Diferentes tipos de neurônios possuem formas distintas, um fator importante para a regulação da forma é a expressão gênica. Além disso, esta característica também está relacionada com a conectividade entre as células nervosas, formando redes. Por meio delas ocorrem as dinâmicas, como por exemplo o aprendizado. Neste trabalho foi desenvolvido um arcabouço de modelagem e simulação neuronal, para analisar a integração das etapas desde a expressão gênica, passando pela geração dos neurônios até as dinâmicas, permitindo o estudo do sistema e relacionamento entre as partes. Na etapa de geração, foram utilizados diferentes padrões de expressão gênica. Por meio dos neurônios, foram criadas as redes, caracterizadas utilizando medidas de centralidade. Ademais, foram executadas as dinâmicas integra-e-dispara, que simula a comunicação entre os neurônios, e o desenvolvimento hebiano, que é uma dinâmica aplicada para simular o aprendizado. Para quantificar a influência da expressão gênica, foram utilizadas as medidas de correlação de Pearson e a informação mútua. Por meio destes testes, foi possível observar que a expressão gênica influencia todas as etapas, sendo que nelas, exceto na geração da forma neuronal, os padrões de expressão com que os neurônios foram organizados também são um fator importante. Além disso, na medida de centralidade betweenness centrality, foi possível observar a formação de caminhos, denominados caminhos do betweenness. Para descrever os caminhos, foram feitas comparações entre as redes neuronais e outras redes espaciais. Assim, foi possível observar que estes caminhos são uma característica comum em redes geográficas e estão relacionados com as comunidades da rede. / Different types of neurons have distinct shapes. An important factor for shape regulation is gene expression, which is also related to the connectivity between nervous cells, creating networks. Dynamics, such as learning, can take place in those networks. In this work we developed a framework for modeling and simulating neurons allowing an integrated analysis from gene expression to dynamics. It will allow the study of the system as a whole as well as the relationships between its parts. In the neuron generation step, we used different patterns of gene expression. The networks were created using those neurons, and several centrality measures were computed to characterize them. Moreover, the dynamic processes considered were the integrate-and-fire model, which simulates communication between neurons, and the hebbian development, which is applied to simulate learning. During every step, Pearsons correlation and mutual information between the level of expression was measured, quantifying the influence of gene expression. Through these experiments it was observed that the gene expression influences all steps, which is in all cases, except in the generation of neuronal shape, an important factor. In addition, by analyzing the betweenness centrality measure, it is possible to observe the formation of paths. To study these paths, comparisons between models and other spatial networks were performed. Thus, it was possible to observe that paths are a common feature in other geographical networks, being related to the connections between network communities.

As células-tronco são definidas como células capazes de auto-renovação e diferenciação em células especializadas. Dentre as células-tronco adultas, as mesenquimais ocupam uma posição de destaque. São células multipotentes que podem originar células de origem mesodérmica, como osteoblastos, adipócitos e condrócitos. Além disso, vários estudos demonstraram que essas células também podem se diferenciar em células de origem extra-mesenquimal, como neurônios e hepatócitos, fenômeno este denominado plasticidade. Aspectos moleculares envolvidos com a plasticidade das células-tronco adultas, bem como durante o processo de comprometimento e diferenciação em células especializadas não estão completamente elucidados. Considera-se que as células-tronco expressam, embora em baixos níveis, uma gama diversa de genes relacionados aos diferentes destinos de diferenciação. Durante a diferenciação o repertório de genes expressos seria reduzido, acompanhado do aumento nos níveis de expressão de uma coleção menor de genes que orientariam a especialização celular. Para o presente estudo adotamos essa hipótese e elaboramos um sistema-modelo experimental no qual células-tronco mesenquimais de medula óssea humana foram induzidas in vitro à diferenciação em osteoblastos. As células-tronco mesenquimais foram obtidas de três doadores saudáveis de medula óssea e induzidas quimicamente à diferenciação em osteoblastos (meio -MEM acrescido de dexametasona, ácido ascórbico e - glicerofosfato) durante 24 h, 48 h, 7 dias e 21 dias. O RNA total foi extraído das culturas de células indiferenciadas (0h) e durante o processo de diferenciação (24 h, 48 h, 7 d e 21 d). Todo o processo de diferenciação foi monitorado com ensaios bioquímicos e por imunocitoquímica. Para avaliar a expressão gênica das célulastronco e durante o processo de diferenciação utilizamos a tecnologia dos cDNA microarrays. Os dados foram analisados com auxílio de programas de bioinformática especializados. Um banco público de dados de expressão gênica (GNF Symatlas) também foi consultado, o que nos auxiliou na interpretação dos dados. Sondas de cDNA fluorescentes (Cy3) oriundas das amostras de RNA foram hibridizadas com os cDNA microarrays (4.500 seqüências alvo). Um pool de cDNAs irrelevantes marcados com Cy5 foi usada como referência na hibridização. A expressão gênica diferencial durante a diferenciação foi analisada pelo método SAM (significance analysis of microarrays) (FDR < 5%). Os genes diferencialmente expressos foram classificados segundo sua representação tecidual de acordo com os valores de expressão obtidos do banco de dados GNF Symatlas. Além disso, foi avaliada por RT-PCR semiquantitativa, a expressão de genes relacionados à osteogênese (ALPL, osteocalcina, COL1A1, RUNX2 e osteopontina), e um marcador de adipócitos, PPARG. Observamos que as células-tronco mesenquimais no seu estado tronco expressam, em níveis similares, genes característicos das linhagens osteo e adipocítica. Entretanto, ao longo do comprometimento com a linhagem osteoblástica o número de genes modulados (reprimidos e induzidos) é crescente. Revelamos que nas fases iniciais da diferenciação osteoblástica in vitro os genes que representam células-tronco adultas foram reprimidos. Entretanto, com o avanço do comprometimento com a linhagem osteoblástica observamos que certos genes foram induzidos como, por exemplo, BMP1, SMAD7, IGFBP4, ITGA5, FN1, BGN, CDH8, GDF10 e SCARB2, todos relacionados à osteogênese. Nossos resultados são importantes para um melhor entendimento das bases genético-moleculares associadas ao potencial plástico e de diferenciação das células-tronco mesenquimais. / Stem cells (SC) are defined by their property of self-renewal and differentiation into specialized cells. The adult mesenchymal stem cells (MSC) correspond to a special type of them. MSC are multipotent and can differentiate into several cell types of mesodermal origin, including osteoblasts, adipocytes and condroblasts. Also, their capacity to differentiate into extra-mesenchymal cells, such as neurons and hepatocytes, was demonstrated and this phenomenon was termed plasticity. Nevertheless, the molecular basis of adult SC plasticity, as well during their commitment and differentiation into specialized cells isnt completely elucidated. It was hypothesized that SC express, although at low levels, many genes related to the differentiation cues that they could assume. According to this hypothesis, the repertory of genes is reduced during differentiation, at the same time that upregulating the expression of specialized genes, which characterize the future tissue. In this study, we adopted this hypothesis and to test it we used an in vitro osteogenic differentiation model-system. Mesenchymal stem cells were obtained from bone marrow of three healthy donors and induced to differentiate into osteoblasts in -MEM media supplemented with dexametasone, ascorbic acid and betaglycerol phosphate during 24 h, 48 h, 7 and 21 days. The differentiation process was monitored by biochemical and immunocytochemistry assays. The total RNA was obtained from undifferentiated (0 h) and differentiated cells. To evaluate gene expression during the differentiation, we used the cDNA microarray technology. Fluorescent Cy3 cDNA probes originated from SC RNA samples were hybridized with a cDNA microarray containing 4,500 target sequences. A pool of irrelevant cDNA was labeled with Cy5 and used as reference. The differential gene expression during differentiation was analyzed by SAM (Significance Analysis of Microarrays) method (FDR < 5%). The public gene expression database (GNF Symatlas) was used to annotate the tissue representation of the modulated genes. The expression of some specific genes related to osteogenesis (ALPL, osteocalcin, COL1A1, RUNX2 e osteopontin) and an adipocyte marker (PPARG) was evaluated by semiquantitative RT-PCR. It was observed that MSC in their stem state express, at similar levels, representative genes of the osteo and adipocyte lineages. However, during the osteoblastic differentiation process the number of modulated genes (repressed or induced) increased. It was observed that at early in vitro osteoblastic differentiation, adult SC characteristics genes were downregulated. Conversely, the osteoblastic commitment of these cells displayed upregulation of specific genes related to bone formation (BMP1, SMAD7, IGFBP4, ITGA5, FN1, BGN, CDH8, GDF10 and SCARB2). These results are important to provide a better understanding of the genetic and molecular basis of the plasticity and commitment phenomenon of adult MSC.

Porphyromonas gingivalis é um bacilo anaeróbio Gram negativo envolvido com o início e progressão de doenças periodontais. É considerado um colonizador tardio ou secundário do biofilme oral capaz de aderir a células de Streptococcus gordonii, um colonizador inicial do biofilme dental. Este estudo se propôs a comparar a expressão de genes de amostras de P. gingivalis isoladas de diferentes condições periodontais usando Differential Display (DD) Reverse Transcription PCR, durante a formação de biofilme misto com S. gordonii. O perfil de expressão gênica de células em biofilme (saúde e periodontite) foi comparado, assim como com células planctônicas pareadas. Bandas diferencialmente expressas nas diferentes condições foram clonadas e seqüenciadas, seguida de identificação dos genes em bancos de dados. A confirmação da expressão diferencial dos genes detectados foi realizada através de PCR em Tempo Real. Desses genes, alguns se relacionam com fatores de virulência, outros com obtenção de energia além de genes relacionados com proteínas de membrana e de transporte. / Porphyromonas gingivalis is a Gram negative anaerobic rod involved with the beginning and progression of periodontal diseases P. gingivalis is a late or secondary colonizer of oral biofilms and adhere to cells of Streptococcus gordonii, an early colonizer of dental plaque. This study aim to compare the gene expression of P. gingivalis strains isolated from different periodontal conditions using Differential Display (DD) Reverse Transcription PCR, in a mixed biofilm with S. gordonii. The gene expression profile was determined with biofilm cells (health and disease) and also with their planktonic samples partners. Bands differentially expressed were cloned, sequenciated and analyzed in gene data bank. Differential expression was confirmed by Real Time PCR. Some of the confirmed genes are related to virulence factors, energy metabolism and transport and membrane proteins.

Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.

Os gliomas estão entre os mais freqüentes e fatais tumores do sistema nervoso central. Apesar dos grandes avanços da Medicina nas áreas diagnósticas e terapêuticas, o tratamento desses tumores ainda é, na grande maioria dos casos, paliativo, sendo a extirpação cirúrgica do tumor o único recurso com potencial curativo e, ainda assim, apenas para os gliomas de baixo grau. Neste trabalho, foram analisados os perfis de expressão gênica diferencial entre linhagens de glioma de rato com diferentes graus de tumorigenicidade (linhagens ST1 e P7), visando identificar genes com potencial de aplicação na doença humana como marcadores moleculares e/ou novos alvos terapêuticos. Numa primeira abordagem, foi realizado um rastreamento de genes potencialmente diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7 de glioma de rato através da hibridização de macroarrays de cDNA comerciais. Um conjunto de três membranas comerciais foi hibridizado com alvos radioativos gerados a partir de mRNA obtido destas duas linhagens, totalizando aproximadamente 3.000 genes. Nestes experimentos, foram identificados aproximadamente 200 genes como sendo possivelmente diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7. Os níveis de expressão relativa de cerca de 40 destes genes foram analisados por Northern blot, sendo que seis deles foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem ST1 enquanto que 4 foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem P7. Num segundo momento, foi realizado um rastreamento de expressão gênica em larga escala, através do uso de microarrays de DNA contendo sondas que permitem a análise de expressão de aproximadamente 24.000 transcritos de rato. Esta análise levou à identificação de uma lista contendo aproximadamente 1.300 genes candidatos a diferencialmente expressos, que apresentaram razões de expressão relativa entre 2 e >3.000. Desta lista, -700 genes foram identificados como provavelmente mais expressos na linhagem ST1, e cerca de 500 genes com expressão maior na linhagem P7. A etapa de subseqüente de validação da expressão diferencial foi realizada através de PCR quantitativo em tempo real (Q-PCR). A expressão de 49 genes foi quantificada em quatro preparações independentes de RNA originárias das linhagens ST1 e P7, sendo que 27 destes genes foram identificados como possivelmente diferencialmente expressos através dos microarrays, 10 dos quais haviam sido previamente confirmados por Northern Blot e 12 genes diversos. Destes genes, 21 foram confirmados por Q-PCR como sendo diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7, além daqueles 10 genes cuja expressão diferencial havia sido anteriormente confirmada por Northern. Ao todo, oito genes foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem ST1, e 23 genes o foram como sendo mais expressos na linhagem P7. Vários dos genes confirmados como sendo diferencialmente expressos na linhagem ST1 estão, direta ou indiretamente, relacionados a parada de crescimento e supressão de fenótipo tumoral. Em contrapartida, diversos dos genes confirmados como sendo diferencialmente expressos na linhagem P7 codificam para receptores de fatores de crescimento peptídicos e seus respectivos ligantes. Em particular, foi detectado maior expressão, na linhagem P7, de receptores e Iigantes relacionados ao fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento para fibroblastos (FGFs) e, também, do fatores de crescimento da família de pleiotrofina/midquina (PTN/MDK), e seus respectivos receptores. Sabidamente, vários destes genes estão envolvidos na neoangiogênese e na fechamento de alças autócrinas/parácrinas de estímulo da proliferação tumoral, em particular de gliomas humanos. Além disso, estes achados foram coerentes com o maior potencial tumorigênico (-2,5x) apresentado pela linhagem P7, quando injetadas s.c. no dorso de animais imunocomprometidos (p<O,01). As linhagens ST1 e P7 foram originalmente isoladas como sendo sublinhagens derivadas da linhagem C6, cuja origem é donal. Assim, uma possível interpretação para as diferenças marcantes dos perfis de expressão detectadas entre as linhagens ST1 e P7, é de que estas diferenças sejam, mais provavelmente, a conseqüência de algumas poucas alterações moleculares em genes-chave, e não de alterações extensas do genoma celular, uma vez que as duas linhagens têm, a priorí, o mesmo \"background\" genético. Assim, um número limitado de aberrações genéticas adicionais, particulares de cada linhagem, seria suficiente para uma modificação substancial dos perfis de expressão gênica, se os genes alterados forem capazes de modular a expressão de vários outros genes. Na busca de indícios que fortalecessem esta hipótese, foi quantificado, em seis linhagens humanas de glioma, a expressão dos mesmos genes cuja expressão foi originalmente quantificada nas linhagens ST1 e P7. Em seguida, foram realizados testes de correlação em pares (Teste de Pearson) entre os níveis de expressão relativos destes genes para as seis linhagens, buscando identificar conjuntos de genes que apresentassem expressão coordenada, que, por sua vez, sugeririam a existência de possíveis relações regulatórias entre os mesmos. Foi possível observar expressão significativamente correlacionada de seis genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN, PTPRZ1 e SCG2), sugerindo uma possível co-regulação recíproca entre diferentes vias de fatores de crescimento e/ou um novo fator remodelador de cromatina (CHD7). Pararelamente, o gene CHD7 foi, por sua vez, identificado como um novo fator remodelador de cromatina putativo, cujo cDNA completo pode ser amplificado, com êxito, através de RT-PCR longo. A expressão destes mesmos seis genes foi quantificada, por Q-PCR, em 64 amostras clínicas de glioma e cérebro humano não-tumoral. Com exceção do gene SCG2, os demais cinco (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN e PTPRZ1) são significativamente mais expressos em todos os graus de glioma, quando comparados com cérebro humano não-tumoral (p<0,05). Foi possível verificar, inclusive, que os níveis de expressão de vários destes genes estão altamente correlacionados nessas amostras. Em particular, observou-se correlação com alta significância entre os genes CHD7xPDGFRA (p=4,7x10-17), FGF1 xPTN (p=1, 1x10-19), do receptor PTPRZ1 contra todos os demais genes (100-6<p<10-9) e, especificamente, contra seu Iigante PTN (p=1,6x10-14). Como os loci dos genes PTN e PTPRZ1 se encontram relativamente próximos (-15 Mb) numa região do cromossomo 7 humano, a qual frequentemente se encontra amplificada em gliomas humanos (7q), é possível que estes dois genes, codificantes para um fator de crescimento e seu respectivo receptor, façam parte de um novo amplicon em gliomas humanos. Além disso, vários genes com maior expressão na linhagem P7 (ALK, FGFR1, RNF130 e ROS01) estão, também, significativamente mais expressos em certos graus de gliomas humanos, quando comparados com tecido cerebral humano não-tumoral. De um modo geral, estes dados indicam que foi possível obter, a partir de linhagens de glioma de rato, incursões aplicáveis para um entendimento mais amplo da biologia que envolve a patogênese da doença humana. Um destes dados extrapoláveis entre diferentes modelos inter-espécies é que a co-expressão de múltiplas vias autócrinas de crescimento parece ser um achado comum tanto em modelos experimentais de glioma em rato quanto em linhagens e amostras clínicas de gliomas humanos, e que estas vias estão, potencialmente, interconectadas ao nível transcricional. Além disso, foi possível verificar que um novo gene codificante para um fator de remodelamento de cromatina (CHD7), apresenta níveis de expressão relativos muito aumentados em amostras clínicas de glioma, quando comparado com cérebro humano não-tumoral. Analisados em conjunto, os resultados obtidos aqui têm o potencial para conduzir ao desenvolvimento racional de novas estratégias terapêuticas e diagnósticas/prognósticas para gliomas humanos. A análise do papel funcional destes genes em glioma, e das vias moduladas por seus produtos, se constituirá de um passo fundamental para o estabelecimento destes genes como potenciais novos alvos terapêuticos e/ou marcadores moleculares. / Gliomas are among the most frequent and fatal tumors of the central nervous system. Despite the recent and important advances in the diagnostic and therapeutic fields, treatment of these tumors still is, in the vast majority of the cases, palliative. Surgical ressection of the tumor remains as the sole potentially curative resource, but only for the low grade gliomas. In the present work, differential gene expression profiles were analyzed between rat glioma cell lines differing in tumorigenic potential (ST1 and P7 cell lines), aimed at identifying genes with potential to become novel molecular markers and therapeutic targets for the human disease. As a first approach, a commercial macroarray-based screening was undertaken in order to identify differentially expressed genes between ST1 and P7 rat glioma cell lines. Three different sets of commercial membranes comprising 3,000 genes were hybridized against radiolabeled targets that were synthesized from mRNA extracted from both cell lines. As a result, near 2,000 genes were identified as being possibly differentially expressed between ST1 and P7 celllines. The relative expression levels of 40 genes from this list were analyzed by Northern blot, and six genes were successfully confirmed as being expressed at higher levels in the ST1 cell line, whereas four genes confirmed heightened expression in P7 cells. As a second approach, a large-scale, Affymetrix microarray-based screening was performed, which allowed measuring the relative expression levels of about 24,000 rat transcripts. This analysis led to the identification of 1,300 candidate differentially expressed genes, for which the differential expression ratios ranged from 2 up to >3,000. From these, -700 genes displayed preferential expression in the ST1 cell line, while around 500 genes were more expressed in P7 cells. The following step, namely, validation of the differential expression, was achieved through Real-Time PCR (Q-PCR). Expression levels of 49 genes were measured in four independent RNA preparations from ST1 and P7 cell lines. About 27 of these genes were identified as putative differentially expressed , 10 of which had previously been confirmed by Northern blot as differentially expressed and 12 additional genes were also included. From this list, 21 genes were confirmed by Q-PCR as being diferentially expressed between the ST1 and P7 cell lines, in addition to those 10 whose differential expression was confirmed by Northern Slol. In total, eight genes were confirmed as being differentially expressed in the ST1 cell line, and 23 genes were confirmed as being expressed at higher leveis in the P7 cells. Many of the genes confirmed as being differentially expressed genes in the ST1 cell line are, directly or indirectly, related to growth arrest and suppression of the malignant phenotype. On the other hand, several of the genes displaying elevated expression in the P7 cell line code for growth factor ligands and receptors related to the PDGFs (platelet-derived growth factors), FGFs (fibroblast growth factors) and PTN/MDK (pleiotrophin/midkine) growth factor families. Many of these genes are already known as being related to neoangiogenesis and to the establishment of autocrine/paracrine loops in human gliomas. In addition, these findings are in keeping with the significantly higher (p<O.01) tumorigenic potential displayed by the P7 cellline (-2,5x), when both cell lines are injected s.c. in the dorsal region of immunodeficient nude mice. Moreover, ST1 and P7 celllines were originally isolated as clonal celllines from the C6 cell line which, in turn, is also acionai cell line. Therefore, a possible interpretation for the remarkably different gene expression profiles between ST1 and P7 cell lines is that those differences are, most Iikely, a consequence of a few molecular defects in key/master genes, rather than extensive aberrations of the cellular genome, given that those celllines have, a priori, similar genetic backgrounds. Thus, a limited number of genetic aberrations, characterisitic of each cell line, would be sufficient for a substantial modification of the gene expression profiles, provided that the altered genes are able to modulate the expression of each other. In an attempt to investigate theis point, the relative expression levels of the same genes were analyzed by Q-PCR, and pairwise correlation tests (Pearson correlation tests) were performed using expression data from the six human glioma cell lines, aimed at identifying gene sets that displayed coordinate expression whichwould suggest the existence of putative regulatory loops among them. It was possible to identify a c1uster of six genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN, PTPRZ1, SCG2) that displays coregulated expression, thus suggesting a possible reciprocal co-regulation among distinct growth factor pathways and a putative chromatin remodeling factor (CHD7). Furthermore, the CHD7 gene was identified as a novel, putative chromatin remodeling factor, and its full-Iength cDNA could be successfully amplified by means of long RTPCR. The expression levels of the same genes was quantified, by Q-PCR, in 64 clinicai samples, comprising gliomas and non-tumoral human brain tissue samples. Except for the SCG2 gene, the remaining five genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN and PTPRZ1) were expressed at significantly higher levels in glioma samples of all grades, when compared to non-tumoral human brain tissue samples (p<O.05). Likewise, we were able to verify that expression levels for many of these genes are strictly correlated in those samples. A particularly high levei of significance was found for the correlation of expression levels between CHD7xPDGFRA (p=4.7x10-17) and also for the FGF1xPTN gene pair (p=1.1x10-19). A strikingly high level of significance (p=1.6x10-14) was also found for the expression levels between the PTPRZ1 receptor and its PTN ligand. Given that the PTN and PTPRZ1 loei are relatively close to each other (-15 Mb) on the long arm of human chromosome 7, which, in turn, is frequently amplified in human gliomas, the genomic region including these two genes may well constitute a novel amplicon in human gliomas. In addition, several other genes with higher expression in the P7 cell line (ALK, FGFR1, RNF130 and ROB01) are also expressed at significantly higher levels in certain glioma grades, when compared to non-tumoral human brain tissue samples. Overall, these data indicate that starting from the rat glioma cell lines model, it was possible to obtain, insights applicable to a better understanding of the biology underlying the pathogenesis of human gliomas. Thus, co-expression of multiple autocrine loops seems to be a commonplace in the rat experimental glioma models as well as in the human glioma cell lines and in clinicai samples, where these pathways are potentially interconnected at the transcriptional leveI. Furthermore, we were able to detect increased mRNA expression levels of a novel putative chromatin remodelling factor (CHD7) in human glioma tissue samples, when compared to non-tumoral human brain tissue samples. Taken together, the results obtained in this work may potentially lead to the rational development of novel therapeutic, diagnostic and prognostic strategies for human gliomas. Functional analysis of these genes in glioma, and the pathways modulated by their products, will be a fundamental step for the establishment of these genes as potentially novel therapeutic targets and/or molecular markers.

Introdução: A periodontite é uma doença inflamatória crônica, de alta prevalência na população, que causa perda dentária. A progressão da doença ocorre por meio de surtos, com períodos de remissão e exacerbação. A análise da expressão gênica de lesões ativas na progressão das doenças periodontais pode demonstrar diferenças na resposta do hospedeiro e indicar processos relacionados à atividade destrutiva da doença. Metodologia: Foram selecionados 54 pacientes, sendo 18 com Doença Periodontal Agressiva (DPA), 25 com Doença Periodontal Crônica (DPC) e 11 com ausência de Doença Periodontal (Controle). Medidas clínicas de profundidade de sondagem (PS), nível de inserção relativo (NIR), sangramento à sondagem (SS) e índice de placa (IP) foram obtidas em dois tempos: inicial e após tratamento na reavaliação com dois meses. Nos pacientes com Doença Periodontal (DP), os sítios que apresentaram perda de inserção de um ou mais milímetros foram considerados ativos e os demais, não ativos. O perfil de expressão gênica, de sítios ativos e não ativos, foi obtido pela análise de biópsias gengivais com o Real Time PCR Array. Resultados: Após o tratamento periodontal não cirúrgico, houve melhora significante em todos os parâmetros clínicos (PS, SS, IP; p<0,05) exceto para o NIR (p>0,05). Dos 5112 sítios tratados, aproximadamente 4% apresentam perda de inserção mesmo após o tratamento com ou sem uso de antibiótico. As doenças DPA e DPC demonstraram diferentes perfis de expressão gênica, com sítios ativos apresentando um padrão significantemente up-regulated em relação aos sítios não ativos. Conclusão: A DPA e a DPC são condições clínicas que apresentam diferenças na resposta imune e a atividade destrutiva da lesão periodontal ativa pode ser reconhecida por um padrão inflamatório up-regulated de resposta. Considerando-se as diferenças observadas, abordagens terapêuticas individualizadas e capazes de modular a resposta poderiam potencializar o efeito benéfico da terapia anti-infecciosa e reduzir o número de sítios ativos da DP progressiva. / Aim: Evaluate the gene expression profile under healthy and periodontal disease conditions; identify possible differences in the gene expression profile between chronic and aggressive periodontal diseases; seek evidences of immune regulation differences in active and non active sites during periodontal destruction. Methods: Clinical parameters of probing depth, relative attachment level, bleeding on probing and plaque index were obtained in two stages: initial and two months. The sites that showed attachment loss 1mm were considered active and others non-active. The gene expression profile of active and non-active sites, was obtained by gingival biopsies analysis with Real Time PCR Array. Results: After non-surgical periodontal treatment, significant improvement in all clinical parameters were achieved (P <0.05), except for the relative attachment level (p> 0.05). The disease showed different gene expression profiles with active sites showing a pattern significantly up-regulated compared to non-active sites. Conclusion: Aggressive and Chronic Periodontitis are clinical conditions that showed differences in the immune response profile and that the progressive periodontal lesion can be recognized by an up-regulated inflammatory response. Considering the observed differences, it is possible that individualized therapeutic approaches that modulate the inflammatory response might enhance the efficacy of the anti-infective therapy and reduce active sites number after treatment.

HIPK2 (homeodomain interacting protein kinase 2) é uma proteína quinase nuclear, originalmente identificada por interagir com homeoproteínas. Sua atividade quinase contribui para a regulação de diversas vias, ativando o programa de morte celular em resposta a estímulos externos ou promovendo diferenciação celular por atuar como co-fator de homeoproteínas. A extensa similaridade estrutural com as outras proteínas da mesma família, HIPK1 e HIPK3, sugere que as três HIPKs possuem funções redundantes. Este trabalho pretendeu contribuir para a elucidação das funções de HIPK2 avaliando a expressão desta durante o desenvolvimento em camundongo. Observou-se ampla distribuição do transcrito desde o dia 9.5 pós-coito (dpc). Com o progresso do desenvolvimento, a expressão passou a se concentrar principalmente em tecidos nervosos, sugerindo uma participação de HIPK2 na morfogênese destes. Além disso, foi desenvolvido um sistema in vitro para se avaliar as funções de HIPK2 humana. A inibição de HIPK2 por RNAi em cultura celular humana levou ao aumento de expressão de genes HIPKs, indicando que possa haver um mecanismo de controle transcricional que ajuste os níveis de proteínas HIPKs na célula. O silenciamento de HIPK2 também provocou aumento de expressão de alguns genes homeobox avaliados, sugerindo que HIPK2 possa reprimir a expressão destes genes em humanos. A análise global de expressão gênica e proteômica nas células deficientes para HIPK2 poderá indicar as diferentes vias de atuação desta proteína. / HIPK2 is a nuclear protein kinase, originally identified because of its interaction with homeoproteins. Its kinase activity can regulate several pathways, triggering the apoptotic program in response to external stimuli or promoting differentiation by acting as a cofactor for homeoproteins. The extensive similarity with the other two proteins from the same family, HIPK1 and HIPK3, suggests that HIPKs have redundant functions. This work tried to contribute to the body of knowledge regarding the functions of HIPK2 addressing its expression during the mouse development. The transcript is broadly expressed in mouse embryos from day 9.5 post-coitum. As development progresses, its expression concentrates mainly in neural tissues, suggesting a role of HIPK2 in its morphogenesis. In addition, an in vitro system was developed to study HIPK2 functions in human cells. The HIPK2 silencing by RNAi in human cell culture led to a raise in expression of the other HIPKs genes, indicating that there might be a transcriptional mechanism controlling HIPKs proteins levels in the cell. HIPK2 inhibition also caused an increase in expression of some homeobox genes, suggesting that HIPK2 can negatively regulate their expression in humans. A global approach of gene expression and proteomics analysis in the HIPK2 deficient cells will help to identify different pathways in which HIPK2 participates.

Nesta dissertação consideramos um o modelo para um gene como sendo um sistema de dois estados, tipo spin, e apresentamos um modelo estocástico para a expressão gênica. As soluções estacionárias e, também, as dependentes do tempo, para o processo de transcrição, são obtidas e as distribuições de probabilidade, que descrevem o estado funcional do gene, são calculadas analiticamente. O valor médio e o ruído transcricional na população de mRNA são analisados. O efeito do ruído transcricional na síntese proteica é contemplado acoplando-se os processo de transcrição e tradução. / In this dissertation we present a two state stochastic model, spin-like, for gene expression. The steady-state solutions and also the time-dependente solutions for the transcription are probed and the probability distribution functions, which describe the functional state of the gene, are exactly calculated. The mean value and the transcriptional noise in the mRNA population are analyzed. The effects of the transcriptional noise in the protein synthesis are contemplated by coupling the transcription and the translation.

Abelhas adultas produzem vitelogenina, a principal proteína da hemolinfa. Ela está envolvida na reprodução, comportamento, imunidade, longevidade e regulação da organização social. A interferência por RNA interference é a mais promissora ferramenta para estudos de função gênica, baseada na introdução de duplex de RNA (dsRNA) que induz a degradação de transcritos alvo-específicos. Injeção de dsRNA altera a transcrição de vitelogenina, mas evidências apontam que a ativação do sistema imune em abelhas seja um efeito colateral destaa manipulação. Desenvolvemos um método para o silenciamento do gene codificador de vitelogenina no desenvolvimento pós-embrionário, que minimiza os efeitos da manipulação, onde 0,5 ?g de dsRNA de vitelogenina (dsVg) ou de GFP (controle exógeno, dsGFP) foi oferecido na dieta natural de larvas de segundo estágio, as quais foram mantidas na colônia. Nosso enfoque principal foi a compreensão dos efeitos do silenciamento pós-transcricional de rainhas e operárias de A. mellifera, em especial na fase larval. Operárias adultas reconhecem larvas tratadas e as remove. Mantemos certa distância entre as células de cria que recebiam o tratamento e a remoção de larvas tratadas diminuiu consideravelmente. A expressão de transcritos de vitelogenina em indivíduos sem tratamento e tratados foi analisada no quinto estágio larval de ambas as castas, bem como em operárias adultas de 7 dias e rainhas recémnascidas, utilizando-se PCR em tempo real e a expressão do gene codificador de actina como controle endógeno. Em adultos, controles sem tratamento e dsGFP expressaram quantidades similares de transcritos de vitelogenina. Os grupos alimentados com dsVg tiveram expressão reduzida de vitelogenina, a saber: quinto estágio larval de operárias (91%) e de rainhas (71%), operárias de 7 dias (88%) e rainhas recém-nascidas (70%). O silenciamento da vitelogenina não afetou a morfologia dos adultos, mas sim a fisiologia de larvas de ambas as castas, como nos títulos de hormônio juvenil e concentração de proteínas circulantes na hemolinfa. Concluímos que a ingestão de dsRNA é um método não-invasivo que induz silenciamento gênico e, assim, uma ferramenta eficiente para estudos funcionais pós-genoma. Os mecanismos regulatórios do gene codificador de vitelogenina e seu papel na diferenciação de castas estão em discussão. / Adult bees produce vitellogenin (Vg), the main protein in hemolymph; it is involved in honey bee (Apis mellifera) reproduction, behavior, immunity, longevity and regulation of social organization. Genetic interference mediated by injection of double-stranded RNA (dsRNA) is a powerful tool for the analysis of gene function in Apis mellifera. Injection of dsRNA effectively alters vitellogenin transcription; however, evidence has been found of immune system activation in treated bees, which could be a collateral effect of treatment. Consequently, we developed a non-invasive protocol for disruption of the A. mellifera genes exemplified by vitellogenin mRNA silencing, to understand it, mainly, in the female larval context. Second instar larvae were treated as follows: the treatment group received 0,5 ?g of double-stranded vitellogenin RNA (dsVg) mixed with larval food deposited in the worker brood cells; control group 1 was left to develop without treatment, while control group 2 received dsGFP (Green Fluorescent Protein), as an exogenous control. Treated and control larvae were maintained in the colony until adult emergence. Workers recognized dsRNAtreated larvae and frequently removed them. To circumvent this problem we increased the distance between the treatment groups. Vg gene expression were determined for fifth instar larvae of both castes and for 7 day-old workers and newly-emerged queens, evaluated by quantitative real time PCR, using actin as an endogenous control. For adults, we found that controls, dsGFP- and non-treated bees expressed similar amounts of Vg transcripts. The dsVg-fed groups had significantly reduced Vg gene expression in fifth instar larvae of workers (91%) and queens (71%) and, also, in 7 day-old workers (88%) and newly-emerged queens (70%). Disruption of the Vg gene did not affect adults morphology but physiological larval traits of both castes, as juvenile hormone titre and protein concentration. We conclude that dsRNA ingestion is an effective non-invasive method for inducing knockdown and an efficient approach for post-genome functional studies. The regulatory mechanisms of vitellogenin gene and its rules during caste differentiation are discussed.

Neste trabalho caracterizou-se a família das nucleotídeo pirofosfatases/ fosfodiesterases do parasita S. mansoni visando avaliá-los como antígenos vacinais. O parasita possui quatro proteínas desta família (SmNPP-5a, SmNPP-5b, SmNPP-5c e SmNPP-6), sendo que duas delas possuem maior expressão gênica nos estágios que infectam o homem. Dos anticorpos produzidos, apenas o anti-SmNPP-5a apresentou especificidade para a proteína nativa e utilizando-os demonstrou-se que a SmNPP-5a é uma glicoproteína associada às membranas do tegumento dos vermes adultos. Também se verificou que esses anticorpos inibiram parcialmente a atividade da enzima em parasitas vivos. Assim avaliamos a SmNPP-5a recombinante como antígeno vacinal juntamente com uma apirase (SmATPDase) e com a fosfatase alcalina (SmAP), outras duas nucleotidases presentes no tegumento de parasitas adultos. A SmNPP-5 e a SmNTDPase apresentaram menor imunogenicidade que a SmAP. Porém só verificamos a redução da carga parasitária em animais imunizados com a SmAP e tratados com doses subcurativas de praziquantel. / In this work the family of nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (NPP) from S. mansoni was characterized in order to evaluate them as vaccine antigens. The parasite has four proteins of this family (SmNPP-5a, SmNPP-5b, SmNPP-5c and SmNPP-6), whereas two of them present higher gene expression in stages that infect humans. Only anti-SmNPP-5a anitbodies showed specificity for the native protein. We use them to characterize SmNPP-5a as a glycoprotein associated with tegument membranes from adult worms. It was also found that these antibodies were able to partially inhibit the activity of the enzyme in live parasites. Thus we evaluated SmNPP-5a as recombinant vaccine antigen together with an apyrase (SmATPDase) and alkaline phosphatase (SmAP), two other nucleotidases involved in nucleotide metabolism and present in the tegument of adult parasites. SmNTDPase and SmNPP-5 were less immunogenic than SmAP. However, we only verified the reduction of parasite burden in mice immunized with SmAP, when the animals also received a subcurative treatment with praziquantel.