As CDKs 9 e 11 fazem parte da subfamília de CDKs transcricionais, e portanto desempenham papéis de controle na dinâmica atividade de síntese e processamento do RNA mensageiro pela RNA Polimerase II. Devido à sua capacidade de modular individualmente a atividade dos complexos de transcrição da RNAP II, estas quinases assumem uma grande importância para a regulação da expressão gênica em células eucarióticas. Casos de desregulação da atividade de CDKs transcricionais têm sido frequentemente relacionados a diversas patologias humanas graves, incluindo vários tipos de câncer e também a AIDS (em razão do papel essencial desempenhado pela CDK9 na replicação do HIV. O objetivo deste trabalho é a obtenção das CDKs humanas 9 e 11 através da expressão heteróloga em Escherichia coli, buscando o aperfeiçoamento de métodos para produzir estas enzimas em quantidade e pureza suficientes para aplicação em estudos estruturais. A utilização de um sistema bacteriano oferece muitas vantagens práticas, como a simplicidade da técnica, baixo custo, altos níveis de expressão, e elevado rendimento na purificação do produto. No entanto, a obtenção de quinases humanas ativas a partir de E. coli sempre representou um desafio experimental, devido aos problemas comumente associados à expressão heteróloga. Os resultados apresentados aqui demonstram a possibilidade de se obter a CDK9 humana enzimaticamente ativa pelo reenovelamento in vitro da proteína expressa pela bactéria na forma de corpos de inclusão, após etapas de solubilização e purificação em condições desnaturantes. Por outro lado, a CDK11 humana só pôde ser obtida em uma versão encurtada, consistindo apenas no seu domínio quinase, devido à forte inibição que um trecho N-terminal da sequência mostrou exercer sobre a expressão da proteína. Assim, este trabalho fornece exemplos de como é possível superar algumas das adversidades comuns da expressão heteróloga a fim de se obter CDKs humanas ativas empregando o sistema bacteriano. / CDK9 and CDK11 are members of the subfamily of transcriptional CDKs and therefore play central roles in the control of the dynamic activity of messenger RNA synthesis and processing by RNA polymerase II. Because of their ability to individually modulate the activity of RNAP II transcription complexes, these kinases are of great importance for the regulation of gene expression in eukaryotic cells. Several cases of deregulation of the transcriptional CDKs have been linked to important human diseases, including various types of cancer and also AIDS (due to the essential role of CDK9 in HIV replication). The objective of this work is to obtain human CDK9 and CDK11 heterologously expressed in Escherichia coli, seeking improved methods to produce these enzymes in quantity and purity suitable for structural studies. A bacterial system offers many practical advantages to protein production, such as technical simplicity, low costs, high levels of expression and high purification yield. However, it has always been an experimental challenge to obtain active human kinases from E. coli, because of the problems commonly associated with heterologous expression. The results presented here demonstrate the possibility of obtaining the enzymatically active human CDK9 by in vitro refolding of the protein expressed as bacterial inclusion bodies, after its solubilization and purification under denaturing conditions. Human CDK11, on the other hand, could only be obtained in a shortened form consisting just of its kinase domain, due to the strong inhibition that an N-terminal stretch exerts on the protein\'s own expression. Therefore, this work provides examples of how it is possible to overcome some of the common adversities of heterologous expression in order to obtain active human CDKs through the bacterial system.

As radiações ionizantes (RI) são amplamente utilizadas na área médica, principalmente para diagnóstico e terapia. Uma vez que a exposição às radiações implica em sérias complicações para a saúde humana e para o meio ambiente, torna-se relevante a compreensão dos mecanismos moleculares que coordenam as respostas em diferentes tipos celulares, especialmente em células normais. A taxa de dose (TD) é um importante fator a ser considerado em radiobiologia, com base em alguns estudos sobre a sua influência nas respostas celulares. Nesse contexto, duas TD distintas (0,5 e 2,0Gy/min) foram testadas para verificar a influência da TD na expressão gênica e protéica em fibroblastos e linfócitos humanos. Fibroblastos primários em estado de confluência foram irradiados com 4Gy e linfócitos com 2 Gy, sob as TDs de 0,5 e 2,0 Gy/min. Em fibroblastos, o RNA foi coletado 6 h após a irradiação, tempo em que foram analisados os níveis de expressão gênica pelo método de microarranjos de cDNA e, para alguns genes de reparo do DNA e algumas proteínas (H2AX, PCNA e FEN1) a expressão foi analisada por qPCR e Western blot, respectivamente, em ambos os tipos celulares, 2 e 6 h após a irradiação. A análise de expressão gênica por microarranjos de cDNA efetuada pelo programa SAM revelou 94 genes (FDR < 0.05) induzidos sob a TD de 0,5 Gy/min. Os principais processos biológicos associados aos genes modulados foram metabolismo, reparo do DNA, apoptose e resposta ao estresse. Por outro lado, 34 genes foram modulados nas células irradiadas sob a taxa de dose de 2,0 Gy/min. Nesta TD, os processos biológicos de maior importância foram: metabolismo, reparo do DNA, replicação, resposta ao estresse e apoptose. Na análise por qPCR, alguns genes de reparo (ERCC1, ERCC3 (ou XPB), XPF, XPA, FEN1) e ATM (sensor de dano) apresentaram uma ampla diferença na modulação gênica detectada em resposta à variação na TD, principalmente nos fibroblastos analisados 2 h após a irradiação. Entretanto, essa diferença foi menor nos linfócitos. Em linfócitos houve um maior número de genes do NER reprimidos relativamente aos fibroblastos, principalmente quando se consideram as células analisadas 2 h após a irradiação, sugerindo que em linfócitos irradiados sob a menor TD, outras vias alternativas de reparo do DNA podem ter ocorrido, possivelmente para lesões do tipo quebra dupla, que são eficientemente induzidas por 2 Gy. A análise protéica de expressão da proteína PCNA indicou que esta se mostrou reprimida nos fibroblastos irradiados com a maior TD, enquanto que a expressão de H2AX nos linfócitos diminuiu 6 h após a irradiação. A proteína PCNA apresentou potencial como um bom indicador dos efeitos de diferentes TDs em fibroblastos irradiados. Em conjunto, os resultados do presente trabalho mostraram uma ampla variedade de processos biológicos envolvidos na resposta ao estresse gerado pela irradiação sob duas diferentes TDs em células humanas (linfócitos e fibroblastos) demonstrando que a TD realmente é capaz de influenciar as respostas celulares em nível transcricional e protéico, o que ainda não foi descrito na literatura. Assim, os resultados constituem informações relevantes que podem contribuir para o esclarecimento das respostas moleculares e vias de sinalização em células normais irradiadas. / Ionizing radiation (IR) has been widely applied in medicine, mainly in diagnosis and therapy purposes. Considering that the exposure to radiation lead to serious complications to human health and environment, it has been relevant to study molecular mechanisms underlying cell responses to gamma-rays in different cell types, especially in normal cells. In radiobiology, dose rate (DR) is an important factor to be taken in account, on the basis of previous results in the literature. In this context, two distinct DR (0.5 and 2.0Gy/min.) were tested aiming to verify the influence of DR on profiles of gene and protein expression displayed by human fibroblasts and lymphocytes. Confluent primary fibroblasts were irradiated with 4Gy and lymphocytes with 2 Gy of -rays, doses delivered at 0.5 and 2.0 Gy/min. RNA was extracted at 6 h post-irradiation for the expression analysis by the cDNA array method in fibroblasts. Few DNA repair genes and proteins (H2AX, PCNA and FEN1) were analyzed by qPCR and Western blot, respectively, in both cell types, at two time-points (2 and 6 h post-irradiation). Results on gene expression were analyzed by the SAM method, which indicated 94 up-regulated genes (False discovery rate < 0.05) at 0.5 Gy/min. The most significant biological processes associated with modulated genes were metabolism, DNA repair, apoptosis signaling and stress response. On the other hand, 34 genes were modulated in cells irradiated at 2.0 Gy/min. (4 up-regulated and 30 down-regulated genes). For such DR, the major biological processes were metabolism, DNA repair, replication, stress response and apoptosis. By using qPCR method, some DNA repair genes (ERCC1, ERCC3 (or XPB), XPF, XPA, FEN1) and ATM (damage sensor) were studied. A wide difference in gene modulation was detected in response to different DR, mainly for fibroblasts analyzed at 2 h post-irradiation. However, this difference was slight in lymphocytes, suggesting that other alternative repair pathways could occurr in irradiated lymphocytes under low TD, possibly in consequence of DNA lesions such as double strand breaks, which are efficiently induced by 2 Gy. Interestingly, the expression of PCNA was down-regulated in fibroblasts irradiated at 2.0 Gy/min, while the expression of H2AX in lymphocytes decreased at both DR 6 h post-irradiation, These findings indicated several biological processes involved in stress responses generated by irradiation at two different DR in human cells. Actually, DR influenced cellular responses at transcriptional and protein levels. These data obtained at molecular level provide relevant information towards clarifying the mechanisms underlying cellular responses displayed by irradiated- normal cells.

O diabetes mellitus gestacional (DMG) é o distúrbio metabólico mais comum da gravidez. A definição padrão do DMG consiste no metabolismo anormal da glicose diagnosticado pela primeira vez durante a gestação. Mulheres que têm história de DMG geralmente apresentam diabetes pós-parto, resistência à insulina, síndrome metabólica, hipertensão e dislipidemia. A detecção precoce deste estado metabólico anormal é importante para eventual intervenção na tentativa de impedir ou mesmo retardar o aparecimento dos outros tipos de diabetes. Alguns estudos têm apontado, em mulheres com DMG, indução de genes envolvidos com resposta imune, particularmente aqueles associados com inflamação. A identificação de genes de inflamação induzidos em gestantes com DMG tem fornecido a base para elucidar a ligação entre vias inflamatórias e DMG. Para testar esta hipótese foi realizada a comparação do perfil transcricional de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de pacientes com DMG e controles. As amostras de RNA total foram hibridadas utilizando oligo microarrays Agilent ® 4 x 44 K englobando o genoma funcional humano total. Os mRNAs diferencialmente expressos foram identificados aplicando-se a análise de Rank Products, e posteriormente submetidos ao agrupamento hierárquico de Pearson por meio do software Cluster. Utilizando o programa TreeView, foi realizada a construção dos dendrogramas com as representações espaciais dos mRNAs, classificados de acordo com suas funções moleculares e vias biológicas. A partir do banco de dados DAVID, foram identificados 130 processos biológicos significantes (P<0.05) incluindo os de resposta imune e defesa, resposta inflamatória, regulação de citocinas, apoptose, desenvolvimento de vasos sanguíneos e proliferação celular. Entre as vias de maior relevância destacamos a via de interação entre receptores de citocinas e a de sinalização do receptor NOD-like, além das vias de câncer, lúpus e asma. Adicionalmente, encontramos os transcritos dos genes IGFBP2, TCF3, OLR1, TCF7L2, previamente associados a alterações metabólicas, diferencialmente expressos nas gestantes com DMG. Também observamos que genes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), HLA-DRB6, HLA-DQA2, HLA-DQB2, HLA-DQB1, HLA-DOA, apresentaram mRNAs induzidos nas pacientes com DMG. A partir deste estudo, constatamos que vias relacionadas ao sistema imunológico e categorias funcionais associadas à inflamação participam da patogenia do DMG. Além disso, evidenciamos que transcritos de genes que pertencem ao MHC e aqueles envolvidos em processos metabólicos, estiveram diferencialmente expressos no DMG. Estes resultados confirmam nossa hipótese inicial e contribuem para o melhor entendimento das bases genéticas desta doença. / Gestational Diabetes Mellitus (GDM) is the most common metabolic disorder found during pregnancy. The standard definition of GDM is the abnormal glucose metabolism first diagnosed during pregnancy. Women who have a history of GDM usually present postpartum diabetes, insulin resistance, metabolic syndrome, hypertension and dyslipidemia. Early detection of this abnormal metabolic status may permit early intervention to prevent or even delay the development of other types of diabetes. The induction of genes involved in immune response in women with GDM has been reported, particularly those associated with inflammatory pathways, providing basis proposing that inflammation genes might be associated to GDM. To test this hypothesis, we compared the transcriptome profiling of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of GDM patients and controls. The total RNA samples were hybridized to Agilent ® 4 x 44 K oligo microarrays covering the whole human functional genome. Differentially expressed mRNAs were obtained by Rank Product analysis and then submitted to hierarchical clustering using the Cluster software . Dendrograms and spatial representations of mRNAs were constructed through the TreeView software . These mRNAs were classified according to their molecular functions and biological pathways using the DAVID database. We observed 130 significant biological processes (P<0.05), including immune and defense response, inflammatory response, regulation of cytokines, apoptosis, blood vessels development and cell proliferation. Among the most relevant pathways, we highlighted the interaction between cytokine receptors, NOD-like receptor signaling and cancer, lupus and asthma pathways. Additionally, we found transcripts of the genes IGFBP2, TCF3, OLR1, TCF7L2, which were previously associated with metabolic abnormalities, differentially expressed in pregnant women with GDM. Some major histocompatibility complex (MHC) genes (HLA-DRB6, HLA-DQA2, HLA-DQB2, HLA-DQB1, HLA-DOA) also presented mRNAs induced in patients with GDM. In conclusion, we found that immunerelated pathways and functional categories associated with inflammation participate in the pathogenesis of DMG. Furthermore, we showed that transcripts of genes belonging to MHC and those involved in metabolic processes were differentially expressed in DMG. These results confirmed our initial hypothesis and contribute to a better understanding of the genetics basis of this disease.

Orientador: Marcelo Campos / Banca: Claudiana Lameu Gomes / Banca: Camila Nomura Boscolo / Resumo: O BaP é um contaminante ambiental capaz de causar inflamação e desregulação de vias celulares. Pela ação da CYP1a1 e CYP1b1, é convertido a metabólitos mais reativos. A literatura mostra que o BaP aumenta a expressão de algumas citocinas próinflamatórias, como a IL-1, porém, são bem contraditórios os relatos sobre o efeito do BaP no cFOS, o qual apresenta papel importante na proliferação, na formação de tumores e, possivelmente, na inflamação. O objetivo deste estudo foi de elucidar a participação do receptor purinérgico P2X7 sobre a expressão dos genes IL- 1 e cFOS, durante exposição ao BaP. Foi empregado as técnicas de qPCR para quantificação de expressão gênica, e testes de correlação e regressão entre IL-1 e cFOS. A exposição ao BaP induziu a expressão dos dois genes, além das enzimas do seu metabolismo. Quando bloqueado o receptor P2X7, além de uma menor indução das CYPs, os níveis de IL- 1e cFOS caíram abaixo dos níveis controle, sugerindo a participação do P2X7. Os testes de correlação e regressão mostraram uma relação forte direta entre IL-1e cFOS, reforçando o papel do cFOS na inflamação / Abstract: BaP is an environmental contaminant capable to cause inflammation and impair cellular pathways. CYP1a1 and CYP1b1 convert it to more reactive metabolites. Studies show that BaP enhances some proinflammatory citokines expression, like IL-1, yet reports about BaP affecting cFOS, which plays important role in proliferation, tumor formation and inflammation, are controversial. This work aimed to elucidate whether P2X7 purinergic receptor plays a role in IL-1 and cFOS expression during BaP exposure. We applied qPCR techniques to quantify gene expression, correlation and regression assays. Our results showed that BaP raised both IL-1 and cFOS genes expression, besides CYPs ones. Morevoer, when blocking P2X7 receptor, IL-1 and cFOS expression dropped under normal levels, which suggest P2X7 participation, in addition to a smaller enzymes induction. Correlation and regression assays exhibited a strong straight relationship between IL-1 and cFOS expression, reinforcing the role of cFOS in inflammation / Mestre

A infestação por larvas de dípteros, conhecida como miíase, é um grande problema na pecuária em todo o mundo e pode causar perdas econômicas severas. A superfamília Oestroidea é um modelo interessante para estudar a evolução de moscas causadoras de miíase devido à diversidade de estratégias de parasitismo entre espécies intimamente relacionadas nessa família. Essas moscas são classificadas pelo seu hábito alimentar como parasitas saprófagos, obrigatórios ou parasitas facultativos. Os parasitas, em particular, podem ser subdivididos pela manifestação clínica/local de infestação como dérmica, nasofaríngea, traumática/ferida e furuncular. Com tal diversidade de estratégias, postula-se que espécies intimamente relacionadas tenham diferenças genéticas que desempenham um papel na formação desses hábitos. Aqui, utilizamos dados de expressão gênica e as sequências codificantes em escala genômica de cinco espécies (Cochliomyia hominivorax, Chrysomya megacephala, Lucilia cuprina, Dermatobia hominis e Oestrus ovis) para encontrar genes que possam estar envolvidos em diferentes estratégias e/ou preferências alimentares. Nós testamos se os 1.287 ortólogos identificados possuiam expressão diferente e restrições evolutivas em diferentes cenários. Ao comparar seus perfis de expressão gênica, encontramos dois genes regulados positivamente; um genes em espécies que causam miíase dérmica envolvido no transporte metabolização de ferro (Ferritina) e outro gene em espécies que causam miíase traumática que responde a níveis reduzidos de oxigênio (anoxia up-regulation-like). Nossa análise evolutiva mostrou um resultado semelhante. Em Ch. hominivorax, encontramos genes diferentes, mas envolvidos nas mesmas funções que podem estar evoluindo sob seleção positiva. Este é o primeiro passo para entender as origens e a evolução da diversidade de estratégias parasitárias em Oestroidea / The infestation by dipterous larvae, known as myiasis, is a major problem in livestock worldwide and can cause severe economic losses. The Oestroidea superfamily is an interesting model to study the evolution of myiasis-causing flies because of the diversity of parasitism strategies among closely-related species in this family. These flies are classified by their feeding habit as saprophagous, obligate parasites or facultative parasites. The parasites in particular can be subdivided into dermal, nasopharyngeal, traumatic/wound and furuncular. With such a diversity of parasitic strategies, we expect that closely-related species have genetic differences that play a role in shaping these habits. Here, we used gene expression and coding sequence data from five species (Cochliomyia hominivorax, Chrysomya megacephala, Lucilia cuprina, Dermatobia hominis and Oestrus ovis) to find genes that may be involved in different parasitic strategies. We tested whether 1,287 orthologs have different expression and evolutionary constrains in different scenarios. By comparing their gene expression profiles, we found two up-regulated genes; one in species causing dermic myiasis that is involved in iron transportation/metabolization (Ferritin), and other in species causing traumatic myiasis that responds to reduced oxygen levels (anoxia up- regulated-like). Our evolutionary analysis showed a similar result. In the Ch. Hominivorax branch, we found different genes, but involved in the same functions that may be evolving under positive selection. This is the first step towards understanding the origins and evolution of the diversity of parasitic strategies in Oestroidea

The study evaluated strategies for induction of ovulation for fixed-time AI (FTAI) in lactating dairy cows submitted to Ovsynch-type protocols initiated after a novel presynchronization strategy. A total of 909 lactating dairy cows from 6 dairy herds were at 36.7 ± 0.28 d in milk, with body condition score of 3.16 ± 0.02 when they underwent presynchronization. On D-15, all cows received an intravaginal progesterone (P4) implant of 1.0 g P4 (new or used) or a used device of 2.0 g P4 and 7 d later (D-8) the P4 implant was removed and cows received 1.0 mg i.m. estradiol cypionate (EC) and 0.530 mg i.m. sodium cloprostenol (PGF). On D0, a synchronization of ovulation protocol for FTAI was initiated and cows were randomly assigned to 1 of 3 experimental groups, that differed only on the strategy to induce ovulation at the end of the protocol. The protocols initiated on D0 with 16.8 &mu;g i.m. of buserelin acetate (GnRH) concomitant with insertion of a 2.0 g (new or used) P4 device. On D6, every cow received 0.530 mg PGF followed by a second PGF on D7, concomitant with P4 device withdrawal. In Group EC, cows received 1.0 mg EC on D7 (time of P4 device withdrawal) as inducer of ovulation. In Group EC/G, cows received EC on D7 and 8.4 &mu;g GnRH administered 16 h before FTAI (56 h after the first PGF). Finally, in Group G, cows only received 8.4 &mu;g GnRH at 56 h after the first PGF. The FTAI was performed on D9 (48 h after P4 device withdrawal) in all experimental treatments and pregnancy diagnosis was performed 31 and 60 d after FTAI. The pregnancy per AI (P/AI) was not different between cows with or without CL on D-15 (44.7 vs. 38.7%) and on D0 (44.3 vs. 37.3), however, cows with CL on D6 had higher P/AI than cows without CL at PGF (45.9 vs. 17.7%). Estrus expression was greater in cows receiving EC compared to cows receiving only GnRH (80.0 vs. 46.1%). Moreover, cows expressing estrus had greater P/AI than cows not showing estrus on d31 (50.8 vs. 34.8) and on d60 (48.5 vs. 27.6%), however, estrus did not affect pregnancy loss. There were no differences between experimental treatments on P/AI on d30 with an overall P/AI of 40.4% (367/909). Pregnancy loss and P/AI on d60 did not differ between treatments. In conclusion, the reproductive program has potential to promote high fertility and the 3 strategies to induce the final synchronized ovulation produced similar fertility. Further research is needed to optimize the presynchronization strategy and to more definitively determine the effect of different methods of ovulation induction on P/AI and in particular on the pregnancy loss after the d30 pregnancy diagnosis. / O estudo avaliou estratégias para induzir a ovulação final em protocolos de IA em tempo fixo (IATF) em vacas leiteiras submetidas a protocolos do tipo Ovsynch iniciados após uma pré-sincronização. Um total de 909 vacas em lactação de seis diferentes fazendas estava com 36,7 ± 0,28 d em lactação e escore de condição corporal de 3,16 ± 0.02 quando iniciaram o protocolo de pré-sincronização. No D-15 todas as vacas receberam um implante de progesterona (P4) de 1,0 g (novo ou usado) ou de 2,0 g (usado), e 7 d após (D-8), o implante de P4 foi retirado e as vacas receberam 1,0 mg i.m. de cipionato de estradiol (CE) e 0,530 mg de cloprostenol sódico (PGF). No D0, iniciou-se o protocolo de sincronização da ovulação para a IATF a as vacas foram aleatoriamente distribuídas em 1 de 3 grupos experimentais, que diferiam somente na estratégia de indução da ovulação ao final do protocolo. Os protocolos se iniciaram no D0 com 16,8 &mu;g de acetato de buserelina (GnRH) concomitante com a inserção de um dispositivo de P4 de 2,0 g (novo ou usado). No D6, todas as vacas receberam 0,530 mg de PGF seguida de uma segunda PGF no D7, concomitante com a retirada do implante de P4. No Grupo CE, as vacas receberam 1,0 mg de CE no D7 (momento da retirada do dispositivo de P4) como indutor de ovulação. No Grupo CE/G, as vacas receberam 1,0 mg de CE no D7 e 8,4 &mu;g de GnRH 16 h antes da IATF (56 h após a primeira PGF). Por último, no Grupo G, as vacas receberam somente 8,4 &mu;g de GnRH no mesmo momento do grupo CE/G. A IATF foi realizada no D9 (48 h após a retirada do implante de P4) em todos os grupos e o diagnóstico de gestação ocorreu 31 e 60 d após a IATF. A prenhez por IA (P/IA) não diferiu entre vacas com ou sem CL no D-15 (44.7 vs. 38.7%) e no D0 (44.3 vs. 37.3), no entanto, vacas com CL no D6 apresentaram maior P/IA do que vacas sem CL na PGF (45.9 vs. 17.7%). Expressão de cio foi maior em vacas que receberam CE do que vacas que receberam somente GnRH (80.0 vs. 46.1%). Além disso, vacas que expressaram cio tiveram maio P/IA no d31 (50.8 vs. 34.8) e no d60 (48.5 vs. 27.6%), no entanto, expressão de cio não afetou perda gestacional. Não houve diferença entre os tratamentos experimentais na P/IA no d31, e a P/IA média foi 40.4% (367/909). Perda gestacional e P/IA aos 60 d não diferiram entres os grupos. Concluímos que o programa reprodutivo tem potencial para promover alta fertilidade e que as 3 estratégias para induzir a ovulação final do programa reprodutivo promoveram fertilidade similares. No entanto, é necessário que seja melhor estudado a interação entre expressão de cio e tratamentos nos parâmetros de fertilidade, assim como, estudar mais a fundo os efeitos dos tratamentos (indutores de ovulação) na fertilidade após o d30 e na perda gestacional.

Orientador: João Pessoa Araújo Júnior / Resumo: O Brasil é o segundo maior produtor de carne bovina do mundo e para se manter competitivo tem objetivado melhorias em higiene e segurança alimentar. Micro-organismos deteriorantes diminuem a vida de prateleira dos produtos e podem viabilizar patógenos em biofilmes predominantemente heterogêneos. Pseudomonas aeruginosa são bactérias mais comuns em carnes, e tem como característica a alta capacidade de produção de biofilme. Sendo ambientais, a contaminação da carne é facilitada por falhas de higiene e boas práticas, sendo relevante estudos sobre a sua presença em produtos cárneos. Neste trabalho, objetivou-se estudar a intensidade de produção de biofilme e sua expressão gênica por cepas de P. aeruginosa isoladas em planta de processamento bovino. As amostras foram obtidas por suabes de carcaças e superfícies em planta de processamento bovino totalizando sete coletas, divididas em dois dias, amostrando-se 22 pontos em cada coleta. Os isolados foram confirmados físico-quimicamente. A produção de biofilme por espectrofotometria classificou a intensidade em fortes, moderadas, fracas e não produtoras. Foram isoladas 32 cepas, das quais 4 demonstraram forte produção de biofilme, 3 moderadas, 4 fracas e 8 não produtoras. Foi predominante a contaminação em carcaças recém abatidas, anteriormente à refrigeração. As amostras foram confirmadas usando o alvo oprL em análise por qPCR, e a comparação da expressão de alginato, algU e algD posteriormente normalizados pelo gene 16S foi realizada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brazil is the second largest beef producer in the world and in order to remain competitive, it has aimed at improving hygiene and food safety. Damaging microorganisms decrease the shelf life of products and may render pathogens viable in predominantly heterogeneous biofilms. Pseudomonas aeruginosa are the most common bacteria in meats, characterized by high biofilm production capacity being environmental, meat contamination is facilitated by good practices hygiene faults being relevant studies on their presence in meat products. The objective of this study was to determine the intensity of biofilm production and its gene expression by strains of P. aeruginosa isolated from a bovine processing plant. Samples were obtained by carcass swabs and surfaces in a bovine processing plant, totaling seven samples, divided in two days, sampling 22 points in each collection. The isolates were physicochemically confirmed. The biofilm production by spectrophotometry classified the intensity as strong, moderate, weak and non-producing. Thirty-two strains were isolated, 4 of which showed strong biofilm production, 3 moderate, 4 weak and 8 non-producing. Contamination was predominant in freshly slaughtered carcass prior to refrigeration. All samples were confirmed in qPCR analysis with the oprL target, and gene expression of strong and weak samples were developmented with alginate genes, algU and algD, normalized by 16S gene. Expression analyzes of the algU and algD genes did not demonstrate s... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Fatores hepatotróficos (FH) possuem a capacidade de promover aumento de massa hepática em ratos e diminuição da fibrose em animais cirróticos. Os FH podem ser importantes nos casos de ressecção e transplantes hepáticos no qual o fígado remanescente necessita de um volume considerável para exercer suas funções após a cirurgia. Objetivou-se neste trabalho avaliar a cinética de uma solução de FH em fígados de animais sadios. Utilizou-se 105 ratos Wistar fêmeas divididos em 7 grupos de 15 animais cada. 6 grupos receberam solução de FH na dose 40 ml/kg/dia, i.p. e 1 grupo controle (CT) recebeu apenas solução salina 0,9%. Os animais foram eutanasiados com 2, 4, 6, 8, 10 e 12 dias (grupos 2, 4, 6, 8, 10 e 12) após o início do tratamento. Avaliou-se os parâmetros biométricos, a proliferação dos hepatócitos pela análise imuno-histoquímica (PCNA), morfometria do colágeno, função hepática e a expressão gênica de colágeno &alpha;I, TGF&beta;1, MMP 2 e PLAU. O aumento de massa hepática foi maior nos grupos 8, 10 e 12. A marcação de hepatócitos PCNA+ obteve seu pico no grupo 2. A morfometria do colágeno (mensurado pelo picrossírius) revelou redução nos grupos 6, 10 e 12 (o Grupo 8 não foi avaliado). A imunofluorescência para colágeno tipo III evidenciou redução do colágeno no grupo 12. Os resultados das enzimas de função hepática permaneceram normais. A expressão gênica do colágeno I obteve alta expressão diminuindo com o decorrer do tratamento; a ação do gene TGF&beta;1 indicou inibição da proliferação celular no grupo 12. MMP 2 e PLAU não demonstraram participar de forma efetiva no mecanismo de ação dos FHs. Os resultados demonstraram que a solução de FH promove a hipertrofia hepatocitária, sem alteração da função hepática e diminuindo o colágeno volumétrico do fígado. Os FH representam uma opção relevante ao tratamento de hepatopatias ou quando é necessário aumento de massa hepática antes de hepatectomias e/ou ressecções. / Hepatotrophic factors (HF) have the ability to the liver mass in rats and decrease fibrosis in cirrhotic rats. HFs can be important in cases of resection and liver transplantation in which the remnant liver needs to restore a considerable mass volume before surgery. Thus, this study evaluates the kinetics of HF solution in the livers of healthy animals. Were used 105 female Wistar rats divided into 7 groups of 15 animals each. 6 groups received HF solution at a dose 40 ml/kg/day, i.p. and 1 control group (CT) only received 0.9% saline solution. The animals were euthanized at 2, 4, 6, 8, 10 and 12 days (groups 2, 4, 6, 8, 10 and 12) after starting treatment. The biometric parameters, proliferation of hepatocytes by immunohistochemical analysis (PCNA), collagen morphometry, liver biochemical function and gene expression of collagen &alpha;I, TGF&beta;1, MMP 2 and PLAU. The increase in liver mass was greater in groups 8, 10 and 12. The index of hepatocytes PCNA+ peak obtained in group 2. Morphometry of collagen (measured by picrosirius red) revealed reduction in groups 6, 10 and 12 (Group 8 was not evaluated). Immunofluorescence for collagen type III showed reduction of collagen in group 12. The results of the enzymes of liver function remained normal. Gene expression of collagen I expression was higher decreasing over the course of treatment; the action of TGF&beta;1 gene showed inhibition of cell proliferation in group 12. MMP 2 and PLAU not shown to effectively participate in the mechanism of action of HFs. The results showed that the solution of HF promotes hepatocyte hypertrophy with no change in liver function and decreasing the volume of liver collagen. Therefore, HFs represents an important option for treatment of chronic liver diseases or when it is necessary to increase liver mass before hepatectomy and/or resections.

Com o advento da tecnologia de microarray, uma grande quantidade de dados de expressão gênica encontra-se disponível. Após a extração das taxas de expressão dos genes, técnicas de formação de clusters são utilizadas para a análise dos dados. Diante da diversidade do conhecimento que pode ser extraído dos dados de expressão gênica, existe a necessidade de diferentes técnicas de formação de clusters. O modelo dinâmico desenvolvido em (Zhao et. al. 2003a) apresenta diversas características interessantes para o problema de formação de clusters, entre as quais podemos citar: a não necessidade de fornecer o número de cluster, a propriedade de multi-escala, serem altamente paralelos e, principalmente, permitirem a inserção de regras e mecanismos mais complexos para a formação dos clusters. Todavia, este modelo apresenta dificuldades em determinar clusters de formato e tamanho arbitrários, além de não realizar a clusterização hierárquica, sendo estas duas características desejáveis para uma técnica de clusterização. Neste trabalho, foram desenvolvidas três técnicas para superar as limitações do modelo dinâmico proposto em (Zhao et. al. 2003a). O Modelo1, o qual é uma simplificação do modelo dinâmico original, porém mais eficiente. O Modelo2, que a partir da inserção de um novo conjunto de elementos no modelo dinâmico, permite a formação de clusters de formato e tamanho arbitrário. E um algoritmo para a clusterização hierárquica que utiliza o Modelo1 como bloco de construção. Os modelos desenvolvidos foram aplicados em dados biológicos, segmentando imagens de microarray e auxiliando na análise do conjunto expressão de genes de St. Jude Leukemia. / With the advent of microarray technology, a large amount of gene expression data is now available. Clustering is the computational technique usually employed to analyze and explore the data produced by microarrays. Due to the variety of information that can be extracted from the expression data, many clustering techniques with different approaches are needed. In the work proposed by (Zhao et. al. 2003a), the dynamical model for data clustering has several interesting features to the clustering task: the number of clusters does not need to be known, the multi-scale property, high parallelism, and it is flexible to use more complex rules while clustering the data. However, two desirable features for clustering techniques are not present: the ability to detect different clusters sizes and shapes, and a hierarchical representation of the clusters. This project presents three techniques, overcoming the restrictions of the dynamical model proposed by (Zhao et. al. 2003a). The first technique, called Model1, is more effective than the original model and was obtained simplifying it. The second technique, called Model2, is capable of detecting different clusters sizes and shapes. The third technique consists in a hierarchical algorithm that uses Model1 as a building block. The techniques here developed were used with biological data. Microarray image segmentation was performed and the St. Jude Leukemia gene expression data was analyzed and explored.

Este trabalho teve como objetivo avaliar os mecanismos envolvidos no aumento da eficácia analgesia da crotalfina (CRF), um peptídeo com atividade tipo opióide, na vigência de inflamação (prostaglandina E2/PGE2) ou lesão tecidual (constrição crônica do nervo isquiático/CCI). A PGE2 (intraplantar), em ratos, aumentou a expressão gênica e protéica de receptores opióides do tipo <font face=\"Symbol\">m e <font face=\"Symbol\">k, no gânglio da raiz dorsal (DRG) e nervo da pata (NP), quando comparado a animais naive. A CCI aumentou a expressão de receptores <font face=\"Symbol\">m e <font face=\"Symbol\">d, no DRG e diminuiu os níveis de receptores <font face=\"Symbol\">k. Embora a PGE2 e CCI, per se, não ativem receptores opióides o CRF e agonistas opióides acarretam maior ativação destes receptores na vigência de sensibilização por PGE2 e CCI. Ainda, o CRF ativa a via das MAPKs (ERK1/2 e JNK), apenas na presença de PGE2, efeito mediado por receptores do tipo <font face=\"Symbol\">k e PKC<font face=\"Symbol\">z. Estes dados mostram que a expressão e ativação de receptores opióides são diferentemente regulados pela injúria aguda ou crônica. / This study aimed to evaluate the mechanisms involved in the increased analgesic efficacy of crotalphine (CRP), an opioid-like peptide, under inflammation prostaglandin E2 (PGE2) and tissue injury (chronic constriction injury/CCI). PGE2 (intraplantar) in rats, increases the genic and proteic expression of <font face=\"Symbol\">m- and <font face=\"Symbol\">k-opioid receptors in the dorsal root ganglia (DRG) and nerve paw (NP), when compared to naïve rats. CCI up-regulates the expression of <font face=\"Symbol\">m and <font face=\"Symbol\">d -opioid receptors in DRG and NP. In contrast, <font face=\"Symbol\">k-opioid receptors were down-regulated by CCI. Although PGE2 and CCI, per se, do not activate opioid receptors, CRP and opioid agonists lead to a higher activation of these receptors in NP slices under PGE2 or CCI sensitization or in DRG cells incubated with PGE2. Moreover, CRP activates ERK1/2 and JNK MAPKs pathways, <font face=\"Symbol\">k-receptor and PKC<font face=\"Symbol\">z-mediated, only when the cells were pre-incubated with PGE2. These data indicate that the expression and activation of opioid receptors are distinctly regulated by the presence of acute or chronic injury.