chaperones are essential for cellular stress response, we assessed the effects of ER stress and heat-shock on pecPDI. ER stress did not affect cell-surface PDI but increased the soluble pool. Both PDI pools were unaltered by heat shock, while stress recovery decreased PDI secretion. These data suggest that PDI release is finely tuned and dependent on the type of stress. Blockade of protein synthesis with cycloheximide did not change pecPDI levels, suggesting that newly-synthesized PDI is not preferentially externalized and that PDI traffic does not require newly-synthesized proteins. An important aspect of the study was the evidence for pecPDI resilience to individual modulation of distinct secretion routes, consistent with strict auto-regulation and possible synergic or complementary pathways. Overall, our data suggest that cell-surface and secreted PDI pool externalization are regulated through independent mechanisms, which in both cases involve Type IV non-conventional routes, with some minor contribution of Golgi-dependent secretory pathway. These patterns compose a strictly regulated process, consistent with an important homeostatic role for pecPDI

Neste estudo foram avaliados os efeitos da subunidade CB (FLA2 isolada do veneno da serpente C. d. terrificus) em células endoteliais quanto: 1) síntese de PGI2 e mecanismos e 2) mecanismos inibitórios sobre moléculas de adesão. Os resultados mostraram que a liberação de PGI2 induzida pela CB depende de COX-1, PGIS, cFLA2, ERK1/2, mas não de COX-2, NF-kB, p38, JNK, iFLA2, receptor IP, AC ou PKA. Em adição, a CB aumentou os níveis de PGIS, mas não de COX-1 ou COX-2. Ainda, a CB inibiu a expressão de ICAM-1 e VCAM-1, mas não de PECAM-1, induzidas pelo LPS. Em relação aos mecanismos da ação inibitória da CB, foi demonstrado que o PPAR-&alpha; e -&beta;/&delta;, IP, AC, PKA e a PGI2 são relevantes para inibição de ICAM-1, mas não de VCAM-1, induzida pelo LPS. Além disso, a CB inibiu a expressão gênica de ICAM-1, VCAM-1, TNF-&alpha; e IL-6, induzida pelo LPS. Este estudo evidenciou importantes vias na ação inibitória da FLA2 crotálica, em um evento fundamental da resposta inflamatória e trouxe a melhor compreensão das atividades biológicas desencadeadas por esta FLA2 em células endoteliais. / In this study the effect of CB, a phospholipase A2 (PLA2) isolated from Crotalus durissus terrificus snake venom, in cultured endothelial cells was investigated, with focus on: i) biosynthesis of prostacyclin (PGI2) and related mechanisms, and ii) inhibitory mechanisms on expression of ICAM-1, VCAM-1 and PECAM-1 adhesion molecules. Results showed that COX-1, PGI2 synthase (PGIS), cPLA2, ERK1/2 and MEK1/2, but not COX-2, NF-kB, p38, JNK, iPLA2, IP receptor, cyclase adenylate nor PKA, are involved CB-induced PGI2 biosynthesis. In addition, CB up-regulated PGIS, but not COX-1 nor COX-2 protein levels. Moreover, CB was able to inhibit LPS-induced ICAM-1 and VCAM-1, but not PECAM-1 protein expression. PPAR-&alpha; and -&beta;/&delta;, IP receptor, cyclase adenylate, PKA and PGI2, but not PPAR-&gamma;, are essential for CB-induced inhibition of ICAM-1. Furthermore, CB inhibited LPS-induced gene expression of ICAM-1, VCAM-1, TNF-&alpha; and IL-6. Inhibition of these cytokines by CB may be related to down regulation of both VCAM-1 and ICAM-1 seen in endothelial cells incubated with this venom PLA2.

Introdução: A imunização de coelhos saudáveis com colágeno do tipo V (COLV) reproduz as principais manifestações da esclerose sistêmica (ES), incluindo fibrose, vasculopatia e produção de autoanticorpos específicos da doença. Estudos preliminares mostraram que, tanto na derme de animais imunizados com COLV (COLV-IM), como na derme de pacientes com ES, observa-se deposição aumentada de COLV anômalo, mas não se sabe qual a relevância clínica deste achado. O remodelamento da matriz extracelular é precoce nos animais COLV-IM, ocorrendo já no sétimo dia após a imunização, o que sugere que o COLV esteja relacionado com a injúria endotelial, evento primário envolvido na patogênese da ES. Desta forma, os objetivos do presente estudo foram avaliar a expressão de COLV na derme de controles saudáveis e de pacientes com ES e sua correlação com espessamento cutâneo, atividade e duração da doença; assim como pesquisar uma possível associação entre a deposição deste colágeno na derme com a expressão de marcadores de apoptose e de ativação endotelial em pacientes e no modelo animal induzido pela imunização com COLV. Pacientes e Métodos: Biópsias de pele de pacientes com ES (N=18, 6 com doença precoce e 12 com doença tardia) e de controles (N=10) pareados por idade e sexo, assim como biópsias de pele de coelhos imunizados com COLV + adjuvante de Freund (COV-IM, N=6) ou adjuvante de Freund (N=6) foram avaliadas. Nos pacientes com ES, o espessamento cutâneo foi avaliado por meio do escore de Rodnan Modificado (MRSS) e a atividade da doença foi calculada pelo índice de atividade de Valentini. Para realizar a quantificação por histomorfometria, o COLV na derme foi identificado por imunofluorescência. Caspase-3, endotelina-1, CTGF, TGF e VEGF nas células endoteliais dérmicas foram marcados por imunohistoquímica. Nos pacientes e nos controles, o COLV proveniente da cultura de fibroblastos dérmicos foi quantificado por PCR RT em tempo real e caracterizado por eletroforese, imunoblotting e reconstrução tridimensional, por meio da microscopia confocal. Resultados: O depósito de COLV foi maior na derme de pacientes com doença precoce, quando comparados aos controles e aos pacientes com doença tardia. A atividade e a duração da ES estiveram associadas com o depósito de COLV. A expressão de RNA mensageiro das cadeias COLV1 COLV2 foi aumentada em relação aos controles e a reconstrução tridimensional confirmou a presença de fibras anômalas de COLV. Observou-se maior expressão de caspase-3, endotelina-1, CTGF, TGF e VEGF nas células endoteliais dos pacientes com ES, quando comparados aos controles. Houve correlação positiva entre o depósito de COLV e a expressão de caspase-3, endotelina-1 e CTGF. Ao comparar-se os coelhos COLV-IM com os controles, observou-se aumento significativo da expressão de COLV aos 7 dias e de endotelina-1 aos 210 dias após a imunização. Embora de maneira não significativa, verificou-se maior expressão de caspase-3, CTGF e VEGF nos animais COLV-IM e, quando os animais foram comparados ao longo do tempo, percebeu-se maior expressão de COLV no sétimo dia após a imunização na derme dos animais COLV-IM, diminuindo no trigésimo dia e voltando a subir aos 75 dias e aos 210 dias. A caspase-3 e a endotelina-1 comportaram-se de maneira semelhante. Conclusão: Estes resultados sugerem que o COLV possa agir como um possível gatilho envolvido na patogênese da ES, agindo como um indutor de ativação e de apoptose endotelial, que por sua vez poderia resultar em maior expressão de COLV, perpetuando o processo de remodelamento observado na pele dos pacientes com ES / Introduction: The immunization of healthy rabbits with type V collagen (COLV) reproduces the main characteristics of systemic sclerosis (SSc), such as fibrosis, vasculopathy and specific auto-antibodies. Preliminary studies demonstrated that both COLV-immunized rabbits (COLV-IM) and SSc patients exhibit increased expression of abnormal COLV in the dermis, but the clinical relevance of this finding is unknown. The remodeling of the extracellular matrix is an early event in COLV-IM rabbits that can be detected by the seventh day after immunization; this observation suggests that COLV is involved in endothelial injury, one of the first manifestations of the disease. Thus, the objectives of this study were to evaluate COLV expression in the dermis of healthy controls and SSc patients and to determine the correlation of this expression with skin thickness, disease activity and duration and search for a possible association between this collagen with apoptosis and activation of endothelial cells markers in patients and in animal model induced by immunization with COLV. Patients and Methods: Skin biopsies from 18 patients (6 early-stage and 12 late-stage) and 10 healthy controls as well as skin biopsies from rabbits immunized with COLV (COLV-IM) and Freund adjuvant (N=6) or Freund adjuvant alone (N=6) were evaluated. Skin thickening assessment was performed with the Modified Rodnan Skin Score (MRSS), and activity was calculated using the Valentini Disease Activity Index. To perform quantification by histomorphometry, COLV was identified by immunofluorescence, and caspase-3, endothelin-1, CTGF, TGF and VEGF in dermal endothelial cells were labeled by immunohistochemistry. In SSc patients and healthy controls, COLV from dermal fibroblast culture was quantified by real-time RT-PCR and characterized by electrophoresis, immunoblotting and tridimensional reconstruction by confocal microscopy. Results: COLV deposition was increased in the dermis of the patients with early disease compared with the healthy controls and the patients with late disease. SSc activity and disease duration were associated with dermal COLV deposition. COLV1 and COLV2 mRNA expression levels were higher in SSc, and a tridimensional reconstruction of SSc dermal heterotypic fibers confirmed the presence of abnormal COLV. The dermal endothelial cell expression of caspase-3, endothelin-1, CTGF, TGF and VEGF was higher in the SSc patients than in the controls. There was a positive correlation between COLV deposition and caspase-3, endothelin-1 and CTGF expression. When the COLV-IM rabbits were compared with the controls, there was a significant increase in the expression of COLV 7 days after the immunization and a significant increase in the expression of endothelin-1 210 days after the immunization. The expression of caspase-3, CTGF and VEGF was higher in the COLV-IM animals than in the control rabbits, although not significantly, and when the rabbits were compared over time, the expression of COLV was higher in the dermis of the COLV-IM animals 7 days after immunization, decreasing at 30 days and increasing again at 75 and 210 days. Caspase-3 and endothelin-1 exhibited similar behavior. Conclusion: these results suggest that COLV can be a possible trigger involved in the pathogenesis of SSc, acting as an inducer of endothelial apoptosis and activation that could result in higher expression of COLV, perpetuating the remodeling process observed in SSc skin

Este estudo teve como objetivo avaliar, in vitro, a citotoxicidade dos cimentos endodônticos Densell Endo, Pulp-Fill, Endofill, Sealer 26, Pulp Canal Sealer e GuttaFlow após 12, 24 e 72 horas de tempo de contato, utilizando-se uma linhagem de células endoteliais ECV-304. Para a avaliação da viabilidade celular, utilizou-se o teste de citotoxicidade MTT. Para cada cimento foram preparados 12 corpos de prova que foram distribuídos em seis grupos experimentais de acordo com as marcas comerciais, sendo quatro para cada tempo. Foi criado um grupo controle que não foi submetido à ação de cimento. Para avaliação do efeito dos cimentos sobre as células endoteliais, os corpos de prova foram inseridos nos poços da placa cultura, incubados a 37C em presença de 5% de CO2 e 100% de umidade. Os testes MTT foram realizados, em quadruplicata, após 12, 24 e 72 horas de contato das amostras com o tapete celular. Foi utilizada a prova Two-Way Anova com o teste Post Hoc de Bonferroni com nível de significância de 5%. Na análise de 12 horas, foi possível observar que o cimento GuttaFlow apresentou média de absorbância de 0,055, seguido do Sealer 26 (média = 0,038). Os cimentos Pulp Canal Sealer e Densell Endo apresentaram a mesma média de absorbância (0,031). O Pulp Fill e o Endofill foram os cimentos que apresentaram maior citotoxicidade (média de absorbância = 0,024 e 0,021, respectivamente). O grupo controle apresentou média de absorbância de 0,158. Em 24 horas observou-se que os cimentos GuttaFlow e Sealer 26 apresentaram as maiores médias de absorbância (0,041 e 0,037, respectivamente), seguidos pelo cimento Pulp Canal Sealer que apresentou média de absorbância de 0,035. Já os cimentos Densell Endo e Pulp Fill apresentaram médias de absorbância de 0,033 e 0,032, respectivamente. O cimento Endofill apresentou uma média de 0,026 e o grupo controle de 0,086. Quando analisados em 72 horas, o cimento Pulp Canal Sealer obteve média de absorbância de 0,049, seguido dos cimentos GuttaFlow e Pulp Fill, ambos com 0,048. Os cimentos Densell Endo, Sealer 26 e Endofill apresentaram respectivamente, médias de 0,044, 0,040 e 0,036. O grupo controle diferenciou-se significativamente de todos os grupos em todos os tempos. Quando analisadas as médias gerais de absorbância dos grupos analisados observou-se que o cimento GuttaFlow se apresentou como o cimento com menor índice de citotoxicidade, apresentando média de absorbência de 0,048. Logo após, apresentando médias de absorbância iguais (0,038) encontraram-se os cimentos Pulp Canal Sealer e Sealer 26; seguidos do Densell Endo e do Pulp Fill, com 0,036 e 0,035, respectivamente. O grupo controle apresentou média de absorbância de 0,098. Portanto, tendo como base os resultados obtidos, pôde-se concluir que o cimento Endofill foi o que apresentou maior citotoxicidade e o cimento GuttaFlow, o menos citotóxico. / This study aimed to evaluate, in vitro, cytotoxicity of root canal sealers Densell Endo, Pulp-Fill, Endofill, Sealer 26, Pulp Canal Sealer and GuttaFlow after 12, 24 and 72 hours of contact time, using a endothelial cell line ECV-304. For the assessment of cell viability, used the MTT cytotoxicity test. For any cement were prepared 12 specimens that were divided into six groups according to the trademarks, four for each time. Created a control group that was not subjected to action of cement. To assess the effects of cements on endothelial cells, the specimens were placed in culture plate wells, incubated at 37C with 5% CO2 and 100% humidity. MTT tests were performed, in quadruplicate, after 12, 24 and 72 contact hours of the samples with monolayers. Was used to test Two-Way Anova with Bonferroni Post Hoc test with significance level of 5%. In the analysis of 12 hours, was observed that the cement GuttaFlow had a mean absorbance of 0,055, followed by Sealer 26 (average = 0,038). Cements Pulp Canal Sealer and Densell Endo had the same mean absorbance (0,031). The Pulp Fill and Enfofill were the cements with higher cytotoxicity (mean absorbance = 0,024 and 0,021, respectively). The control group had a mean absorbance of 0,158. In 24 hours it was observed that the cements Sealer 26 and GuttaFlow had the highest average absorbance (0,041 and 0,037, respectively), followed by cement Pulp Canal Sealer that had a mean absorbance of 0.035. Already cements Densell Endo and Pulp Fill showed means absorbance of 0,033 and 0,032, respectively. Cement Endofill&#61650; showed an average of 0,026 and the control group, 0,086. When analyzed at 72 hours, the cement Pulp Canal Sealer had an average absorbance of 0,049, followed by cement GuttaFlow and Pulp Fill, both with 0,048. Cements Densell Endo, Sealer 26 and Endofill showed respectively, averaging 0,044, 0,040 and 0,036. The control group differed significantly from all groups at all times. When analyzing the overall means of absorbance groups analyzed showed that the cement GuttaFlow introduced himself as the cement with a lower index of cytotoxicity, with a mean of 0,048 absorbance. Soon after, with averages of equal absorbance (0,038) met cements Pulp Canal Sealer and Sealer 26; followed by Endo Densell and Pulp Fill, with 0,036 and 0,035, respectively. The control group had a mean absorbance of 0,098. Therefore, based on the results, could conclude that the cement Endofill showed the highest cytotoxicity and cement GuttaFlow, the least cytotoxic.

A proteína dissulfeto isomerase (PDI) tem ganhado destaque em processos de sinalização celular. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel da PDI na sinalização redox induzida por TNF-a em células endoteliais e por Angiotensina II (Ang II) em células musculares lisas vasculares (CMLV). Em cultura de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana (HUVECs) os dados demonstraram que a PDI e a ERp46 regulam especificamente a fosforilação da ERK 1/2 induzida por TNF-a, possivelmente via alterações redox sobre a GTPase Ras e participa da angiogenese induzida por TNF-a. Em CMLV de artérias de resistência, os dados sugerem a participação da PDI na contração induzida por Ang II, bem como na disfunção vascular associada à hipertensão arterial, através da regulação da expressão e atividade da Nox1. Desta forma, podemos concluir que a PDI apresenta um papel na regulação da sinalização redox induzida por TNF-a e Ang II em células endoteliais e CMLV, respectivamente. Tais resultados apontam para um novo papel da PDI na fisiopatologia do sistema cardiovascular. / Protein disulfide isomerase (PDI), an oxidoreductase of endoplasmic reticulum, has emerged as a key player in cell signaling. The aim of the present study was to investigate the role of PDI in redox signaling induced by TNF-a in endothelial cells and by Angiotensin II (Ang II) in vascular smooth muscle cells (VSMCs). In human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) ERp46 or PDI inhibition reduced specifically TNF-a-induced ERK1/2 phosphorylation, possibly via redox modifications in Ras GTPase and TNF-a-induced angiogenesis. In VSMCs from resistance arteries, our results suggest that PDI positively regulates Nox1 dependent signaling and expression in VSMCs from resistance arteries and could be a new player in the oxidative stress and vascular dysfunction observed in hypertension. Altogether, the results provide evidence for a role for PDI in cardiovascular pathophysiology.

Introdução: A imunização de coelhos saudáveis com colágeno do tipo V (COLV) reproduz as principais manifestações da esclerose sistêmica (ES), incluindo fibrose, vasculopatia e produção de autoanticorpos específicos da doença. Estudos preliminares mostraram que, tanto na derme de animais imunizados com COLV (COLV-IM), como na derme de pacientes com ES, observa-se deposição aumentada de COLV anômalo, mas não se sabe qual a relevância clínica deste achado. O remodelamento da matriz extracelular é precoce nos animais COLV-IM, ocorrendo já no sétimo dia após a imunização, o que sugere que o COLV esteja relacionado com a injúria endotelial, evento primário envolvido na patogênese da ES. Desta forma, os objetivos do presente estudo foram avaliar a expressão de COLV na derme de controles saudáveis e de pacientes com ES e sua correlação com espessamento cutâneo, atividade e duração da doença; assim como pesquisar uma possível associação entre a deposição deste colágeno na derme com a expressão de marcadores de apoptose e de ativação endotelial em pacientes e no modelo animal induzido pela imunização com COLV. Pacientes e Métodos: Biópsias de pele de pacientes com ES (N=18, 6 com doença precoce e 12 com doença tardia) e de controles (N=10) pareados por idade e sexo, assim como biópsias de pele de coelhos imunizados com COLV + adjuvante de Freund (COV-IM, N=6) ou adjuvante de Freund (N=6) foram avaliadas. Nos pacientes com ES, o espessamento cutâneo foi avaliado por meio do escore de Rodnan Modificado (MRSS) e a atividade da doença foi calculada pelo índice de atividade de Valentini. Para realizar a quantificação por histomorfometria, o COLV na derme foi identificado por imunofluorescência. Caspase-3, endotelina-1, CTGF, TGF e VEGF nas células endoteliais dérmicas foram marcados por imunohistoquímica. Nos pacientes e nos controles, o COLV proveniente da cultura de fibroblastos dérmicos foi quantificado por PCR RT em tempo real e caracterizado por eletroforese, imunoblotting e reconstrução tridimensional, por meio da microscopia confocal. Resultados: O depósito de COLV foi maior na derme de pacientes com doença precoce, quando comparados aos controles e aos pacientes com doença tardia. A atividade e a duração da ES estiveram associadas com o depósito de COLV. A expressão de RNA mensageiro das cadeias COLV1 COLV2 foi aumentada em relação aos controles e a reconstrução tridimensional confirmou a presença de fibras anômalas de COLV. Observou-se maior expressão de caspase-3, endotelina-1, CTGF, TGF e VEGF nas células endoteliais dos pacientes com ES, quando comparados aos controles. Houve correlação positiva entre o depósito de COLV e a expressão de caspase-3, endotelina-1 e CTGF. Ao comparar-se os coelhos COLV-IM com os controles, observou-se aumento significativo da expressão de COLV aos 7 dias e de endotelina-1 aos 210 dias após a imunização. Embora de maneira não significativa, verificou-se maior expressão de caspase-3, CTGF e VEGF nos animais COLV-IM e, quando os animais foram comparados ao longo do tempo, percebeu-se maior expressão de COLV no sétimo dia após a imunização na derme dos animais COLV-IM, diminuindo no trigésimo dia e voltando a subir aos 75 dias e aos 210 dias. A caspase-3 e a endotelina-1 comportaram-se de maneira semelhante. Conclusão: Estes resultados sugerem que o COLV possa agir como um possível gatilho envolvido na patogênese da ES, agindo como um indutor de ativação e de apoptose endotelial, que por sua vez poderia resultar em maior expressão de COLV, perpetuando o processo de remodelamento observado na pele dos pacientes com ES / Introduction: The immunization of healthy rabbits with type V collagen (COLV) reproduces the main characteristics of systemic sclerosis (SSc), such as fibrosis, vasculopathy and specific auto-antibodies. Preliminary studies demonstrated that both COLV-immunized rabbits (COLV-IM) and SSc patients exhibit increased expression of abnormal COLV in the dermis, but the clinical relevance of this finding is unknown. The remodeling of the extracellular matrix is an early event in COLV-IM rabbits that can be detected by the seventh day after immunization; this observation suggests that COLV is involved in endothelial injury, one of the first manifestations of the disease. Thus, the objectives of this study were to evaluate COLV expression in the dermis of healthy controls and SSc patients and to determine the correlation of this expression with skin thickness, disease activity and duration and search for a possible association between this collagen with apoptosis and activation of endothelial cells markers in patients and in animal model induced by immunization with COLV. Patients and Methods: Skin biopsies from 18 patients (6 early-stage and 12 late-stage) and 10 healthy controls as well as skin biopsies from rabbits immunized with COLV (COLV-IM) and Freund adjuvant (N=6) or Freund adjuvant alone (N=6) were evaluated. Skin thickening assessment was performed with the Modified Rodnan Skin Score (MRSS), and activity was calculated using the Valentini Disease Activity Index. To perform quantification by histomorphometry, COLV was identified by immunofluorescence, and caspase-3, endothelin-1, CTGF, TGF and VEGF in dermal endothelial cells were labeled by immunohistochemistry. In SSc patients and healthy controls, COLV from dermal fibroblast culture was quantified by real-time RT-PCR and characterized by electrophoresis, immunoblotting and tridimensional reconstruction by confocal microscopy. Results: COLV deposition was increased in the dermis of the patients with early disease compared with the healthy controls and the patients with late disease. SSc activity and disease duration were associated with dermal COLV deposition. COLV1 and COLV2 mRNA expression levels were higher in SSc, and a tridimensional reconstruction of SSc dermal heterotypic fibers confirmed the presence of abnormal COLV. The dermal endothelial cell expression of caspase-3, endothelin-1, CTGF, TGF and VEGF was higher in the SSc patients than in the controls. There was a positive correlation between COLV deposition and caspase-3, endothelin-1 and CTGF expression. When the COLV-IM rabbits were compared with the controls, there was a significant increase in the expression of COLV 7 days after the immunization and a significant increase in the expression of endothelin-1 210 days after the immunization. The expression of caspase-3, CTGF and VEGF was higher in the COLV-IM animals than in the control rabbits, although not significantly, and when the rabbits were compared over time, the expression of COLV was higher in the dermis of the COLV-IM animals 7 days after immunization, decreasing at 30 days and increasing again at 75 and 210 days. Caspase-3 and endothelin-1 exhibited similar behavior. Conclusion: these results suggest that COLV can be a possible trigger involved in the pathogenesis of SSc, acting as an inducer of endothelial apoptosis and activation that could result in higher expression of COLV, perpetuating the remodeling process observed in SSc skin

A síndrome do anticorpo antifosfolípide (SAF) é uma doença autoimune sistêmica caracterizada por episódios trombóticos recorrentes e/ou complicações durante a gravidez e presença de anticorpos antifosfolípides séricos (aPL). Os pacientes com SAF apresentam maior risco de aterosclerose e doenças cardiovasculares (DCVs). Estudos sugerem que as células endoteliais desempenham um papel central na patogênese do SAF uma vez que pacientes com SAF apresentam comprometimento da função endotelial quando comparados a controles saudáveis. A suplementação de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 (n-3 PUFA) parece melhorar a função endotelial em pacientes com diabetes tipo 2 (DM2), dislipidemia, e lúpus eritematoso sistêmico. Dessa forma, ela poderia ser de grande relevância clínica na SAF. Objetivo: Avaliar a eficácia da suplementação de PUFA n-3 na função endotelial (desfecho primário) de pacientes com SAF primária. Desfechos secundários incluíram inflamação sistêmica, perfil lipídico e segurança. Métodos: Foi realizado um estudo clínico randomizado de 16 semanas com 22 mulheres adultas com SAF primário. As pacientes foram alocadas aleatoriamente (1: 1) para receber suplementação com placebo (PL) ou n-3 PUFA (w-3). Antes (pré) e após (Pós) 16 semanas de intervenção, elas foram avaliadas quanto a função endotelial (usando tonometria da artéria periférica), marcadores de função endotelial (concentrações circulantes de adesão intercelular molécula-1 [ICAM-1], molécula de adesão vascular-1 [VCAM-1], e-selectina e fibrinogênio), marcadores inflamatórios (concentrações circulantes de proteína C reativa [PCR], IL-6, IL-10, TNF [fator de necrose tumoral] , IL-1ra e IL-1beta), perfil lipídico, segurança (razão internacional normalizada [INR] e efeitos adversos auto-relatados. Resultados: Após a intervenção, o grupo w-3 apresentou aumento significativos no RHI (Índice de Hiperemia reativa) e LnRHI (transformação logarítmica do Índice de hiperemia reativa)q uando comparados com PL (+13% versus -12%, p = 0,06, ES = 0,9 e +23% versus -22%, p = 0,02, ES = 1,0). Não foram observadas alterações nas concentrações de e-selectina, VCAM-1 e fibrinogênio (p > 0,05). Em contrapartida, grupo ?-3 apresentou diminuição nas concentrações circulantes de IL-10 (-4% vs. + 45%, p = 0,04, ES = -0,9) e concentração reduzida não significativa de TNF (-11% vs. + 0,3%, p = 0,12, ES = -0,7), IL-1beta (-22% vs. + 12%, p = 0,2, ES = - 0,7) e ICAM-1 (+ 3% vs. + 48%, p = 0,12, ES = -0,7) quando comparado ao PL após a intervenção. Apesar das concentrações aumentadas de colesterol total e LDL-colesterol (+ 6% vs. -2%, p = 0,07, ES = 0,7; + 11% vs. -0,3%, p = 0,02, ES = 0,8), não foram observadas diferenças entre w -3 e PL na relação LDL-colesterol/HDL-colesterol (+ 7% vs. + 1%, p = 0,4, ES = 0,3) e triglicerídeos (-20% vs. -18%, p = 0,5, ES = -0,06). Nenhuma alteração no INR foi observada e nenhum efeito adverso foi relatado. Conclusão: Suplementação de PUFA n-3 por 16 semanas levou a melhorias na função endotelial e à ligeira diminuição no millieu inflamatório de pacientes com SAF primária bem controlada. Esses resultados dão suporte à suplementação de PUFA n-3 como terapia adjuvante em SAF / Antiphospholipid Syndrome (APS) is a systemic autoimmune disease characterized by recurrent thrombotic episodes and/or complications during pregnancy, and persistent serum antiphospholipid antibodies (aPL). Patients with APS are at increased risk for atherosclerosis and cardiovascular diseases (CVDs). It has been suggested that endothelial cells play a central role in the pathogenesis of APS as patients with APS show impaired endothelial function when compared with their healthy peers. Omega-3 polyunsaturated fatty acid (n-3 PUFA) supplementation has been shown to improve endothelial function in type 2 diabetes (T2D), dyslipidemia, and systemic lupus erythematosus. Thus, it could be of high clinical relevance in APS. Objective: To evaluate the effectiveness of n-3 PUFA supplementation on endothelial function (primary outcome) of patients with primary APS. Secondary outcomes were systemic inflammation, lipid profile, safety, and clinical parameters. Methods: A 16-week randomized clinical trial was conducted with 22 adult women with primary APS. Patients were randomly assigned (1:1) to receive either placebo (PL) or n-3 PUFA (?-3) supplementation. Before (Pre) and after (Post) 16 weeks of the intervention patients were assessed for endothelial function (using peripheral artery tonometry), endothelial function markers (circulating levels of intercellular adhesion molecule-1 [ICAM-1], vascular adhesion molecule-1 [VCAM-1], e-selectin and fibrinogen), inflammatory markers (circulating levels of C-reactive protein [CRP], IL-6, IL-10, TNF, IL-1ra, and IL-1beta), lipid profile, safety (international normalized ratio [INR] and self-reported adverse effects. Results: Following the intervention, w-3 presented significant increases in RHI and LnRHI when compared with PL (+13% vs. -12%, p=0.06, ES=0.9; and +23% vs. -22%, p=0.02, ES=1.0). No changes were observed for e-selectin, VCAM-1 and fibrinogen levels (p > 0.05). In contrast, w-3 showed decreased circulating levels of IL-10 (-4% vs. +45%, p=0.04, ES=-0.9) and nonsignificant decreased levels of TNF (-11% vs. +0.3%, p=0.12, ES=-0.7), IL-1beta (-22% vs. +12%, p=0.2, ES=-0.7), and ICAM-1 (+3% vs. +48%, p=0.12, ES=-0.7) when compared with PL after the intervention. Despite increased levels of total cholesterol and LDL-cholesterol (+6% vs. -2%, p=0.07, ES=0.7; +11% vs. -0.3%, p=0.02, ES=0.8), no differences between ?-3 and PL were observed in LDL-cholesterol/HDL-cholesterol ratio (+7% vs. +1%, p=0.4, ES=0.3) and triglycerides (-20% vs. -18%, p=0.5, ES=-0.06). No changes in INR were observed and no adverse effects were reported. Conclusion: Sixteen weeks of n-3 PUFA supplementation led to improvements in endothelial function and a slight decrease in the inflammatory milieu of patients with well-controlled primary APS. These results support a role of n-3 PUFA supplementation as an adjuvant therapy in APS

A diminuição da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) e o aumento na atividade das metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) são alguns dos principais mecanismos fisiopatogênicos envolvidos nas doenças cardiovasculares (DCV). Foi demonstrado que o NO pode reduzir a expressão e atividade de MMPs em células musculares lisas vasculares, células mesangiais, entre outras. Em outro estudo, foi mostrado que drogas inibidoras da NO sintase (NOS) podem aumentar a expressão de MMPs. Apesar de o NO apresentar-se diminuído e as MMPs aumentadas durante as DCV, não há evidência clara de que os níveis de NO possam modular diretamente a atividade de MMPs no aparelho cardiovascular. Também não se sabe se este possível efeito seria mediado pelo NFB, nem se este possível efeito é dependente da ativação da guanilato ciclase [que promove a formação de GMP cíclico (GMPc)]. Desta maneira, este estudo teve como objetivos: A) investigar os efeitos de drogas ativadoras da via NO-GMP sobre os aumentos da atividade e expressão de MMP-9 em células endoteliais que acontecem sob efeito de phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA, droga indutora da expressão de MMP-9); e B) determinar se a inibição de NOS em células endoteliais é acompanhada por aumento da atividade e expressão de MMPs, e C) determinar se estes efeitos são dependentes da ativação de NFB ou da formação de GMPc. Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas em DMEM e tratadas por 24 horas com 10 nmol/L de PMA ou diferentes concentrações de drogas ativadoras da via NO-GMP ou de inibidor da NOS. Meio de cultura condicionado ou lisado celular foram coletados e submentidos aos ensaios de zimografia, ELISA, immunoblotting ou análise da concentração de nitrito. Os tratamentos com detanonoato, SNAP, atorvastatina e nitrito de sódio diminuíram os aumentos da atividade gelatinolítica e expressão de MMP-9 estimulados por PMA sem afetar as concentrações do inibidor tecidual da metaloproteinase da matriz-1 (TIMP-1). Esses efeitos não foram modificados pelos tratamentos com ODQ (inibidor da guanilato ciclase solúvel) ou 8- bromo-cGMP (um análogo de GMPc) ou hemoglobina (um sequestrador de NO). Enquanto o PMA aumentou a concentração de fosfo-NFB p65, os tratamentos com SNAP, atorvastatina ou nitrito não apresentaram influência sobre esse efeito. O tratamento com L-NAME, um inibidor da NOS, não apresentou efeito sobre a atividade gelatinolítica de MMP-9. Em conclusão, foram demonstrados que os efeitos inibitórios de drogas ativadoras da via NO-GMPc sobre a produção estimulada de MMP-9 em células endoteliais são independentes de mecanismos mediados por GMPc e NFB, e a inibição da NOS não altera a atividade de MMP-9. / Impaired nitric oxide (NO) bioavailability and imbalanced matrix metalloproteinases (MMPs) activity have important roles in the pathophysiological mechanisms involved in cardiovascular disease (CVD). It was shown that NO can reduce MMPs expression and activity in vascular smooth muscle cells, mesangial cells, and others. In another study, a NO synthase (NOS) inhibitor has increased MMPs expression. Although NO was decreased and MMPs was increased during CVD, there is clear evidence that NO levels can directly modulate MMPs activity in the cardiovascular system. Also, it is not known whether this effect would be mediated by NFB, nor whether this effect is dependent on guanylate cyclase activity (which promotes the formation of cyclic GMP). Thus, this project aims to study whether A) the effect of NO donors might decrease MMP-9 activity and expression in endothelial cells stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (a well-known inducer of MMP-9), and B) the effect of NOS inhibitors might increase MMPs activity and expression in endothelial cells, and C) to determine whether those effects are mediated by the NFB activation or cGMP levels. Endothelial cells from human umbilical vein (HUVECs) were grown in modified DMEM and were treated for 24 hours with 10 nmol/L PMA or different concentrations of NO-GMPc pathway stimulating drugs or NOS inhibitor. Conditioned medium or cell lysate were collected after treatments and analyzed by zymography, ELISA, immunoblotting or to determine nitrite concentration. Detanonoate, SNAP, atorvastatin or sodium nitrite treatments attenuated PMA-induced increases in MMP- 9 gelatinolytic activity and expression, but they had no effect on tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1) concentrations. These effects were not modified by ODQ (a soluble guanylate cyclase inhibitor), or 8-bromo-cGMP (cGMP analogue), or hemoglobin (a NO scavenger). While PMA increased phospho-NFB p65 concentration, SNAP, atorvastatin or nitrite had no influence on this effect. The treatment with L-Name, a NOS inhibitor, had no effect on MMP-9 activity. In conclusion, this study shows that the inhibitory effects of NO-GMPc pathway stimulating drugs on MMP-9 production by endothelial cells are independent of cGMP- and NFB-mediated mechanisms, and NOS inhibitor had no effect on MMP-9 levels