A exposição ao estresse induz um aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) e glutamato em estruturas do cérebro de ratos, as quais estão relacionadas com o transtorno de depressão maior (DM) em humanos. Ademais, o estresse está diretamente relacionado com o aumento da metilação do DNA, uma alteração epigenética repressiva, no hipocampo de animais. Estudos anteriores demonstraram o efeito tipo antidepressivo dos inibidores da enzima óxido nítrico sintase (NOS) em animais submetidos ao estresse. Porém não se sabe se há uma relação entre o aumento do NO e glutamato induzido pelo estresse e alteração na metilação do DNA em genes relacionado com a patofisiologia da DM. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos dos inibidores da NOS nas alterações comportamentais e nos mecanismos intracelulares relacionado com a metilação do DNA no cérebro de ratos submetidos ao teste do desamparo aprendido (learned helplessness - LH) e em cultura celular do hipocampo desafiadas com NMDA e dexametasona. Métodos: Estudo 1: Cultura primária de células do hipocampo ou cultura imortalizada HiB5 foram desafiadas/estressadas com NMDA (30µM,1h), L-arginina (500µM,1h) e/ou dexametasona (1µM, 1h ou 24h) e pré-tratadas com inibidor seletivo da nNOS (NPA, 100nM, 30min antes do desafio) ou com inibidor da DNMT (5-Aza, 10 µM, 30 min antes do desafio). A expressão dos genes para as enzimas DNMTs, BDNF, NT4, TrkB e nNOS foram avaliadas por RT-qPCR, a expressão proteica das enzimas DNMT3b e nNOS foram avaliadas por western blotting. Estudo 2: Ratos foram submetidos à choques inescapáveis (0,4 mA; 40 choques) na sessão de pré-teste do LH, após sete dias os animais foram submetidos a sessão de teste (choques escapáveis de 0,4 mA). Os animais foram tratados com inibidores da NOS 7-nitroindazole (7-NI;60mg/kg,i.p), aminoguanidina (AMG; 30mg/kg,i.p) ou veículo por 7 dias e submetidos a sessão de teste 1h, após a última injeção. A metilação global foi analisada por imunoensaio (ELISA) e a expressão dos genes DNMT3b, BDNF, nNOS e iNOS foram avaliadas por RT-qPCR, nas estruturas: cortex, hipocampo ventral e hipocampo dorsal. Resultados: Estudo 1: O pré- tratamento com NPA, atenuou o aumento da expressão do mRNA para a enzima DNMT3b, em cultura primária do hipocampo desafiada com NMDA, dexametasona e Larginina, e também em cultura HiB5 desafiada com dexametasona. Porém, o NPA não inibiu a diminuição da expressão do BDNF (exon 1, exon 4 e exon 9), em cultura primária de células do hipocampo desafiadas com NMDA. O pré tratamento com 5-Aza, não inibiu as alterações induzidas pelo NMDA em cultura primária de hipocampo. Estudo 2: Ratos submetidos ao estresse dos choques inescapáveis na sessão de pré-teste apresentaram aumento no número de falhas em escapar dos choques na sessão de teste (desamparo aprendido), um efeito que foi atenuado pelo tratamento com AMG ou 7-NI. Interessantemente, o efeito comportamental do estresse foi acompanhado por aumento nos níveis da metilação global do DNA e DNMT3b no hipocampo ventral (vHPC), que foi atenuado pelos pré-tratamentos com AMG e 7-NI, porém não houve diferença estatisticamente significante no córtex e no hipocampo dorsal dos ratos. Conclusão: Os dados apresentados demonstraram que tanto o estresse (in vivo) quanto o desafio com glicocorticóides, NMDA e L-arginina (in vitro) são capazes de modular a expressão daenzima DNMT3b e a metilação de DNA no hipocampo. O tratamento com inibidores da NOS reduzem os efeitos do estresse in vivo (comportamental e molecular) e in vitro. Em conjunto, os dados sugerem que a liberação de glutamato e NO durante o estresse pode modular a expressão da enzima DNMT3b, levando ao aumento da metilação do DNA em genes relacionados com a resposta de adaptação ao estresse. Essa é a primeira evidência de que o NO pode modular metilação do DNA induzida por estresse. / Stress exposure increases glutamate and nitric oxide (NO) levels, as well as DNA methylation in the hippocampus. However, it is not yet known if there is a causal relationship between these events. Moreover, both nitric oxide synthase (NOS) inhibitors and DNA methylation inhibitors counteract the behavioral effects of stress. Therefore, our aim was to investigate the effects of NOS inhibitors on stress-induced changes on behaviour, DNA methylation and genes expression in the hippocampus of rats submitted to learned helplessness - LH. Moreover, the effects of direct administration of dexamethasone (glucocorticoid), NMDA and L-arginine was investigated in hippocampal cell cultures. Methods: Study 1: Primary hippocampal cell culture was challenged with NMDA (30µM,1h), L-arginine (500µM,1h) or dexamethasone (1µM,24h) and pretreated with nNOS inhibitor (NPA, 100nM, 30min before the challenge) or with DNMT inhibitor (5-Aza, 10 µM, 30 min before the challenge). DNMTs, BDNF, NT4, TrkB and nNOS gene expression was assessed by RT-qPCR. DNMT3b and nNOS levels were assessed by western blotting. Study 2: Rats were submitted to inescapable footshocks and treated with the NOS inhibitors 7-nitroindazole (7-NI; 60 mg/kg, i.p) or aminoguanidine (AMG; 30 mg/kg, i.p], or vehicle for 7 days and tested 1h after the last injection with escapable footshocks. The number of escape failures during the test, global DNA methylation (ELISA) and DNMT3b, BDNF, nNOS and iNOS mRNA expression (RT-qPCR) was evaluated. Results: NPA pretreatment attenuated DNMT3b mRNA expression in hippocampus primary cell culture challenged with NMDA, dexamethasone or L-arginine. Similarly effects were observed in HiB5 cell challenged with dexamethasone. However, NPA pretreatment did not inhibit the decrease of BDNF (exon 1, exon 4 and exon 9) induced by NMDA. Moreover, pretreatment with 5-Aza did not inhibit the decreased of BDNF induced by NMDA in primary cell culture. Study 2: Stress exposure increased the number of escape failures in the test, which was attenuated by treatment with AMG or 7-NI, an antidepressant-like effect. Interestingly, the increased DNA methylation DNMT3b mRNA expression in the ventral hippocampus (vHPC) of stressed rats were also attenuated by treatment with both AMG and 7-NI. Conclusions: NOS inhibitors attenuated stress-induced depressive-like behavior, DNA methylation and DNMT3b mRNA expression in the vHPC. In vitro, selective nNOS inhibition also blocks corticosterone-, NMDA- and L-arginine-induced DNMT3b mRNA expression in hippocampal cell culture. Altogether, our results suggest that glutamate release, leading to NO production during stress may mediate intracellular mechanisms that regulate DNMT3b expression and DNA methylation. This is the first evidence indicating that NO modulates DNA methylation induced by stress.

O chumbo (Pb) é um metal tóxico que se acumula no organismo e provoca diversos efeitos, afetando vários sistemas, tais como renal, gastrointestinal, reprodutor, endócrino, hepático e hematopoiético. No que se refere a estudos epigenéticos, quando comparados a outros metais, o Pb é, até o momento, o menos estudado e, portanto, muito pouco se sabe a respeito dos efeitos epigenéticos sobre a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) do Pb e, consequentemente, sobre a toxicidade induzida pela exposição ao Pb. Assim, o objetivo do presente estudo consiste em avaliar o padrão de metilação de regiões promotoras dos genes GCLC e MT2A, quantificar a porcentagem de metilação global além das dosagens de parâmetros hepáticos e renais e associá-los à exposição ao Pb. De acordo com os guidelines STROBE e STREGA, 100 trabalhadores do sexo masculino com idades entre 18 e 67 anos participaram do trabalho. Cerca de 6,0 mL de sangue e 5,0 mL de soro foram coletados após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). As concentrações de Pb no sangue (Pb-s) e no plasma (Pb-p) foram determinadas por espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS); o DNA genômico foi extraído do sangue total e quantificado por kits específicos. As amostras de DNA foram tratadas com bissulfito de sódio e a quantificação da porcentagem de metilação global do DNA dos indivíduos expostos ao metal foi determinada pelo método de Elisa indireto e o sequenciamento das amostras para avaliar o padrão de metilação de regiões promotoras dos genes GCLC (Subunidade Catalítica de Glutamato-Cisteína Ligase) e MT2A (Metalotioneína 2A), pela técnica de pirosequenciamento. Também foram determinadas as atividades das enzimas transaminase glutâmica oxalacética (TGO) e pirúvica (TGP), bem como da gama-glutamil transferase (GGT) no plasma por espectrofotometria UV/Visível. Cerca de 32% dos voluntários consomem bebidas alcoólicas regularmente e 12% são fumantes. A concentração de Pb-s em média foi de 19 ± 10 ?g/dL (variando de 1,8 a 48 ?g/dL) e Pb-p 0,56 ± 0,64 ?g/dL atingindo valores de até 4,0 ?g/dL. A maioria dos indivíduos, apresentou concentrações de ureia, creatinina, TGO, TGP e GGT dentro dos valores de referência. Em relação aos marcadores epigenéticos, foi observada uma associação inversa entre concentrações de Pb-s e Pb-p, ou seja, indivíduos que apresentavam altas concentrações do metal, tinham menor % de metilação global do DNA. Em relação ao estudo das regiões promotoras dos genes MT2A e GCLC, os resultados sugerem que o Pb não altera a metilação nas ilhas CpGs localizadas nas regiões promotoras dos genes MT2A e GCLC, entretanto, foi capaz de induzir alterações no padrão de metilação global do DNA, fornecendo resultados acerca das possíveis interações entre o genoma e o metal. / Lead (Pb) is a toxic metal that accumulates in the body and induces several effects, affecting several systems, such as renal, gastrointestinal, reproductive, endocrine, hepatic and hematopoietic. Regarding epigenetic studies, when compared to other metals, Pb is the least studied and, therefore, very little is known about the epigenetic effects on absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) of Pb and, consequently, on the toxicity induced by the metal. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the methylation pattern of GCLC and MT2A gene promoter regions, to quantify the percentage of global methylation in addition to hepatic and renal measurement levels and to associate them with Pb exposure. According to the STROBE and STREGA guidelines, 100 male workers between 18 and 67 years old participated in the study. About 6.0 mL of blood and 5.0 mL of serum were collected after signing the free and informed consent term (TCLE). Pb concentrations in blood (b-Pb) and plasma (p-Pb) were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS); the genomic DNA was extracted from whole blood and quantified by specific kits. The DNA samples were treated with sodium bisulfite and the quantification of the DNA global methylation percentage of workers exposed to the metal was determined by the indirect Elisa method and the sequencing of the samples to evaluate the methylation pattern of GCLC (Catalytic Subunit of Glutamate-Cysteine Ligase) and MT2A (Metallothionein 2A) by the technique of pyrosequencing. The activities of glutamic oxalacetic transaminase (TGO) and pyruvic (TGP) enzymes as well as gamma-glutamyl transferase (GGT) in plasma were also determined by UV / Visible spectrophotometry. About 32% of volunteers regularly drink alcohol and 12% are smokers. The mean b-Pb concentration was 19 ± 10 ?g / dL (ranging from 1.8 to 48 ?g / dL) and p-Pb 0.56 ± 0.64 ?g / dL reaching values up to 4.0 ?g / dL. Most of the individuals had concentrations of urea, creatinine, TGO, TGP and GGT within the reference values. In relation to the epigenetic markers, an inverse association was observed between b-Pb and p-Pb concentrations, individuals with high concentrations of the metal, had lower % of global DNA methylation. Regarding the study of the promoter regions of the MT2A and GCLC genes, the results suggest that Pb does not alter the methylation in the CpG islands located in the promoter regions of the MT2A and GCLC genes, however, it was able to induce changes in the DNA global methylation pattern, providing results on possible interactions between the genome and the metal.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é a neoplasia hematológica mais comum na infância e representa uma doença heterogênea em relação à biologia e ao prognóstico e seu tratamento consiste principalmente em quimioterapia. Apesar dos avanços no tratamento, cerca de 20% dos pacientes apresentam recaída da doença e/ou óbito indicando a necessidade de terapias diferenciadas para esse grupo. Recentemente, drogas epigenéticas como inibidores de DNA metiltransferases (iDNMTs) tem mostrado efeitos anti-neoplásicos promissores para o tratamento de diversos tipos de neoplasias incluindo a LLA. Nos tumores, a hipermetilação gênica é encontrada em vários genes, incluindo genes de reparo do DNA, reguladores do ciclo celular e apoptose. Sendo assim, drogas desmetilantes estão sendo apontadas como promissores agentes para o tratamento do câncer. A Zebularina (ZB) é um iDNMT análogo de citidina que inibe a metilação do DNA. Esta droga tem mostrado resultados animadores para o tratamento de diversas neoplasias, incluindo glioblastoma, leucemia mielóide aguda, câncer de mama, próstata e outros. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do tratamento com a ZB, associada ou não à quimioterápicos, em linhagens celulares pediátricas de LLA, por meio de ensaios funcionais como proliferação celular, capacidade clonogênica, apoptose e ciclo celular. Além disso, foi analisada a capacidade desmetilante da droga e a expressão dos genes DNMT1, DNMT3a e DNMT3b após o tratamento com a ZB. A ZB inibiu a proliferação celular de maneira dose e tempo-dependente e agiu sinergicamente quando combinada com o MTX em ambas as linhagens. Ela também diminuiu a capacidade clonogênica e aumentou a taxa de apoptose nas duas linhagens estudadas. Além disso, o tratamento com ZB causou uma parada na fase S do ciclo celular na linhagem ReH. A ZB foi capaz de desmetilar parcialmente o gene AhR e reduzir a expressão dos genes DNMT1, DNMT3a e DNMT3b. Todos os dados encontrados no presente trabalho sugerem que as drogas desmetilantes podem ser interessantes agentes para o tratamento da LLA pediátrica. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common hematologic malignancy in childhood and represents a heterogeneous disease regarding its biology and prognosis. Its treatment consists mainly of chemotherapy. Despite advances in treatment, about 20% of patients experience disease recurrence and/or death indicating the need for differentiated therapies for this group. Recently, epigenetic drugs such as DNA methyltransferases inhibitors (iDNMTs) has shown antineoplastic and promising results for several types of tumors including ALL. Gene hypermethylation is found in several genes in tumors cells, including genes responsible for DNA repair, cell cycle and apoptosis regulators. Therefore, demethylating agents may be promising agents for cancer treatment. Zebularine (ZB) an iDNMT is a cytidine analogue that inhibits DNA methylation. This drug has shown promising results for the treatment of many cancers, including glioblastoma, acute myeloid leukemia, breast and prostate cancer and others. The aim of this study was to evaluate the effects of ZB treatment, associated or not with chemotherapeutic agents, in childhood ALL cell lines through functional tests such as cell proliferation, clonogenic capacity, apoptosis and cell cycle. In addition, we examined the demethylating ability of ZB and the expression of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b genes after treatment with this agent. ZB inhibited cell proliferation in a dose- and time-dependent manner and showed synergistic effects when combined with MTX in both cell lines. ZB treatment also reduced clonogenic capacity and increased the number of apoptotic cells in both cell lines studied. Furthermore, treatment with ZB caused an S phase cell cycle arrest in ReH cell line. ZB was able to partially demethylate AhR gene and reduce the expression of genes DNMT1, DNMT3a and DNMT3b. These results suggest that demethylating drugs may be interesting agents for the treatment of childhood ALL.

A Dnmt3b é a principal DNA metiltransferase no processo de remetilação de regiões de DNA repetitivo do genoma durante a onda de reprogramação epigenética que ocorre no desenvolvimento embrionário. Sua expressão é regulada por uma série de mecanismos, entre os quais encontram-se os microRNAs (miRNAs). O objetivo deste trabalho foi investigar o papel dos mRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a e hsa-miR-26b na regulação da expressão de DNMT3B durante a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas e suas consequências para a metilação do DNA destas células. Para isto, geramos curvas de expressão dos miRNAs investigados, bem como da DNMT3B, a fim de verificar a existência de correlação entre elas. Também analisamos o efeito da superexpressão de miRNAs miméticos sobre a expressão de DMMT3B e o efeito da inibição da interação entre os miRNAs e a região 3\'UTR de DNMT3B sobre a expressão da DNA metiltransferase e sobre os níveis de metilação do DNA das células. Constatamos que a expressão de DNMT3B está inversamente correlacionada com a expressão dos miRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a e hsa-miR-26b, mas não do hsa-miR-29b, regulador já validado para o controle da expressão de DNMT3B em células tumorais. Verificamos também que o impedimento da ligação do hsa-miR-203 ao segundo sítio predito para a ligação deste miRNA ao mRNA de DNMT3B ocasionou um aumento significativo na expressão da DNA metiltransferase, embora tal aumento não tenha refletido alteração nos níveis de metilação do DNA das células. Desta forma, concluímos que os miRNAs investigados fazem parte da maquinaria de regulação da DNA metiltransferase 3B na diferenciação de células-tronco embrionárias, embora o exato papel funcional de cada um deles no controle da expressão de DNMT3B e na metilação do DNA destas células ainda necessite ser melhor esclarecido / Dnmt3b is the major DNA methyltransferase in the proccess of repetitive DNA remethylation during the epigenetic reprogramming wave that occurs in the embryonic development. Its expression is regulated through several mechanisms, including microRNA (miRNAs). The aim of this study was to investigate the role of the miRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a, and hsa-miR-26b in the regulation of DNMT3B expression during the differentiation of human embryonic stem-cells, and its consequences to the DNA methylation of these cells. To accomplish this, we generated expression curves for the investigated miRNAs, as well as for DNMT3B, to verify the existence of correlation between them. We also analysed the effect of superexpressing mimetic miRNAs on DNMT3B expression, and the effect of inhibiting the interaction of these miRNAs with DNMT3B 3\'UTR region on the DNA methyltransferase expression and the levels of DNA methyation. We found that DNMT3B expression is inversely correlated to hsa-miR-203, hsa-miR-26a, and hsa-miR-26b expression, but not to hsa-miR-29b, a previously validated DNMT3B regulator in tumor cells. We also verified that blocking the interaction of hsa-miR-203 to its predicted second interaction site at the DNMT3B mRNA significantly increased DNMT3B expression, but did not interfere with the levels of DNA methylation in these cells. Thus, we conclude that the investigated miRNAs are part of the DNMT3B regulatory machinery during the differentiation of embryonic stem-cells, although the exact functional role of each of them in the control of DNMT3B expression and in the DNA methylation of these cells still remains to be further explored

A Doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais comum na atualidade. Cerca de 10% dos casos da doença estão relacionados com fatores genéticos e os outros 90% são devido a fatores ambientais e epigenéticos. Evidências indicam alterações na metilação de genes relacionados ao desenvolvimento da doença de Parkinson. No entanto, não se sabe o efeito de inibidores da metilação de DNA sobre a neurotoxicidade induzida por MPP+, uma neurotoxina que mimetiza processos neurodegenerativos associados ao Parkinson in vitro. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos inibidores da metilação de DNA (RG108, n-ftaloil-l-triptofano e 5azadC, 5-aza-2´-deoxycytidina) e do doador universal de grupamentos metil (SAM, S-adenosilmetionina) sobre neurotoxicidade induzida por MPP+ em cultura de células imortalizadas (PC12), por meio da análise da viabilidade celular avaliada no teste do MTT (3 - [4,5 dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio); e da análise de neuritogênese, na presença e na ausência de MPP+. Os resultados demonstraram que: 1. o tratamento com DNMTi (inibidor da DNA metiltransferase) ou com SAM induziram efeito per se sobre a viabilidade celular, apenas quando incubados em altas concentrações e em perídos prolongados (24h); 2. não modificaram a morte celular induzida pelo MPP+, em baixas concentrações, mas agravaram a neurotoxicidade quando incubados em altas concentrações ou por períodos prolongados (24h); 3. essas drogas induziram neuritogênese per se e potencializaram a neuritogênese induzida pelo NGF (fator de crescimento neural); 4. protegeram parcialmente contra a diminuição da neuritogênse induzida pelo MPP+. O conjunto de dados sugere que tanto os DNMTi quanto o SAM podem ser citotóxicos, dependen de suas concentrações e do tempo de exposição à droga. No entanto, essas drogas são capazes de aumentar a neuritogênese (diferenciação celular) e proteger contra a neurotoxicidade celular induzida pelo NGF, em células diferenciadas. / Parkinson\'s disease is the second most common neurodegenerative disease nowadays. About 10% of the disease cases are related to genetic factors and the other 90% are due to environmental and epigenetic factors. Evidence indicates changes in DNA methylation in genes related to the development of Parkinson\'s disease. However, the effect of DNA methylation inhibitors on MPP+-induced neurotoxicity, a drug that mimics neurodegenerative processes associated with Parkinson\'s in vitro, is not known. The aim of this study was to evaluate the effect of DNA methylation inhibitors (RG108, N-phthalyl-L-tryptophan and 5azadC, 5-aza-2?-deoxycytidine) and of the universal donor of methyl group (SAM, S-adenosyl methionine) on: 1. MPP+ -induced neurotoxicity in culture of immortalized cells (PC12), by analysis of cell viability in the MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium) test; 2. neuritogenesis, in the presence and absence of MPP +. Results indicated that: 1. treatment with DNMTi or SAM induced effects per se on cell viability only at higher concentrations and after prolonged periods of incubation (24h); 2. DNMTi (DNA methyltransferase inhibitors) and SAM increased cell differentiation and neuritogenesis per se, especially when incubated for 30 minutes, as well as they potentiated NGF-induced neurogenesis; 3. the drugs attenuated MPP+-induced effects on neuritogenesis. Altogether, these data suggests short treatment with both DNMTi and SAM do not cause cellular cytotoxicity (cell death), but are able to increase neuritogenesis (cell differentiation) and protect against MPP+-induced neurotoxicity in differentiated cells.

A esquistossomose é um grave problema de saúde pública, com alta mortalidade e morbidade em países endêmicos, causada pelo verme trematódeo do gênero Schistosoma. O praziquantel é a única droga disponível para tratamento da doença, é usada em larga escala para tratamento de populações de áreas endêmicas, porém não previne a reinfecção e tem efeito somente em vermes adultos. Drogas estudadas em câncer como inibidores de histona deacetilases (iHDACs) modificam o padrão epigenético da célula desencadeando a morte celular, e em Schistosoma mansoni já foi mostrado que a inibição de HDACs além de aumentar a acetilação de histonas alterou o fenótipo de miracídios e provocou morte em esquistossômulos e vermes adultos. O presente estudo investigou o efeito do iHDAC Trichostatin A (TSA) na regulação da transcrição gênica em esquistossômulos, detectando por meio de ensaios de microarray centenas de genes diferencialmente expressos, relacionados a replicação de DNA, metabolismo e complexos modificadores de histonas. A inibição de HDAC em vermes adultos levou a um aumento da acetilação nas marcas de histonas H3K9ac, H3K14ac e H4K5ac relacionadas à indução de transcrição. Com imunoprecipitação de cromatina seguida de PCR (ChIP-qPCR) detectou-se o aumento de deposição de H3K9ac e H3K14ac na região promotora de genes com expressão aumentada ou diminuída, porém a marca de repressão H3K27me3 não sofreu alteração na região promotora de nenhum gene analisado. Análises adicionais indicaram um conjunto de genes diferencialmente expressos que codificam proteínas histone readers, que fazem parte de complexos modificadores de histonas, como EED capaz de identificar a marca de repressão H3K27me3 e regular a atividade de EZH2, apontando um novo alvo terapêutico. O efeito sinérgico entre iHDAC e um iEZH2 foi testado e detectou-se o aumento da mortalidade de esquistossômulos. A estrutura de SmEZH2 foi modelada por homologia e usada para análises computacionais que sugeriram uma alta afinidade de ligação de SmEZH2 com o iEZH2, abrindo uma perspectiva de desenvolvimento de novas drogas específicas para tratamento da esquistossomose. / Schistosomiasis is a serious public health problem, with high mortality and morbidity in endemic countries, caused by trematode worms of the genus Schistosoma. Praziquantel is the only available drug for treatment of the disease; it is used extensively to treat populations in endemic areas, but does not prevent reinfection and is effective only in adult worms. Drugs studied in cancer as histone deacetylase inhibitors (iHDACs) modify the epigenetic status of the cell, triggering cell death, and it has been shown in Schistosoma mansoni that inhibition of HDACs increase histone acetylation, alter the phenotype of miracidia and cause death in schistosomules and adult worms. The present study investigated the effect of iHDAC Trichostatin A (TSA) on the regulation of gene transcription in schistosomules, detecting by means of microarray assays hundreds of differentially expressed genes related to DNA replication, metabolism and histone remodeling complexes. Inhibition of HDAC in adult worms led to an increase in histone acetylation marks H3K9ac, and H3K14ac H4K5ac related to transcriptional induction. With chromatin immunoprecipitation followed PCR (ChIP-qPCR) we detected an increased deposition of H3K9ac and H3K14ac at the promoter region of genes with increased or decreased expression, but the repressive mark H3K27me3 was not changed at all analyzed gene promoter regions. Additional analysis indicated a set of differentially expressed genes that encode histone reader proteins that are part of histone modifier complexes such as EED, which is able to identify the repression mark H3K27me3 and to regulate EZH2 activity, pointing to a new therapeutic target. The synergistic effect between iHDAC and one iEZH2 has been tested and found to cause an increase in schistosomules mortality. The SmEZH2 structure was modeled by homology and used for computational analyses, which suggested a high affinity binding of SmEZH2 with iEZH2, opening the opportunity for development of new specific drugs for treatment of schistosomiasis.

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Patologicamente esta doença caracteriza-se pelo acúmulo anormal do peptídeo β-amilóide (Aβ) no córtex e no hipocampo, emaranhados neurofibrilares intracelulares formados por tau hiperfosforilada, disfunção progressiva sináptica e, posteriormente perda neuronal. As opções terapêuticas disponíveis melhoram os sintomas, mas não impedem a progressão da doença, portanto, ainda está faltando uma estratégia terapêutica efetiva para DA. Há estudos relacionados à utilização de terapia epigenética para o tratamento da DA, a terapêutica mais desenvolvida é a que envolve a classe dos inibidores das deacetilases (HDACs). Assim, este trabalho tem por objetivo investigar o efeito protetor do inibidor da HDAC ácido hidroxâmico de suberoilanilida (SAHA) em um modelo de DA em camundongos. Para isso, foram utilizados 50 camundongos Swiss adultos, pesando entre 30-35 g, divididos em dois experimentos. No primeiro, os camundongos foram divididos em 6 grupos que receberam uma injeção de Aβ1-42 via intracerebroventricular (i.c.v.) no início da experiência (exceto o grupo Sham que foi utilizado como controle) para investigar a atividade das histonas   acetiltransferase (HATs) e HDAC, determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), expressão do mRNA de BDNF e modulação da via (cAMP/PKA/CREB) em uma curva de tempo (6 horas, 1, 3, 7 e 21 dias). Ao final de cada tempo, os animais foram submetidos ao teste cognitivo e foram eutanasiados. O córtex pré-frontal e o hipocampo foram removidos para posteriores análises. No segundo experimento, os camundongos foram dividos em 4 grupos: Grupo Controle (sham+veículo); Grupo Aβ1-42 (Aβ1-42 + veículo); Grupo SAHA (25 mg/kg, via intraperitoneal) (sham + SAHA); Grupo Interação (Aβ1-42 + SAHA). O peptídeo Aβ1-42 ou o veículo foram infundidos por injeção i.c.v. e, um dia depois, iniciou-se o tratamento, por via i.p., durante 21 dias. Ao final do experimento os animais foram submetidos ao teste cognitivo, eutanásiados para retirada das estruturas cerebrais. As amostras foram utilizadas para a determinação dos níveis de BDNF, expressão do mRNA de BDNF, atividade enzimática das histonas (HDAC e HATs) e regulação da via cAMP/PKA/CREB. O presente estudo observou deficiências significativas causadas pela Aβ1-42 na memória (Labirinto Aquático de Morris), bem como causou desequilíbrio das enzimas HAT/HDAC, redução de cAMP, PKA e CREB e BDNF no córtex pré-frontal e hipocampo de camundongos. A inibição de HDAC, com SAHA demostrou neuroproteção nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas por Aβ1-42. Estes dados mostram que a acetilação através da inibição do HDAC, desempenha um papel fundamental na mediação da memória e demonstra que SAHA poderá ser uma ferramenta médica promissora na abordagem terapêutica para o tratamento da DA. / Alzheimer's disease (AD) is a chronic neurodegenerative disorder characterized clinically by the progressive loss of cognitive function, neuropsychiatric and behavioral disorders. Pathologically this disease is characterized by the abnormal accumulation of β-amyloid peptide (Aβ) in the cortex and hippocampus, intracellular neurofibrillary tangles formed by hyperphosphorylated tau, progressive synaptic dysfunction and, later, neuronal loss. The available therapeutic options improve the symptoms, but they do not prevent the progression of the disease, therefore, an effective therapeutic strategy for AD is still lacking. There are studies related to the use of epigenetic therapy for the treatment of AD, the most developed therapy is that involving the class of deacetylase inhibitors (HDACs). Thus, this work aims to investigate the protective effect of the HDAC inhibitor hydroxamic acid suberoilanilide (SAHA) in an AD model in mice. For this, 50 Swiss adult mice weighing between 30-35 g were used, divided in two experiments. In the first, the mice were divided into 6 groups that received an injection of Aβ1-42 via the intracerebroventricular (i.c.v.) at the beginning of the experiment (except the Sham group that was used as control) to investigate histone activity acetyltransferase (HATs) and HDAC, determination of brain derived neurotrophic factor (BDNF) levels, expression of BDNF mRNA and modulation of the pathway (cAMP / PKA / CREB) in a time curve (6 hours, 1, 3, 7 and 21 days). At the end of each time, the animals were submitted to the cognitive test and were euthanized. The prefrontal cortex and hippocampus were removed for further analysis. In the second experiment, the mice were divided into 4 groups: Control Group (sham + vehicle); Group Aβ1-42 (Aβ1-42 + vehicle); SAHA group (25 mg / kg, intraperitoneal route) (sham + SAHA); Interaction Group (Aβ1-42 + SAHA). The Aβ1-42 peptide or vehicle was infused by i.c.v. and one day later the treatment was started i.p. for 21 days. At the end of the experiment the animals were submitted to the cognitive test, euthanasia for removal of the cerebral structures. The samples were used for the determination of BDNF levels, expression of BDNF mRNA, histone enzymatic activity (HDAC and HATs) and regulation of the cAMP / PKA / CREB pathway. The present study observed significant deficiencies caused by Aβ1-42 in memory (Morris Aquatic Labyrinth), as well as caused imbalance of HAT / HDAC enzymes, cAMP, PKA and CREB and BDNF reduction in the prefrontal cortex and hippocampus of mice. Inhibition of HDAC with SAHA demonstrated neuroprotection in behavioral and neurochemical changes induced by Aβ1-42. These data show that acetylation through inhibition of HDAC plays a key role in memory mediation and demonstrates that SAHA may be a promising medical tool in the therapeutic approach to AD.

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A HDAC3 ainda é pouco relatada em estudos metabólicos e pode ser inibida pelo RGFP966, inibidor seletivo tipo benzamida. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da HDAC3 em camundongos induzidos à obesidade via dieta hiperlipídica. Trata-se de um estudo experimental conduzido com 32 camundongos C57BJ/6 adultos (n=8), onde foram administradas dieta padrão (NPD) ou dieta rica em lipídeos (HFD) por 120 dias. Durante o dia 91 ao dia 120 dia foi administrado o RGFP966 (50 mg/kg; via subcutânea) para causar a hiperacetilação. O peso corporal foi aferido semanalmente e no 120º dia os animais foram submetidos à eutanásia com pentobarbital (180 mg/kg; via intraperitoneal) e o sangue e o hipocampo foram coletados para as análises bioquímicas. Foram analisados os seguintes parâmetros sanguíneos: glicose, insulina, perfil lipídico, leptina e adiponectina. No hipocampo foram analisados: interleucina 6 (IL-6), interleucina 1 beta (IL-1β) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). Os resultados do presente estudo demonstraram que a HFD aumentou o peso corporal, os níveis plasmáticos de glicose, insulina, triglicerídeos, colesterol total e lipoproteína de baixa densidade (LDL) comparado ao controle, enquanto o RGFP966 (50 mg/Kg) reduziu esses níveis. A lipoproteína de alta densidade (HDL) no plasma teve valores menores nos camundongos com HFD, contudo o uso do RGFP966 levou ao acréscimo significativo dessa lipoproteína. As interleucinas IL-6, IL-1β e TNF-α no hipocampo aumentaram significativamente no grupo com HFD comparando com o grupo NPD. Em contraste, o inibidor RGFP966 reduziu as interleucinas, atenuando o processo inflamatório causado pela HFD. Quanto aos níveis de adipocinas, a HFD aumentou drasticamente os níveis de leptina e reduziu os níveis de adiponectina no plasma. O uso do inibidor atenuou essas alterações, pois sua administração no grupo HFD evitou a redução da adiponectina e o aumento da leptina, atuando na regularização da sinalização da ingesta alimentar e homeostase energética. Constata-se que a inibição seletiva da HDAC3 pelo RGFP966 modulou as alterações no peso corporal, parâmetros bioquímicos, adipocinas no sangue e citocinas pró-inflamatórias no hipocampo mesmo com administração de HFD, evidenciando que a enzima HDAC3 está envolvida nas alterações decorrentes da obesidade. Assim, a inibição da HDAC3 pode proteger contra o ganho de peso, alterações metabólicas e inflamatórias demonstrando ser um importante alvo terapêutico para estudos relacionados à obesidade. / Epigenetics is the study of hereditary changes related to gene expression without involving changes in DNA. Among the epigenetic mechanisms, histone deacetylase-catalyzed histone deacetylation (HDACs) represses the transcription. Dietary factors influence the histones, being important to interconnect obesity and epigenetic aspects. HDAC3 is still poorly reported in metabolic studies and may be inhibited by RGFP966, a selective inhibitor of the type benzamide. The objective of present study was to investigate the role of HDAC3 in mice induced to obesity via a hyperlipid diet. This is an experimental study conducted with 32 C57BJ / 6 adult mice (n = 8), where normal pellet diet (NPD) or high fat diet (HFD) were administred for 120 days. During the day 91 to day 120 was administered the RGFP966 (50 mg/kg; subcutaneously via) to cause hyperacetylation. Body weight was measured weekly and on day 120 animals were euthanized with pentobarbital (180 mg/kg; intraperitoneal via) and the blood and the hippocampus were collected for biochemical analysis. The following blood parameters were analyzed: glucose, insulin, lipid profile, leptin and adiponectin. In the hippocampus were analyzed: interleukin 6 (IL-6), interleukin 1 beta (IL-1β) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α). The results of the present study demonstrated that HFD increased body weight, plasma glucose, insulin, triglycerides, total cholesterol and low density lipoprotein (LDL) levels compared to control, while RGFP966 (50 mg / kg) reduced these levels. Plasma high densitiy lipoprotein (HDL) had lower values in HFD mice, however the use of RGFP966 led to a significant increase of this lipoprotein. The interleukins IL-6, IL-1β and TNF-α in the hippocampus increased significantly in the HFD group compared to the NPD group. In contrast, the inhibitor RGFP966 reduced interleukins, attenuating the inflammatory process caused by HFD. As for adipokine levels, HFD dramatically increased leptin levels and reduced plasma adiponectin levels. The use of the inhibitor attenuated these changes, since its administration in the HFD group avoided the reduction of adiponectin and the increase of leptin, acting in the regularization of food intake signaling and energetic homeostasis. It was found that the selective inhibition of HDAC3 by RGFP966 modulated changes in body weight, biochemical parameters, blood adipokines and proinflammatory cytokines in the hippocampus even with HFD administration, evidencing that the HDAC3 enzyme is involved in the alterations resulting to obesity. Thus, the inhibition of HDAC3 may protect against weight gain, metabolic and inflammatory changes proving to be an important therapeutic target for studies related to obesity.

O glioblastoma (GBM) é considerado um dos tumores mais agressivos do sistema nervoso central (SNC). Mesmo com o uso de protocolos modernos de tratamento o prognóstico se mantém bastante reservado, sendo que crianças com GBM apresentam uma sobrevida média de 12 a 15 meses. Mecanismos epigenéticos podem interferir no processo de carcinogênese, sendo que a acetilação do DNA pode modular a expressão de genes que atuam no controle do ciclo celular, contribuindo assim para o desenvolvimento e progressão de neoplasias. Estudos clínicos demonstram que inibidores de histonas deacetilases (HDACs), em monoterapia ou combinados a outros agentes antineoplásicos, são clinicamente ativos e bem tolerados no tratamento de uma ampla variedade de tumores. Estes inibidores podem sensibilizar a resposta celular à irradiação ionizante, possibilitando uma redução nas doses-padrão utilizadas, minimizando os efeitos colaterais a curto e longo prazo. A radiação ionizante induz dano no DNA e é geralmente aceito que quebras da dupla-fita (DSBs) é o tipo de lesão mais severa relacionada à sobrevivência celular e preservação da integridade genômica. No presente estudo, avaliamos o potencial efeito radiosensibilizante do PCI-24781, um novo e potente pan-inibidor de HDAC nas linhagens celulares de GBM pediátrico SF188 e KNS42. Foram comparadas as taxas de proliferação celular, clonogenicidade e apoptose das linhagens SF188 e KNS42 com ou sem tratamento com PCI-24781. Também foram comparadas as taxas de clonogenicidade das linhagens SF188 e KNS42 que foram irradiadas com ou sem tratamento prévio com PCI-24781. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos do PCI-24781 na expressão de algumas das principais proteínas responsáveis pelo reparo de quebras da dupla-fita ocasionadas pela irradiação. Para os ensaios de proliferação celular foram utilizados os tempo de 24, 48, 72 e 96h, para apoptose, 48h e para capacidade clonogênica sem irradiação o tempo de 48h, em diferentes doses de PCI-24781 (0,25 - 16 M). O inibidor bloqueou significativamente a proliferação celular (p<0,05), induziu morte por apoptose (p<0,05) e reduziu a capacidade na formação de colônias (p<0,001) em ambas as linhagens. No ensaio para avaliação da radiosensibilidade, foram utilizadas as doses do IC30 11 de cada linhagem do ensaio clonogênico seguida de diferentes doses de irradiação. Ambas as linhagens apresentaram uma significativa (p<0,001) diminuição na formação de colônias em todas as doses de irradiação. A linhagem mais resistente à droga, SF188 foi escolhida para estudo do reparo de quebras da dupla-fita ocasionadas pela irradiação. As expressões da proteína Rad51, importante na via de reparo por recombinação homóloga (HR), e das proteínas DNA-PKcs, Ku70 e Ku86, importantes na via de reparo por união terminal não-homóloga (NHEJ) apresentaram uma maior diminuição quando a linhagem irradiada foi previamente tratada com PCI-24781 em comparação à radioterapia exclusiva. Estes achados demonstram que o inibidor de histona PCI-24781 apresenta um importante papel como agente radiosensibilizante, comprometendo o reparo das quebras de dupla-fita em células de GBM pediátrico tratadas com radioterapia. / Glioblastoma (GBM) is considered one of the most aggressive tumors to affect the central nervous system (CNS). Even employing modern treatment protocols the prognosis remains very poor, with children affected by GBM presenting a median survival rate of 12 to 15 months. Epigenetic mechanisms may interfere with the process of tumorigenesis, and DNA acetylation can modulate the expression of genes that contribute in cell cycle control and participate to the development and progression of cancer. Clinical studies demonstrate that histone deacetylase inhibitors (HDACs), alone or in combination with other antineoplastic agents, are clinically active and well tolerated in the treatment of a wide variety of tumors. These inhibitors may sensitize the cellular response to ionizing radiation, enabling the reduction in standard doses of radiation, ultimately minimizing both short and long-term side effects. Ionizing radiation induces DNA damage and it is generally accepted that the double-stranded breaks (DSBs) is the most severe type of injury related to cell survival and preservation of genomic integrity. In the present study, we evaluated the potential radiosensitizer effect of PCI-24781, a novel potent pan-HDAC inhibitor in the pediatric GBM cell lines SF188 and KNS42. We compared the cell proliferation rates, apoptosis of clonogenicity of KNS42 and SF188, with or without treatment with PCI-24781. Moreover, clonogenicity rates were compared between cell lines that were irradiated with or without prior treatment with PCI-24781 Additionally, we evaluated the effects of PCI-24781 in the expression of some of the major proteins responsible for the repair of double-stranded breaks caused by the irradiation. For the cell proliferation assays, the times of 24, 48, 72 and 96 hours were used, for apoptosis, the time of 48h and clonogenic capacity without irradiation, the time of 48h, and different doses of PCI-24781 (0,25 - 16 M). The inhibitor significantly blocked cell proliferation (p<0,05), inducing cell death by apoptosis (p<0,05) and reducing the colony forming ability (p<0,001) of both lineages. In the assays to evaluate the radiosensitivity , the IC30 doses of the clonogenic assays were used for each cell-line after different doses of irradiation. Both lineages showed a significant decrease (p<0,001) in colony formation at all doses of irradiation. The most resistant cell-line to the drug, SF188, was 13 chosen to study the double-strand breaks repair caused by irradiation. The Rad51 protein levels, critical for homologous recombination (HR), and the DNA-PKcs proteins Ku70 and Ku86, important for DNA repair through non-homologous end joining (NHEJ) showed significant decrease in expression when cell-line was treated with PCI-24781 prior to radiotherapy. These data demonstrates that the histone deacetylase inhibitor PCI-24781 plays an important role as a radiosensitizer agent, compromising the repair of double-strand breaks in pediatric GBM cells following irradiation.

Ao longo dos últimos anos observou-se um aumento no número de idosos no mundo, com isso faz-se necessário buscar terapias que amenizem os danos relacionados e também elucidar os mecanismos envolvidos neste processo. O exercício físico tem sido sugerido como uma ferramenta importante, não farmacológica, para atenuar os déficits relacionados à idade. Ainda, estudos recentes sugerem uma relação entre o processo de envelhecimento cerebral e o desequilíbrio de mecanismos epigenéticos, contudo, estes dados ainda não são conclusivos. Sabe-se que o grau de neuroplasticidade varia com a idade e que as estruturas encefálicas podem responder diferentemente à exposição ao exercício. Estudos demonstram que o córtex pré-frontal está envolvido em funções de alta ordem como atenção, tomada de decisão e memória de trabalho. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de diferentes protocolos de exercício físico (sessão única e exercício diário moderado) sobre a modulação de marcadores epigenéticos em córtex pré-frontal de ratos Wistar de 3 e 21 meses de idade. Os animais foram submetidos ao protocolo de sessão única (20 minutos) ou o exercício diário moderado (20 minutos durante 14 dias), 1 hora após a última sessão foram eutanasiados. O córtex pré-frontal foi dissecado e a acetilação da H4, o conteúdo da DNA metiltransferase (DNMT1 e DNMT3b), assim como a atividade da histona metiltransferase H3K27 foram analisadas. Os resultados serão apresentados na versão completa desta dissertação. / Over the past few years the number of elderly people has increased in the world, therefore it is necessary to search therapies that ameliorate age-related deficits as well as elucidate the mechanisms involved in this process. Physical exercise has been suggested as an important non-pharmacological approach to alleviate the age-related decline. Furthermore, recent studies have suggested a relationship between the process of brain aging and imbalance of epigenetic mechanisms, however, these data are not conclusive. It is well described that prefrontal cortex is involved in higher functions like attention, decision making and working memory. Then, the aim of this study was to investigate the effects of two exercise protocols (single session and daily moderate exercise) on the modulation of epigenetic markers in the prefrontal cortex from Wistar rats of 3- and 21- months-old. Animals were submitted to single session protocol (20 minutes) or the daily moderate exercise (20 minutes for 14 days), and 1hour after the last exercise session animals were euthanized. Prefrontal cortex was dissected out and acetylation of H4, the content of DNA methyl transferase (DNMT1 and DNMT3B), as well as histone methyltransferase H3K27 activity were analyzed. Results will be presented in the full version.