Proteínas Inativadoras de Ribossomos (RIPs) são rRNA N-glicosilases capazes de inibir a síntese protéica pela remoção de uma adenina específica do RNA ribossomal. São geralmente classificadas em tipo 1 e tipo 2, sendo as últimas divididas em altamente tóxicas e não tóxicas. A maior parte das RIPs tipo 2 identificadas pertence a espécies de dicotiledôneas, como é o caso da pulchellina. As cadeias tóxicas das RIPs possuem uma região C-terminal hidrofóbica conservada, a qual se atribui a capacidade de interação com a membrana do retículo endoplasmático (RE), durante o transporte retrógrado da toxina para o citosol. Neste trabalho duas abordagens diferentes foram aplicadas para o estudo das RIPs tipo 2: identificação e caracterização de novos integrantes desta família de proteínas, e investigação da interação da cadeia-A da pulchellina (PAC) com sistemas miméticos da membrana celular. Na primeira abordagem, uma busca in silico em bancos de dados genéticos públicos permitiu identificar quatro novas RIPs do tipo 2 de monocotiledôneas. A análise da estrutura primária das proteínas identificadas mostrou a ocorrência de mutações em alguns dos principais aminoácidos que formam o sítio ativo nas RIPs, indicando uma possível perda de função. O representante de Saccharum officinarum (cana-de-açúcar) foi então analisado em maior detalhe, sendo sua cadeia-A clonada (soRIPA), expressa em sistema heterólogo e caracterizada em termos de atividade e estrutura secundária. Os ensaios in vitro mostraram que a soRIPA não foi capaz de depurinar ribossomos eucariotos. Porém, os ensaios de inibição da síntese proteica mostraram uma possível atividade inibitória da soRIP, que precisa ainda ser confirmada. A presença dos transcritos no banco do SUCEST sugere que estes genes não sejam pseudogenes, embora não tenha sido possível purificar a proteína a partir de extratos de folhas. Isto indica que se a soRIP está sendo traduzida, deve sofrer um rápido turnover, tornando difícil a sua detecção e purificação ou, ainda, que a ausência de sítios de ligação à galactose funcionais na cadeia-B impediu sua purificação por cromatografia de afinidade à galactose. A outra abordagem no estudo das RIPs tipo 2 foi centrada na cadeia-A recombinante da pulchellina (rPAC), estudando sua interação com monocamadas de Langmuir. Foram construídos 3 mutantes da rPAC, cada um com diferentes deleções na região C-terminal visando determinar a região responsável pela interação com a membrana do RE. A cinética de adsorção e pressão superficial exercida pela rPAC sobre a monocamada, assim como o estudo com os mutantes demontraram que a proteína interage fortemente com a monocamada fosfolipídica e que esta interação in vitro é dependente da presença da região C-terminal. De forma geral, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram com novas informações sobre esta família de proteínas, identificando e analisando novos integrantes e, ainda, adicionando detalhes do mecanismo funcional do tráfego das toxinas RIPs. / Ribosome Inactivating Proteins (RIPs) are rRNA N-glycosilases which are able to inhibit the protein synthesis by removing a specific adenine from the ribosomal RNA. They are usually classified as type 1 and type 2, being the latter divided into highly toxic and nontoxic. The majority of type 2 RIPs currently identified are found in species of dicotyledons, as the pulchellin. The toxic chain of RIPs has a conserved hydrophobic C-terminal region, which is believed to be responsible for the interaction with the lipid membrane of the endoplasmic reticulum ER during the retrograde transport of the toxin to the cytosol. In this work, two different approaches were applied in the study of type 2 RIPs: identification and characterization of new members of this protein family, and investigation of the interaction of the pulchellin\'s A-chain (PAC) with systems that mimic the cellular membrane. In the first approach, an in silico search in public genetic databases was performed and allowed us to identify four new type 2 RIPs in monocots. The primary structure analysis of the identified proteins showed the presence of mutations in key amino acids that form the active site of RIPs, indicating a possible interference on its catalytic activity. The representative of Saccharum officinarum (sugar cane) was then analyzed in greater detail. Its A-chain clone (soRIPA) was expressed in a heterologous system and characterized in terms of activity and secondary structure. In vitro experiments showed that soRIPA was not able to perform the depurination of eukaryotic ribosomes. However, the inhibition of protein synthesis assays presented a possible low inhibitory activity of the soRIP, which still needs to be further investigated. The presence of transcripts on the bank of SUCEST indicates that these genes are not pseudogenes, although it was not possible to purify the protein from leaf extracts. If the soRIP is being translated, this may indicate that it undergoes a quick turnover, preventing its detection and purification. It is also possible that the absence of functional galactose binding sites in the B-chain has prevented its purification by galactose affinity chromatography. Our second approach to the study of type 2 RIPs was focused on the recombinant pulchellin A-chain (rPAC), by investigating its interaction with Langmuir monolayers. We have constructed three mutants of rPAC, each one with different deletions at the C-terminal to determine the region responsible for interaction with the membrane of the ER. The adsorption kinetic and surface pressure applied by rPAC on the monolayer, as well as the study of the mutants, have demonstrated that the protein has a strong interaction with the phospholipid monolayer and that this interaction in vitro is dependent on the presence of the C-terminal. The results of this work have provided new information about the type 2 RIP protein family, identifying and analyzing new members, and also bringing new details about the functional mechanism of the RIP\'s toxin traffic.

O ferro (Fe) é um dos metais mais importantes para a homeostase. Está envolvido em vários processos fisiológicos como, por exemplo, processo redox, síntese de DNA, metabolismo energético e transporte de biomoléculas. A regulação da concentração deste metal é bem controlada já que o seu excesso pode culminar na produção de espécies reativas de oxigênio que causam dano celular e sua escassez inibe o sistema imunológico. Um dos elementos chaves para o sucesso da cura de doenças infecciosas está na capacidade do hospedeiro em conter a proliferação do microrganismo e na ativação controlada da imunidade celular. Assim como os organismos eucariotos, grande parte dos organismos procariotos necessita de Fe para proliferação e manutenção das atividades biológicas. Deste modo, a interação entre esses dois organismos promove uma batalha para a captura deste metal que pode influenciar no curso de uma doença infecciosa tanto para o beneficio do hospedeiro quanto para o patógeno invasor. A Tuberculose (TB) é a maior causa de morte por doença infecciosa em adultos no mundo sendo responsável pela morte de 1 milhão de pessoas anualmente. Embora a doença tenha grande possibilidade de cura e tratamento disponível para a população, a reincidência de TB é alta e o surgimento de cepas resistentes à antibioticoterapia cresce gradativamente. Diante disso, é necessário compreender cada vez mais o processo fisiopatológico envolvido na TB para buscar novos alvos terapêuticos para cura e redução dos índices de mortalidade. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão de genes envolvidos na homeostase do ferro em macrófagos humanos após a infecção com Mycobacterium tuberculosis H37Rv e o isolado clinico hipervirulento Mycobacterium tuberculosis Beijing 1471 com e sem suplementação de ferro. Para isso, macrófagos infectados foram lisados para obtenção e purificação de RNA total e o estudo de expressão gênica foi realizado utilizando a tecnologia de PCR em tempo real (RT-qPCR). Além disso, foi determinada a concentração de ferro no sobrenadante dessas culturas bem como o crescimento desses microrganismos no interior dos macrófagos. Genes envolvidos no controle da internalização do Fe em macrófagos foram diferentemente expressos nas culturas infectadas em relação ao controle não infectado. Também foi possível observar que a expressão desses genes varia com o tempo de infecção e com o tratamento com ferro, demostrando que existe um esforço da célula hospedeira em conter a infecção. Não foi observado variação significativa com relação à dosagem de ferro no sobrenadante das culturas infectadas em relação ao controle e o crescimento das micobactérias dentro dos macrófagos não variou de maneira significativa com relação aos tratamentos empregados. Dessa forma, este estudo contribuiu para o esclarecimento da resposta do macrófago frente à infecção com micobactérias que apresentam perfil de virulência distinto entre si e a interação do ferro neste processo patológico. / Iron (Fe) is one of the most important metals to homeostasis. It is involved in various physiological processes such as redox process, DNA synthesis, energy metabolism and transport of biomolecules. The concentration regulation of this metal is well-controlled since its excess can lead to the production of reactive oxygen species that cause cell damage and its scarcity inhibits the immune system. One of the key elements for the cure of infectious diseases is the host\'s ability to contain the spread of the organism and control activation of cellular immunity. Just as eukaryotes, most prokaryotes organisms require Fe for its proliferation and maintenance of biological activities. Thus, the interaction between these two organisms promotes a battle to capture this metal that can influence the course of an infectious disease either to the benefit of the host or to the invading pathogen. Tuberculosis (TB) is the leading cause of death from infectious disease among adults worldwide and is responsible for the death of 1 million people annually. Although the disease has high possibility of cure and treatment available to the population, the recurrence of TB is high and the emergence of resistant strains to antibiotics grows gradually. Therefore, it is necessary to understand more the pathophysiological process involved in TB to seek new therapeutic targets for healing and reduction in mortality. The present study aims to evaluate the expression of genes involved in iron homeostasis in human macrophages after infection with Mycobacterium tuberculosis H37Rv and the hypervirulent clinical isolate Mycobacterium tuberculosis Beijing in 1471 with and without iron supplementation. For this, macrophages were lysed and purificated to obtain total RNA, and the study of gene expression was performed using the technology of Real-time PCR (RT-qPCR). Furthermore, the iron concentration in the supernatant of these cultures was determined as well as growth of these microorganisms in macrophages. Genes involved in controlling internalization of Fe in macrophages were differently expressed in infected compared to uninfected control cultures. It was also observed that the expression of these genes varies with the time of infection and treatment with iron, showing that there is an effort of host cell to contain the infection. No significant variation was observed onto the iron dosage in the supernatant of infected compared to control cultures and the growth of mycobacteria inside macrophages did not vary significantly between treatments. Thus, this study contributed to the clarification of the macrophage response to infection with mycobacteria that have distinct virulence profile among themselves and the interaction of the iron in this disease process.

INTRODUÇÃO: A obesidade é um grave problema de saúde pública, sendo definida como o acúmulo excessivo de gordura, possivelmente decorrente do desequilíbrio, por um longo período, entre a quantidade de energia ingerida e o gasto energético. OBJETIVO: Investigar a contribuição dos polimorfismos dos genes CD40, ICAM-1, VCAM, E-selectina, LIGHT, RAGE e CX3CR1 na associação com a obesidade. CASUÍSTICA E MÉTODOS: O estudo foi realizado no Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC) e no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (HU/USP), com 199 indivíduos (40 com peso normal, 55 com sobrepeso e 104 obesos) brasileiros, sem vínculo genético, de etnias branca, parda, negra e amarela, de ambos os sexos (55 homens e 144 mulheres), com idade entre 30 e 68 anos. Foi realizado o estudo dos polimorfismos dos genes CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectina (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A, ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T e VCAM (rs3176878) C>T, por pirossequenciamento, a análise da expressão dos genes LIGHT, CX3CR1, RAGE e ICAM-1, pela PCR em tempo real, e as dosagens das formas solúveis de PAI-1, IL-6, TNF-α, resistina, adiponectina e leptina, utilizando o sistema LUMINEX. RESULTADOS: As frequências alélica e genotípica dos polimorfismos estudados CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectina (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A, ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T e VCAM (rs3176878) C>T não apresentaram associação significativa com a obesidade. Foi encontrada associação na análise da expressão do CX3CR1 com a obesidade e também foi encontrada associação do polimorfismo ICAM-1 (rs281432) G>C com a expressão do gene RAGE em indivíduos com peso normal. CONCLUSÕES: Não houve associação dos polimorfismos CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectina (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A, ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T e VCAM (rs3176878) C>T com a obesidade, mas houve associação da expressão do gene CX3CR1 com a obesidade. Houve, também, associação do polimorfismo ICAM-1 (rs281432) G>C com a expressão do gene RAGE em indivíduos de peso normal. / Background: Obesity is a serious health problem and it is defined as an excessive fat accumulation which is caused by an imbalance between the amount of energy intake and energy expenditure over a long period. Objective: The main objective of this study was to investigate the contribution of CD403 ICAM-1, VCAM, E-selectin, LIGHT, RAGE e CX3CR1 gene polymorphisms and its association with obesity. Material and Methods: The study was realized at Dante Pazzanese Institute of Cardiology and University Hospital of São Paulo University. There were included 199 individuals (40 normal weight, 55 overweight and 104 obese), all Brazilian, with no genetic link, from all ethnics in both genders (55 men and 144 women), aged between 30 and 68 years. The study of CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectin (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A , ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T and VCAM (rs3176878) C>T were conducted by pyrosequencing. The analysis of LIGHT, CX3CR1, RAGE and ICAM-1 gene expression were performed by real-time PCR and the measurements of PAI-1, IL- 6, TNF-a, resistin, leptin and adiponectin soluble forms using LUMINEX system. Results: The allele and genotype frequency of CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectin (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A , ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T and VCAM (rs3176878) C>T gene polymorphisms showed no significant association with obesity. There was found association in the analysis of CX3CR1 expression with obesity and it was found association of ICAM-1 gene polymorphism (rs281432) G>C with RAGE gene expression in the normal weight group. Conclusion: There was no association of CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectin (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A , ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T and VCAM (rs3176878) C>T gene polymorphisms with obesity. However, it was found association of CX3CR1 gene expression with obesity and an association of ICAM-1 (rs281432) G>C gene polymorphism with RAGE gene expression in normal weight individuals.

Objetivo: A pesquisa avalia as transformações nas instâncias de controle da liberdade de expressão após a redemocratização brasileira e o veto constitucional à censura, em 1988. Esse reposicionamento do controle estatal reforça a persistente preponderância da proteção a interesses privados, fora do escrutínio público, que resiste à regulação pública. Com o bloqueio das propostas no legislativo (em simbiose com produtores midiáticos), restou o apelo ao judiciário nos casos que demandam controle comunicativo em conflitos inerentes às novas liberdades conquistadas com a abertura. Assim, um debate político é reduzido e canalizado ao embate legal, o que deixa o público privado da sua influência sobre a delimitação da liberdade de expressão devido ao caráter hermético das discussões judiciárias - em um processo em que o público se posiciona não como agente, mas como plateia dos debates feitos em seu nome. Métodos: Parte-se de uma análise das entidades de regulação da comunicação, avaliando-se como sua recente formação (ou abandono) foi afetada pelo processo de abertura democrática. A pesquisa avalia como o judiciário ocupou o espaço de controle comunicativo, analisando casos que tratam de proibição de expressões públicas. A análise foca como são delimitados os sentidos do termo tabu \"censura\" nos acórdãos dos julgamentos do Supremo Tribunal Federal (STF). Resultados: A proposta de classificação sistêmica dos debates no STF aponta preponderância de argumentos liberais contrários ao controle do Estado, mas uma ponderação mais conservadora na colisão de direitos entre indivíduos. A análise evidencia disputas sobre o contraste ou continuidade de práticas autoritárias do passado nos novos tempos democráticos, além de dissenso sobre os significados e limites do que se entende como censura e sua problemática harmonização ou dissonância com uma estrutura legal que, explicitamente, veta esse cerceamento, mas mantém brechas legais que permitem esse controle. / This research evaluates how censorship mechanisms have changed after the end of Brazil\'s military dictatorship and the constitutional prohibition of censorship, in 1988. State control has shifted to a new role that stimulates the persistent dominance of private interests over public scrutiny, resisting government regulation. A symbiosis between media owners and congress representatives frequently blocks new law proposals. The judiciary, however, is still an option to appeals demanding communicative control concerning conflicts regarding new liberties that are now available because of the return of democracy. Court appeals reduce a political debate to a legal dispute, which deprives the public from its influence on how to determine the limits to free speech due to the hermetic characteristics of judicial rulings - in a way that the public is not a player, but an audience during the debates made on its behalf. Methods: This research analyzes entities that regulate communication practices, evaluating how their recent formation (or abortion) relates to democratic reforms after the dictatorship. This work evaluates how the judiciary occupied the space of communicative control, analyzing cases that deal with public expression and its repression. The analysis focus on how the rulings of Brazilian Supreme Court (\"Supremo Tribunal Federal\" - STF) delimit the meaning of \"censorship\", a democratic taboo. Results: The proposed systemic classification of debates in STF points to a dominance of liberal arguments against State control, but a more conservative ponderation in individual rights collisions. The analysis reveals a dispute on the contrast or continuity of past authoritarian practices in new democratic times. There is dissent on the meanings and limits concerning what is understood as censorship and its problematic harmonization or dissonance in a legal structure that explicitly forbids this prohibition, while, at the same time, legal loopholes that allow this kind of control still remain.

Este trabalho apresenta uma leitura dos romances Texaco, de Patrick Chamoiseau, e Cidade de Deus, de Paulo Lins, a partir dos espaços onde se desenvolvem as narrativas: respectivamente as favelas Texaco, em Fort-de-France, Martinica, e Cidade de Deus, no Rio de Janeiro, Brasil. O objetivo do estudo é analisar a formação e o desenvolvimento do espaço e identificar as implicações que ele terá na constituição da identidade pessoal das personagens e, ao mesmo tempo, como essa interação contribuirá para a construção da identidade das próprias favelas. O texto, precedido por uma Introdução que traz um preâmbulo sobre a relação entre esses dois romances, está dividido em três capítulos: Que espaços são esses?, em que há uma breve discussão das questões que envolvem a ficcionalização dessas favelas nos romances e do aparato teórico sobre espaço que nos guiará nas análises; Texaco: a luta coletiva pelo espaço e Cidade de Deus: a luta individual no espaço, capítulos nos quais nos detemos mais demoradamente na leitura dos livros de Chamoiseau e Lins. Nas considerações finais, discutem-se como as personagens, e o próprio espaço transformado em personagem, traçam suas trajetórias pessoais a partir de percursos inversos. / This paper presents the analysis of the novels Texaco, by Patrick Chamoiseau, and City of God, by Paulo Lins, considering the spaces where the stories take place: respectively in Texaco slum, in Fort-de-France, Martinica, and City of God, a slum in Rio de Janeiro, Brazil. The purpose of this project is to analyze the space and to identify the implications resulted from the gathering and development of these environments in the creation of the characters personal identities and, at the same time, to show how this interaction contributes with the creation of the slums identities. The text, preceded by an Introduction that brings the preamble on the relation of these two novels, is divided into three chapters: What are these places?, in which there is a brief discussion on matters related to the fictionalization of the slums in the stories and the theoretical support to guide the analysis; Texaco: the collective fight for the space and City of God: the individual fight for the space, chapters we dedicate to the reading of both Chamoiseaus and Lins novels. The final considerations show how the characters and the space, also converted into a character, develop their own paths from the building of inverted ways.

O produto do gene thi1 de Arabidopsis thaliana está provavelmente envolvido na biossíntese de tiamina (vitamina B1) e na proteção do DNA organelar contra danos. Estudos sobre a biossíntese da tiamina em plantas sugerem uma localização plastidial para este mecanismo, o que está de acordo com a existência de um peptídeo de trânsito cloroplástico (TP) na região N-terminal de THI1. Por outro lado, em leveduras a tiamina é sintetizada em mitocôndrias. Interessantemente, o cDNA de thi1 de A. thaliana complementa uma cepa de levedura com disrupção no gene homólogo thi4. A análise da seqüência de aminoácidos de THI1 revelou a presença de uma região capaz de formar uma estrutura do tipo a-hélice anfifílica, freqüentemente encontrada em preseqüências mitocondriais, localizada logo após o peptídeo de trânsito cloroplástico. O papel desta região na localização da proteína THI1 nas mitocôndrias foi comprovado a partir de ensaios envolvendo construções de genes quiméricos (contendo ou não a putativa seqüência de direcionamento mitocondrial) e um gene repórter (uidA). Estas construções foram introduzidas em plantas de tabaco e a localização da atividade GUS foi determinada nas frações subcelulares das plantas transgênicas. Análise direta da presença de THI1 nas mitocôndrias e cloroplastos de Arabidopsis foi realizada via imunolocalização. Também foram fornecidas evidências que as duas isoformas organelares são codificadas por um único transcrito nuclear. Experimentos de transcrição/tradução in vitro indicaram a ocorrência de dois produtos da tradução a partir de códons de iníciação em fase de leitura. Mutações sítio-específicas na seqüência de thi1 acoplados à experimentos usando a proteína fluorescente verde (GFP) mostraram que a tradução no primeiro AUG determina a localização da proteína nos cloroplastos, enquanto que a tradução no segundo AUG é responsável pelo endereçamento da proteína às mitocôndrias. A análise do contexto para início da tradução revelou que a região em torno do primeiro AUG é mais favorável para a tradução do mRNA de thi1. Além disso, observou-se a presença de uma forte estrutura em "grampo de cabelo" próximo ao segundo códon AUG, indicando um contexto subótimo capaz de interferir na tradução. Estas observações confirmaram os dados obtidos a partir da tradução in vitro na qual a iniciação se dá preferencialmente no primeiro AUG o que pode sugerir uma maior necessidade da proteína nos plastídeos. / Arabidopsis thaliana thi1 gene product is probably involved in both thiamine biosynthesis as well as protection of organellar DNA from damage. Studies of thiamine biosynthesis in plants suggest a plastid location for the pathway, which is in agreement with the predicted THI1 N-terminal chloroplastic transit peptide (TP). On the other hand, thiamine is synthesized in mitochondria in yeast cells. Interestingly, A. thaliana thi1 cDNA complements a yeast strain disrupted for the homologous thi4 gene. Analysis of THI1 amino acid sequence revealed the presence of a putative amphiphilic a-helix, which is typical for mitochondrial presequences, located downstream of the chloroplast transit peptide. The role of this sequence on mitochondrial import has been shown by chimeric gene constructs (carrying or not the putative mitochondrial presequence) and the uidA reporter gene. These constructions have been introduced into tobacco plants and the GUS activity has been measured in subcellular fractions of transgenic plants. Direct analysis of THIp in mitochondria and chloroplasts has been done via ImmunoGold labelling experiments. Additional evidence suggested that the two organellar isoforms were encoded by a single nuclear transcript. In vitro transcription/translation experiments revealed the presence of two translational products by a differential usage of two in-frame translational start codons. Coupling site-specific mutations on THI1 encoding sequence with green fluorescent protein (GFP) gene fusions showed that translation initiation in the first AUG directs translocation of THI1 to plastids. However, when translation initiates from the second AUG THI1 is addressed to mitochondria. Analysis of the translation efficiency of thi1 mRNA revealed that the best context for translation initiation is present at the first AUG. In addition, it has been shown a suboptimal context at the second AUG and a strong stem-and-loop structure which is likely to slow translation. These observation confirm the in vitro translation data in which translation occurs preferentially in the first AUG, what could suggest a higher requirement of the protein in plastids.

A fissura lábio-palatina não-sindrômica (FLP NS) é uma doença multifatorial, determinada pela interação entre fatores genéticos e ambientais e sua incidência é estimada entre 0,34 e 2,29 a cada 1000 nascimentos. Trata-se de uma embriopatia causada por erros durante a morfogênese orofacial, a qual depende de uma fina regulação de mecanismos como proliferação celular, remodelagem de matriz extracelular, e transição epitélio-mesenquimal. Apesar de intensos esforços para se determinar fatores genéticos e ambientais de susceptibilidade, a etiologia desta malformação permanece pouco compreendida. Vários loci associados às FLP NS vêm sendo identificados por meio de estudos de mapeamento gênico convencionais, entretanto, a grande maioria dos resultados não se replica em diferentes estudos, e não há clareza acerca do efeito funcional das variantes detectadas. Neste contexto, uma abordagem interessante para investigar a etiologia da doença é a análise de expressão gênica, que pode ser utilizada para identificar alterações de vias biológicas que convergem na manifestação do quadro clínico. Em vista disso, neste trabalho nós utilizamos a análise do transcriptoma de células-tronco de polpa dental de pacientes portadores de FLP NS, com o intuito de identificar padrões de expressão relacionados a mecanismos biológicos relevantes para a embriopatogênese da doença. Obtivemos padrões de expressão que sugerem desregulação de mecanismos associados à remodelagem de matriz extracelular e à transição epitélio-mesenquimal. Além disso, ao utilizarmos diferentes condições de cultura celular, verificamos em uma nova amostra de pacientes a desregulação de vias biológicas relacionadas ao reparo de DNA e checkpoint do ciclo celular. Nossos dados revelam a aplicabilidade das células-tronco de polpa dental para este tipo de abordagem, e indicam que tais perfis de expressão podem levar ao acometimento da morfogênese lábio-palatina. Além disso, mostramos pela primeira vez uma conexão entre desregulação de expressão gênica e a documentada maior incidência de formas esporádicas de câncer em famílias segregando a FLP NS. Nossos resultados abrem novas possibilidades para a investigação da etiologia das FLP NS, e ajudarão na compreensão dos eventos embrionários que predispõem a essa malformação. / Non-syndromic cleft lip and palate (NSCL/P) is a multifactorial disease determined by the interplay between genetic and environmental factors, with a variable incidence of 0.34-2.29:1000 births. This malformation arises from errors during lip and palate morphogenesis, which requires tight regulation of biological mechanisms such as cellular proliferation, extracellular matrix remodelling, and epithelial-mesenchymal transition. Albeit much effort has been put into determining the genetic and environmental factors underlying disease susceptibility, the aetiology of NSCL/P remains obscure. Many candidate loci have been identified through conventional gene mapping strategies, however, there is a general lack of reproducibility across studies, and there is no consensus with regard to the functional implications of the identified genetic variants. In this context, an alternative approach resides in assessing differential expression patterns to identify alterations in biological networks that could lead to phenotype manifestation. Here, we analysed the transcriptome of dental pulp stem cells from NSCL/P patients in order to pinpoint dysregulated pathways involved in the embryopathogenesis of the disease. We encountered expression patterns related to dysregulation of extracellular matrix remodelling and epithelial mesenchymal transition. Moreover, by subjecting a novel NSCL/P sample to differential cell culture conditions, we observed abnormal transcription of genes partaking in DNA repair and cell cycle checkpoint pathways. Our results show the applicability of dental pulp stem cells to this strategy and suggest that the observed expression patterns could lead to impairment of lip and palate morphogenesis. Moreover, we described for the first time a connection between abnormal gene expression in these individuals and the elevated occurrence of sporadic cancer types in NSCL/P families. Our results open new possibilities to investigate the aetiology of NSCL/P and provide further insight into the ontogenetic events underlying disease predisposition.

Este estudo determinou a expressão gênica e a localização tecidual de receptores do fator de inibição da migração de macrófagos (MIF) na interface materno-placentária em camundongos aos 7,5, 10,5, 13,5 e 17,5 dias de gestação (ddg). Observou-se expressão gênica dos receptores na decídua durante todo o período estudado. CD74 e CD44 foi imunolocalizado em células deciduais, endoteliais e leucócitos, sugerindo que estas populações são presuntivos alvos do diálogo parácrino trofoblasto-decídua. No compartimento fetal, a expressão de CD74 ocorreu aos 7.5 e 17,5 ddg e de CD44, durante a gestação. RNAm dos receptores, mas não imunolocalização destes foi observada no trofoblasto aos 7,5 ddg, sugerindo mecanismos reguladores pós-transcricionais. Como a sinalização mediada por MIF requer CD74 para ativação de CD44, a baixa expressão de CD74 aos 10,5 e 13,5 ddg sugere sinalização limitada. Os resultados sugerem que a placenta fetal tem populações específicas expressando CD44-CD74 no final da gestação, o que pode ser determinante para a ativação celular mediada pelo MIF. / The study determined the gene expression and tissue localization of the macrophage migration inhibitory factor (MIF) receptors (CD74-CD44) at the maternal placental interface in mice, on gestation days (gd) 7.5, 10.5, 13.5 and 17.5. We observed the gene expression of the receptors to the decidua in all gestation days. CD74-CD44 were immunolocalized in decidual and endothelial cells and, leukocytes, suggesting these cells are presumptive targets for trophoblast-decidual paracrine dialogue. In the fetal compartment, expression of CD74 occurred on gd7.5 and 17.5 and of CD44 during all pregnancy. mRNA for both receptors, but not immunolocalization was detected on the gd7.5-trophoblast, suggesting post-transcriptional regulatory mechanism. As MIF-mediated signaling requires CD74 for activation of CD44, low expression of CD74 on gd10.5 and 13.5 suggests restriction of MIF effect. The results suggest fetal placenta has specific populations expressing CD74-CD44 in the final pregnancy, which can be a determining factor in mechanisms of cellular activation mediated by MIF.

O papilomavirus humano (HPV) é o agente etiológico da infecção sexualmente transmissível mais comum na população mundial. A prevalência da infecção por HPV é estimada em 660 milhões de pessoas e mais de 50% das mulheres serão acometidas pela infecção ao menos uma vez na vida. O HPV é responsável por virtualmente todos os casos de câncer de colo de útero (99%), além de causar muitos outros tipos de câncer de mucosa. O câncer cervical afeta aproximadamente 1.4 milhões de mulheres e 500 mil novos casos surgem anualmente, resultando em 250 mil mortes por ano. Os maiores índices de incidência são observados na América Latina e na África. Duas vacinas contra o HPV são comercializadas desde 2006 por empresas estrangeiras. Entretanto, o custo mínimo da vacinação é superior a 600 reais. Este preço torna sua incorporação pelo sistema de saúde um processo economicamente inviável. Dessa forma, devem ser buscadas alternativas para a produção de uma vacina eficaz, de qualidade e de baixo custo no Brasil. A proteína L1, principal proteína do capsídeo do HPV, tem a propriedade de se auto agregar em partículas semelhantes às virais (VLPs), que são o principal componente das vacinas atuais e possuem muita semelhança com os vírions nativos, introduzindo inclusive, uma imunização predominantemente tipo-específica. Este projeto se propôs a construir e avaliar vetores de expressão visando à produção em larga escala da proteína L1 do HPV 16, o tipo de HPV de maior risco e incidência na população mundial. Foram construídos cinco plasmídeos para Pichia pastoris, uma das principais plataformas industriais de expressão. Eles se diferenciam pelos marcadores de seleção e pelas sequências de manutenção do vetor, mas têm exatamente o mesmo objetivo: gerar sistemas que possuam múltiplas cópias do gene da L1 e que não necessitem da utilização de antibióticos. Essa estratégia foi escolhida porque a produtividade de muitas das proteínas heterólogas tem grande dependência da dosagem gênica e porque o uso de antibióticos encarece muito o custo da produção. Na primeira etapa do projeto foi avaliado um sistema de expressão epissomal auxotrófico, mas ele não se manteve estável ao longo de 60 gerações. Na segunda parte, dois vetores de integração ao sítio do DNA ribossomal foram testados. O sistema mais estável e produtivo foi caracterizado quanto ao número de cópias integradas ao genoma da P. pastoris e ao nível de expressão. O sistema é capaz de produzir clones com mais de 30 cópias do gene da L1 e dois clones expressaram cerca de 20 a 30 miligramas/litro de L1. Adicionalmente outros dois vetores integrativos que utilizam sequências teloméricas para integração foram construídos. Ainda são necessários estudos conjuntos de fermentação em larga escala e purificação da proteína para verificar a viabilidade do sistema / The human papillomavirus (HPV) is the etiologic agent of the sexually transmitted infection most common worldwide. The prevalence of HPV infection is estimated at 660 million people and over 50% of women will be affected by the infection at least once in their lifetime. HPV is responsible for virtually all cervical cancers cases (99%), and causes many other types of mucosal cancer. Cervical cancer affects approximately 1.4 million women, and 500.000 new cases occur annually, resulting in 250.000 deaths per year. The highest incidence rates are seen in Latin America and Africa. Two HPV vaccines are marketed since 2006 by foreign companies. However, the minimum cost of vaccination is higher than 360 dollar. This price makes its incorporation by the Brazilian Health System economically unfeasible. Thus, alternatives must be found to produce an effective vaccine, with low cost and high-quality in Brazil. The L1 protein, the major capsid protein of HPV, has the ability to self aggregate into virus-like particles (VLPs) which are the main component of current vaccines. The VLPs are very similar to the native virions and can introduce an immunization predominantly type-specific. This project aimed to construct and evaluate expression vectors to produce, at large scale, the L1 protein of HPV 16, which is the HPV type at greater risk and incidence in the world. Five plasmids were constructed for Pichia pastoris, one of the major industrial expression platforms. They differ in the selection markers and the vector maintenance sequences, but they have exactly the same goal: to create systems with multiple copies of the L1 gene and that don\'t require the use of antibiotics. This strategy was chosen because the productivity of many heterologous proteins have heavy dependence on gene dosage and because the use of antibiotics is extremely expensive for its production. In the first stage of the project, it was rated an episomal auxotrophic expression system, but it was unstable after a period of 60 generations. In the second part, two vectors for integration in the ribosomal DNA locus were tested. The most stable and productive system was featured on the number of copies integrated into the P. pastoris genome and on the expression level. It was proved that the system is able to produce clones with more than 30 copies of the L1 gene and two clones expressed approximately 20-30 milligrams/liter of L1. Additionally, two other integrative vectors for integration in telomeric sequences were constructed for future testing. More studies on large-scale fermentation and protein purification will be necessary to determine the feasibility of the system.

A puberdade é o momento quando um mamífero, macho ou fêmea, se torna capaz de produzir gametas viáveis e exibir comportamento sexual completo. Trata-se do resultado do ajuste gradativo entre o aumento da atividade gonadotrófica e a habilidade das gônadas em assumir simultaneamente a esteroidogênese e a gametogênese. Um dos principais fatores que influenciam o início à puberdade é o genético. A puberdade é uma característica fisiológica originada por muitos fatores (orgânicos e ambientais), que relacionam-se com a expressão de diversos genes, muitos dos quais ainda com funções desconhecidas. Metodologias para a análise da expressão gênica diferencial em tecidos, em particular a Análise Serial de Expressão Gênica (SAGE), incluem ferramentas que permitem a análise global e simultânea de vários transcritos de um determinado tecido, sejam eles conhecidos ou não, fornecendo informações sobre o padrão de expressão gênica de um determinado tipo celular de maneira qualitativa e semi-quantitativa. O objetivo do presente projeto foi analisar, por meio da técnica de SAGE, a expressão gênica diferencial no folículo ovariano de fêmeas bovinas da raça Nelore púberes e pré-púberes, segundo o critério da apresentação ou não de ondas de crescimento folicular que culminavam com a ovulação.. Um total de 14.531 e 14.285 tags tiveram sua seqüência de DNA determinada, revelando a existência de 6.840 e 6.386 genes únicos (biblioteca das novilhas pré-púberes e púberes respectivamente). A comparação entre as duas bibliotecas revelou um total de 127 tags diferencialmente expressos (P<0,05). Os folículos ovarianos de novilhas púberes apresentaram expressão mais elevada de algumas enzimas esteroidogências (CYP11A1 e CYP19) e do transportador de colesterol para a mitocôndria (StAR) indicando intensa atividade esteroidogência (produção de estrógeno) quando comparada ao folículo das bezerras pré-púberes. Além disso, o CTGF (fator de crescimento do tecido conectivo) e o TIMP2 (inibidor tecidual de metaloproteinases) foram mais abundantes nos folículos dos animais púberes, indicando que os mesmos já iniciaram o processo de luteinização, sem entrentanto iniciar o processo de ruptura da matriz extracelular que ocorre na ovulação. A maior expressão de genes relacionados ao metabolismo da matriz extracelular e do citoesqueleto (como por exemplo a osteonectina, a actina e proteínas relacionadas à actina) sugere que os folículos dos animais púberes estão se preparando para a remodelação tecidual. A maior expressão de conexina 43 (gap junction protein) nos folículos dos animais púberes sugere uma intensa comunicação das células da granulosa entre si e com o oócito quando comparadas aos folículos das bezerras pré-púberes. Dentre os genes diferencialmente expressos e mais abundantes no folículo das bezerras pré-púberes, destacou-se o gene da proopiomelanocortina (POMC), que codifica vários fatores hipofisários. Os conhecimentos gerados por este trabalho poderão ser úteis para a identificação de marcadores genéticos para aplicação em programas de seleção assistida por marcadores / Puberty is the stage where any mammal, male or female, becomes able to produce viable gametes and manifest complete sexual behavior. These are results from the gradative adjustment between the increase in gonadotrophic activity and the ability of gonads in undergoing simultaneously both steroidogenesis and gametogenesis. One of the major factors interferring with puberty initiation is the genetics. Puberty is a physiological process controlled by several factors (organic and environmental) related with the expression of several genes, most of them with unknown function. Differential gene expression approaches, in particular the Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), include tools that allow the global and simultaneous analysis of several transcripts from a given tissue, being known or unknown, providing qualitative and semi-quantitative information about the genetic profiles of any cellular type of interest. Using the SAGE approach, the aim of the present study was to analyse the differential gene expression profiles of ovarian follicles from pubertal and pre-pubertal Nelore breed females, observed for the presence or not of follicular growth waves ending in an ovulation, A total of 14,531 and 14,285 tags had their DNA sequences determined, revealing the existence of 6,840 and 6,386 unique tags (pre-pubertal and pubertal follicle libraries respectively). Comparison between the two SAGE libraries revealed 127 differentially expressed genes (P<0,05). Follicles from pubertal heifers showed increased expression of some steroidogenic enzymes (CYP11A1 and CYP19) and StAR, the mitochondrial cholesterol transporter, which together indicates a marked steroidogenic activity (oestrogen production), when compared with follicles from pre-pubertal heifers. Furthermore, connective tissue growth factor (CTGF) and TIMP2 (tissue inhibitor of metalloproteinases 2) were shown to be increased in pubertal follicles, indicating the starting of luteinization proccess, without however initiating the rupture of extracellular matrix, which takes place in ovulation. Higher levels of expression presented by extracellular matrix and cytoskeletal related genes (as examples osteonectin, actin and actin-related proteins) also indicate that the follicle from pubertal heifers is at the verge of tissue remodelation. The higher expression of connexin 43 (gap junction protein) indicated that this follicle shows a more intense communication among granulosa cells and between these and the oocyte, as compared to the pre-pubertal calves follicle. Among the differentially expressed genes more abundant in the pre-pubertal follicle is the proopiomelanocortin gene (POMC), which codifies to some hypophiseal factors. The knowledge generated by this study may contribute to the identification of genetic markers to be used in marker assisted selection programmes