Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Rui Pereira Leite Júnior / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: José Belasque Júnior / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é uma das principais doenças que acometem a citricultura mundial e ataca uma ampla gama de espécies comerciais de citros, causando perdas significativas nos países produtores. A espécie de laranja doce Hamlin (Citrus sinensis) é suscetível ao cancro cítrico, enquanto a espécie de tangerina Satsuma (Citrus unshiu) é resistente. Para compreender os mecanismos moleculares relacionados aos sistemas de defesa ativados pela planta é importante identificar as alterações transcricionais de cada espécie vegetal sob estresse fitopatogênico, a fim de desvendar os elementos moleculares que são específicos de cada espécie. O objetivo do presente trabalho foi realizar uma análise comparativa temporal do transcriptoma de duas espécies cítricas contrastantes em resposta à Xac, pela técnica do RNA-Seq (Illumina). Um total de 5.673 e 6.231 transcritos diferencialmente expressos foi induzido nos tempos 24, 48 e 72 horas após a inoculação de Xac em Satsuma e Hamlin, respectivamente, enquanto 3.982 e 7.944 transcritos foram reprimidos. Deste total, 52 transcritos foram induzidos em comum, nas duas espécies, em todos os tempos de inoculação. Estes genes estão relacionados com a defesa basal da planta contra o ataque de Xac, pois apresentam genes que participam na percepção e reconhecimento do patógeno, genes que codificam fatores de transcrição e genes que participam na defesa da planta, como glucanases e proteinases. Entre os genes induzidos exclusivamente na espécie resistente Satsuma destacou-se uma proteinase aspártica. Esta proteína apresentou a maior expressão gênica no tempo 24 horas e pode estar envolvida na resistência desta espécie, visto que na espécie suscetível Hamlin, a expressão desta proteína foi menos expressiva e tardia, no tempo 48 horas. Outra resposta oposta entre as espécie foi na expressão de genes relacionados à ... / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a one of the most important disease affecting citrus production worldwide and attacks a wide range of commercial species of citrus trees, causing significant losses in producing countries. Hamlin sweet orange (Citrus sinensis) is canker-sensitive, while Satsuma mandarin (Citrus unshiu) is canker-resistant. To understand the molecular mechanisms underlying the differences in responses to Xac, transcriptional profiles of these two genotypes following Xac attack were compared by RNA-Seq (Illumina). The purpose of this study was to examine simultaneous changes in gene expression profile during the early stages (24, 48 and 72 hpi) of citrus canker infection in Satsuma and Hamlin. A total of 5673 and 6231 up-regulated transcripts were identified at 24, 48 and 72 hpi in Satsuma and Hamlin, respectively, while 3982 and 7944 were down-regulated. Of these, 52 transcripts were up-regulated in common between both genotypes. These genes in common are related to basic defense against Xac, because there are genes involved in patogen perception and recognition, transcription factors and genes related to plant defense, such as glucanases and proteinases. Among up-regulated genes expressed only in Satsuma, aspartic proteinase was highlighted. This protein presented the highest gene expression 24 hpi and it can be involved in Satsuma resistance, since the expression of this protein was less pronounced and delayed in Hamlin. Another opposite response between these two genotypes was the expression of genes related to cell wall. Such genes were pectato lyase, extensin, cellulose sinthase, and xiloglucano endotransglycosilase. The genes were up-regulated in Satsuma, while in Hamlin, they were down-regulated. For genes related to plant defense, both genotypes up- regulated pathogenesis-related proteins, especially 72 hpi. However, the expression of these genes did not prevent the symptoms in ... / Mestre

Orientador: Celso Luis Marino / Coorientador: Zengjian Jeffrey Chen / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Claudia Barros Monteiro Vitorello / Banca: Carlos Alberto Labarte / Banca: Ivan de Godoy Maia / Resumo: O Eucalyptus é um dos gêneros mais importantes no setor florestal mundial. Por esse motivo, programas de melhoramento genético florestal são desenvolvidos no intuito de aumentar a produtividade, introduzir características desejáveis e reduzir impactos ambientais. No entanto, características deletérias podem ser incorporadas em determinados cruzamentos nos ciclos de melhoramento, seja por endogamia biparental ou segregação de loci heterozigóticos. As anomalias são um exemplo deste efeito e podem acarretar perdas na produção de mudas, na produtividade e atrasos no desenvolvimento de genótipos elite. Portanto, a identificação e caracterização de genes relacionados às anomalias são muito importantes nos programas de melhoramento. Ao realizar um cruzamento controlado entre dois indivíduos de Eucalyptus grandis, a empresa Suzano Papel e Celulose detectou uma anomalia com segregação mendeliana de 3 (normais) :1 (anormais) na progênie. As plântulas anômalas morrem em poucos meses e diferem significativamente em algumas características morfológicas, como altura, diâmetro da base do caule, dimensões e forma do limbo foliar e número de ramificações laterais. Estudos prévios permitiram identificar uma marca molecular ligada à anomalia que apresentou identidade com genes da superfamília Bet v1, família PR10 (pathogenesis-related protein 10). No entanto, não era claro o envolvimento desta família gênica no desenvolvimento da anomalia. Neste cenário, o presente trabalho teve como objetivo a identificação e caracterização dos genes envolvidos na anomalia detectada. Genes e vias metabólicas, diferencialmente expressos entre os fenótipos contrastantes, demonstraram elevada atividade em processos relacionados à resposta de defesa nas plantas anormais. Tais resultados sugerem que a anomalia é causada pela ativação inadequada do sistema imune da planta (resposta autoimune) associado à incompatibilidade ... / Abstract: Eucalyptus is one of the most important genus in worldwide forestry culture. For this reason forest improvement programs are developed aiming the increase of productivity, the introduction of desirable traits and the reduction of environmental impacts. However deleterious traits can be incorporated in certain crossings through the recurrent improvement cycles either by biparental inbreeding or by segregation of the heterozygous loci. Anomalies are an example of this deleterious effect and they can cause losses in seedling production, productivity and delays in the elite genotypes development. Thus, the identification and characterization of genes related to the anomalies are very important in forest improvement programs. In a controlled cross between two Eucalyptus grandis individuals, the Suzano Papel and Celulose SA company has detected an anomaly with Mendelian segregation ratio of 3 (normal) :1 (abnormal) in the progeny. Abnormal seedlings die in a few months and show significant difference in some morphological characteristics, such as height, stem-base diameter, dimensions and shape of leaf lamina, and number of branches. Previous studies allowed the identification of a molecular marker related to the anomaly that showed identity with Bet v1 superfamily genes, PR10 family (pathogenesis-related protein 10). However, it was not clear the involvement of this gene family in the anomaly. In this scenario, the present study aimed to identify and characterize the genes involved in the detected anomaly. Genes and metabolic pathways, differentially expressed between the contrasting phenotypes, showed high activity of process related to defense response in abnormal plants. These results suggest that the anomaly is caused by the inappropriate activation of the immune system of the plant (autoimmune response) associated with genetic incompatibility. The gene families of thaumatin-like proteins, Bet v1 proteins, and chitinase class I proteins ... / Doutor

Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Daniel Guariz Pinheiro / Coorientador: Flávia Maria de Souza Carvalho / Banca: Poliana Fernanda Giachetto / Banca: Michael dos Santos Brito / Resumo: No Brasil, a cultura da cana-de-açúcar tem se expandido para regiões com prolongados períodos de deficiência hídrica, o que vem limitando a produção sucroenergética. Neste estudo, os perfis de expressão gênica de duas cultivares de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), uma tolerante e outra sensível ao estresse hídrico, foram avaliados através da tecnologia de RNA-Seq. A montagem de novo do transcriptoma de folhas foi realizada visando identificar e analisar os genes diferencialmente expressos entre as cultivares, envolvidos com a resposta molecular durante períodos de estresse hídrico. Para isso, as duas cultivares foram plantadas em casa de vegetação e aos 60 dias após o plantio foram submetidas a três controlados potenciais hídricos do solo (controle, déficit hídrico moderado e déficit hídrico severo) e avaliadas aos 30, 60 e 90 dias após a aplicação dos tratamentos. A partir do método RNA-Seq, foram geradas mais de um bilhão de sequências, as quais permitiram obter um total de 177.509 e 185.153 sequências de transcritos, para as cultivares tolerante e sensível, respectivamente. O conjunto de transcritos expressos foram montados com o auxílio do programa Trinity. Estes transcritos foram alinhados com sequências de Sorghum bicolor, Miscanthus giganteus, Arabidopsis thaliana bem como sequências de cana-de-açúcar disponíveis em bancos públicos. Esta análise permitiu identificar o conjunto de genes de cana-de-açúcar compartilhados com outras espécies, bem como levou à identificação de novos transcritos ainda não catalogados. Os transcritos foram anotados e categorizados através dos termos do Gene Ontology (GO) em três categorias: componente celular, função molecular e processos biológicos para as duas cultivares. Os termos "regulador de enzima" e "regulador de transcrição" que se encontram dentro da categoria função molecular estão em evidência dentro dos termos associados aos... / Abstract: In Brazil, the sugarcane culture has expanded to areas with prolonged drought seasons, which is constraining sugarcane production. In this study, the gene expression profiles of two sugarcane cultivars (Saccharum spp.), one tolerant and other sensitive to water stress, were assessed by the RNA-Seq technology. The de novo assembly of leaves transcriptome was held aiming to identify and to analyze differentially expressed genes between the cultivars involved with molecular response during water stress periods. In order to accomplish this, the two cultivars were planted in a greenhouse and 60 days after planting them, they were submitted to three potential controlled water soil (control, moderate drought and severe water deficit) and evaluated at 30, 60 and 90 days after treatments application. Using the RNA-Seq method were generated over a billion sequences, which allowed to obtain a total of 177,509 and 185,153 transcripts sequences for the tolerant and sensitive cultivars, respectively. The set of expressed transcripts were assembled using the Trinity program. These transcripts were aligned with Sorghum bicolor, Miscanthus giganteus, Arabidopsis thaliana sequences and sugarcane sequences available in public databases. This analysis allowed the identification of the set of sugarcane genes shared with other species, as well as led to the identification of novel transcripts not cataloged yet. The transcripts were annotated and categorized by the terms of the Gene Ontology (GO) into three categories: cellular component, molecular function and biological process for the two cultivars. The terms "enzyme regulator" and "transcription regulator" that lie within the molecular function category are highlighted within the terms associated with the differentially expressed genes between the contrasting cultivars, suggesting the importance of gene regulation for the studied cultivars. This study found different molecular patterns of the involved ... / Mestre

Orientador: Gustavo Vitti Môro / Banca: Rinaldo Cesar de Paula / Banca: Bruno Henrique Sardinha de Souza / Resumo: Os híbridos de milho transgênicos, em geral, apresentam o locus transgênico em hemizigose. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do número de alelos transgênicos em híbridos de milho em relação à expressão de Cry1F nas folhas, ataque de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) e a produtividade de grãos, utilizando cinco híbridos isogênicos nas versões transgênicas homozigota e hemizigota, além da versão convencional de um dos híbridos. O nível de expressão da proteína Cry1F (PRYF) foi quantificado pela técnica de ELISA. Nos experimentos de campo, conduzidos na primeira e segunda safras do ano agrícola 2015/2016, avaliou-se o ataque de S. frugiperda em campo (ALC), por infestação natural, e a produtividade de grãos (PG). Dois bioensaios foram realizados em laboratório para avaliar a sobrevivência larval de S. frugiperda de 1º instar (SL) alimentadas com as folhas dos híbridos. Os híbridos transgênicos, homozigotos e hemizigotos, não apresentaram silenciamento gênico. Os híbridos homozigotos apresentaram maior concentração de proteína Cry1F. Quando houve elevado ALC, na primeira safra, os híbridos transgênicos foram superiores à testemunha convencional na PG, entretanto, não houve diferença entre os híbridos homozigotos e hemizigotos. Os híbridos transgênicos também foram superiores à testemunha convencional nos bioensaios, sendo que os homozigotos apresentaram as menores médias de SL. A presença de um alelo transgênico a mais nos híbridos homozigotos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstracts: Genetically modified (GM) maize hybrids, in general, possess the transgenic locus in a hemizygous state. The aim of the study was to assess the effect of the number of transgenic alleles in maize hybrids regarding the Cry1F leaf expression, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) attack and grain yield, through the evaluation of five isogenic hybrids in the homozygous and hemizygous transgenic versions and a non-GM hybrid. Cry1F protein expression levels (PRYF) were quantified by ELISA. In field experiments conducted during the summer and autumn seasons of 2015/2016, we assessed the leaf-feeding injury of S. frugiperda in the field (LFI) by natural infestation and grain yield (GY). Two bioassays were carried out in the laboratory to evaluate the survival of first-instar S. frugiperda larvae (SL) fed with the maize hybrids. Transgenic hybrids did not present gene silencing. Homozygous hybrids presented higher Cry1F expression levels than hemizygous hybrids. With high LFI during the summer season, transgenic hybrids were superior to the non-GM for GY, however, there was no difference between homozygous and hemizygous hybrids. The transgenic hybrids were superior to the non-GM hybrid in the bioassays, and the homozygotes caused the highest mortality of S. frugiperda. The addition of one transgenic allele in the homozygous hybrids provided an additive genetic effect, increasing PRYF and S. frugiperda control, whereas GY was not affected. In conclusion, there are no limitations to the use of transgenic homozygous maize hybrids, which presented better S. frugiperda control comparing to hemizygous hybrid. / Mestre

O iodeto reduz a expressão, cauda poli(A) e taxa de tradução do mRNA da NIS, a partir de 30 min de tratamento. O estudo atual objetivou caracterizar as bases moleculares envolvidas nesses efeitos inibitórios. Células PCCl3 foram tratadas com NaI (10-3M), por diferentes períodos de tempo, e avaliou-se: a meia-vida do mRNA de NIS; o papel das porções 3\'UTR/5\'UTR; o envolvimento de eventos transcricionais; a organização do citoesqueleto de actina; o conteúdo total, meia-vida, degradação, internalização e atividade de NIS; a ativação da via PI3K/Akt. Os resultados evidenciaram que o excesso de iodeto: reduz a meia-vida e interage com a porção 3\'UTR do mRNA de NIS; inibe a atividade do promotor de NIS; desorganiza o citoesqueleto de actina; reduz o conteúdo total, de membrana, a meia-vida e atividade de NIS; aumenta a internalização de NIS por clatrinas, e sua degradação por lissosomos; ativa a via PI3K/Akt. Conclui-se que o iodeto ativa diferentes mecanismos moleculares, transcricionais e pós-transcricionais, para promover o efeito inibitório sobre a expressão de NIS. / Iodide reduces NIS mRNA expression, poly(A) tail length and transcription rate, after 30 min of treatment. The present study aimed to caracterize the molecular basis involved in these inhibitory effects. PCCl3 cells were treated with NaI (10-3M) and assays were performed to evaluate: NIS transcript half-life; the role of NIS mRNA 3\'UTR/5\'UTR; the involvement of transcriptional events; the organization of actin cytoskeleton; the total content, half-life, degradation, internalization and activity of NIS; the activation of PI3K/Akt pathaway. The results indicatred that iodide excess: reduces NIS transcript half-life and interacts with its 3\'UTR portion; inhibits NIS promoter activity; disrupts the actin cytoskeleton; reduces NIS total and membrane content, NIS half-life and NIS activity; induces the internalization of NIS through clathrin and its degradation through lisosomes; activates the PI3K/Akt pathway. In conclusion, iodide activates different molecular mechanisms, transcriptional and post-transcriptional, to promoter the inhibitory effect on NIS expression.

A esquistossomose é um grave problema de saúde pública, com alta mortalidade e morbidade em países endêmicos, causada pelo verme trematódeo do gênero Schistosoma. O praziquantel é a única droga disponível para tratamento da doença, é usada em larga escala para tratamento de populações de áreas endêmicas, porém não previne a reinfecção e tem efeito somente em vermes adultos. Drogas estudadas em câncer como inibidores de histona deacetilases (iHDACs) modificam o padrão epigenético da célula desencadeando a morte celular, e em Schistosoma mansoni já foi mostrado que a inibição de HDACs além de aumentar a acetilação de histonas alterou o fenótipo de miracídios e provocou morte em esquistossômulos e vermes adultos. O presente estudo investigou o efeito do iHDAC Trichostatin A (TSA) na regulação da transcrição gênica em esquistossômulos, detectando por meio de ensaios de microarray centenas de genes diferencialmente expressos, relacionados a replicação de DNA, metabolismo e complexos modificadores de histonas. A inibição de HDAC em vermes adultos levou a um aumento da acetilação nas marcas de histonas H3K9ac, H3K14ac e H4K5ac relacionadas à indução de transcrição. Com imunoprecipitação de cromatina seguida de PCR (ChIP-qPCR) detectou-se o aumento de deposição de H3K9ac e H3K14ac na região promotora de genes com expressão aumentada ou diminuída, porém a marca de repressão H3K27me3 não sofreu alteração na região promotora de nenhum gene analisado. Análises adicionais indicaram um conjunto de genes diferencialmente expressos que codificam proteínas histone readers, que fazem parte de complexos modificadores de histonas, como EED capaz de identificar a marca de repressão H3K27me3 e regular a atividade de EZH2, apontando um novo alvo terapêutico. O efeito sinérgico entre iHDAC e um iEZH2 foi testado e detectou-se o aumento da mortalidade de esquistossômulos. A estrutura de SmEZH2 foi modelada por homologia e usada para análises computacionais que sugeriram uma alta afinidade de ligação de SmEZH2 com o iEZH2, abrindo uma perspectiva de desenvolvimento de novas drogas específicas para tratamento da esquistossomose. / Schistosomiasis is a serious public health problem, with high mortality and morbidity in endemic countries, caused by trematode worms of the genus Schistosoma. Praziquantel is the only available drug for treatment of the disease; it is used extensively to treat populations in endemic areas, but does not prevent reinfection and is effective only in adult worms. Drugs studied in cancer as histone deacetylase inhibitors (iHDACs) modify the epigenetic status of the cell, triggering cell death, and it has been shown in Schistosoma mansoni that inhibition of HDACs increase histone acetylation, alter the phenotype of miracidia and cause death in schistosomules and adult worms. The present study investigated the effect of iHDAC Trichostatin A (TSA) on the regulation of gene transcription in schistosomules, detecting by means of microarray assays hundreds of differentially expressed genes related to DNA replication, metabolism and histone remodeling complexes. Inhibition of HDAC in adult worms led to an increase in histone acetylation marks H3K9ac, and H3K14ac H4K5ac related to transcriptional induction. With chromatin immunoprecipitation followed PCR (ChIP-qPCR) we detected an increased deposition of H3K9ac and H3K14ac at the promoter region of genes with increased or decreased expression, but the repressive mark H3K27me3 was not changed at all analyzed gene promoter regions. Additional analysis indicated a set of differentially expressed genes that encode histone reader proteins that are part of histone modifier complexes such as EED, which is able to identify the repression mark H3K27me3 and to regulate EZH2 activity, pointing to a new therapeutic target. The synergistic effect between iHDAC and one iEZH2 has been tested and found to cause an increase in schistosomules mortality. The SmEZH2 structure was modeled by homology and used for computational analyses, which suggested a high affinity binding of SmEZH2 with iEZH2, opening the opportunity for development of new specific drugs for treatment of schistosomiasis.

A possibilidade da proteção de plantas de sorgo contra fungos fitopatogênicos por diferentes preparações obtidas a partir de células da levedura Saccharomyces cerevisiae, um não patógeno, tem sido demonstrada nos últimos anos por vários pesquisadores. Aparentemente, a proteção pode ocorrer por indução de resistência ou por ação da levedura como agente de controle biológico. Contudo, os mecanismos fisiológicos e bioquímicos que são ativados nas plantas durante o fenômeno de proteção não estão esclarecidos. Foram utilizados dois cultivares de sorgo, sendo um resistente ao Colletotrichum sublineolum (cv. Brandes) e outro suscetível (cv. Tx398B). Mesocótilos, plantas com 14 dias e folhas com 30 dias foram tratados com água, S. cerevisiae ou C. sublineolum e avaliados quanto aos parâmetros de expressão gênica da enzima fenilalanina amônia-liase (FAL) e o acúmulo de compostos fenólicos totais. Os resultados obtidos evidenciaram que C. sublineolum induziu o tecido resistente a expressar os genes desta enzima em plantas com 14 dias e folhas de sorgo com 30 dias e também foi responsável pelo acúmulo de compostos fenólicos no decorrer do tempo em mesocótilos. Por sua vez, S. cerevisiae não induziu a expressão gênica da FAL em tecidos de sorgo, bem como não alterou o acúmulo de compostos fenólicos nos mesocótilos. Dessa maneira, a proteção de plantas de sorgo contra fitopatógenos por S. cerevisiae pode envolver outros passos do metabolismo fenólico / not available

Os mosquitos pertencentes à família Culicidae (Diptera) desempenham importante papel como vetores de patógenos causadores de doenças que acometem o homem em várias partes do mundo (MARCONDES, 2001), causando um grande impacto socioeconômico e de saúde pública nas áreas em que ocorrem. Aspectos biológicos e comportamentais dos mosquitos também contribuem decisivamente para sua atuação como transmissor de patógenos que atingem as populações humanas. O repasto sanguíneo é um processo fisiológico fundamental no ciclo de vida destas espécies. Por outro lado, a alimentação sanguínea infectada causa mudanças no metabolismo das fêmeas recémingurgitadas, desencadeando a expressão diferencial de genes envolvidos em respostas imunológicas, como também de genes envolvidos em outros processos fisiológicos. Como um dos interesses de nosso grupo é estudar as alterações sofridas pelo inseto vetor após a infecção por patógeno, nesse trabalho o ponto de partida para esse estudo foi a escolha dos genes DV431431, DV340891 e DV411647 que nas análises in silico apresentaram expressão diferencial mediante a infecção por vírus da Dengue ou Plasmodium gallinaceum. Após experimentos de RT-PCR em tempo real, foi mostrado que apenas o gene DV411647 apresentou expressão elevada 48 horas após a alimentação sanguínea infectada tanto por P. gallinaceum como por vírus dengue. Na busca por uma função predita desse gene em mosquitos, nós utilizamos a ferramenta Editseq através do software DNAstar para traduzir o peptídeo que apresentou maior número de aminoácidos, e confrontamos através de Blastp com o banco de dados GenBank, obtivemos uma provável desidrogenase/redutase de cadeia curta (AAK55494). Experimentos de Western blot evidenciaram que esta proteína esta presente no intestino médio das fêmeas 72 horas após a alimentação com sangue infectado por vírus dengue tipo 2. / Mosquitoes belonging to the family Culicidae (Diptera) play an important role as vectors of disease-causing pathogens that affect humans in various parts of the world (Marcondes, 2001), causing a great socioeconomic impact and public health areas in which they occur. Biological and behavioral aspects of mosquito also contribute decisively to its role as a transmitter of pathogens that affect human populations. The blood meal is a fundamental physiological process in the life cycle of these species. On the other hand, the infected blood meal causes changes in the metabolism of newly engorged females, triggering the differential expression of genes involved in immune responses, as well as genes involved in other physiological processes. As one of the interests of our group is to study the changes undergone by the insect vector after infection with the pathogen, in this work the starting point for this study was the selection of genes DV431431, DV340891 and DV411647 that the in silico analysis showed differential expression by Dengue virus infection of Plasmodium gallinaceum.Após or RT-PCR experiments in real time, it was shown that only the gene DV411647 had high expression 48 hours after the blood meal infected by both P. gallinaceum as for dengue virus. In the search for a predicted function of this gene in mosquitoes, we use the tool Editseq by DNAstar software to translate the peptide with the highest number of amino acids, and confronted by blastp with the GenBank database, we obtained a probable dehydrogenase / reductase short chain (AAK55494). Western blot experiments showed that this protein is present in the midgut of females 72 hours after feeding with blood infected with dengue virus type 2.

A dengue é uma doença infecciosa com grandes taxas de morbimortalidade, causada pelo vírus da dengue (DENV). Segundo a Organização Mundial de Saúde, cerca de 50 a 100 milhões de pessoas são infectadas anualmente em mais de 100 países tropicais e subtropicais de todos os continentes. O espectro clínico da infecção pelo DENV pode incluir formas assintomáticas ou sintomaticas que variam desde uma febre indeterminada e autolimitada, passando pela febre clássica da dengue (FD) até quadros graves denominados febre hemorrágica da dengue/síndrome do choque da dengue (FHD/SCD). Recentemente, ocorreu um dramático aumento do número de casos de FHD/SCD nas Américas, e este aumento coincidiu com a introdução do dengue sorotipo 3, genótipo III. No presente trabalho, objetivou-se a clonagem e a expressão das proteínas NS1 e NS3 do vírus da dengue tipo 3. As proteínas NS1 e NS3 do DENV-3 foram clonadas e expressas com sucesso em sistema procarioto. A amplificação dos genes das proteínas NS1 e NS3 foi realizada por RT-PCR, o qual gerou amplicons de cerca de 1050 e 1850 pb, respectivamente. Em seguida, os genes foram clonados por inserção dos amplicons no vetor plasmidial pCR-XL. Os genes de NS1 e NS3 foram subclonados no vetor de expressão pQE-30 através de sítios de restrição para as enzimas BamHI e HindIII. A expressão proteica foi obtida em sistema procarioto utilizando a cepa BL21(DE3) de E. coli, resultando em proteínas de 45 e 70 kDa as quais foram confirmadas por análises em Western blot utilizando como anticorpo primário fluido ascítico imune de camundongos e soro de pacientes com dengue. Estas proteínas virais podem ser utilizadas para estudos relacionados à patogênese, replicação e mecanismos de escape do sistema imune do DENV, além disso, podem ser potencias antígenos em métodos de diagnóstico. / Dengue is an infectious disease with high morbidity and mortality rates caused by dengue virus (DENV). According to the World Health Organization, about 50 to 100 million people are infected annually in more than 100 tropical and subtropical countries from all continents. The clinical spectrum of DENV infection can includes asymptomatic or symptomatic forms ranging from undetermined and self-limited fever, through dengue fever (DF) to severe disease called dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS). Recently, there has been a dramatic increase in the number of cases of DHF/DSS in the Americas, and this increase coincided with the introduction of dengue virus type 3 (DENV-3), genotype III. The present study aimed to clone and express NS1 and NS3 proteins of DENV-3. The NS1 and NS3 proteins of DENV-3 was successfully cloned and expressed in a prokaryotic system. Amplification of NS1 and NS3 genes was carried out by RT-PCR, which yielded amplicons of approximately 1050 and 1850 bp, respectively. Then, the genes were cloned by inserting the amplicons into the plasmid vector pCR-XL. NS1 and NS3 genes were subcloned into the expression vector pQE-30 through the restriction sites for BamHI and HindIII enzymes. The protein expression was obtained in a prokaryotic system using the strain BL21 (DE3) of E. coli, resulting in 45 and 70 kDa proteins, which were confirmed by Western blot analysis using immune mouse ascitic fluid and serum of patients with dengue as primary antibody. These viral proteins can be used to study the pathogenesis, mechanisms of replication and immune escape of DENV, moreover, can be potential antigens in diagnostic methods.

Uma variedade de agentes antitumorais é capaz de induzir danos no material genético e estimular respostas como o bloqueio do ciclo celular, reparo do DNA ou apoptose. A resposta inicial das células é o bloqueio no ciclo em uma tentativa de reparar o dano, no entanto, se esse dano for muito extenso ou comprometer o metabolismo celular, uma cascata de sinalização aciona mecanismos alternativos que inibem a proliferação das células e acionam vias de morte. Os astrocitomas malignos são os tumores cerebrais mais comuns que afetam o sistema nervoso central, compreendendo mais de 60% dos tumores cerebrais primários. O tratamento padrão é a radioterapia seguida de quimioterapia, no entanto, o prognóstico para pacientes portadores desse tipo de câncer ainda continua desanimador. A cisplatina é um agente genotóxico largamente empregado no tratamento de gliomas, além de outros tipos de câncer. Essa droga liga-se ao DNA, formando aductos, os quais levam a um bloqueio na duplicação e na transcrição, podendo induzir apoptose nas células dependendo da extensão do dano. No presente trabalho foram avaliadas as respostas celulares ao tratamento com a cisplatina em linhagem de glioma (U343 MG-a) e em fibroblastos normais transformados por SV40 (MRC-5). Foram avaliadas as respostas em termos de sobrevivência celular, indução de apoptose e expressão gênica em larga escala pela técnica de micro-arranjos de cDNA, sendo esta última realizada somente para a linhagem U343. A cisplatina causou uma redução acentuada na sobrevivência das células MRC-5 (~1%) e U343 (< 1%) após cinco dias de tratamento (teste de sobrevivência celular) com concentrações que variavam de 12,5 a 300 ?M. O tratamento por 24 h com iguais concentrações de cisplatina reduziu a sobrevivência das linhagens em cerca de 20-80% (teste de citotoxicidade). Ambas as linhagens sofreram apoptose após o tratamento com diversas concentrações de cisplatina (12,5, 25 e 50 ?M). A linhagem U343 apresentou uma freqüência máxima de apoptose de 20,4% após o tratamento com 25 ?M de cisplatina por 72 h, enquanto a linhagem MRC-5 apresentou 11,0% de apoptose após 50 ?M de cisplatina por 48 h. Os dados de expressão gênica analisados pelo método de micro-aranjos de cDNA, obtidos 48 h após o tratamento das células U343 com 25 ?M de cisplatina, mostraram genes significativamente (p ?0,05) reprimidos relacionados principalmente com alterações no citoesqueleto (TBCD, RHOA, LIMK2 e MARK1), apoptose ou sobrevivência celular (BCL2-XL, ING1, RHOA, VDP, TIMP2, DYRK3 e NFKBIE), invasão celular ou metástase (LIMK2, TIMP2 e CALU), reparo de DNA (SMC1L1) e metabolismo celular (DYRK3, MARK1, TBCD, LIMK2, VDP e P4HB), entre outros processos. Esses dados apontam para um sério comprometimento da maquinaria celular como um todo após os danos induzidos pela cisplatina. Embora o mecanismo de apoptose justifique cerca de 20% da extensão de morte celular, conforme foi comprovado nos ensaios de apoptose (induzida por 25 ?M de cisplatina), a maior parte das células são eliminadas em conseqüência da ação da droga em vários níveis do metabolismo e manutenção da integridade celular, visto o elevado grau de citotoxicidade da cisplatina, demonstrado nos testes de sobrevivência. / A variety of antitumoral agents is capable of inducing DNA damage and eliciting cell cycle arrest, DNA repair or apoptotic responses. The initial response is a cell cycle arrest in an attempt to repair the DNA damage, but under conditions of extensive DNA lesions and high drug cytotoxicity, a signaling cascade triggers alternative mechanisms that inhibit cell proliferation and activate cell death pathways. Astrocytomas are the most common neoplasm of the central nervous system, comprising more than 60% of primary brain tumors. The standard treatment for theses tumors are radiotherapy followed by chemotherapy, however, the prognostic for these patients is still very discouraging. Cisplatin is an efficient DNA-damaging antitumor agent employed for the treatment of various human cancers, including gliomas. This drug binds to DNA, producing diverse types of adducts, which can block replication, transcription, and lead to apoptosis induction. In the present work, we analyzed cellular responses to treatments with the anticancer agent cisplatin in MRC-5 (normal human fibroblasts SV40 transformed) and U343 MG-a (glioma cell line). The responses were evaluated in terms of cell survival, apoptosis induction and profiles of gene expression by the cDNA microarrays method (only for U343 cell line). Cisplatin treatment resulted in a pronounced reduction in MRC-5 cell survival (~ 1%) and U343 (< 1%) after five days of treatment (cell survival test) with several concentrations of cisplatin, ranging from 12.5 to 300 ?M. Following 24h of treatment under similar cisplatin concentrations the survival was reduced at about 20-80% (cytotoxicity test). Both cell lines underwent apoptosis after treatment with different concentrations of cisplatin (12.5; 25 and 50 ?M), but U343 cells presented a maximal frequency of 20.4% apoptosis (25 ?M cisplatin treatment for 72h), while MRC-5 cells presented 11.0% (50 ?M cisplatin treatment for 48h). Analysis of gene expression performed for U343 cells treated with 25 ?M cisplatin for 48h showed several genes that were found significantly (p ? 0,05) down-regulated, most of them related with cytoskeleton alterations (TBCD, RHOA, LIMK2 and MARK1), apoptosis or cell survival (BCL2-XL, ING1, RHOA, VDP, TIMP2, DYRK3 and NFKBIE), cell invasion or metastasis (LIMK2, TIMP2 and CALU), DNA repair (SMC1L1), and cell metabolism (DYRK3, MARK1, TBCD, LIMK2, VDP and P4HB), among others. As a whole, these data demonstrate a serious commitment of the cell machinery after cisplatin-induced cellular damage. About 20% of the cell death corresponds to apoptosis, as was showed by the present assays. However, most of the cells are eliminated by the action of the drug in various levels of the metabolism and maintenance of cell integrity, due to the elevated degree of cisplatin citotoxicity, as demonstrated in cell survival tests.