BCG é uma das vacinas mais usadas no mundo. Avanços na manipulação genética têm permitido o seu uso como carreador de antígenos heterólogos, porém o aprimoramento dos sistemas de expressão se faz necessário, sendo o promotor um importante elemento, uma vez que regula o nível de produção do antígeno, induzindo uma resposta imunológica adequada. Avaliamos a atividade de diferentes promotores de micobactérias, como o PAg, PAN, PBlaF*, Phsp60 e um promotor ainda não caracterizado do micobacteriófago L5, usando o gene gfp como repórter da expressão, todos clonados no vetor extracromossomal, pLA71. Foi possível avaliar as cepas de M. smegmatis e BCG fluorescentes para quase todas as construções e alguns plasmídeos pLA71-p mostraram características diferentes dependentes da micobactéria transformada. Numa escala de força de expressão, os diferentes promotores se apresentaram como fraco (pLA71-PAN-gfp), médio (pLA71-PBlaf*-gfp) e forte (pLA71-Phsp60-gfp). Os rBCG foram usados para infecção de macrófagos e a atividade dos promotores não foi afetada após a internalização. Para ensaio de localização, camundongos foram inoculados com BCG e foi possível confirmar a presença de colônias (recombinantes ou não) nos pulmões após 1 e 3 dias de inoculação, por plaqueamento em meio sólido e por microscopia confocal. / BCG is one of the most widely used vaccines in the world. Advances in genetic manipulation have allowed their use as a carrier for heterologous antigens, however the improvement of systems of expression is necessary, the promoter being an important element, since it regulates the expression level of the antigen, inducing an adequate immune response. We evaluated the activity of different promoters of mycobacteria, such as PAg, PAN, PBlaF* and Phsp60, and the not yet characterized promoter of the micobacteriophage L5, using GFP as a reporter gene expression activity, all cloned in the extrachromosomal vector, pLA71. It was possible to evaluate promoters in the M. smegmatis and BCG strains, fluorescent for almost all constructions and some pLA71-p plasmids showed different characteristics dependent on the transformed mycobacterium. The different promoters showed expression levels as weak (pLA71-PAN-gfp), medium (pLA71-PBlaf*-gfp) and strong (pLA71-Phsp60-gfp). The rBCG were used for infection of macrophages and the activity of the promoters wasnt affected after internalization. For BCG location test, mice were inoculated and it was possible to confirm the presence of colonies (recombinant or not) in the lungs after 1 and 3 days after inoculation by plating on solid medium and by confocal microscopy.

Células neuronais cocultivadas com células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) podem induzir estas últimas à transdiferenciação neuronal. No entanto, os processos de comunicação celular envolvidos nessa indução, e a funcionalidade da ADSC transdiferenciada in vivo, são desconhecidos. Recentemente, um novo tipo de comunicação celular mediada por vesículas extracelulares são indicados na modulação de diferentes eventos celulares como a diferenciação. Portanto, a hipótese, nesta proposta, foi identificar se o processo de diferenciação celular é mediado por vesículas extracelulares e se as células diferenciadas são capazes de atuar na regeneração de tecidos nas lesões do sistema nervoso periférico. Para tal, essa pesquisa foi dividida em duas fases: a primeira consiste no processo in vitro, com o objetivo de observar o processo de transição da ADSC para a linhagem neuronal e analisar a função da comunicação celular no processo de diferenciação; a segunda consistiu na avaliação in vivo da possível funcionalidade das ADSC diferenciadas. O camundongo foi o modelo animal utilizado (C57BL/6 e FVB). As ADSC e as células neuronais foram isoladas, cultivadas em cultivo primário e cocultivadas durante três, sete e 14 dias. Para a comprovação das mudanças fenotípicas das ADSC, realizou-se a imunolocalização com beta tubulina III e SNAP25 e PCR em tempo real (RT-qPCR) dos genes Map2 e Snap25. Seguido de analises de genes relacionados com a neurogênese. Adicionalmente, as vesículas extracelulares foram isoladas e utilizados para análises in vitro da diferenciação e análises gênicas e funcionais. Como resultado, verificou-se que as ADSC em cocultivo com neurônios podem se diferenciar em neuronais-like. Além disso, comprovou-se a comunicação por vesículas extracelulares entre neurônios e ADSC, e as vesículas extracelulares foram correlacionadas neste processo, pelo transporte da proteína SNAP25. Após estes resultados prosseguiu-se para a segunda fase deste trabalho, a etapa in vivo, que incidiu na utilização das ADSC cocultivadas por sete dias e avaliação funcional local e sistêmica no processo de regeneração do nervo ciático após neurotmese. Como resultado desta etapa as células-tronco cocultivadas modularam a lesão, e proporcionaram uma melhoria na funcionalidade após lesão. Conclui-se, através desta pesquisa, que as ADSC diferenciadas em neuronais-like, sob indução dos neurônios e suas vesículas extracelulares podem ser uma fonte celular alternativa no auxílio na regeneração de nervos periféricos. / Neuronal cells co-cultured with stem cells derived from adipose tissue (ADSC) can induce the latter to neuronal transdifferentiation. However, the cellular communication processes involved in this induction, and the functionality of the transdifferentiated ADSC in vivo, are unknown. Recently, a new type of cellular communication measured by extracellular vesicles was indicated in the modulation of different cellular events like differentiation. Therefore, the hypothesis in this proposal was to identify if the process of cellular differentiation is mediated by extracellular vesicles and if the differentiated cells are able to act in the regeneration of tissues in the lesions of the peripheral nervous system. For this, the research was divided in two phases: the first one consisted of the in vitro process, with the objective of observing the transition process of the ADSC to the neuronal lineage and analyzing the cellular communication function in the differentiation process; the second consisted in the in vivo evaluation of the possible functionality of the differentiated ADSCs. Murine was the animal model used (C57BL/6 and FVB). ADSCs and neuronal cells were isolated, cultured in primary culture and co-cultured for three, seven and 14 days. To confirm the phenotypic changes of ADSC, immunolocalization with beta tubulin III and SNAP25 and real-time PCR (RT-qPCR) of the Map2 and Snap25 genes was performed, followed by analysis of genes related to neurogenesis. In addition, extracellular vesicles were isolated and used for in vitro differentiation and gene and functional analysis. As a result, it has been found that ADSCs in co-culture with neurons can differentiate into neuronal-like. The communication by extracellular vesicles between neurons and ADSCs was verified, and the extracellular vesicles were correlated in the differentiation process by the transport of the protein SNAP25. After these results, the second phase of this work was continued, the in vivo step, which focused on the use of the co-cultivated ADSCs for seven days and functional local and systemic evaluation in the process of sciatic nerve regeneration after neurotmese. As a result of this step, the co-cultured stem cells modulated the lesion and provided an improvement in functionality after injury. It is concluded that ADSCs can transdifferentiate neuronal lines in co-culture with neurons, the extracellular vesicles play a certain role in this process and the transdifferentiated ADSC may be an alternative to aid in the regeneration of peripheral nerves.

O protozoário ciliado Ichthyophthirius multifiliis causador da doença dos pontos brancos em muitas espécies de peixes de água doce destaca-se como um importante patógeno por ser responsável por grandes perdas para a indústria de pescados mundial. Duas espécies de peixes de grande importância para a economia no Brasil foram selecionadas para este estudo, o pintado (Pseudoplatystoma corruscans (Spix & Agassiz, 1829) e a cachara (Pseudoplatystoma reticulatum (Eigenmann & Eigenmann, 1889). Com o objetivo de avaliar a resposta imune destes peixes frente ao parasita, inicialmente, o protozoário I. multifiliis foi isolado e repicado em P. corruscans para a obtenção da forma infectante (teronte) utilizada nas imunizações. A identificação molecular dos peixes foi realizada através da amplificação e sequenciamento do gene RAG2 mostrando que as espécies puras são homozigotas enquanto o híbrido é heterozigoto para este gene. Através de PCR foi realizada ainda a caracterização parcial dos genes arginase 1, arginase 2, IL-1β, IL-8 e TNF-α dos peixes pertencentes a família Pseudoplatystoma que resultaram em amplificações de sequências com aproximadamente 530, 815, 400, 280 e 300 pb, respectivamente, que foram usadas para a construção de primers específicos utilizados nas análises de expressão gênica por PCR em tempo real (qPCR). A expressão gênica em P. corruscans e P. reticulatum imunizados com terontes vivos de I. multifiliis foram verificadas 6, 12, 18 e 24 horas após imunização, sendo retirada amostras do baço, fígado e rim anterior dos peixes. No geral a expressão dos genes destes órgãos em P. corruscans apresentam um padrão semelhante de regulação. Um aumento significativo de expressão em relação ao período de imunização foi verificado para: a arginase 2 as 6 e 18 horas no baço, as 6 h no fígado e as 6, 18 e 24 horas no rim cranial; o gene da IL1-β as 24 h no fígado e 18 h e 24 h no rim cranial; e o gene da IL-8 somente as 18 h no baço. Já os genes arginase 1 e TNFα não tiveram regulação significativa nos períodos. Para P. reticulatum observou-se que somente o baço teve aumento na regulação com diferenças significativas nos períodos para arginase 2, IL-8 e TNFα, as 6 e 18 horas, já os genes arginase 1 e IL1-β não apresentaram alterações significativa. / The ciliate protozoan Ichthyophthirius multifiliis has been reported in various freshwater fishes and stands out as an important pathogen for being responsible to severe losses to both food and aquarium fish production. Among the fish species explored economically in Brazil it can be highlight the pintado (Pseudoplatystoma corruscans (Spix & Agassiz, 1829) and cachara (Pseudoplatystoma reticulatum (Eigenmann & Eigenmann, 1889). At this study the parasite I. multifiliis was original isolated from a petshop infected fish and maintained by serial transmission on naive pintado (P. corruscans) to obtain the infecting form (teronte) used at immunizations. The molecular identification of fish was realized through the amplification and sequencing of RAG2 gene, were the pintado (P. corruscans) and cachara (P. reticulatum) were homozygous, while the hybrid between those fish was considered heterozygous for this gene. At the partial gene characterization from fishes belonging to the Pseudoplatystoma family, the PCR amplification result in sequences of 530, 815, 400, 280 and 300 pb of the genes arginase 1, arginase 2, IL1-β, IL-8 e TNFα respectively, which were used to construct of specific primers for the quantitative real-time PCR (qPCR). The gene expression at P. corruscans and P. reticulatum immunized with live theronts of I. multifiliis was evaluated 6, 12, 18 and 24 hours after the immunization, where it was collected samples of the spleen, liver and heady kideny. The gene expression of the organs of pintado (P. corruscans) showed similar pattern of expression. An up-regulation with statistical significance was observed for: arginase 2 at 6 and 18 hours at spleen, 6 h at kidney and 6, 18 and 24 h at head kidney; the gene of IL1-β at 24 h at spleen, 18 and 24 hours at head kidney; the gene of IL-8 at 18 h at spleen. The genes of arginase 1 and TNFα didn\'t showed statistical significant regulation at this experiment. At the gene expression of cachara (P. reticulatum) only the spleen had a statistical alteration after theronts immunization where the arginase 2, IL-8 and TNFα was up-regulated at 6 h and 18 h, while the arginase 1 and IL1-β didn\'t showed statistical alteration.

As proteínas de choque térmico (Hsp) apresentam importantes funções homeostáticas e podem induzir respostas imunológicas tanto inflamatórias como reguladoras. Por essas propriedades, as Hsp e seus peptídeos têm grande potencial como agentes imunomoduladores. Neste estudo, o nosso objetivo foi identificar peptídeos da Hsp60 com potencial imunorregulador, a partir da análise de sua capacidade de modificar, in vitro a expressão de genes imunorreguladores (REGULA) ou inflamatórios (INFLAMA) em células mononucleares do sangue de indivíduos sadios. A análise desse painel REGULA/INFLAMA nos mostrou que os principais peptídeos potencialmente imunorreguladores estão presentes na região N-terminal da Hsp60. Selecionamos os 3 peptídeos que mostraram as maiores razões REGULA/INFLAMA (N2, N6 e N7) para serem testados nos demais experimentos. A análise das citocinas induzidas pelos peptídeos nos mostrou que existe correspondência entre a presença do RNA mensageiro e a proteína produzida e, o peptídeo N7 induziu uma alta razão IL-10/IFN-. Os peptídeos selecionados interagiram diretamente com linfócitos T purificados, o que mostra que a atividade dos peptídeos da Hsp60 independe de APC. Apesar de diferenças entre o efeito na população celular heterogênea de PBMC e na mais homogênea de linfócitos T, os peptídeos da Hsp60 induziram um predomínio de modificações REGULA com indução sustentada de Foxp3 e GATA-3. Os peptídeos selecionados, N2, N6 e N7, foram capazes de inibir a resposta proliferativa alogeneica (maior inibição: peptídeo N7 60,53%) e induzida pelo anticorpo anti-CD3 (maior inibição: peptídeo N2 31,01%). A partir desses resultados, concluímos que o nosso painel de expressão gênica REGULA/INFLAMA foi adequado para identificar peptídeos da Hsp60 predominantemente reguladores. Dentre os possíveis mecanismos supressores desses peptídeos, apontamos a ação das citocinas reguladoras IL-10, TGF-, a inibição de fatores de transcrição próinflamatórios como T-bet e RORt, e a geração de células T reguladoras. O próximo passo, já em andamento no nosso laboratório, será testar esses peptídeos em modelos de transplante e doenças autoimunes visando, no futuro, o seu uso em aplicações terapêuticas na clínica. / Heat shock proteins (HSPs) have dual immunologic functional activity inducing both proinflammatory and regulatory responses. These properties place HSPs and their peptides as molecules displaying great potential as immunomodulatory agents. In this study, our goal was to identify potential immunoregulatory Hsp60 peptides, analyzing their capacity to modify the expression of immunoregulatory (REG) or proinflammatory (INFLAMMA) genes in PBMC of healthy individuals. The REG/INFLAMMA gene panel analysis showed that most peptides displaying an immunoregulatory profile belong to the Hsp60 N-terminal region. We selected 3 peptides that showed the highest REG/INFLAMMA ratio (N2, N6 and N7) for functional studies. Cytokine analysis showed good correspondence between messenger RNA and protein production induced by the peptides, and N7 peptide induced high IL-10/IFN- ratio. The selected peptides also interacted directly with purified T lymphocytes, indicating an APC-independent activity for Hsp60 peptides. Despite differences between the effect on PBMC and on purified lymphocytes, Hsp60 peptides induced predominantly REG type of gene expression modifications, with the induction of Foxp3 and GATA-3. The selected peptides, N2, N6 and N7, were capable of inhibiting allogeneic proliferation (highest inhibition: N7 peptide 60,53%) and the proliferation induced by anti-CD3 antibody (highest inhibition: N7 peptide 31,01%). We concluded that our REG/INFLAMMA gene expression panel was appropriate to indentify regulatory Hsp60 peptides. Among their possible suppressive mechanisms, we can point out the action of the regulatory cytokines IL-10 and TGF-, the inhibition of proinflammatory transcription factors T-bet and RORt and the generation of regulatory T cells. The next step, ongoing in our lab, is to test these peptides in experimental models of allotransplantation and autoimmune diseases, aiming at future therapeutic applications in the clinic.

As infestações por Rhipicephalus microplus, conhecido como o carrapato do boi, causam enormes prejuízos econômicos na produção de gado na região tropical e países subtropicais em todo o mundo. O método atual de controle do ectoparasito depende exclusivamente de produtos tóxicos como os acaricidas, que deixam resíduos no meio ambiente e seu uso contínuo tem provocado o aparecimento de carrapatos resistentes, sendo, portanto, de pouca eficácia. O grupo de pesquisa em carrapatos da FMRP-USP tria antígenos candidatos que foram testados em vacinação experimental feita em bovinos, utilizando formulação antigênica multicomponente. Baseando-se nos resultados do transcriptoma de leucócitos do sangue periférico de bovinos vacinados, que identificou genes diferencialmente expressos, cuja expressão é afetada pelas infestações e a partir do transcriptoma da pele de bovinos da raça Nelore e Holandês, o presente estudo tem objetivo avaliar, através da técnica Nanostring, genes que possam ser empregados em testes para identificar bovinos geneticamente resistentes ao carrapato e comparar com os dados já obtidos dos transcriptomas de sangue periférico e de pele. Foi analisada a expressão gênica de leucócitos de sangue periférico de vacas da raça holandesa pouco e muito infestada, e da raça nelore durante períodos de baixa e alta infestação natural por carrapatos. Os dados obtidos mostraram que a infestação modulou um número maior de genes nos holandeses muito infestados do que nas outras raças. De acordo com a análise funcional realizada dos genes diferencialmente expressos (DEGs) encontrados pode-se observar uma possível relação do perfil de expressão gênica dos holandeses com a imunidade inata, ao passo que o perfil de expressão gênica encontrado na raça nelore pode estar relacionado tanto com a imunidade inata quanto a imunidade adaptativa. Dessa forma, avaliando o perfil de resistência e suscetibilidade, este trabalho sugere que os genes CXCL6, S100A8 (Calgranulina A) TYRP1, IgM, ELANE, CCL19, PDGFRL, VCAM1, NOX1 e CEBPE, podem ser possíveis assinaturas gênicas relacionadas a resistência ou suscetibilidade / Infestations with the cattle tick, Rhipicephalus microplus, cause huge economic losses in cattle production in tropical and subtropical countries worldwide. Control of ticks and tick-borne diseases of livestock depends almost exclusively of chemical control, such as use of acaricides, which leads to environmental concerns and due to their continued use, has generated resistance mechanisms in ticks, presenting steadily decreasing efficiency in controlling tick infestations. The research group of ticks of FMRP-USP selects new antigens that were tested in an experimental immunization, using a multicomponent antigen formulation. Based on the transcriptome results from peripheral blood leukocytes from vaccinated cattle, which identified genes whose expression is affected by infestations, and from the skin transcriptome of Nelore and Holstein bovine, the aim of this project is evaluate, by Nanostring technology, genes that may be used in tests to identify genetically resistant cattle to bovine tick and compare with the data already obtained from peripheral blood transcriptome and skin transcriptome. Gene expression was analyzed in peripheral blood of Holstein (much infested or less infested), and Nelore during periods of low and high natural infestation of ticks. The results showed that a greater number of genes were modulated in Holstein than the other breeds. According to the functional analysis of differentially expressed genes (DEGs) it can be observed a possible correlation from Holsteins profile with innate immunity, while the gene expression profile found in Nelore can be related both with the innate and adaptive immunity. Thus, evaluating the resistance and susceptibility profile, this work suggests that genes CXCL6, S100A8 (Calgranulin A) TYRP1, IgM, ELANE, CCL19, PDGFRL, VCAM1, NOX1 and CEBPE may be possible gene signatures related to resistance or susceptibility.

Random Forest é uma técnica computacionalmente eciente que pode operar rapida-mente sobre grandes bases de dados. Ela tem sido usada em muitos projetos de pesquisa recentes e aplicações do mundo real em diversos domínios, entre eles a bioinformática uma vez que a Random Forest consegue lidar com bases que apresentam muitos atributos e poucos exemplos. Porém, ela é de difícil compreensão para especialistas humanos de diversas áreas. A pesquisa de mestrado aqui relatada tem como objetivo criar um modelo simbólico, ou seja, uma única árvore a partir da Random Forest para a classicação de bases de dados de expressão gênica. Almeja-se assim, aumentar a compreensão por parte dos especialistas humanos sobre o processo que classica os exemplos no mundo real tentando manter um bom desempenho. Os resultados iniciais obtidos com o algoritmo aqui proposto são pro-missores, uma vez que ela apresenta, em alguns casos, desempenho melhor do que outro algoritmo amplamente utilizado (J48) e um pouco inferior à Random Forest. Além disso, a árvore criada apresenta, no geral, tamanho menor do que a árvore criada pelo algoritmo J48. / Random Forest is a computationally ecient technique which can operate quickly over large datasets. It has been used in many research projects and recent real-world applications in several elds, including bioinformatics since Random Forest can handle datasets having many attributes, and few examples. However, it is dicult for human experts to understand it. The research reported here aims to create a symbolic model, i.e. a single tree from a Random Forest for the classication of gene expression datasets. Thus, we hope to increase the understanding by human experts on the process that classies the examples in the real world trying to keep a good performance. Initial results obtained from the proposed algorithm are promising since it presents in some cases performance better than other widely used algorithm (J48) and a slightly lower than a Random Forest. Furthermore, the induced tree presents, in general, a smaller size than the tree built by the algorithm J48.

Utilizada amplamente no tratamento de Leucemias Linfoblásticas Agudas, a L-Asparaginase é uma enzima que atua diminuindo a concentração de L-asparagina livre no plasma e, dessa forma, impede a proliferação de células cancerígenas. Isso ocorre porque tais células, ao contrário das células saudáveis, não conseguem sintetizar o aminoácido L-asparagina que necessitam para a síntese proteica por não possuírem a enzima asparagina sintetase devido a um silenciamento genético. A L-Asparaginase utilizada no Brasil era importada e produzida em bactéria, o que gerava problemas com custo e abastecimento, além de causar algumas reações imunológicas aos usuários. Isso impulsiona a encontrar alternativas para produção nacional de tal enzima e, se possível, com menor potencial alergênico. Para isso, foi estudada a produção da enzima L-Asparaginase do gene ASP1 de Saccharomyces cerevisiae em sistema de expressão heteróloga Pichia pastoris através da clonagem do gene sintético (ASP1), com códons otimizados para expressão em P. pastoris, estudo este nunca antes realizado ao que se sabe. Além disso, a produção da enzima foi realizada com auxílio de um planejamento experimental fatorial em agitador orbital levando em conta as variáveis: pH, temperatura e concentração do indutor. A melhor condição encontrada dentre as estudadas neste trabalho foi, a temperatura de 20°C, pH 6,0 e concentração de indutor de 1,5% que alcançou uma atividade de 6,9 U/g de célula e apesar do esforços, o peptídeo sinal utilizado (alfa da S. cerevisiae) não foi capaz de promover a secreção da enzima para o meio extracelular.Deve-se salientar que a realização de um maior número de ensaios através de um planejamento experimental fatorial fracionário para encontrar uma região de rendimentos máximos talvez melhore o ajuste dos modelos mostrados. Este trabalho foi a primeira tentativa de expressão do gene ASP1 de S. cerevisiae em Pichia pastoris até o momento, e pretende-se aprofundar mais este estudo. / Used widely in the treatment of Acute lymphoblastic leukemia, L-Asparaginase is an enzyme that acts by decreasing the concentration of L-asparagine free in the plasma and thus prevents the proliferation of cancer cells. This is because such cells, in contrast to healthy cells can not synthesize L-asparagine amino acid for protein synthesis need not possess the enzyme asparagine synthetase due to a gene silencing. The L-asparaginase used in Brazil was imported and produced in bacteria, which caused problems with cost and supply, as well as cause some immune responses to users. This boosts find alternatives to domestic production of this enzyme and, if possible, less allergenic potential. For this, the production of L-asparaginase enzyme ASP1 Saccharomyces cerevisiae gene heterologous to Pichia pastoris expression system was investigated by cloning the synthetic gene (ASP1), with codons optimized for expression in P. pastoris, this study never before achieved to what is known. Furthermore, the enzyme production was performed with the aid of a factorial design in an orbital shaker taking into account the following variables: pH, temperature and concentration of inducer. The best condition found among those studied in this work was a temperature of 20 ° C, pH 6.0 and concentration of 1.5% inductor attained an activity of 6.9 U / g cell and despite the efforts, used signal peptide (S. cerevisiae alpha) was not able to promote the secretion of the enzyme into the medium extracelular.Deve be noted that the achievement of a greater number of tests using a fractional factorial design yields to find a region maximum might improve the fit of the models shown. This work was the first attempt to ASP1 gene expression of S. cerevisiae in Pichia pastoris to date, and is intended to further deepen this study.

A evolução da vida na terra foi possível graças ao desenvolvimento de mecanismos temporais precisos capazes de ajustar processos fisiológicos que ocorriam no interior do organismo com os ciclos ambientais, promovendo assim, ganhos na capacidade adaptativa e comportamental desses indivíduos. A retina exerce função de suma importância nesse processo através da percepção da informação fótica que possibilita o ajuste dos ritmos circadianos. Nesse tecido, o glutamato apresenta um importante papel tanto na transmissão da informação fótica direcionada ao processo de formação de imagem quanto nos ajustes dos relógios biológicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar como o glutamato, aplicado por períodos diferentes (6 e 12h), é capaz de modular a expressão dos genes de relógio na retina de Gallus gallus. Através de diferentes protocolos que envolveram a administração de glutamato na concentração de 100μM por 6 e 12 horas e em diferentes repetições (1 e 3 pulsos) avaliou-se através de PCR quantitativo a expressão dos genes Clock, Per2 e Bmal1. Os diferentes genes de relógio na retina de Gallus gallus apresentam diferentes respostas frente às trocas de meio e frente ao tratamento com o glutamato. O gene Clock responde com ativação da transcrição para ambos os tratamentos, de forma dependente da repetição dos estímulos. Já para o gene Per2 o tratamento com glutamato impõe uma oscilação de expressão com um ritmo ultradiano, enquanto que as trocas de meio não determinam alterações na transcrição. A expressão do gene Bmal1 não é afetada nem por trocas de meio, nem por glutamato. Novos estudos devem ser fomentados no sentido de se elucidar as vias pelas quais o glutamato leva ao perfil de oscilação observado e qual o mecanismo pelo qual a repetição de trocas de meio atua como sinalizador para o estabelecimento da sincronização celular / The evolution of life on earth was possible thanks to the development of precise temporal mechanisms to adjust physiological processes to environmental cycles, thus promoting gains in the individual adaptive and behavioral ability. The retina plays a very important role of paramount importance in this process through the perception of photic information that allows the adjustment of circadian rhythms. In this tissue, glutamate functions in the transmission of photic information directed to both image formation and biological clock entrainment. The aim of this study was to evaluate how glutamate, applied for different periods (6 and 12h), is able to modulate the expression of the clock genes in the retina of Gallus gallus. Using different protocols involving the administration of 100μM glutamate for 6 and 12 hours and with different repetitions (1 and 3 pulses) the expression of Clock, Per2 and Bmal1 genes was evaluated by quantitative PCR. Clock gene responds with activation of transcription to both treatments depending on the repetition of the stimulus. As for Per2 gene, glutamate treatment imposes an oscillation with an ultradian expression rhythm, whereas medium changes do not affect its transcription. The expression of Bmal1 gene is not affected by either medium changes or glutamate. Further studies should be encouraged in order to elucidate the pathways by which glutamate leads to observed oscillation profile, and which mechanism triggered by the repetition of medium changes acts as signal to establish cell synchronization

As conexinas (Cx) compõem as junções comunicantes do tipo gap, entre elas a Cx43 é a mais prevalente. A diminuição de sua expressão está relacionada com diversas alterações fisiológicas. Sua importância in vivo foi relatada em camundongos com deleção de um dos alelos de Cx43 (Cx43+/-), pois os animais Cx43-/- não são viáveis. Devido esta inviabilidade técnica, os estudos com essa proteína foram realizados com animais Cx43+/-. Assim, este trabalho propõe a criação de um modelo transgênico para o estudo da Cx43. Para isso, o gene Cx43 foi reintroduzido ao genoma murino, porém regulado pelo sistema induzido por doxiciclina TetOn. Vetores de expressão gênica foram construídos e validados quanto sua funcionalidade in vitro e posterior transferencia para zigotos murinos por meio de microinjeção pronuclear. Obtivemos sucesso na construção do sistema de expressão. A funcionalidade dos vetores foi confirmada in vitro utilizando células HeLa e E10. Nos experimentos in vivo, apesar das taxas adequadas de nascimento nenhum deles apresentou genótipo positivo para o transgene. / The connexins (Cx) comprise gap junctions type, and the Cx43 is the most prevalent. The decrease of its expression is related to various physiological changes. Its importance in vivo has been reported in mice with deletion of one allele of Cx43 (Cx43+/-), because the animals Cx43-/- are not viable. So all studies with this protein were performed with animals Cx43+/-. Thus, this paper proposes the creation of new a transgenic model for the study of Cx43 protein. For this, the Cx43 gene was reintegrated to the murine genome, but drived by doxycycline Teton inducible system. Gene expression vectors were constructed and validated in vitro and subsequent transfer to mouse zygotes by pronuclear microinjection. We got success in vector construction and functionality. The functionality of the vectors was confirmed in vitro using HeLa cells and E10. In experiments in vivo, despite adequate rates of birth, no one animal showed positive genotype for the transgene.

A glândula pineal é um órgão neuroendócrino regulado pelo fotoperíodo ambiental. Sua principal inervação é constituída por fibras simpáticas provenientes do gânglio cervical superior que, liberando noradrenalina, ativa receptores b1 adrenérgicos resultando na produção noturna de melatonina, cuja biossíntese envolve a conversão da serotonina à NAS. O ATP, co-liberado com a noradrenalina, liga-se a receptores purinérgicos presentes na pineal e leva a uma potenciação da produção de NAS. Após a liberação, o ATP sofre rápida degradação enzimática, degradação esta, funcionalmente importante, uma vez que metabólitos do ATP atuam como ligantes em diferentes receptores. Os receptores purinérgicos são classificados em duas grandes famílias: receptores P1, que reconhecem adenosina e, receptores P2, que reconhecem principalmente ATP, ADP e AMP. Várias famílias de enzimas estão envolvidas na hidrólise de ATP liberado para o meio extracelular, sendo elas: as E-NTPDases, as E-NPPs e a ecto-5\'-nucleotidase. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a expressão gênica, a distribuição celular e a atividade das ecto-nucleotidases na glândula pineal de ratos a fim de aprimorar a caracterização do sistema purinérgico neste órgão. / The pineal gland is a neuroendocrine organ regulated by environmental photoperiod. Its main innervation is constitute by fibers from the sympathetic superior cervical ganglion that by releasing noradrenaline active b1 adrenergic receptors resulting in the nocturnal production of melatonin whose biosynthesis involves the conversion of serotonin to NAS. ATP, co-released with norepinephrine binds purinergic receptors present in the pineal gland and leads to an enhancement of the production of NAS. After release, ATP and other nucleotides are rapid enzymatic degradation, this degradation is functionally important since ATP metabolites act as ligands in different receivers. Purinergic receptors are classified into two large families: P1 receptors that recognize adenosine and P2 receptors that recognize mainly ATP, ADP and AMP. Several families of enzymes are involved in the hydrolysis of ATP released into the extracellular environment: the E-NTPDase, E-NPP and the ecto-5\'-nucleotidase. This study aimed to characterize the gene expression, the cellular distribution and activity of ecto-nucleotidases in the rat pineal gland in order to improve the characterization of the purinergic system in this organ.