Com o objetivo de analisar a expressão diferencial de genes em cepas de Trypanosoma cruzi pela técnica de microarranjos de DNA, construímos um protótipo de lâminas contendo 710 etiquetas de seqüências transcritas (ESTs) de epimastigotas de CL Brener e 20 genes de várias cepas do parasita. A seqüência nucleotídica estava disponível para 576 ESTs. Desta forma, seqüenciamos as 134 ESTs restantes e sua seqüência foi depositada no dbEST do GenBank. O agrupamento das sondas indicou que a lâmina continha 665 seqüências únicas. Inicialmente, avaliamos o microarranjo para a análise de genômica comparativa entre as cepas CL Brener (T. cruzi II) e Silvio (T. cruzi I). Um total de 4 hibridizações foram realizadas. Verificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01 no teste-t) que 31 seqüências do microarranjo (4,3%) apresentaram maior sinal de hibridização com o DNA de CL Brener, enquanto 37 sondas (5,0%) apresentaram situação inversa. Esse resultado sugere diferenças no número de cópias gênicas e/ou variação na similaridade das seqüências. Várias sondas com hibridização diferencial foram confirmadas em experimentos de Southern blot com DNA genômico dos dois isolados. Em seguida, o microarranjo foi avaliado para a análise da expressão diferencial de genes. Para isto, a lâmina foi hibridizada com cDNA de formas epimastigotas (fase midlog de crescimento) de CL Brener e Silvio. Um total de 8 experimentos de hibridização foi realizado com preparações de RNA obtidas de três cultivos independentes. Identificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01), 84 sondas (84/730; 11,5%) diferencialmente expressas: 35 sondas mais expressas em Silvio e 49 sondas mais expressas em CL Brener. Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. A comparação dos dados dos experimentos de hibridização do microarranjo com DNA e cDNA das duas cepas permitiu concluir que não há uma correlação direta entre a abundância de determinado ene e seu nível de expressão. Em alguns casos, observamos que seqüências com maior hibridização com o DNA de uma cepa são mais expressas na outra. Visando iniciar os estudos de expressão diferencial de genes em cepas isoladas de pacientes chagásicos, escolhemos as cepas Famema e Hem 179 (T. cruzi II), isoladas, respectivamente, de um paciente com a forma indeterminada da doença de Chagas e de um paciente com alterações cardíacas e digestivas. Observamos que aproximadamente 2,5% (18/730) das sondas apresentaram expressão diferencial nas formas epimastigotas das duas cepas e que 9,0% (65/730) das sondas mostraram razões de hibridização diferente nas formas infectantes (tripomastigotas metacíclicos). Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. Entre as sondas mais expressas em Hem 179, está a seqüência que codifica a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7). O conjunto de dados permitiu concluir que microarranjos contendo predominantemente ESTs de CL Brener são uma ferramenta útil para estudos de genômica comparativa, análise de expressão gênica em isolados de T. cruzi, bem como para a descoberta de novos genes. Além disto, este estudo indicou uma regulação pós-transcricional intensa dos níveis de RNA em T. cruzi. Ampliamos os estudos para um maior número de cepas e construímos outro microarranjo contendo 710 ESTs de CL Brener (forma epimastigota), 45 ESTs da cepa Tulahuen (forma amastigota) e 32 genes de várias cepas do parasita. As 787 seqüências representam 714 seqüências únicas. O RNA total foi isolado de formas epimastigotas de cepas de três pacientes com a forma cardíaca (cepas 115, B13 e 147), e de três pacientes assintomáticos (cepas VL10, Famema e Berenice 62). Cinco da seis cepas são de regiões endêmicas de Minas Gerais (exceto Famema que é do estado de São Paulo). Após hibridização competitiva, a análise estatística dos dados indicou expressão diferencial de 14 sondas (14/787; 17,7%) entre os dois grupos de cepas. Destas, 9 sondas estão induzidas em todas as cepas isoladas de pacientes cardíacos e 4 sondas estão reprimidas em todas as cepas de cardíacos quando comparadas com as cepas de assintomáticos. Dentre as sondas mais expressa em cepas de cardíacos estão: as ESTs que codificam a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7), a aspartato aminotransferase, enzima importante no processo de regeneração de metionina, e a triparedoxina peroxidase de T. cruzi, envolvida na resistência a peróxidos exógenos. Também foram reveladas 8 ESTs que não apresentam similaridade em bancos de dados. Parte destas sondas foi confirmada por Northern blot com RNA total de todas as cepas. Em alguns casos, identificamos diferenças do tamanho de transcritos entre as cepas. Em resumo, a análise da expressão diferencial de genes em cepas de pacientes com a forma cardíaca e indeterminada da doença de Chagas permitiu identificar alguns genes que podem estar relacionados à patogênese e/ou serem usados como alvo para o prognóstico da evolução doença. Posteriormente, realizamos um experimentos-piloto para investigar a resposta transcricional de fibroblastos humanos em cultura à infecção com duas cepas de T. cruzi: VL10 (isolada de indivíduo assintomático) e 147 (isolada de indivíduo com cardiopatia severa). Após 24 horas de infecção, os RNAs das monocamadas foram extraídos. No mesmo período, RNA foi extraído de fibroblastos humanos não infectados e usado como referência. Experimentos de hibridização competitiva foram realizados em lâminas de microarranjo contendo oligonucleotídios derivados de 24.000 genes humanos, construídas o Laboratório de Tecnologia Molecular do Instituto Nacional do Câncer do NIH, em Frederick, EUA chefiado pelo Dr. David Munroe. Identificamos 28 sondas diferencialmente transcritas nas células infectadas com a cepa 147 (paciente cardíaco). Destas, 27 sondas (27/28; 96,4%) estão com expressão reduzida nas células infectadas. Por outro lado, apenas uma sonda, correspondente ao gene da \"heme oxigenase (decycling) 1\", apresentou indução nas células infectadas com 147. Na infecção de células com a cepa VL10, encontramos 17 sondas diferencialmente transcritas. Destas, 16 sondas (16/17; 94,1 %) estão com expressão aumentada nas células infectadas (dentre elas, a heme oxigenase), enquanto que apenas uma sonda (proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina) mostra situação inversa. Concluímos que as diferenças de resposta da mesma célula hospedeira à infecção pelas duas cepas são marcantes, o que determina um estudo temporal ao longo da infecção para a confirmação das observações acima. Comprovamos por PCR em tempo real o aumento da expressão da heme oxigenase na infecção pelas duas cepas e repressão da expressão da proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina apenas em células infectadas por VL10. / To investigate differential gene expression in Trypanosoma cruzi strains by microarray DNA technology, we have constructed a prototype slide that contains 710 expression sequence tags (ESTs) of CL Brener epimastigotes and 20 genes of various parasite strains. The nucleotide sequence was available for 576 ESTs. Therefore, we have sequenced 134 additional ESTs and the sequences have been deposited in dbEST of GenBank. Clustering of these probes indicated that slide contains 665 unique sequences. Initially, we have evaluated the microarray for comparative genomic analysis between CL Brener (T. cruzi II) and Silvio (T. cruzi I) strains. Four independent experiments were performed. We verified that 31 probes (4.3%) showed statistical significant (P≤, 0.01 in t-test) higher hybridization with CL Brener DNA, whereas 37 probes (5.0%) showed the inverse situation. This suggests differences in the abundance of the genes in the genomes of the strains and/or variation in sequence similarity. Some of these probes were confirmed by Southern blot with genomic DNA of both strains. Next, we evaluated the microarray for the analysis of differential gene expression. For this purpose, the slide with hybridized with cDNA obtained from epimastigote forms in mid-log growth phase of CL Brener and Silvio strains. A total of eight hybridization experiments were perfonned with RNA preparations obtained from three independent parasite harvests. We identified 84 probes (841730; 11.5%) that showed statistically significant changes (P≤, 0.01 in t-test) in expression: 35 probes up regulated in Silvio and 49 probes up regulated in CL Brener. Some of these probes were confirmed by Northern blot. When we compared the data of the hybridization of the microarray with genomic DNA and cDNA of CL Brener and Silvio, we verified no correlation between the putative abundance of a particular gene and its expression level. In a few cases, we noticed that sequences with higher hybridization with genomic DNA of one strain were more expressed in the other. In an initial attempt of investigate differential gene expression in human T. cruzi isolates, we selected the strains Famema and Hem 179 (both T. cruz II), obtained, respectively, from an asymptomatic individual and from a patient with severe cardiopathy and digestive disorders. Differential expression of 2.5% (181730) and 9.0% (651730) of the probes was observed, respectively, in epimastigotes and metacyclic trypomastigotes of the two strains. Some of the probes were confirmed by Northern blot. Among the probes more expressed in Hem 179 is the gene encoding subunit 7 of theNADH dehydrogenase (ND7). We concluded that microarrays, containing predominantly ESTs of CL Brener, are a powerful tool for comparative genomics and gene expression analyses in T. cruzi as well as for discovery of new genes. In addition, this study has provided further evidence for a high level of post-transcriptional regulation of RNA abundance in T. cruzi. We have extended the analysis to a larger number of strains and constructed a new set of microarray slides, which contain 710 ESTs of CL Brener epimastigotes, 45 ESTs Tulahuen strain amastigotes and 32 characterized genes of various strains. These probes represent 714 unique sequences. Total RNA was extracted from mid-log phase epimastigotes of three strains isolated from patients with cardiac disorders (115, B13 and 147) and three strains from asymptomatic patients (VL10, Famema and Berenice 62). Five of these strains are from endemic areas of Minas Gerais (except Famema that is from the state of São Paulo). After competitive hybridization with the microarray, statistical analysis of the data indicated differential expression of 14 probes (14/787, 17.7%) between the two groups of strains. Among these sequences, 9 probes are up regulated in all the strains from cardiac patients and 4 probes are down regulated in all these strains as compared with all the strains isolated from asymptomatic individuals. Among the probes up regulated in the strains from cardiac patients there are ESTs encoding subunit 7 of the NADH dehydrogenase (ND7); aspartate aminotransferase, key enzyme in the methionine regeneration process; and T. cruzi tryparedoxin peroxidase, an important enzyme for resistance to exogenous peroxides. Eight ESTs with no similarity matches in databases were also disclosed. Some of these probes were confirmed by Northern blot assays with RNA of all the strains. In some cases, we noticed differences of the molecular size of the transcripts among the strains. In summary, the analysis of differential gene expression in strains isolated from human chagasic patients with the cardiac and indeterminate forms allowed the identification of some potential genes that may be related to pathogenesis and/or may be used as targets for prognosis of the evolution of Chagas disease. Subsequently, we performed a pilot experiment to investigate the transcriptional response of human fibroblasts in culture to the infection by two T. cruzi strains: VL10 (isolated from an asymptomatic patient) and 147 (isolated from a patient with severe cardiomyopathy). After 24 hours of infection, total RNA was extracted from the infected monolayers. In the same period, RNA was extracted from not infected human fibroblasts, and used as a control. Competitive hybridization experiments were performed in microarray slides containing oligonucleotides representing 24,000 human genes, constructed in the Laboratory of Molecular Technology of the National Institute of Cancer of N1H, in Frederick, EUA headed by Dr. David Munroe. We identified 28 probes differentially transcribed in cells infected with 147 strain. Of these, 27 probes (27/28; 96.4%) were down regulated in the infected celIs, and only one probe, corresponding to the heme oxygenase (decycling) 1 gene, showed up regulation. For the fibroblast infected with VL 10 strain, we found 17 probes differentially transcribed. Of these, 16 probes (16/17; 94.1%) were up regulated (among these probes there is the heme oxigenase sequence), and only one probe (insulin-like growth factor binding protein 5) showed the inverse situation. We concluded that there are drastic differences in the response of the same cell line to the infection by two parasite stmins. This determines that a temporal analysis of gene expression during the infection process should be performed to corroborate the above observations. The increase of heme oxigenase transcripts in fibroblasts infected by the two strains was comrrmed by real time-PCR This methodology also confirmed down-regulation of the insulin-like growth factor binding protein 5 rnRNA in fibroblasts infected with VL 10 strain.

Septinas são proteínas de ligação ao nucleotídeo de guanina (GTP). Foram inicialmente identificadas em fungos e atuam na fase final da divisão celular. Posteriormente, também verificaram que esta família de proteínas está presente em outros eucariotos com exceção de plantas. Septinas são purificadas de fungos Saccharomyces cerevisiae, Drosophila e cérebro de mamíferos na forma de heterofilamentos e são constituídas de três regiões principais: um N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-coil C-terminal. Sabe-se que existem pelo menos catorze genes que codificam septinas em humanos, no entanto, há poucas informações estruturais sobre elas. Destas catorze septinas, somente três (septinas 2, 6 e 7) tiveram parte de suas estruturas cristalográficas determinada, principalmente os domínios GTPase. A família das septinas pode ser dividida em quatro subgrupos baseado em similaridade seqüencial. Um deles (grupo II) é formado por SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 e a recém-descoberta SEPT14. A proteína SEPT11 foi descrita pela primeira vez em 2004 e detectada em vários tecidos humanos. Faz parte de complexos com outras septinas na formação de heterofilamentos e pode estar envolvida no transporte tubular e filtração glomerular nos rins. Para apresentar os estudos com a proteína SEPT11 nós a dividimos em domínios estruturais: SEPT11NG (domínios N-terminal e GTPase), SEPT11G (domínio GTPase), SEPT11GC (domínios GTPase e C-terminal) e SEPT11NGC (domínios N-terminal, GTPase e C-terminal). Os genes dos domínios estruturais SEPT11G e SEPT11GC foram clonados em vetor de expressão bacteriano, e SEPT11NG em vetor de propagação bacteriano. Tanto SEPT11G quanto SEPT11GC foram produzidos em E. coli e purificados com sucesso. O espectro de dicroísmo celular (CD) e o emprego de técnicas computacionais mostraram que a SEPT11 apresenta um perfil característico de proteínas do tipo &#945/&#946 coerente com a estrutura observada para SEPT6. Os estudos de espalhamento de luz a 350 nm mostraram que a proteína sofre um forte processo de agregação em temperaturas maiores que 30&#176C, parecido com outras septinas (incluindo SEPT4 e SEPT2) e condizentes com estudos de estabilidade térmica acompanhados por CD. Resultados de cromatografia de exclusão molecular indicam que SEPT11G foi produzida na forma de um homodímero (como também visto para SEPT4, SEPT2 e SEPT7) e SEPT11GC na forma de um monômero. Todos estes dados sugerem que as proteínas heterólogas descritas aqui enovelaram corretamente e assumiram sua estrutura nativa. Porém também foi demonstrado que a SEPT11G não apresentava nenhum nucleotídeo ligado (GDP ou GTP) mesmo quando purificada na presença dos mesmos. Resultados de modelagem da SEPT11G baseado no domínio GTPase da SEPT6 não revelaram nenhuma diferença significativa em torno do sítio ativo capaz de explicar a incapacidade da SEPT11 em ligar GTP/GDP. Especulamos que no caso da SEPT11 (e possivelmente outras septinas do grupo II), a presença de outras septinas e a montagem do heterofilamento sejam necessárias para estabilizar a interação entre GTP e a proteína. / Septins are GTP-binding proteins. They were originally identified in fungi and act during the final stages of cell division. Subsequently, they were also identified in other eukaryotic with the exception of plants. Septins are purified from Saccharomyces cerevisiae, Drosophila, and mammalian brain in the form of heterofilaments and consist of three principal regions: a variable N-terminal domain, a central highly conserved GTP-binding domain and a coiled-coil domain at the C-terminus. It is known that there are at least 14 human septin genes but as yet, there is still relatively little structural information concerning their protein products. Of these, only three (septins 2, 6 and 7) have had part of their three-dimensional structure (principally the GTPase domain) determined by X-ray crystallography. The septin family can be divided into four subgroups on the basis of sequence similarity. One of them (group II) is composed of SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 and SEPT14. SEPT11 was described for the first time in 2004 and was observed to be expressed in several human tissues. It is described as forming part of heterofilamentous complexes with other septins and may be involved in the glomerular filtration in the kidney. In order to characterize the SEPT11 protein, it was initially divided into its component structural domains and several constructs elaborated: SEPT11NG (N-terminal and GTPase domain), SEPT11G (GTPase domain), SEPT11GC (GTPase domain and C-terminal) and SEPT11NGC (N-terminal, GTPase and C-terminal domains). The genes corresponding to SEPT11G and SEPT11GC were cloned in an expression vector and SEPT11NG into a bacterial propagation vector. Both SEPT11G and SEPT11GC were successfully produced in E. coli and subsequently purified. Both circular dichroism spectra and computational techniques indicated that SEPT11 exhibited that both proteins were of the &#945/&#946 type, as anticipated, coherent with the structure of SEPT6. Light scattering measurements at 350 nm showed that the protein undergoes a process of aggregation at temperatures above 30&#176C, similar to other septins (SEPT2 and SEPT4) and consistent with thermal stability studies using circular dichroism. Results of size exclusion chromatography indicated that SEPT11G formed dimers (similar to SEPT2, SEPT4 and SEPT7) and SEPT11GC apparently formed monomers only. All of these experimental data suggest that the heterologously expressed proteins described here folded into their native conformation. On the other hand, we also demonstrated that SEPT11G was nucleotide free even when purified in the presence of excess GTP or GDP. Homology modeling of the GTPase domain of SEPT11 failed to reveal any significant differences with respect to SEPT6 which would explain this lack of binding activity. We speculate that in the case of SEPT11 (and possibly other members of the group II septins) the presence of partner septins and the formation of the heterofilaments are essential for stable nucleotide binding.

Ruído pode ser definido como um exemplo em um conjunto de dados que aparentemente é inconsistente com o restante dos dados existentes, pois não segue o mesmo padrão dos demais. Ruídos em conjuntos de dados podem reduzir o desempenho das técnicas de Aprendizado de Máquina (AM) empregadas e aumentar o tempo de construção da hipótese induzida, assim como sua complexidade. Dados são geralmente coletados por meio de medições realizadas em um domínio de interesse. Nesse sentido, nenhum conjunto de dados é perfeito. Erros de medições, dados incompletos, errados, corrompidos ou distorcidos, falhas humanas ou dos equipamentos utilizados, dentre muitos outros fatores, contribuem para a contaminação dos dados, e isso é particularmente verdadeiro para dados com elevada dimensionalidade. Sendo assim, a detecção de ruídos é uma tarefa crítica, principalmente em ambientes que exigem segurança e confiabilidade, uma vez que a presença desses pode indicar situações que degradam o desempenho do sistema ou a segurança e confiabilidade das informações. Algoritmos para a detecção e remoção de ruídos podem aumentar a confiabilidade de conjuntos de dados ruidosos. Nesse âmbito, esse trabalho investiga técnicas de detecção de ruído baseadas em distância, em que a remoção de ruídos é feita em uma etapa de pré-processamento, aplicadas a problemas de classificação de dados de Expressão Gênica, caracterizados pela presença de ruídos, elevada dimensionalidade e complexidade. O objetivo é melhorar o desempenho das técnicas de AM empregadas para solucioná-los. Por fim, combinações de técnicas de detecção de ruído são implementadas de modo a analisar a possibilidade de melhorar, ainda mais, o desempenho obtido. / Noise can be defined as an example which seems to be inconsistent with the remaining ones in a data set. The presence of noise in data sets can decrease the performance of Machine Learning (ML) techniques in the problem analysis and also increase the time taken to build the induced hypothesis and its complexity. Data are collected from measurements made which represent a given domain of interest. In this sense, no data set is perfect. Measurement errors, incomplete, corrupted, wrong or distorted examples, equipment problems or human fails, besides many other related factors, help contaminating the data, and this is particularly true for data sets with high dimensionality. For this reason, noise detection is a critical task, specially in domains which demand security and trustworthiness, since the presence of noise can lead to situations which degrade the system performance or the security and trustworthiness of the involved information. Algorithms to detect and remove noise may increase trustworthiness of noisy data sets. Based on that, this work evaluates distance-based noise detection techniques, in which noise removal is done by a pre-processing phase, in gene expression classification problems, characterized by the presence of noise, high dimensionality and complexity. The objective is to improve the performance of ML techniques used to solve these problems. Next, ensembles of noise detection techniques are developed in order to analyze the possibility to further improve the performance obtained.

O agonista beta-adrenérgico ractopamina (RAC) modifica a composição da carcaça suína por aumentar a massa muscular e reduzir a deposição de gordura. O objetivo neste estudo foi avaliar os efeitos do tempo de fornecimento de RAC sobre o desempenho, concentração de ureia plasmática (CUP), características de carcaça e expressão gênica dos receptores beta- adrenérgicos (beta-AR) e das isoformas da cadeia pesada de miosina (MyHC) em suínos em terminação. Oitenta suínos, machos castrados (PV inicial = 69,42 ± 1,24 kg), foram utilizados em um experimento em blocos completos casualizados com cinco tratamentos, oito repetições por tratamento e dois animais por unidade experimental (baia). Os tratamentos consistiram de rações sem RAC (controle) ou com 10 ppm de RAC fornecidas por 7, 14, 21 ou 28 dias préabate. O PV individual e o consumo de ração por baia foram obtidos para determinar o ganho diário de peso (GDP), o consumo diário de ração (CDR) e a conversão alimentar (CA). Amostras de sangue foram coletadas para determinação da CUP. No final do experimento, os animais (PV final = 102,46 ± 1,44 kg) foram abatidos e amostras de pelos e do músculo Longissimus dorsi coletadas. As carcaças foram avaliadas 24 horas post-mortem. As amostras de pelos foram utilizadas para detecção da mutação no gene do receptor de rianodina do tipo 1 (RYR1). A expressão gênica dos beta-AR (subtipos beta1 e beta2) e das isoformas MyHC (I, IIa, IIx/d e IIb) foi quantificada nas amostras de músculo. As análises estatísticas foram realizadas apenas com os animais homozigotos dominantes para a mutação no gene do RYR1. O aumento no período de fornecimento de RAC não afetou (P > 0,05) o PV final, o GDP e o CDR, porém resultou em melhora linear (P < 0,01) na CA. Melhoras (P < 0,05) nas médias semanais de GDP e CA foram observadas durante os primeiros 21 dias de fornecimento de RAC, no entanto, o crescimento animal declinou (P < 0,05) na 4ª semana de tratamento. A CUP apresentou efeito quadrático (P < 0,01) com o aumento na duração do fornecimento de RAC. Houve aumento linear (P <= 0,01) no peso da carcaça quente, na profundidade do músculo Longissimus dorsi, na área de olho de lombo e na relação carne:gordura com o aumento na duração do tratamento com RAC. Não foram detectados efeitos da RAC (P > 0,05) sobre a expressão gênica dos beta1-AR e das isoformas MyHC IIa e MyHC IIx/d, porém o aumento no período de fornecimento de RAC tendeu a reduzir linearmente (P = 0,08) a expressão gênica dos beta2-AR. Embora os níveis de RNAm da isoforma MyHC I tenham sido reduzidos linearmente (P < 0,01), a expressão gênica da isoforma MyHC IIb aumentou linearmente (P < 0,01) com o aumento na duração do tratamento com RAC. Portanto, as melhores respostas de desempenho e carcaça ocorreram quando a RAC foi fornecida por 21 e 28 dias, respectivamente. Além disso, o agonista alterou a expressão gênica das isoformas MyHC, e é possível que a ação da RAC esteja relacionada com a população de beta2-AR. / The beta-adrenergic agonist ractopamine (RAC) modifies the swine carcass composition by increasing muscle mass and decreasing fat deposition. The objective in this study was to evaluate the effects of RAC feeding duration on performance, plasma urea nitrogen (PUN) concentration, carcass traits, and gene expression of beta-adrenergic receptors (beta-AR) and myosin heavy chain (MyHC) isoforms in finishing pigs. Eighty barrows (initial BW = 69.42 ± 1.24 kg) were used in a randomized complete block design experiment with five treatments, eight replicates per treatment, and two animals per experimental unit (pen). The dietary treatments consisted of diets containing no RAC (control) or 10 ppm RAC fed for 7, 14, 21, or 28 days before slaughter. Individual pig BW and pen feed disappearance were obtained to determine average daily gain (ADG), average daily feed intake (ADFI), and feed to gain ratio (F:G). Blood samples were collected for determination of PUN concentrations. At the end of the experiment, pigs (final BW = 102.46 ± 1.44 kg) were slaughtered and hair and Longissimus dorsi muscle samples collected. The carcasses were evaluated 24 hours postmortem. Hair samples were used to detect the mutation of the ryanodine receptor type 1 (RYR1) gene. Gene expression of beta-AR (beta1- and beta2-subtypes) and MyHC isoforms (I, IIa, IIx/d, and IIb) was quantified in the muscle samples. Statistical analyses were performed using only the homozygous dominant pigs for the RYR1 gene mutation. Increasing RAC feeding period did not affect (P > 0.05) final BW, ADG, and ADFI, but resulted in a linear improvement (P < 0.01) in F:G. Average weekly improvements (P < 0.05) in ADG and F:G were observed during the first 21 days of RAC feeding, however, animal growth declined (P < 0.05) in the 4th week of treatment. The PUN concentrations showed a quadratic effect (P < 0.01) as RAC feeding duration increased. There were linear increases (P <= 0.01) in hot carcass weight, Longissimus dorsi muscle depth, loin eye area, and muscle to fat ratio as RAC treatment duration increased. No effects of RAC feeding (P > 0.05) were detected for beta1-AR and for isoforms of MyHC IIa and MyHC IIx/d gene expression, but increasing RAC feeding period tended to linearly decrease (P = 0.08) beta2-AR gene expression. Even though mRNA levels of MyHC I isoform decreased linearly (P < 0.01), gene expression of MyHC IIb isoform increased linearly (P < 0.01) as RAC treatment duration increased. Therefore, greater growth and carcass responses occurred when RAC was fed for 21 and 28 days, respectively. Furthermore, the agonist altered the MyHC gene expression and the RAC action may be related to the beta2-AR population.

Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão e outros canídeos como hospedeiros definitivos e os bovinos como principais hospedeiros intermediários. Causa nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, gerando prejuízos significativos na pecuária mundial. Como Toxoplasma gondii e Plasmodium, N. caninum possui um sistema específico de secreção que permite a invasão ativa do parasita na célula hospedeira, formação do vacúolo parasitóforo e replicação. Devido ao seu ciclo intracelular, várias estratégias foram desenvolvidas para caracterizar o processo de invasão no filo, como deleção ou controle da expressão de genes envolvidos. Entre os genes com papel importante no processo invasivo, NcMic2-like1 possui destaque já que o soro contra essa proteína recombinante inibiu 60% da invasão de N. caninum in-vitro. Essa proteína micronêmica possui domínios adesivos (uma integrina e seis trombospondinas) que atuam na ligação entre os receptores da célula hospedeira e o motor de actina e miosina do parasita, possibilitando a invasão ativa. O objetivo central do trabalho foi o desenvolvimento de ferramentas genéticas para a deleção e hiperexpressão de NcMic2-like1 e outras proteínas em N. caninum para a compreensão profunda desse mecanismo, além da caracterização, localização e expressão de NcMic2-like1. Para isso dois modelos baseados na resistência a drogas e integração ao genoma do parasita foram construídos. Um se baseia na resistência contra cloranfenicol (pelo gene Cloranfenicol Acetil Transferase - CAT) e o outro contra pirimetamina (pela mutação da Diidrofolato Redutase-Timidilato Sintase - DHFRM2M3). As sequências que conferem resistência foram ligadas ao promotor e região 3\' UTR de três genes de N. caninum, NcSAG1 (ou SAG1-like); NcDHFR ou NcHXGPRT conferindo resistência às drogas após transfecção. A esses vetores de resistência foram ligadas duas sequências do controle de expressão por tetraciclina, o sistema TetR/tetO. Adaptando o sistema de T. gondii para N. caninum, TetR foi expresso sob controle do promotor RPS13 ou Tubulina de N. caninum e tetO controlou a expressão de Lac-Z (?-galactosidase), ii uma enzima repórter. TetR e tetO foram transfectados de modo estável utilizando os vetores CAT e DHFRM2M3. O sistema foi responsivo à adição de tetraciclina, além de indicar um meio provavelmente independente de TetR quando apenas tetO foi avaliado em N. caninum. Foi possível expressar Lac-Z em N. caninum, possibilitando o desenvolvimento e padronização de ensaios de invasão, crescimento e detecção do taquizoíta. Também foi realizada a detecção de YFP (proteína amarelo fluorescente) nos taquizoítas transfectados com YFP fundida em TetR. Essas ferramentas de inserção e deleção de genes possibilitaram a construção de vetores para a hiper expressão ou deleção de NcMic2-like1. Para hiper expressão o vetor foi obtido pela substituição de Lac-Z pelo gene NcMic2-like1. Para deleção de NcMic2-like1 o vetor foi desenvolvido pela ligação do seu promotor e região 3\' UTR ä CAT ou NcDHFRM2M3, que promove a substituição do gene alvo pelos de resistência por recombinação homóloga. Adicionalmente foram desenvolvidas formas para a expressão e purificação de proteínas em N. caninum. Também foi obtida a solubilização de NcMIC2-like1 recombinante pelo sistema pET28 após a adição de uma cauda solúvel amplificada do genoma de N. caninum. O desenvolvimento de métodos de manipulação genética é um fato inédito para N. caninum e possibilitará estudos moleculares mais profundos sobre os mecanismos de invasão e replicação, onde NcMic2-like1 aparece como primeira candidata para esses ensaios. / The Apicomplexa protozoan Neospora caninum is an obligate and intracellular parasite that has the dog and other canides as definitive host and especially cattle as intermediate hosts. It causes respectively encephalopathy. abortions and loss of fertility causing deep economic impact at the world livestock. As Plasmodium and Toxoplasma gondii, N. caninum has a specific system of active secretion, which allows the invasion of the parasite into the host cell, the establishment of parasitophorous vacuole and replication. Due to the intracellular cycle of parasite, several strategies have been developed to characterize the invasion process of the phylum, such as deletion or control of expression of related genes. Among the genes with an important role in the invasive process, NcMic2-like1 stands out, once the serum against the recombinant form inhibited the in vitro invasion of N. caninum up to 69%. This microneme protein has adhesive domains (one integrin and six thrombospondins) acting between the host cell receptors and the actin/myosin motor of the parasite, allowing the active invasion. The main aim of this work was the development of genetic tools for deletion and overexpression of NcMic2-like1 and other proteins in N. caninum for a deep understanding of this mechanism, in addition to the characterization, localization and expression of NcMic2-like1. Therefore two models based on the drug resistance and integration into the genome of the parasite were constructed. One was based on the resistance against chloramphenicol (chloramphenicol acetyl transferase gene by - CAT) and the other against pyrimethamine (by mutation of dihydrofolate reductase-thymidylate synthase - DHFRM2M3). The sequences that confer these two drug resistance patterns have been ligated to the promoter and the 3\' UTR region of three genes from N. caninum, NcSAG1 (or SAG1-like); NcDHFR or NcHXGPRT, conferring resistance to the drugs after transfection. These vectors were ligated to two sequences that confer resistance controlled by tetracycline, the TetR / tetO system. The T. gondii system was adapted for N. caninum. TetR was expressed under the control of N. caninum tubulin promoter and tetO controlled the expression of Lac-Z (?-galactosidase), a reporter enzyme. TetR and tetO were stably inserted in N. caninum after transfection iv with the vectors based on CAT and DHFRM2M3.The system was responsive following tetracycline presence, in addition to a TetR independent mechanism in N. caninum . Moreover, it was possible to express Lac-Z in N. caninum enabling the development and standardization of invasion, growth and detection tachyzoite assays. It was also possible to detect through fluorescence microscopy the YFP (yellow fluorescent protein) in tachyzoites transfected with YFP fused to TetR.. The tools for gene insertion and deletion allowed the construction of vectors for hiperexpression or deletion of NcMic2-like1. For hiperexpression the vector was obtained by the replacement of the Lac-Z by the NcMic2-like1 gene. For the NcMic2-like1 deletion the vector was achieved after the ligation of its promoter and 3 \'UTR region to CAT or NcDHFRM2M3. This approach leads to the replacement of the target gene by the resistance gene through homologous recombination. Furthermore approaches for expression and purification of proteins in N. caninum were developed. Also, a soluble recombinant NcMIC2-like1 form was obtained with pET28 system added with a soluble tail amplified from a genome region of N. caninum. The development of genetic manipulation methods is an unprecedented event for N. caninum and will enable deeper molecular studies over mechanisms of invasion and replication, where NcMic2-like1 is the first candidate for these assays.

O desenvolvimento em insetos é coordenado majoritariamente pela ação de dois grandes hormônios: HJ e 20E. Esses hormônios desencadeiam cascatas gênicas resultando em mudanças fenotípicas, fisiológicas e comportamentais. Além dos hormônios, os miRNAs também atuam sobre a expressão desses genes componentes das cascatas de resposta aos hormônios durante o desenvolvimento nos insetos. Neste estudo objetivamos analisar a relação entre hormônios e genes, hormônios e miRNAs e genes e miRNAs, em estágios finais do desenvolvimento de Apis mellifera. O perfil de expressão dos fatores de transcrição Usp, ftz-f1, EcR, chd64, inr2, Kr-h1, gce e os regulares putativos miR-34, miR-281 e miR-252b foram avaliados a partir do 5 estagio larval até adultos recém emergidos, por meio de RT-qPCR. Também avaliamos o efeito de doses exógenas de HJ III e 20E sobre o desenvolvimento pupal (Pw e Pb). A maioria dos genes testados mostraram responder as variações hormonais nos estágios pupais tal qual respondem em estágios larvais. Contudo, gce e chd64 mostraram responder diferente as variações hormonais em estágios pupais, sugerindo assim, que estes podem desempenhar papel diferente nos estágios finais do desenvolvimento. O gce que é um receptor nuclear de HJ em insetos, mostrou rápida resposta ao tratamento com 20E e não respondeu ao tratamento com HJ, semelhantemente o chd64 também não respondeu aos tratamentos com HJ. Nossos dados ainda apontam Usp como um gene de resposta imediata (early gene). O miR-34 e o miR-281 são fortes candidatos a reguladores chave na metamorfose, uma vez que estes apresentam interações (in silico) com a maioria dos genes aqui estudados, além de responderem ao tratamento hormonal para ambos os hormônios. Este estudo caracteriza componentes da rede regulatória do desenvolvimento pupal em abelhas melíferas. / The development in honeybees is mainly controlled by the action of two major hormones, juvenile hormone (JH) and 20-hidroxyecdysone (20E). These hormones trigger gene cascades, which results in phenotypic, physiological and behavioral changes. Besides hormones, a class of non-coding RNAs, the microRNAs, regulates gene expression at a post-transcriptional level during insect development. In this study we aimed to analyze the relationship between developmental genes and morphogenetic hormones, in final stages of the development of Apis mellifera. The expression profile of the orphan nuclear receptor Usp, ftz-f1, EcR, chd64, inr2, Kr-h1), gce, early-trypsin, and their putative regulators miRNA-34, miRNA-281, miRNA-252a and miRNA-252b were assessed from 5? instar larvae to newly emerged adults by qPCR. The effect of exogenous doses of both hormones applied on white eyed pupae (Pw) and brown eyed pupae (Pb) was also tested. Most of the genes seem to respond to hormonal variation in pupal stages as they do in larval stages. However, gce and chd64 showed a different response to hormonal treatment in pupal states, thus suggesting they play different roles in final stages of development. Unexpectedly gce, which is a nuclear receptor of JH in insects, showed a quick response to 20E treatment and no response to JH in pupal stages of honeybees, as well as chd64 which also responded only to the 20E treatment. In addition, we recognized Usp as an Immediate Early Gene, for it responded rapidly to hormonal treatments and quickly restored its level. In addition, we find the miR-34 and miR-281 as strong candidates of regulators since they presented many putative interactions in the 3\'UTR of the candidate genes and showed to be affected by the hormonal treatment. This study describes new components to the regulatory network that regulates bee development.

Linhagens de camundongos AIRmax e AIRmin diferem quanto a reatividade inflamatória aguda às partículas de Biogel. A AIR divergente nessas linhagens está bem estabelecida, no entanto, diferenças na resposta inflamatória crônica ao Biogel ainda não foram descritas. Assim, nós decidimos verificar se o processo de seleção que modificou a resposta inflamatória aguda nessas linhagens, também afetou o desenvolvimento da resposta inflamatória crônica. A infiltração de células no exsudado da linhagem AIRmax foi maior que na linhagem AIRmin em ambos os períodos avaliados (48h e 30d), e no período de 48 horas, os animais AIRmax apresentaram alta produção de citocinas no exsudato inflamatório. Essa linhagem mostrou ainda maior número de genes ativados envolvidos na transdução de sinal, resposta imune e inflamatória. Alguns genes envolvidos com a resposta inflamatória aguda, também apresentaram diferenças após 30 dias. Esses resultados indicam que o processo de seleção para a inflamação aguda pode ter afetado também o desenvolvimento da resposta inflamatória crônica ao Biogel. / AIRmax and AIRmin mouse lines differ in terms of acute inflammatory response after Biogel injection. The distinct AIR in these lines is well established, however, differences in late or chronic inflammatory response to Biogel were not described yet. Thus, we decided to check if the genetic selection that modified the acute inflammatory response in these lines, also affected the development of a chronic inflammatory response. We found that AIRmax mice had higher cellular influx in the inflammatory exudate than AIRmin mice in both analyzed periods (48h and 30d) and that after 48 hours of Biogel injection, AIRmax mice showed higher cytokine levels in inflammatory exudates. This line also showed higher number of up regulated genes in AIRmax than in AIRmin mice involved with inflammatory response, immune response and signal transduction. Some acute inflammatory response genes also showed differences on day 30. Our results indicate that the genetic selection for acute inflammatory response may also have affected the chronic inflammatory response to Biogel.

No experimento 1, avaliou-se os efeitos da leptina exógena na concentração sérica de leptina e na expressão do gene LEP no tecido adiposo de novilhas zebuínas pré-púberes. Amostras de tecido adiposo (mesentérico, perirenal e subcutâneo) e de sangue foram obtidas de 36 novilhas, distribuídas nos tratamentos: A) dieta de alta energia; B) dieta de baixa energia; BL) dieta de baixa energia + 4,8 g/kg PV de oLeptin subcutânea, duas vezes ao dia, por 56 dias. A concentração de leptina foi determinada com kit comercial ELISA (Cusabio) específico. Amostras de sangue de quatro novilhas por grupo foram coletadas em seis pontos no tempo, sendo um antes e um após o tratamento hormonal. Dois dias após a obtenção da puberdade, oito novilhas por grupo foram abatidas para coleta de tecido. A expressão gênica foi quantificada nos depósitos de gordura por PCR em tempo real. A oLeptina aumentou transitoriamente a concentração de leptina do grupo BL, com pico (11,1 ± 1,4 ng/mL) após 7 dias do início do tratamento. A leptina sérica do grupo A aumentou linearmente no tempo, enquanto no grupo B, manteve-se constante (4,0 ± 2,0 ng/mL). A dieta A aumentou a expressão de leptina no tecido adiposo em 2,4 vezes; e a administração de oLeptina diminuiu a expressão do gene LEP em cerca de 2,5 vezes, comparando com o grupo controle. A redução na expressão do gene LEP explica a redução na leptina sérica do grupo BL após 30 dias de tratamento hormonal. O objetivo do experimento 2 foi clonar a região codificadora da leptina bovina, transformar leveduras Pichia pastoris KM71H e expressar a proteína no meio de cultura. O gene da leptina foi amplificado em reação de PCR, a partir de amostra de tecido adiposo subcutâneo de novilha do grupo A. Os primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (senso) e 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT - 3\' (antisenso), contendo sítios EcoRI e SalI, foram desenhados com base na sequência do mRNA da leptina bovina (NM 173928.2), substituindo a sequência sinal de secreção nativa pela sequência do Fator do Saccharomyces cereviasiae. O inserto foi clonado nos vetores de expressão pPICZ&alpha;A e pGAPZ&alpha;A (Invitrogen), sendo as leveduras transformadas por eletroporação. Clones com múltiplas cópias do gene foram selecionados em meio YPD + 500 &#956;g/mL de zeocina, e 22 colônias recombinantes foram selecionadas para análise de expressão em pequena escala. Colônias pPICbLep foram inicialmente cultivadas em meio de crescimento (BMGY), sendo transferidas para meio de indução (BMMY), contendo metanol. A indução durou 144 horas. Alíquotas de 200 &#956;l de sobrenadante foram coletadas diariamente, para análise da presença da bLeptina por SDS-PAGE. As colônias pGAPbLep foram cultivadas em meio YPD por 96 h, com coleta de sobrenadante a cada 24 h. As leveduras foram transformadas com sucesso, com os plasmídeos pPICbLep e pGAPbLep, entretanto, apenas as colônias pGAPbLep expressaram uma proteína de 35 kDa, o dobro do tamanho esperado para a bLeptina (17 kDa), provavelmente por ocorrência de dimerização. Mais estudos são necessários sobre os processos de produção de leptina recombinante bovina em Pichia pastoris. / In experiment 1, the effects of exogenous leptin were evaluated on serum leptin levels and on LEP gene expression in the adipose tissue of prepubertal zebu heifers. Adipose tissue (mesenteric, perirenal and subcutaneous) and blood samples were collected from 36 heifers, distributed among treatments: A) high energy diet; B) low energy diet; BL) low energy diet + 4,8 g/kg BW subcutaneous oLeptin, twice daily, for 56 days. Leptin concentration was determined with specific commercial ELISA kit (Cusabio). Blood from four heifer per group was sampled in six time points, one before and one after the hormonal treatment. Two days after puberty attainment , eight heifers per group were slaughter for tissue sampling. Gene expression was quantified in fat depots by real time PCR. The oLeptin increased transiently leptin concentration in group BL, with a peak (11,1 ± 1,4 ng/mL) after 7 days of treatment. Serum leptin in group A increased linearly in time, while in group B it remained constant (4,0 ± 2,0 ng/mL). Diet A enhanced leptin expression in the adipose tissue 2.4-fold, and oLeptin administration decreased de expression 2.5-fold, comparing to the control group. The decrease in LEP gene expression explains the reduction in serum leptin from group BL after 30 d of hormonal treatment. The objective with experiment 2 was to clone de codifying region of bovine leptin, transform KM71H Pichia pastoris yeasts, and express the protein in culture media. The leptin gene was amplified by PCR, from subcutaneous adipose tissue sample from a heifer in group A. Primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (forward) and 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT 3 (reverse), containing EcoRI and SalI restriction sites, were designed based in the mRNA sequence from bovine leptin (NM 173928.2), replacing the native secretion signal sequence by the -factor sequence from Saccharomyces cereviasiae. The insert was cloned in the expression vectors pPICZ&alpha;A and pGAPZ&alpha;A (Invitrogen), and yeasts were transformed by electroporation. Clones with multiple copies of the gene were selected in YPD + 500 &#956;g/mL zeocina, and 22 recombinant colonies were selected for a small-scale expression analysis. pPICbLep colonies were initially cultivated in growth media (BMGY), and then transferred to the induction media (BMMY), containing methanol. The colonies were inducted for 144 h. Supernatant aliquots (200 &#956;l) were collected daily, for bLeptin analysis in SDS-PAGE. pGAPbLep colonies were cultivated in YPD media for 96 h, collecting supernatant samples each 24 h. Yeasts were successfully transformed with the plasmids pPICbLep and pGAPbLep, however, only pGAPbLep colonies expressed a protein with 35 kDa, twice the size expected for the bovine leptin (17 kDa), probably because of dimerization. More studies are necessary about the recombinant bovine leptin production processes in Pichia pastoris.

A conversão do amido, armazenado nas frutas durante seu desenvolvimento, em açúcares, é desempenhada por várias enzimas, constituindo-se em um dos principais processos do amadurecimento. A função das enzimas hidrolíticas, alfa-amilase e beta-amilase, no metabolismo amido-sacarose durante o amadurecimento de bananas, foi avaliada através da determinação dos perfis de transcrição e tradução dos seus genes. Utilizando-se da expressão heteróloga de clones de cDNA das amilases, foi possível obter as proteínas recombinantes, inclusive na sua forma enzimaticamente ativa, bem como induzir a produção de anticorpos policlonais em coelhos, com os quais pode-se acompanhar a variação nos níveis de expressão de cada uma das duas enzimas. O tratamento de bananas com o hormônio etileno induziu a antecipação dos processos de degradação do amido e síntese de açúcares em relação ao grupo de frutas controle. Enquanto no grupo controle, as variações nos níveis de proteína e transcrição relativos à alfa-amilase sugerem que há redução na expressão do gene, no grupo tratado com etileno não foi possível detectar a expressão da proteína, apesar dos incrementos na transcrição e atividade. Tal fato pode ser associado à degradação do grânulo de amido e conseqüente solubilização de proteínas ligadas à sua superfície e ao provável aumento no turnover de proteínas promovidos pelo etileno. Em resposta ao tratamento com etileno, houve antecipação dos picos de atividade relacionados especificamente com a beta-amilase, o mesmo ocorreu na detecção do transcrito e sua proteína. Tais resultados sugerem que em bananas, os padrões de expressão e atividade da beta-amilase estão diretamente relacionados à degradação do amido, respondendo também às variações hormonais na fruta, não sendo possível afirmar o mesmo para alfa-amilase. / The starch breakdown in plants is accomplished by several enzymes and pathways and it is the main feature of the ripening in climacteric fruits, such as banana. The function of the hydrolytic enzymes, alpha-amylase and beta-amylase, in the starch-to-sugar metabolism during banana ripening, was evaluated through the determination of the profiles of transcription and translation of its genes. Using the heterologous expression of amylases cDNA clones, was possible to get recombinant proteins in its enzymatically active form, as well as inducing the production of the polyclonal antibodies in rabbits, and use this to evaluate the expression profile of each one enzyme. The treatment of bananas with the hormone ethylene induced the anticipation of the processes of degradation of starch and synthesis of sugars in relation to the control group. While in the control group the variations of protein and transcription levels for alpha-amylase suggests a reduction in the gene expression, in the ethylene group was not possible to detect the expression of the protein, despite the increments in the transcription and activity. Such fact can be associated with the degradation of the starch granules and the resultant surface protein solubilization, and the probable increase in the protein turnover promoted by ethylene treatment. In response to the ethylene, the peak related to beta-amylase activity has been anticipated and the same was occurred with the transcription and translation of this enzyme. These results suggest that the profile of expression and activity of beta-amylase are directly related to the degradation of starch and do respond to hormonal treatment of banana fruits, which could not be affirmed for the enzyme alpha-amylase.

As células-satélite musculares vêm sendo muito estudadas em diferentes pesquisas, especialmente com o objetivo de aumentar a compreensão do mecanismo de sua ação na regeneração muscular e as respectivas implicações nas diferentes miopatias, visando identificar possíveis alvos terapêuticos. Dois modelos para distrofias, os camundongos Largemy d e Lama2dy2j/J possuem um padrão de degeneração intenso e bastante semelhante, mas com diferenças na expressão de genes envolvidos na cascata de regeneração. Por isso, estes constituem interessantes modelos para o estudo de possíveis diferenças no mecanismo de ativação e atuação das células-satélite no músculo distrófico. Assim, os objetivos específicos deste projeto consistiram em: 1) isolar e caracterizar por citometria de fluxo as populações de células-satélite dos modelos Largemy d e Lama2dy2j/J em comparação com o normal C57Black6, quanto a expressão de marcadores de miogênese e de células-tronco pluripotentes; e 2) estudar e comparar o perfil de expressão gênica destas populações de células satélites através de microarray de expressão. Na caracterização fenotípica das células isoladas do músculo normal, aquelas que aderem mais precocemente (PP1) e mais tardiamente (PP2) mostram um padrão fenotípico semelhante entre si e com características mais próximas às miogênicas. Já a população de células de adesão bem mais tardia (PP6) apresentou um padrão de marcação misto, mantendo as características miogênicas, mas apresentando tambem padrão de células-tronco mesenquimais, sugerindo o fenótipo de células mais imaturas. Nos músculos distróficos, identificamos diferenças na constituição do pool de células presentes inicialmente no músculo, onde na linhagem Lama2dy2j/J há indícios de uma população em estágio proliferativo, enquanto que na linhagem Largemy d há presença de células com maior imaturidade. Os resultados da analise de expressão gênica nas populações caracterizadas se mostraram concordantes com os fenótipos celulares avaliados por citometria. Identificamos a hipo-expressão de genes ligados à regeneração e remodelamento muscular em ambos modelos distróficos. Considerando os genes diferentemente expressos somente em cada um dos modelos, os resultados sugerem ativação de proliferação celular e inibição da diferenciação na linhagem Lama2dy2j/J e distúrbios na miogênese na linhagem Largemy d. Assim, pudemos identificar vias importantes alteradas em cada um dos modelos que explicam parte das diferenças encontradas nos trabalhos anteriores / Muscle satellite cells have been widely studied, especially to understand their mechanism of action in muscle regeneration and correspondent implications in the different dystrophic processes, aiming the identification of potential therapeutic targets. Two mice models for muscular dystrophies, Largemyd and Lama2dy2j/J, have a pattern of an intense and very similar degeneration, but with differences in the expression of genes involved in the regeneration cascade. Therefore, they are interesting models to study possible differences in the mechanism of activation and action of satellite cells in the dystrophic muscle. The main objectives of this project are: 1) to isolate and characterize by flow cytometry, populations of satellite cells from Largemyd and Lama2dy2j/J models, as compared to normal C57Black6, evaluating the presence of myogenic and pluripotent stem cells markers; and 2) to study and compare gene expression profiles of these populations of satellite cells using microarray technique. In the phenotypic characterization of cells harvested from normal muscle, both faster (PP1) and slower (PP2) populations to adhere in culture flasks show similar phenotypic characteristics, which were closer to myogenic phenotype. On the other hand, the population of cells with very delayed adhesion ability (PP6) presented a mixed pattern, maintaining the myogenic characteristics, but associated to positive mesenchymal stem cell´s markers, suggesting a phenotype of more immature cells. In dystrophic muscles, we could identify differences in the constitution of the first pool of cells present in the Lama2dy2j/J muscle where there is evidence of a population in proliferative stage, while in the Largemyd strain, we found more immature cells. Gene expression profile in the characterized populations showed consistent concordance with the cellular phenotypes assessed by flow citometry. In both dystrophic models, we identified down-regulated genes related to regeneration and remodeling of the muscle. Considering only the genes differently expressed in each dystrophic model, data suggest the activation of cell proliferation and inhibition of differentiation pathways in Lama2dy2j/J strain and altered myogenesis in the Largemyd model. Thus, we identified important altered pathways in each of the dystrophic models that could explain most of the differences in gene expression profile in the muscle, described in our previous work