Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta. / Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.

Orientador: Fernando Antonio Cabral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T22:16:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LopesFilho_Genival_M.pdf: 416602 bytes, checksum: 4ccc5298df0fb2a67696261d6015fda9 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Pitanga (Eugenia uniflora) é uma fruta nativa do Brasil e amplamente distribuída nos países da América do Sul. Atualmente, seu uso é para a obtenção de polpas e sucos, mas quando se fala do seu potencial antioxidante e propriedades farmacológicas, a pitanga ainda é pouco estudada. Os carotenóides por sua vez, são amplamente conhecidos pelo seu poder corante, valor nutricional, atividade antioxidante e proteção contra algumas doenças. No presente trabalho, foram obtidos extratos a partir dos frutos liofilizados da pitanga usando o dióxido de carbono supercrítico como solvente de extração, nas condições de 40°C e 60°C e nas pressões de 100, 150, 200, 250, 300, 350 e 400 bar. Os ensaios foram realizados em duplicata. Os extratos foram saponificados com KOH metanólico e a análise dos carotenóides foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos. O maior rendimento global em extrato foi de 1,03% na condição de 60°C e 350 bar. Quanto à composição de carotenóides, os extratos apresentaram uma composição complexa sendo b-criptoxantina, licopeno e rubixantina os carotenóides majoritários. A condição de maior concentração de carotenóides totais nos extratos foi a 60°C e 250 bar perfazendo 5474ìg/g, sendo licopeno, rubixantina e cis-licopeno os carotenóides majoritários nesta condição, representando, respectivamente, 49, 22 e 17% do total. Contudo, a melhor condição operacional para extração de rubixantina foi a 40°C e 300 bar (1485 ìg/g). A variação das condições operacionais de temperatura e pressão indicou que o dióxido de carbono supercrítico é seletivo no fracionamento dos diferentes carotenóides, sendo que na isoterma de 60°C não foi detectada a presença de b- criptoxantina nos extratos quando a pressão variou de 200 a 300 bar. Notou-se que para pressões acima de 250 bar, nas duas isotermas, não houve influência das condições operacionais de extração nas concentrações de a e b-caroteno nos extratos / Abstract: Pitanga (Eugenia uniflora) is a fruit native from Brazil and widely distributed in South America. Nowadays, it is used for obtaining pulps and juices, in spite of this, there are few studies analyzing its antioxidant activity and pharmacological properties. On the other hand, the carotenoids, are widely known for their coloring power, nutritional role, antioxidant activity and protection against some diseases. In the present work, extracts of freeze-dried powder of fruits of pitanga were obtained by supercritical carbon dioxide extraction. The operational conditions were as follows: pressures of 100, 150, 200, 250, 300, 350 and 400 bar and temperatures of 40 and 60°C. The assays were conducted in duplicate. The extracts were saponified with 10% methanolic KOH and the carotenoid analysis was carried out by high performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detector. The larger global yield was achieved at 60°C and 350 bar (1,03%). All extracts showed a complex carotenoid composition with b-cryptoxanthin, lycopene and rubixanthin as the major carotenoids. The condition of higher carotenoid content in the extract was 60°C and 250 bar, reaching 5474 ìg/g, being lycopene, rubixanthin and cislycopene the major carotenoids, representing, respectively, 49, 22, and 17% of the total amount. However, the best operational condition for rubixantin extraction was at 40°C and 300 bar (1485 ìg/g). The variation of pressure and temperature showed that supercritical carbon dioxide is selective for carotenoids extraction, as was confirmed at 60°C and pressures among 200 and 300 bar. In this condition any b-cryptoxanthin in the supercritical extracts was detected. For pressures above 250 bar, there was no influence of pressure and temperature on the concentration of a and b-carotene in pitanga extracts / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-26T10:58:22Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariadne Gomes Carvalho - 2013.pdf: 15859092 bytes, checksum: 49e244032bbe4e6e46e0c3264cf9c86b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-26T12:34:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariadne Gomes Carvalho - 2013.pdf: 15859092 bytes, checksum: 49e244032bbe4e6e46e0c3264cf9c86b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T12:34:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariadne Gomes Carvalho - 2013.pdf: 15859092 bytes, checksum: 49e244032bbe4e6e46e0c3264cf9c86b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-07-19 / Eugenia uniflora L., known as pitangueira, is widely distrubuted in Brazil; its leaves are used in popular medicine as a treatment for diarrhea, fever, inflamation, hyperglycemia and hypertension. The pharmacological activities are due mainly to the phenolic compounds present in its leaves; therefore the aim of this work was to isolate these compounds. Powdered air-dried leaves were homogenized in 50% aqueous acetone. The filtrate was concentrated and extracted with ethyl acetate, yielding AcOEt fraction. The aqueous layer was lyophilized and after that dissolved in methanol to separate the soluble and the insoluble methanolic fractions. The ethyl acetate and methanol soluble fractions were subjected to repeated column chromatography over Diaion HP-20 and Sephadex LH-20. Isolated compounds were analyzed by NMR H1, C13, COSY, HSQC and HMBC (with variable temperature) and mass spectroscopy. The applied technique of temperature variation spectroscopy has proved to be extremely promising for identification of macrocyclic compounds, providing accurate data for not only elucidation but correction of previously described assignments. Two galloyl esters: 2,3-di-O-galloyl-β-D-glucose (26 mg), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (92 mg) and two monomeric ellagitannins: 3-O-galloyl-4,6-HHDP-β-D-glucose (540 mg) and2-Ogalloyl- 4,6-HHDP-β-D-glucose (20 mg) were obtained. The methanol soluble fraction furnished three dimeric ellagitannins: oenothein B (770 mg), eugeniflorinD2 (260 mg) and camptothin A (56 mg). In addition to hydrolysable tannins, four flavonoids were also isolated and identified: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (114 mg), kaempferol-3-O- α-L-rhamnopyranoside (80 mg), myricetin-3-O-α-L-rhamno-pyranoside(32 mg) and myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside (97 mg).For the first time in this specie the following compounds were found 2,3-di-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,3,4,6- penta-O-galloyl-β-D-glucose, 3-O-galloyl-4,6-HHDP-β-D-glucose, 2-O-galloyl-4,6- HHDP-β-D-glucose, camptothin A, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside, and myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside. The methodology applied in this work allowed the isolation and identification of eleven phenolic compounds, in the near future they will be tested in several biological assays. / Eugenia uniflora L., conhecida como pitangueira, é uma espécie amplamente distribuída no Brasil, onde suas folhas são usadas na medicina popular no tratamento de diarréia, febre, inflamação, hiperglicemia e hipertensão. Comprovou-se que muitas das suas atividades farmacológicas se devem aos compostos fenólicos presentes em suas folhas. A fim de isolar e identificar as substâncias fenólicas desta espécie realizou-se extração de suas folhas secas e moídas com uma mistura de acetona e água (1:1).Após a extração a acetona foi removida em rotaevaporador e o extrato aquoso foi particionado com acetato de etila. A fase aquosa foi liofilizada e parcialmente solubilizada em metanol. As frações acetato de etila e solúvel em metanol foram submetidas à cromatografia em coluna com Diaion HP-20 e Sephadex LH-20 como adsorventes. As substâncias isoladas foram caracterizadas por espectroscopia de RMN de 1H e 13C (uni e bidimensional, com variação de temperatura) e massas.A técnica utilizada de espectroscopia com variação de temperatura mostrou-se extremamente promissora para identificação de compostos macrocíclicos, fornecendo dados precisos para elucidação e correção de assinalamentos já previamente descritos.Foram identificados dois ésteres galoílicos: 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose (26 mg) e 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose (92 mg), dois elagitaninos monoméricos: 3- O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose (540 mg) e 2-O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose (20 mg) e três elagitaninos diméricos: oenoteína B (770 mg), eugeniflorina D2 (260 mg) e camptotina A (56 mg). Além dos taninos hidrolisáveis também foram isolados e identificados quatro flavonóides: quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (114 mg), canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (80 mg), miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (32 mg) e miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-L-ramnopiranosídeo (97 mg). Pela primeira vez foram encontrados nesta espécie os compostos 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose, 1,2,3,4,6- penta-O-galoil-β-D-glicose, 3-O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose, 2-O-galoil-4,6-HHDF-β-Dglicose, camptotina A,canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo e a miricetina-3-O-(2"-Ogaloil)- α-L-ramnopiranosídeo. Através da metodologia utilizada foi possível isolar e identificar onze compostos polifenólicos, que serão posteriormente testados em diversos ensaios biológicos.

Orientadores: Fernando Antonio Cabral, Alessandra Lopes de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T07:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peixoto_CamilaArantes_D.pdf: 1203931 bytes, checksum: c453369b0ad4f9252d730ea40671e0ad (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Averiguado que não existe na literatura a caracterização de extratos obtidos por fluido supercrítico das folhas de Eugenia uniflora L. (pitangueira), este trabalho visou à obtenção destes extratos variando as condições de extração supercrítica no que se refere à temperatura e pressão de 30, 40, 50 e 60 °C e 100, 150, 200, 250 e 300 bar. Verificou-se que as condições ótimas de rendimento para o processo foram as de 40 ºC e 300 bar e a 60 ºC, nas pressões de 250 e 300 bar, que corresponderam aos rendimentos: 3,68, 3,54 e 3,96 %, respectivamente. Os extratos das folhas obtidos por extração supercrítica, por hidrodestilação e por microextração em fase sólida foram caracterizados. Os compostos majoritários encontrados no extrato obtido por hidrodestilação foram curzereno (34,76 %), germacreno B (11,84 %) e C15H20O2 (9,56 %). Os compostos: ß-elemeno, ß-cariofileno e ?-elemeno estão presentes tanto no óleo essencial das folhas como também no extrato obtido por microextração em fase sólida. O composto majoritário presente nos extratos supercríticos foi o C15H20O2 seguido de curzereno e germacreno B. Pelo método de DPPH (1,1-difenil-2-pirilhidrazina) o extrato obtido com álcool hidratado é o que apresenta maior atividade antioxidante, visto o maior conteúdo de fenóis totais, dentre todos os extratos obtidos das folhas de E. uniflora. O valor da atividade antioxidante expressa em CI50 para o extrato etanólico das folhas de pitangueira foi 16,95 µg/mL. A modelagem termodinâmica clássica foi empregada para estimar a solubilidade dos componentes majoritários do extrato / Abstract: Examined in the literature that there is not the characterization of extracts obtained by supercritical fluid from the leaves of Eugenia uniflora L. (Surinam cherry), this work aimed to obtain these extracts varying conditions of supercritical extraction as regards temperature and pressure of 30, 40, 50 and 60 °C an d 100, 150, 200, 250 and 300 bar. It was found that the optimum operational conditions for the process were 40 ºC and 300 bar and 60 ° C, at pressures of 250 and 300 bar, which corresponded to yield of: 3,68; 3,54 and 3,96 %, respectively. The extracts of the leaves obtained by supercritical extraction, by hydrodistillation and by solid phase microextraction were characterized. The majority compounds found in the extract obtained by hydrodistillation were curzerene (34,76 %), germacrene B (11,84 %) and C15H20O2 (9,56 %). The compounds: ß-elemene, ß- caryophyllene and ?-elemene are presented in the essential oil of the leaves as well in the extract obtained by solid phase microextraction. The major compound presented in supercritical extracts was C15H20O2 followed by curzerene and germacrene B. By the DPPH antioxidant activity method, the extract obtained with hydrated alcohol presented the higher antioxidant activity, because the higher concentration of total phenols among all the extracts obtained of the leaves of E. uniflora. The value of antioxidant activity expressed in IC50 for the hydrated alcohol extract of the leaves of E. uniflora was 16,95 g/mL. The classical thermodynamic modeling was used to estimate the solubility of major components of the extract / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientadores: Fernando Antonio Cabral, Losiane Cristina Paviani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-23T09:13:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diniz_TabataTayaraGarmus_M.pdf: 2219524 bytes, checksum: d534ef54252dcca6946c4b832f819e43 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Esse trabalho objetivou, através da combinação de processos de extração, a obtenção de extratos naturais a partir de folhas de pitanga (Eugenia uniflora L.) e de folhas de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.). Os extratos foram obtidos por extração sequencial em leito fixo a 60 ºC e 400 bar, primeiro por extração com dióxido de carbono supercrítico (scCO2), seguido por extração com etanol em uma segunda etapa e por último, extração com água (terceira etapa). Curvas de extração (rendimento de extrato em função da massa de solvente) foram obtidas no intuito de se avaliar o desempenho da extração quanto ao rendimento em função do tipo de solvente. Todos os extratos foram avaliados quanto ao teor de fenóis e flavonoides totais e a fração volátil obtida na primeira etapa com scCO2 foi avaliada quanto ao seu perfil químico por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-EM). Para efeito de comparação, mais dois tipos de extratos etanólicos e aquosos foram obtidos: 1) Extratos em etapa única a partir das folhas, com etanol e com água em leito fixo a 60 °C e 400 bar sem prévia extração com scCO2 e 2) Extratos convencionais utilizando um sistema a baixa pressão e 60 ºC. A análise dos resultados mostrou que o caráter do solvente empregado influenciou significativamente no processo de obtenção dos extratos, pois o rendimento apresentou tendência de aumento com o aumento da polaridade do solvente, sendo os extratos aquosos os de maior rendimento, seguidos dos etanólicos e por último os supercríticos. O estudo apontou o processo de extração sequencial (em três etapas) como o mais eficaz em termos de rendimento global de extração e de fenóis e flavonoides totais para Eugenia uniflora. O extrato obtido com etanol (60 ºC e 400 bar) após extração supercrítica e o extrato obtido com scCO2 apresentaram as maiores concentrações de fenóis e flavonoides totais, respectivamente, dentre todos os extratos obtidos das folhas de E. uniflora L. Na matriz Lippia sidoides Cham., o processo de extração etanólica a 60 ºC e 400 bar em etapa única permitiu obter extratos mais concentrados em fenóis e flavonóis e o melhor rendimento de flavonoides totais. Os resultados para o rendimento de compostos fenólicos do alecrim-pimenta aponta a extração sequencial como a mais eficiente. A influência da extração supercrítica prévia foi diferente dependendo da matriz vegetal estudada. O scCO2 como primeiro solvente de extração permitiu obter extratos etanólicos e aquosos mais concentrados em compostos fenólicos para pitanga / Abstract: The objective of this study was to obtain natural extracts from leaves of pitanga (Eugenia uniflora L.) and pepper-rosmarin (Lippia sidoides Cham.) with the combination of different sequential extraction techniques. The extracts were obtained by sequential extraction in fixed bed (60 °C and 400 bar), first by extraction with supercritical carbon dioxide (scCO2), followed by extraction with ethanol in a second step and finally extracted with water in a third step. Extraction curves (yield of extracts by the mass of solvent) were obtained in order to evaluate the performance of the extraction yield due to the type of solvent. All extracts were evaluated for their content of total phenols and flavonoids and the more volatile fraction obtained in the first step with scCO2 was evaluated for its chemical profile by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). For comparison, two types of ethanol and aqueous extracts were obtained: 1) single-step extracts from the leaves with ethanol and water in the fixed bed at 60 °C and 400 bar without prior extraction with scCO2 and 2) extracts using a conventional low pressure system and 60 °C. The results showed that the nature of the solvent employed strongly influenced the process of obtaining extracts, as the yield showed a tendency to increase with increasing polarity of the solvent. The aqueous extracts showed the highest yield, followed by ethanol and finally the supercritical The study pointed out the process of sequential extraction (three-step) as the most effective in terms of global extraction yield and total phenols and flavonoids for Eugenia uniflora. The extract obtained with ethanol (60 °C and 400 bar) after supercritical extraction and the extract obtained with scCO2 were those with the highest concentrations of total phenols and flavonoids, respectively, among all the extracts obtained from the leaves of E. uniflora L. At Lippia sidoides Cham. matrix, the process of single-step ethanolic extraction at 60 °C and 400 bar obtained more concentrated yields in phenols and flavonols and the best yield of total flavonoids. The results for the yield of phenolic compounds from pepper-rosmarin indicate the sequential extraction as the most efficient process. The influence of prior supercritical extraction was different according to plant matrix studied. The scCO2 as the first extraction step yielded ethanolic and aqueous extracts more concentrated in phenolic compounds for E. uniflora / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestra em Engenharia de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:30:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4141_1.pdf: 1720990 bytes, checksum: 5e8e50cbfc6284c1ac5f25ade0f3d555 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A pesquisa de compostos químicos biologicamente ativos para fins terap êuticos em plantas utilizadas na medicina popular e em seus micro -organismos endofíticos tem enriquecido as opções terapêuticas com novos fármacos antinflamatórios, antimicrobianos, antitumorais, entre outros. Em busca de soluções para conter o avanço da multirresistência microbiana, o presente trabalho buscou isolar e avaliar a bioatividade dos endofíticos de Eugenia uniflora L., pitanga, além de confirmar a eficácia antimicrobiana dos extratos de folhas da mesma planta. 43 fungos, 7 bactérias e uma actinobactéria foram isolados das folhas de três exemplares da pitangueira, os quais, foram testados frente às bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, leveduras de interesse clínico, fungos filamentosos e cepas de Staphylococcus aureus isoladas no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco, algumas com perfil de multirresistência. Os fungos endofíticos apresentaram atividade antimicrobiana para pelo menos um dos patógenos testados, com destaque para atividade frente a Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis e Escherichia coli. A produção de enzimas como amilase, celulase e protease também foi avaliada. A actinobactéria, Streptomyces sp.UFPEDA 968 apresentou os melhores resultados principalmente contra bactérias Gram-negativas como Shigella flexneri, Bacillus subtilis e para as cepas multirresistentes, foi conduzida ao processo de fermentação, a fim de selecionar o melhor tempo, meio de cultura, temperatura e pH para produção dos metabólitos secundários bioativos. Foi realizada a extra ção dos referidos metabólitos utilizando diferentes solventes, tanto do líquido fermentado como da biomassa celular, revelando o acetato de etila como melhor solvente, e a presença dos compostos bioativos apenas no líquido fermentado. Um estudo fitoquímic o comparativo foi realizado entre o extrato da planta e o extrato de Streptomyces sp. UFPEDA 968, apresentando flavonóides diferentes, ausência de alcalóides e taninos nos dois referidos extratos. A presença do esteróide β- sitosterol foi encontrada nos dois extratos. Entretanto, esta diversidade de vias metabólicas secundárias ressalta a importância da pesquisa destas duas fontes de metabólitos secundários biologicamente ativos

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-05T16:47:08Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Vivian Torres.pdf: 1720900 bytes, checksum: eeb183049d2f9124f6fc1457526d4cc0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T16:47:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Vivian Torres.pdf: 1720900 bytes, checksum: eeb183049d2f9124f6fc1457526d4cc0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-08 / Eugenia uniflora L. é uma planta pertencente à família Myrtaceae, conhecida popularmente por pitanga cuja literatura tem demonstrado efeito antimicrobiano contra alguns microrganismos gram-positivos e fungos de importância clínica. Considerando a possibilidade da eficácia desta planta frente a microrganismo potencialmente cariogênicos nosso trabalho submeteu o extrato bruto seco (EBS) das folhas de E. uniflora L. a um estudo microbiológico para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) frente a Streptococcus sanguis (ATCC 15300), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Candida albicans (ATCC 10321), microrganismos de importância na área odontológica. Foi encontrada uma CIM = 1,56 mg/mL com halo de inibição de 11mm frente a S. sanguis, um resultado muito promissor, principalmente quando comparado ao controle positivo, gluconato de clorexidina, produto disponível no mercado para controle do biofilme oral. A partir destes resultados, foi dada continuidade ao trabalho com o desenvolvimento de formas farmacêuticas (dentifrício e enxaguatório bucal) para uso odontológico contendo extrato bruto seco das folhas de E. uniflora L. e estudo de estabilidade preliminar e acelerada dos produtos obtidos. Os parâmetros avaliados foram propriedades organolépticas e físico-químicas atendendo as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e legislação vigente. Quanto às propriedades organolépticas não foi observada nenhuma alteração significativa de aspecto, cor e odor. Na avaliação de propriedades físico-químicas, parâmetros como pH e densidade mantiveram-se estáveis durante todo o estudo. Podemos concluir que as formas farmacêuticas obtidas foram compatíveis com o extrato bruto seco das folhas da pitanga e que podem ser utilizadas para realização de estudos de estabilidade de longa duração e avaliação clínica de eficácia.

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elementos pre-textuais.pdf: 523607 bytes, checksum: 27be7027fc9c387998065d1e58c13784 (MD5) Previous issue date: 2010-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study evaluated the nutritional and technological potential in pitanga (Eugenia uniflora L.), based on its anatomical, physical, chemical. and macroscopic features. Anatomical analysis showed that the pericarp, the edible part of the fruit, consists of parenchymatous mesocarp and exocarp and endocarp epidermis. In cross section it was observed that the epidermis is composed of a single layer of cells, which explains the fragility of the fruit handling, and coated with a thin layer of cuticle, which gives sleek appearance to the fruit. The epicarp cells presented anthocyanins and carotenoids, responsible for the typical color of the fruit. The mesocarp didn’t have sclerenchyma, consisting of parenchyma cells bulky, thin walls, with conspicuous intercellular spaces. The evaluation of the anthocyanin extracts stability of pitanga indicated good stability in acidic pH, with the perspective of use as a colorant in food products. The pitanga juice was obtained by enzymatic treatment yielding 50% , in relation to the pulp. Showed intense color, flavor and kept the peculiar aroma of the fruit and preserved 43.8% of the vitamin C and 77% of phenolic compounds. The addition of juice to green tea provided the development of a functional beverage with sensory acceptance. The pectins were extracted sequentially with water and citric acid 5%, resulting four fractions, while those from acid extraction had a high yield. The monosaccharide composition analysis showed that all pectic fractions werw performed by the same monosaccharides, in different proportions, with a predominance of galacturonic acid, the main constituent of the pectin chain. The presence of arabinofuranose was confirmed by nuclear magnetic resonance (NMR). All fractions showed a degree of esterification below 50% were classified as LM pectin (low degree of esterification). High pressure size exclusion chromatography coupled with multidetection system (HPSECMALLS/RI/UV) indicated that the fractions are polydisperse, with a predominance of populations with high and medium molar mass. The rheological behavior of the fractions at concentration 30g.L-1 and 20% sucrose, demonstrated that viscous solution or weak gels were obtained in the most of analysis. However, for fraction EIV V, storage modulus (G’) showed a weak dependence on frequency and was always higher than loss modulus (G”) over all frequency range, characteristic of typical, gel-like system. These results indicate that the pitanga has a high technological potential. / Este trabalho visou avaliar o potencial nutricional e tecnológico da pitanga (Eugenia uniflora L.), com base nas suas características anatômicas, físicas, químicas e macroscópicas. A análise anatômica mostrou que o pericarpo, parte comestível do fruto, é formado por mesocarpo parenquimático e, epicarpo e endocarpo epidérmicos. Em corte transversal observou-se que a epiderme é constituída por uma única camada de células, o que justifica a fragilidade do fruto ao manuseio, e revestida por uma camada delgada de cutícula, que confere aspecto luzidio ao fruto. As células do epicarpo apresentam antocianinas e carotenóides, responsáveis pela cor típica do fruto. O mesocarpo não apresenta esclerênquima, sendo constituído por células parenquimáticas volumosas, de paredes delgadas, com espaços intercelulares conspícuos. A avaliação da estabilidade do extrato antôcianico de pitanga indicou boa estabilidade em pH ácido, com perspectiva de uso como corante em produtos alimentícios. O suco de pitanga foi obtido por tratamento enzimático, com rendimento de 50% em relação à polpa. Apresentou cor intensa, manteve o sabor e aroma peculiares do fruto e preservou 43,8% do teor de vitamina C e 77% de compostos fenólicos. A adição do suco ao chá verde proporcionou a elaboração de uma bebida funcional com aceitabilidade sensorial. As pectinas de pitanga foram extraídas sequencialmente com água e ácido cítrico 5%, obtendo-se quatro frações, sendo que as provenientes da extração ácida apresentaram maior rendimento. A análise da composição monossacarídica mostrou que todas as frações extraídas foram constituídas pelos mesmos monossacarídeos, em diferentes proporções, com predomínio de ácido galacturônico, principal constituinte da cadeia das pectinas. A presença de arabinofuranose foi comprovada por ressonância magnética nuclear (RMN). Todas as frações apresentaram grau de esterificação inferior a 50%, sendo classificadas como pectinas LM (baixo grau de esterificação). A análise cromatográfica por exclusão estérica acoplada a multidetectores (HPSEC-MALLS) indicou que as frações apresentam-se polidispersas, com predomínio de populações de alta e média massa molar. As análises reológicas de algumas frações obtidas na condição utilizada (concentração 30g.L-1 e 20% de sacarose), demonstraram que os géis formados apresentaram módulo de perda (G”) superior ao módulo de estocagem (G’), caracterizando o comportamento de uma solução viscosa ou gel fraco; entretanto a fração EIV V apresentou caráter sólido. Estes resultados indicam que a pitanga apresenta elevado potencial tecnológico.

A semente de Pitanga é resíduo do processamento da polpa e suco da fruta e os poucos trabalhos existentes sobre sua composição denotam grande valor nutricional. A extração com fluido supercrítico, pelos benefícios que apresenta, constitui uma excelente ferramenta para a obtenção e estudo de extratos. Assim, os objetivos deste trabalho foram obter extratos de sementes de Pitanga utilizando CO2 supercrítico (SC-CO2), caracterizá-los e avaliar possíveis atividades biológicas in vitro. As sementes lavadas, secas e trituradas foram caracterizadas e apresentaram umidade de 12,73%, granulometria de 0,48mm e extrato etéreo de 0,52%. As sementes foram colocadas em contato com o SC-CO2 em diferentes condições de pressão (P) e temperatura (T), conforme um Delineamento Composto Central Rotacional com P e T como variáveis independentes. A condição operacional de rendimento mais elevado foi repetida com etanol como co-solvente (SCEtOH). Para todos os extratos determinou-se o perfil de voláteis por cromatografia gasosa com espectrômetro de massas (CG/EM), a concentração de compostos fenólicos totais (CFT), a atividade antioxidante pela inativação dos radicais DPPH e ABTS, e a presença de terpenos por cromatografia em camada delgada (CCD). Nos extratos, obtidos via SC-CO2, Soxhlet e SC-EtOH, além de sua fração purificada, foram determinadas a concentração inibitória mínima (CIM) com S. aureus, E. coli, B. subtilis e P. aeruginosa, e a inibição da enzima arginase de Leishmania e de rato. O rendimento dos extratos variou de 0,16 a 0,48%, sendo P a única variável que influenciou no processo (p<0,05). Na análise de superfície de resposta constatou-se que os melhores rendimentos foram obtidos a altas pressões, indicando que baixas temperaturas podem ser usadas para não degradar as substâncias termossensíveis. CFT variaram de 17,95 a 73,89 ppm em ácido gálico equivalente (GAE) nos extratos e P e T, no intervalo estudado, não influenciaram (p<0,05) na concentração destes compostos. A presença de terpenos com atividade antioxidante foi detectada preliminarmente, nas análises de CCD. O perfil de voláteis obtidos por CG/EM indicou como componentes majoritários os sesquiterpenos - γ-elemeno (12,54-37,76 ppm equivalente ao limoneno - EqLim) e germacrone (8,44-36,41 ppm EqLim), ambos com reconhecida atividade biológica. A concentração destes sesquiterpenos foi influenciada pela interação entre P e T. A atividade antibacteriana para os quatro extratos foi elevada apresentando uma CIM de 125 ppm para todos os micro-organismos testados. A inibição da enzima arginase foi baixa para o extrato supercrítico, Soxhlet e a fração purificada, porém o extrato SC-EtOH inibiu em até 48% o que indica forte ação contra o desenvolvimento da Leishmania. Ainda, a inibição da arginase em mamíferos tem função vasodilatadora. O extrato SC-EtOH possui compostos diferentes dos demais devido à modificação da polaridade pelo co-solvente (EtOH). Esta hipótese é também constatada pela atividade antioxidante, que foi menor para os extratos supercríticos que para aqueles obtidos com SCEtOH que apresentou maior concentração em equivalente de Trolox e inibição do radical DPPH de 94%. Os resultados mostram extratos de semente de Pitanga altamente promissores para aplicações contra enfermidades devido à ação antimicrobiana e inibitória da arginase. / The Pitanga seed is a waste of the fruit pulp and juice processing, and the few existing studies on its composition denote a high nutritional value. Due to its benefits, the supercritical fluid extraction is an excellent tool to obtain and study extracts. Therefore, the objectives of this study were to obtain extracts of Pitanga seeds using supercritical CO2 (SC-CO2), characterize them and evaluate potential biological activities in vitro. The washed, dried and crushed seeds were characterized and presented 12.73% moisture, particle size of 0.48 mm and 0.52% ether extract. The seeds were placed in contact with the SC-CO2 under different conditions of pressure (P) and temperature (T), according to a Central Composite Design with P and T as independent variables. The operational condition of higher yield was repeated with ethanol as co-solvent (SC-EtOH). For all extracts were determined: the profile of volatiles by gas chromatography with mass spectrometer (CG/ EM), the concentration of total phenolics compound (CFT), the inactivation of antioxidant activity by DPPH and ABTS radicals and the presence of terpenes by layer chromatography (CCD). In the extracts obtained by SC-CO2, Soxhlet and SC-EtOH and its purified fraction, the minimum inhibitory concentration (CIM) with S. aureus, E. coli, B. subtilis and P. aeruginosa were determined, as well as the inhibition of the enzyme arginase of Leishmania and rat. The yield of extracts ranged from 0.16 to 0.48%, being P the only variable that influenced the process (p<0.05). In response surface analysis it was found that the best yields were obtained at high pressures, indicating that low temperatures can be used not to degrade the thermo-sensitive substances. CFT ranged from 17.95 to 73.89 ppm gallic acid equivalent (GAE) in extracts and P and T, over the range studied, did not influence (p<0.05) the concentration of these compounds. The presence of terpene with antioxidant activity was detected preliminary, in the analysis of CCD. The volatile profile obtained by CG/ EM indicated the sesquiterpenes as major components - γ-elemeno (12.54 to 37.76 equivalent to ppm limonene - EqLim) and germacrone (8.44 to 36.41 ppm EqLim), both with recognized biological activity. The concentration of these sesquiterpenes was influenced by the interaction between P and T. The antibacterial activity for the four extracts presented a high CIM of 125 ppm for all microorganisms tested. The inhibition of the enzyme arginase was low for the supercritical extract, Soxhlet and purified fraction, but the SC-EtOH extract inhibited up to 48% indicating strong action against the development of Leishmania. Furthermore, the inhibition of arginase in mammals has a vasodilator function. The SC-EtOH extract possesses different compounds due to the modification of their polarity with the co-solvent (EtOH). This hypothesis is also confirmed by the antioxidant activity, which was lower for the supercritical extracts compared with the extracts obtained with SC-EtOH, with the highest equivalent concentration of Trolox and DPPH radical inhibition of 94%. The results show that extracts of Pitanga seeds are highly promising for applications against diseases, due to antimicrobial activity and inhibition of arginase.