A resposta proliferativa das células mononucleares do sangue periférico dos adultos com dermatite atópica mostrou-se diminuída após estímulos com mitógenos (enterotoxinas estafilocócicas A e B, "pokeweed" e fitohemaglutinina) e antígenos (toxóide tetânico e Candida albicans). A correlação positiva dos níveis séricos de interleucina-18, IgE e escore de gravidade da doença sugerem que esta citocina seria um marcador de atividade da dermatite atópica do adulto / A reduced proliferative response of peripheral blood mononuclear cells in adults with atopic dermatitis was detected when stimuli with mitogens (staphylococcal enterotoxins A and B, phytohemaglutinin, pokeweed), and with antigens (tetanus toxoid and Candida albicans) were performed. A positive correlation of interleukin-18, IgE levels and severity scores of the disease suggest that this cytokine could be a marker of disease activity in adult atopic dermatitis

INTRODUÇÃO: A dermatite atópica (DA) é uma doença cutânea inflamatória, acompanhada por prurido intenso e xerose cutânea. A etiopatogenia da DA é multifatorial, envolvendo fatores genéticos, ambientais e imunológicos, dentre outros. OBJETIVOS: Avaliar a influência das enterotoxinas A e B do Staphylococcus aureus (SEA e SEB) na resposta mediada por células Th17 e Th22 nos indivíduos adultos com DA. MÉTODOS: Foram selecionados 38 pacientes adultos com DA e um grupo controle com 40 indivíduos adultos, pareados por idade e gênero Os métodos utilizados foram: 1) ELISA: dosagem dos níveis séricos de IL-6, IL-17, IL-22 e IL-12p40/IL-23 e em sobrenadantes de culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas com SEA e SEB; 2) Imuno-histoquímica: análise da expressão de IL-17 em fragmentos de pele; 3) Citometria de fluxo: a) análise das citocinas circulantes em amostras de soro: IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF, IL-17A e IFN-y b)avaliação das células T CD4+ mono e polifuncionais secretoras de IL-17, IL-22, TNF, IFN-y, MIP-1beta, e expressão do marcador de ativação celular CD38; c) células Th22 e Tc22 estimuladas com SEA e SEB. RESULTADOS: 1) Através do ELISA, a secreção de IL-22 sérica e em PBMC induzidas por SEA e SEB foi significativamente mais elevada, quando comparada ao grupo controle; 2) houve aumento na expressão de IL-17 em amostras de pele de doentes de DA através da imuno-histoquímica; 3) Através da citometria de fluxo, foram detectados: a) níveis séricos de IL-2, 5, 6, 10, 17A e IFN-y elevados no grupo com DA em relação aos controles; houve diferença significativa nos níveis circulantes de IL-17A nos pacientes com DA moderada e grave; b) na avaliação monofuncional das células T CD4+ sob estímulo de SEA/SEB, houve redução da expressão das citocinas IFN-y, IL-17A, IL-22 ou TNF na DA, quando comparadas ao grupo controle; na análise polifuncional das células T CD4+/CD8+, ocorreu redução da resposta na DA em relação aos controles; nos pacientes atópicos encontramos aumento da resposta em situação basal na dependência de CD38, e redução na resposta frente a SEA/SEB na ausência de CD38; c) encontramos resposta reduzida das células Th22, e elevada de células Tc22 frente aos estímulos SEA e SEB, nos pacientes com DA. CONCLUSÕES: O estudo corrobora o papel patogênico das enterotoxinas estafilocócicas na DA. A ativação crônica com superantígenos estafilocócicos pode contribuir com a alta frequência de células T CD4+ CD38+ polifuncionais, e com a resposta polifuncional anérgica, mediadas por células T CD38- / BACKGROUND: Atopic dermatitis (AD) is an inflammatory skin disease with intense itching and xerosis. AD pathogenesis is multifactorial, involving genetic, environmental, and immunological factors, among others. OBJECTIVES: To evaluate the influence of enterotoxins A and B from Staphylococcus aureus (SEA and SEB) in Th17 and Th22 cell response in adults with AD. METHODS: We evaluated 38 adult patients with AD, and a control group of 40 adults, age and gender matched. Assays: 1) ELISA: evaluation of IL-6, IL-17, IL-12p40/IL-23 and IL-22 serum levels and in supernatants of mononuclear cell cultures from peripheral blood (PBMC), stimulated with SEA/SEB; 2) Immunohistochemistry: analysis of IL-17 expression in skin specimens; 3) Flow cytometry: a) analysis of circulating cytokines in serum samples: IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF, IL-17A and IFN-y b) evaluation of mono and polyfunctional TCD4+ cells that secrete IL-17, IL-22, TNF, IFN-y, MIP-1beta, and expression of the activation marker CD38; c) analysis of Tc22 and Th22 cells stimulated with SEA and SEB. RESULTS: 1) Secretion of IL-22 in the serum and from supernatants of cell cultures from PBMC, stimulated with SEA and SEB were higher in AD patients, when compared to the control group by ELISA; 2) there was an increase of IL-17 expression in skin samples by immunohistochemistry; 3) Flow cytometry showed: a) elevated serum levels of IL-2, 5, 6, 10, 17A and IFN-y in AD, when compared to controls; there was a significant difference in circulating levels of IL-17A in patients with moderate and severe disease; b) monofunctional evaluation of T CD4+ cells under SEA/SEB stimuli showed reduced expression of IFN-y, IL-17A, IL-22 or TNF cytokines in AD, compared to controls; the same was observed for polyfunctional CD4+/CD8+ T cells analysis, exhibiting a diminished response in AD. In atopic patients under basal conditions, there was an augmented CD38- dependent response and reduced pattern to SEA/SEB in the absence of CD38; c) finally, we observed a reduced response of Th22 cells and enhanced Tc22 cells under SEA/SEB stimuli in patients with AD. CONCLUSIONS: This study corroborates the pathogenic role of staphylococcal enterotoxins in AD. Chronic activation with staphylococcal superantigens may contribute to the high frequency of polyfunctional CD4 +CD38+ T cells and with the anergic polyfunctional response mediated by T CD38- T cells

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-09-21Bitstream added on 2014-06-13T20:24:20Z : No. of bitstreams: 1 thuler_amg_dr_jabo.pdf: 1407432 bytes, checksum: d7e6ed286b2d4a2ad8e9b2120b24b7ca (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) da FCAV-UNESP. Foram caracterizados geneticamente, por PCR, isolados de Bacillus thuringiensis, provenientes de três coleções brasileiras, quanto aos tipos de genes cry1, avaliando-se o efeito dos mesmos sobre uma população de Plutella xylostella caracterizando-se também os isolados de B. thuringiensis quanto à presença de enterotoxinas HBL, NHE e o regulador pleitrópico PLC, por verificação biomolecular, avaliando a variabilidade, bem como a estruturação genética de populações de B. thuringiensis, por PCR-RFLP. Verificou-se que existe uma distribuição homogênea das subclasses cry1 dentro do banco de isolados de B. thuringiensis, com maior porcentagem de isolados portadores dos genes cry1Ab (42,12%) e com menor porcentagem de representantes da subclasse cry1Db (0,6%). Nos bioensaios observou-se 100% de mortalidade para lagartas de P. xylostella com os isolados utilizados, indicando que combinações de tipos diferentes de genes cry1 apresentam ação tóxica para larvas de P. xylostella. Analisando a estrutura populacional de B. thuringiensis foram obtidos 78 haplótipos, definidos para as populações das diferentes coleções, e 76 haplótipos, definidos para as populações de diferentes regiões brasileiras, retratando a variabilidade genética para os loci hblA, plcR, nheBC e cry1 analisados. Segundo valores FSTs, de comparação duas a duas, diferenças significativas entre coleções e populações de B. thuringiensis provenientes das regiões brasileiras foram verificadas. Mesmo assim, alguns grupos formados são constituídos por uma população clonal de isolados da bactéria. / The work was developed in the Laboratory of Bacterias’ Genetics and Applied Biotechnology (LGBBA) at UNESP/ Jaboticabal Campus. There were genetically characterized, by PCR, isolates of B. thuringiensis, belonging to three Brazilian collections basead on cry1 gene content, evaluating their effects on Plutella xylostella. They were also characterized concerning their enterotoxins production such as HBL, NHE and the PLC virulence factor, using molecular techniques, so as to evaluate their gene diversities, as well as their population genetic, using the PCR-RFLP approach. It was observed a homogeneous distribution of the cry1 subclasses within B. thuringiensis strain collections studied, with bigger percentage of isolates showing the cry1Ab genes (42.12%) and with lower percentage of isolates for subclass cry1Db (0.6%). The bioassays have revealed 100% mortality to P. xylostella larvae meaning that the effectiveness of B. thuringiensis as a biological control agent does not depend at the cry genes content. When the B. thuringiensis population structure was considered, 78 haplotypes were defined for the strains contents of different collections and 76 haplotypes were defined for strains of different Brazilian regions, exhibiting the great genetic variability for hblA, plcR, nheBC and cry1 loci. According to the FSTs values for establish pair comparisons, significant differences among the B. thuringiensis collections and populations, were observed. Nevertheless some of the formed groups were considered as bacterial clonal population.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GermanaGR_DISSERT.pdf: 1130619 bytes, checksum: 8a9b56b38e3290f0902f54c5111e97b8 (MD5) Previous issue date: 2015-09-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to investigate the presence of enterotoxigenic and methicillin-resistant genes in Staphylococcus aureus isolated from goat milk obtained from Rio Grande do Norte state producers. To achieve such goal, 49 samples of goat milk and searched for S. aureus. The colonies were isolated in Petrifilm plates, Staph Express 3M model and biochemically identified. Afterwards, the isolated strains underwent an assessment to evaluate their antibiotic resistance profile, through the use of disk diffusion technique on Mueller-Hinton agar. Following we carried out a polymerase chain reaction (PCR) to search for the following selected genes: 16S rRNA (for molecular identification of S. aureus), mecA (characterizes the methicillin-resistant S.aureus) and enterotoxigenic genes (sea, seb-sec, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej and tsst-1). Results from morphological and biochemical analyses revealed that all isolated strains belonged to the Staphylococcus aureus species. We also observed, through the antibiogram, high percentage of resistance to the antibiotics penicillin G (87.75%) and oxacillin (75.51%). Multidrug resistance was detected in 73.46% of the isolated strains. Analyzing the PCR, we confirmed that 100% of the isolated strains were S. aureus because of the amplification of the 16S rRNA gene. The mecA gene was found in 4.08% of the samples. In samples confirmed as S. aureus, concerning the research for staphylococcal enterotoxins (SE), there was amplification of the sej gene fragments in 79.5% of the samples, followed by the sei gene in 48.9%, sed gene in 22.4%, sea gene in 12, 2%, seh and sec genes in 8.1%, and sec gene in 2% for the samples. We did not observe any amplification for the seb-sec, see and tsst-1 genes. The strains of S. aureus isolated from goat milk have shown the presence of genes responsible for the production of toxins, a fact that requires greater care when processing this milk in the dairy industry. In addition, to antibiotic resistance and detection of mecA gene also leads to concern, can pose risks to consumer health / O objetivo do presente trabalho foi investigar a presença de genes enterotoxigênicos e de resistência à meticilina em Staphylococcus aureus isolados de leite caprino obtido de produtores do estado do Rio Grande do Norte. Para a realização do estudo, realizou-se a pesquisa de S.aureus em 49 amostras de leite caprino. O isolamento foi realizado em placas Petrifilm , modelo Staph Express 3M e identificadas bioquimicamente. Em seguida, os isolados foram submetidos a avaliação quanto ao perfil de resistência a antibióticos, utilizando a técnica de difusão em discos em Agar Mueller-Hinton. Seguiu-se com a realização da reação em cadeia pela polimerase (PCR) para pesquisa dos seguintes genes selecionados: 16S rRNA (para identificação molecular dos S. aureus), mecA (que caracteriza S. aureus resistente à meticilina) e genes enterotoxigênicos (sea, seb-sec, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej e tsst-1). Os resultados das análises morfológicas e bioquímicas revelaram que todos os isolados pertenciam a espécie Staphylococcus aureus. Observou-se através do antibiograma realizado um maior percentual de resistência para os antimicrobianos penicilina G (87,75%) e oxacilina (75,51%). Multirresistência foi verificada em 73,46% dos isolados. Com a análise da PCR, confirmou-se que 100% dos isolados eram S. aureus, pela amplificação do gene 16S rRNA. O gene mecA foi detectado em 4,08% das amostras. Na pesquisa de enterotoxinas estafilocócicas (SE), nas amostras confirmadas para S. aureus, houve amplificação em 79,5 % dos fragmentos do gene sej, seguido de 48,9% do gene sei, 22,4% do gene sed, 12,2% para o gene sea, 8,1% para os genes seh e seg e 2% para o gene sec. Não foi observada nenhuma amplificação para os genes seb-sec, see e Tsst-1. As amostras de S. aureus isoladas a partir do leite caprino demostraram presença de genes responsáveis pela produção de toxinas, fato que exige um maior cuidado no tratamento deste leite pela indústria de alimentos. Além disso a resistência aos antibióticos e detecção do gene mecA também leva a preocupação, podendo representar riscos à saúde do consumidor

A resistência aos antimicrobianos pela produção de β-lactamases em enterobactérias é um problema adicional neste cenário. Staphylococcus spp é considerado um patógeno humano freqüentemente associado a infecções adquiridas no ambiente hospitalar. O objetivo desse trabalho foi estudar a resistência aos antimicrobianos em cepas de Enterobactérias e Staphylococcus spp. isoladas de equipamentos utilizados no preparo de dietas destinadas à pacientes internados em um hospital universitário no município do Rio de Janeiro, além de verificar a presença de genes codificadores de enterotoxinas nas cepas de Staphylococcus spp. As enterobactérias e os Staphylococcus spp. foram isolados e identificados por metodologia convencional. Para o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foram utilizados discos contendo antimicrobianos clinicamente relevantes. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de microdiluição em caldo para os antimicrobianos clinicamente relevantes. A pesquisa de genes que codificam β-lactamases em enterobactérias foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-1 e blaCMY-2. Para Staphylococcus spp. foram pesquisados, através da PCR e sequenciamento, os genes de resistência a meticilina, gentamicina e eritromicina e os genes codificadores de enterotoxinas (sea-see, seg-sej, sen-ser e seu). Foram isoladas 97 cepas de enterobactérias, 40 de liquidificador e 57 de batedeira e 40 cepas de Staphylococcus spp., 20 de cada equipamento. Dentre as enterobactérias, o gênero Enterobacter foi isolado com maior frequencia (n=37, 38%). Foram ainda isoladas seis cepas de Salmonella spp. Das enterobactérias, 80% (n=79) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 38% (n=37) a três ou mais. A expressão fenotípica presuntiva de b-lactamases do tipo AmpC foi detectada em 32 cepas. O gene blaCMY-2 não foi encontrado. Doze cepas apresentaram halos de inibição com screaning positivo para a pesquisa de ESBL. Foi detectada a presença do gene blaSHV em K. pneumoniae subsp. pneumoniae. O sequenciamento desse gene permitiu identificá-lo como sendo blaSHV-36. Dentre os Staphylococcus spp., oito foram identificados como coagulase-positivas (SCP) e 32 como coagulase-negativas (SCN). As oito cepas de SCP foram identificadas como S. aureus subsp. aureus. Dentre os SCN, as espécies identificadas com maior frequência foram: S. caprae (n=7, 17,5%), S. simulans (n=5, 12,5%) e S. epidermidis (n=4, 10%). Destas, 83% (n=33) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 30% (n=12) foram resistentes a mais do que três. Duas cepas (5%) de S. epidermidis apresentaram perfil de resistência a até seis antimicrobianos e genes de resistência a meticilina, a eritromicina e a gentamicina. Todas as sete cepas que foram resistentes no TSA e na CIM a gentamicina, apresentaram o gene aac(2)/aph(6). O gene ermB foi observado ainda em uma S hominis subsp hominis que apresentou resistência na CIM e no TSA. Foi detectada a presença de pelo menos um gene codificador de enteroxotxina em 83% (n=33) das cepas. O gene seg foi detectado em 11 cepas, o gene sei em 17 cepas e o gene sen em 31 cepas. Os resultados encontrados implicam as dietas preparadas com esses equipamentos como veículo de disseminação de enteropatógenos e Staphylococcus spp. com marcadores de resistência e genes codificadores de enterotoxinas relevantes no ambiente hospitalar.

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Janete Apparecida Desiderio Sena / Banca: Gislayne Fernandes Lemes Trindade Vilas-Bôas / Banca: Sérgio Antonio de Bortoli / Banca: Fernando Hercos Valicente / Resumo: O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) da FCAV-UNESP. Foram caracterizados geneticamente, por PCR, isolados de Bacillus thuringiensis, provenientes de três coleções brasileiras, quanto aos tipos de genes cry1, avaliando-se o efeito dos mesmos sobre uma população de Plutella xylostella caracterizando-se também os isolados de B. thuringiensis quanto à presença de enterotoxinas HBL, NHE e o regulador pleitrópico PLC, por verificação biomolecular, avaliando a variabilidade, bem como a estruturação genética de populações de B. thuringiensis, por PCR-RFLP. Verificou-se que existe uma distribuição homogênea das subclasses cry1 dentro do banco de isolados de B. thuringiensis, com maior porcentagem de isolados portadores dos genes cry1Ab (42,12%) e com menor porcentagem de representantes da subclasse cry1Db (0,6%). Nos bioensaios observou-se 100% de mortalidade para lagartas de P. xylostella com os isolados utilizados, indicando que combinações de tipos diferentes de genes cry1 apresentam ação tóxica para larvas de P. xylostella. Analisando a estrutura populacional de B. thuringiensis foram obtidos 78 haplótipos, definidos para as populações das diferentes coleções, e 76 haplótipos, definidos para as populações de diferentes regiões brasileiras, retratando a variabilidade genética para os loci hblA, plcR, nheBC e cry1 analisados. Segundo valores FSTs, de comparação duas a duas, diferenças significativas entre coleções e populações de B. thuringiensis provenientes das regiões brasileiras foram verificadas. Mesmo assim, alguns grupos formados são constituídos por uma população clonal de isolados da bactéria. / Abstract: The work was developed in the Laboratory of Bacterias' Genetics and Applied Biotechnology (LGBBA) at UNESP/ Jaboticabal Campus. There were genetically characterized, by PCR, isolates of B. thuringiensis, belonging to three Brazilian collections basead on cry1 gene content, evaluating their effects on Plutella xylostella. They were also characterized concerning their enterotoxins production such as HBL, NHE and the PLC virulence factor, using molecular techniques, so as to evaluate their gene diversities, as well as their population genetic, using the PCR-RFLP approach. It was observed a homogeneous distribution of the cry1 subclasses within B. thuringiensis strain collections studied, with bigger percentage of isolates showing the cry1Ab genes (42.12%) and with lower percentage of isolates for subclass cry1Db (0.6%). The bioassays have revealed 100% mortality to P. xylostella larvae meaning that the effectiveness of B. thuringiensis as a biological control agent does not depend at the cry genes content. When the B. thuringiensis population structure was considered, 78 haplotypes were defined for the strains contents of different collections and 76 haplotypes were defined for strains of different Brazilian regions, exhibiting the great genetic variability for hblA, plcR, nheBC and cry1 loci. According to the FSTs values for establish pair comparisons, significant differences among the B. thuringiensis collections and populations, were observed. Nevertheless some of the formed groups were considered as bacterial clonal population. / Doutor

A resistência aos antimicrobianos pela produção de β-lactamases em enterobactérias é um problema adicional neste cenário. Staphylococcus spp é considerado um patógeno humano freqüentemente associado a infecções adquiridas no ambiente hospitalar. O objetivo desse trabalho foi estudar a resistência aos antimicrobianos em cepas de Enterobactérias e Staphylococcus spp. isoladas de equipamentos utilizados no preparo de dietas destinadas à pacientes internados em um hospital universitário no município do Rio de Janeiro, além de verificar a presença de genes codificadores de enterotoxinas nas cepas de Staphylococcus spp. As enterobactérias e os Staphylococcus spp. foram isolados e identificados por metodologia convencional. Para o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foram utilizados discos contendo antimicrobianos clinicamente relevantes. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de microdiluição em caldo para os antimicrobianos clinicamente relevantes. A pesquisa de genes que codificam β-lactamases em enterobactérias foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-1 e blaCMY-2. Para Staphylococcus spp. foram pesquisados, através da PCR e sequenciamento, os genes de resistência a meticilina, gentamicina e eritromicina e os genes codificadores de enterotoxinas (sea-see, seg-sej, sen-ser e seu). Foram isoladas 97 cepas de enterobactérias, 40 de liquidificador e 57 de batedeira e 40 cepas de Staphylococcus spp., 20 de cada equipamento. Dentre as enterobactérias, o gênero Enterobacter foi isolado com maior frequencia (n=37, 38%). Foram ainda isoladas seis cepas de Salmonella spp. Das enterobactérias, 80% (n=79) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 38% (n=37) a três ou mais. A expressão fenotípica presuntiva de b-lactamases do tipo AmpC foi detectada em 32 cepas. O gene blaCMY-2 não foi encontrado. Doze cepas apresentaram halos de inibição com screaning positivo para a pesquisa de ESBL. Foi detectada a presença do gene blaSHV em K. pneumoniae subsp. pneumoniae. O sequenciamento desse gene permitiu identificá-lo como sendo blaSHV-36. Dentre os Staphylococcus spp., oito foram identificados como coagulase-positivas (SCP) e 32 como coagulase-negativas (SCN). As oito cepas de SCP foram identificadas como S. aureus subsp. aureus. Dentre os SCN, as espécies identificadas com maior frequência foram: S. caprae (n=7, 17,5%), S. simulans (n=5, 12,5%) e S. epidermidis (n=4, 10%). Destas, 83% (n=33) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 30% (n=12) foram resistentes a mais do que três. Duas cepas (5%) de S. epidermidis apresentaram perfil de resistência a até seis antimicrobianos e genes de resistência a meticilina, a eritromicina e a gentamicina. Todas as sete cepas que foram resistentes no TSA e na CIM a gentamicina, apresentaram o gene aac(2)/aph(6). O gene ermB foi observado ainda em uma S hominis subsp hominis que apresentou resistência na CIM e no TSA. Foi detectada a presença de pelo menos um gene codificador de enteroxotxina em 83% (n=33) das cepas. O gene seg foi detectado em 11 cepas, o gene sei em 17 cepas e o gene sen em 31 cepas. Os resultados encontrados implicam as dietas preparadas com esses equipamentos como veículo de disseminação de enteropatógenos e Staphylococcus spp. com marcadores de resistência e genes codificadores de enterotoxinas relevantes no ambiente hospitalar.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:42:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Milena_Tomasi_ Bassani.pdf: 628517 bytes, checksum: af4a756ae84e13ef34c451b2d486162e (MD5) Previous issue date: 2009-10-27 / he accessory gene regulator (agr) is a S. aureus global regulator of virulence factors, as the staphylococcal enterotoxins (SE), responsible for the staphylococcal food poisoning. There are four different agr groups due to the polymorphism in the amino acids sequence of the agrC and agrD. In the literature is described a relationship among agr groups and virulence factors, diseases, preferential host and antibiotic resistance. In this context, it was aimed to characterize the agr groups through biplex PCR, and relationship among agr groups, enterotoxigenic and antimicrobian profiles of S. aureus isolated from foods and bovine mastitis milk. A total of 115 strains were used to characterize the agr groups , being 30 isolated from f bovine mastitis milk and 85 isolated from several sources of foods. To assess the relationship between agr groups and enterotoxin production were used 14/85 strains previously characterized for the presence of some enterotoxins (sea, seb, sec, sed e cluster egc). To determine the profile of antibiotics resistance were used 71/115 strains. We observed a prevalence of agr group II with19.1% (22/115 strains), followed by the agr I with 8.6% (10/115 strains), agr III with 7.8% (9 / 115 strains), and agr IV with6.0% (7 / 115 strains). Among the strains isolated from bovine mastitis milk agr group I was prevailed with 20% (6/30 strains), whereas in the strains isolated from several food sources was observed prevalence of agr group II with 32.7% (18/85 strains), especially among those from chicken meat. Among the 14 strains (14/85) that contained enterotoxin genes, the majority of them contained the cluster egc (70%) belonged to agr II, whereas no relationship was found with those who had the genes for the classical SE (sea, seb, sec, sed). Considering the antibiotic resistance 100% of bovine mastitis milk strains and from various sources of food were resistant to penicillin, ampicillin, cefoxitin, and vancomycin. Relationship was observed between food strains, which were resistant to vancomycin and agr II, however, no relationship was found between antibiotic profile and agr groups among the strains isolated from bovine mastitis milk. These results demonstrated the prevalence of agr II among food strains and agr I among bovine mastitis milk strains. Moreover, the strains that carried the cluster egc were predominant agr II, which could indicate the occurrence of a clonal group among those. Another important result obtained in this study was the high rate of S. aureus multiresistant strains isolated from food, which emphasizes the importance of dissemination of these strains among foods. / O accessory gene regulator (agr) é um regulador global de fatores de virulência em S. aureus, como as enterotoxinas estafilocócicas (EE), responsáveis pela intoxicação alimentar estafilocócica. São conhecidos quatro distintos grupos agr devido ao polimorfismo na seqüência dos aminoácidos de agrC e agrD. Na literatura descreve-se relação entre fatores de virulência, patogenias, hospedeiro preferencial e perfil de resistência a antibióticos com grupos agr. Neste contexto, objetivou-se caracterizar grupos agr através de biplex PCR, e relacioná-los com os perfis enterotoxigênico e antimicrobiano de cepas de S. aureus isoladas em alimentos e leite de vacas mastíticas. Para caracterização dos grupos agr foram utilizadas 115 cepas, sendo 30 isoladas em leite de vacas mastíticas e 85 em diversas fontes de alimentos. Para a relação entre grupos agr e produção de enterotoxina foram utilizadas 14/85 cepas previamente caracterizadas quanto à presença de alguma enterotoxina (eea, eeb, eec, eed e cluster egc), já para determinar o perfil de resistência a antibióticos utilizaram-se 71/115 cepas. Observou-se uma prevalência do grupo agr II, com 19,1% (22/115 cepas), seguido do agr I, com 8,6% (10/115 cepas), agr III 7,8% (9/115 cepas), e agr IV, 6,0% (7/115 cepas). Entre as cepas isoladas em leite de vacas com mastite houve predomínio do grupo agr I, com 20% (6/30 cepas); já nas cepas isoladas de diversas fontes de alimentos observou-se prevalência do grupo agr II, com 32,7% (18/85 cepas), especialmente entre as provenientes de carne de frango. Entre as 14/85 cepas que carreavam genes de enterotoxinas, a maioria que albergava o cluster egc (70%), pertencia ao grupo agr II, enquanto nenhuma relação foi observada com aquelas que possuíam os genes para as EE clássicas (eea, eeb, eec, eed). Com relação ao perfil de resistência antimicrobiana, 100% das cepas isoladas de leite de vacas com mastite e das diversas fontes de alimentos apresentaram resistência à penicilina, ampicilina, cefoxitina e vancomicina. Observou-se relação entre cepas isoladas de alimentos, que eram resistentes à vancomicina e grupo agr II, entretanto, nenhuma relação foi observada entre perfil antimicrobiano e grupos agr entre as cepas isoladas em leite de vacas com mastite. Através destes resultados demonstra-se a prevalência do grupo agr II entre as cepas isoladas de alimentos e do grupo agr I em cepas isoladas de leite de vacas mastíticas. Além disso, nas cepas que carreiam o cluster egc houve predominância do grupo agr II, podendo indicar um grupo clonal entre essas. Outro resultado relevante obtido neste estudo foi à elevada taxa de cepas de S. aureus multiresistentes isoladas em alimentos, o que ressalta a importância da disseminação de cepas multiresistentes entre os alimentos.

As condições de produção de queijos frescos são favoráveis à ocorrência e à produção de enterotoxinas produzidas por estafilococos, sendo estes os principais micro-organismos relacionados aos casos de intoxicação alimentar no mundo, tornando-se necessários estudos sobre a rastreabilidade das fontes de contaminação durante a fabricação, identificação genotípica e habilidade de cepas em produzir enterotoxinas. Este trabalho teve como objetivo isolar e identificar estafilococos positivos para o teste de coagulase, potencialmente produtores de enterotoxinas em laticínios do estado de São Paulo, desde o leite recebido até o produto final. A técnica da mPCR foi utilizada para identificar três espécies de Staphylococcus coagulase-positiva (S. aureus, S. hyicus e S. intermedius) entre os isolados obtidos de diferentes pontos de processamento em laticínios do Estado de São Paulo. O perfil genético das cepas foi avaliado através da comparação de bandas pela técnica Enterobacteria Repetitive Intergenic Consensus (ERIC-PCR) e graficamente demonstrados por um dendrograma. O DNA de 102 cepas isoladas, de amostras de leite cru, leite pasteurizado, coágulo, manipulador, superfícies de equipamentos de laticínios do Estado de São Paulo e queijos foi extraído e submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando-se primers específicos para a detecção de fragmentos dos genes envolvidos na síntese das toxinas (SE) do tipo A, B, C, D, E, G, H, I e J. Das 102 cepas avaliadas, 5 apresentaram amplificação do fragmento do gene responsável pela codificação da toxina A, 3 para toxina C, 56 para toxina G, 59 para toxina H, 9 para toxina I, e nenhuma para toxinas B, D, E e J. Amostras de leite cru, leite pasteurizado e queijos produzidos nos laticínios e dos isolados de Staphylococcus spp. coagulase positiva que apresentaram ao menos algum dos genes relacionados à produção de toxinas clássicas (A, B, C, D e E) foram submetidos a um teste de detecção de enterotoxinas pelo sistema VIDAS® Staph Enterotoxin (SET2). Os dados obtidos para a identificação molecular das cepas, da ocorrência de cepas portadoras dos genes relacionados à produção de enterotoxinas e da produção fenotípica das enterotoxinas foram submetidos ao teste qui-quadrado. O presente trabalhou confirmou que o risco de intoxicação estafilocócica é real, pois foi encontrada enterotoxina em amostras de leite pasteurizado e queijos. / The production conditions of fresh cheese are favorable to the occurrence and production of enterotoxin produced by Staphylococci, which are the main microorganisms related to food poisoning cases in the world, requiring studies to trace the sources of contamination during manufacturing and genotypic identification ability of strains to produce enterotoxin. This study aimed to isolate and identify staphylococci positive for coagulase test, potentially producing enterotoxins in dairy products in the state of São Paulo, from milk receiving to final product. In three dairy producers of Minas fresh cheese, samples were collected from various points in the manufacturing process. the technique of mPCR was used to identify three coagulase-positive species (S. aureus, S. hyicus and S. intermedius) between isolates from different points of a processing dairy in the state of São Paulo. The genetic profile of the strains were evaluated by comparing the bands through the technique Enterobacteria Repetitive Intergenic Consensus (ERIC-PCR) and were graphically displayed by a dendrogram. The DNA of 102 strains isolated from samples of raw milk , pasteurized milk , curd, handler and equipment surface from dairies in São Paulo State and cheese were subjected to the polymerase chain reaction (PCR), using primers for the detection of specific fragments of the genes involved in the synthesis of toxins (SE) of type A, B , C , D, E, G , H, I and J. Of the 102 strains tested, five showed amplification of the gene fragment encoding toxin A, three for toxin C , 56 to toxin G, 59 to toxin H, 9 to toxin I, and none for toxins B D, E and J. For confirmation, each isolated strain carrying at least some of the genes related to the production of classical enterotoxinas, cheese and milk samples was subjected to detection by enterotoxigenic VIDAS® Staph Enterotoxin II (VIDAS SET2) bioMérieux. This identification reinforces the need to adopt proper hygiene practices in the dairy, avoiding thus the spread of these microorganisms and the possible production of enterotoxin . The data obtained for the molecular identification of the strains, the occurrence of strains carrying the genes related to the production of enterotoxin production and phenotypic enterotoxins were subjected to the Chi-squared test. This work confirmed that the risk of staphylococcal food poisoning is real, because enterotoxin was found in samples of pasteurized milk and cheeses.

Linhagens de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) são consideradas como importante agente de diarréia, principalmente entre crianças e turistas em países em desenvolvimento. Entre os fatores de virulência expressos por ETEC, as enterotoxinas termo-lábil (LT) e termo-estável (ST) representam os mais relevantes fenótipos. Evidências preliminares sugerem que a severidade da diarréia associada a linhagens de ETEC deve refletir a diversidade natural de linhagens selvagens quanto à produção de enterotoxinas e/ou à ocorrência de variantes naturais com efeitos tóxicos reduzidos. No presente trabalho, investigamos diversidade genética do óperon etx, que codifica para a toxina LT, e da capacidade de produção e secreção de LT por linhagens de ETEC isoladas de humanos ou suínos em diferentes regiões geográficas. Os resultados mostraram considerável variabilidade na produção de LT com valores variando de 2 a 2.525 ng de toxina por mL de cultura. Secreção de LT foi também variável com valores variando de menos que 0,04% a 49,5% do total de LT produzida pelas diferentes linhagens de ETEC. Adicionalmente, experimentos de alça ligada em coelho mostraram uma boa correlação entre a quantidade de LT secretada sob condições in vitro e a capacidade de causar acúmulo de fluidos in vivo. Nós determinamos ainda diversidade de ETEC pela obtenção das seqüências dos óperons etxAB de 50 linhagens (LT+ or LT+/ST+) pertencentes a diferentes sorotipos com ênfase para as linhagens produtoras apenas de LT e isoladas de crianças assintomáticas. As seqüências de nucleotídeo completas dos genes etxAB revelaram 23 alterações de aminoácidos nas subunidades A (18) e B (5), as quais geraram 16 variantes de LT. Entre estes variantes de LT, um mostrou efeito tóxico reduzido em comparação à toxina de referência LT1. A forma de LT atenuada (LT4) tem atividade enzimática reduzida devido à troca de aminoácido. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains represent an important etiological agent of diarrheal disease, particularly among children and travelers in developing countries. Among the virulence factors expressed by ETEC strains the heat-labile (LT) and heat-stable (ST) enterotoxins represent the most revelevant phenotypes. Indirect evidences suggest that the severity of diarrhea associated to ETEC strains might reflect the natural diversity of wild strains to produce enterotoxins and/or the occurrence of variants endowed with reduced toxic effects. In the present study, we investigated both the genetic diversity of the etx operon, encoding the heat-labile toxin, and the capability to produce/secrete LT by ETEC strains isolated from humans or porcine in different geoghrafic areas. The results showed a remarkable variability on the production of LT with values ranging from 2 to 2,525 ng of toxin per ml of culture. LT secretion was also variable with values ranging from less than 0.04% to 49.5% of total LT produced by the different ETEC strains. Additionally, rabbit ileal loop experiments showed a good correlation between the amounts of secreted LT under in vitro conditions and fluid accumulation in vivo. We determined also the diversity of the etxAB operon of 50 ETEC strains (LT+ or LT+/ST+) belonging to different serotypes with emphasis to LT+-only producing strains isolated from asymptomatic children. The complete nucleotide sequences of the etxAB genes revealed 23 amino acid changes at the A (18) or B (5) subunits, which generated 16 variant forms of LT. Among these LT variants, one of them showed reduced toxic effects in comparison to the reference toxin LT1. The attenuated LT form (LT4) had decreased enzymatic activity due to an amino acid replacement (K4R) at the A1 subunit. LT4 retains its immunogenic and adjuvant properties following nasal immunization. Additionaly, the LT4 variant showed altered immune modulatory features and promoted a more biased Th1 response, which favor activation of effector CD8+ T lymphocytes, to co-administred antigen with regard to LT1. Taken together, our results demonstrate that ETEC strains isolated from human subjects express natural genetic variability leading to a remarkable polymorphism of the etx operon as well as production and secretion of LT. Such natural genetic diversity observed in ETEC strains may affect the host-pathogen relationships and, consequently, contribute to the severity of the disease among infected subjects.