A homocistinúria é um erro inato do metabolismo caracterizado, bioquimicamente, pela deficiência da enzima cistationina-β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos e vasculares característicos, como retardo mental e arteriosclerose, cuja fisiopatologia é desconhecida. No presente trabalho, avaliamos os efeitos in vitro e in vivo da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos. Primeiramente, observamos o efeito in vitro da exposição de homogeneizados de córtex parietal de ratos ao ácido fólico, avaliando a inibição causada pela homocisteína sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas plasmáticas. Nos estudos in vivo, investigamos o efeito do pré-tratamento com ácido fólico sobre a inibição das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase em córtex parietal e em soro de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia aguda, respectivamente. Considerando que a Na+,K+-ATPase é suscetível ao ataque de radicais livres, nós determinamos o efeito da hiperhomocisteinemia aguda sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo total de grupos tióis em córtex parietal de ratos. Finalmente, investigamos o efeito do ácido fólico sobre a redução da atividade da Na+,K+-ATPase em córtex parietal e sobre o aumento do índice de dano ao DNA em sangue total de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia crônica. Nossos resultados mostraram que a homocisteína in vitro reduz, significativamente, a atividade da Na+,K+-ATPase e que o ácido fólico previne esse efeito. Estudos cinéticos com o substrato ATP revelaram que a homocisteína inibe de forma não-competitiva a enzima Na+,K+-ATPase. Os estudos in vivo confirmaram que a hiperhomocisteinemia aguda diminui as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase e que o pré-tratamento com ácido fólico também previne os efeitos causados pela homocisteína. Por outro lado, a hiperhomocisteinemia aguda não alterou os parâmetros de estresse oxidativo analisados. A hiperhomocisteinemia crônica inibiu a Na+,K+-ATPase em córtex parietal e aumentou o índice de dano ao DNA em sangue total de ratos e, novamente, o tratamento com ácido fólico previne tais efeitos. Esses resultados, em conjunto, revelam os efeitos da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos e colaboram com o entendimento da fisiopatologia da homocistinúria. Além disso, os resultados sugerem que o ácido fólico, já utilizado por alguns pacientes homocistinúricos, poderá ser uma importante ferramenta terapêutica utilizada na prevenção dos efeitos neurológicos e vasculares da homocisteína.

Introdução: A Síndrome de Down (SD) é um distúrbio genético complexo atribuído à presença de três cópias do cromossomo 21. O cromossomo 21 extra é de origem materna em quase 95% dos casos, originado por um erro na segregação cromossômica durante a meiose. O único fator de risco reconhecido para erros devido a não-disjunção é a idade materna avançada na concepção. Um estudo preliminar sugeriu que alterações no metabolismo do folato e o polimorfismo C677T do gene MTHFR poderiam ser considerados fatores de risco materno para SD. Objetivos: Este estudo procurou associar alguns fatores genéticos - relacionados aos polimorfismos em genes que codificam enzimas que participam do metabolismo do ácido fólico/homocisteína - e fatores ambientais - relacionados a dosagens de folato e vitamina B12, além de hábitos maternos durante a gestação - como possíveis fatores de risco para SD e suas malformações maiores. Material e Métodos: Foram analisados os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR, A2756G do gene MTR, A66G do gene MTRR, 844ins68 do gene CBS e A80G do gene RFC-1 em 239 mães de crianças com SD e 197 mães de crianças normais, através de um estudo caso-controle. Também foram feitas dosagens de folato e vitamina B12 em 150 mães casos e 148 mães controle. Resultados: A distribuição das variantes genotípicas foi comparada entre mães de crianças com SD e mães controle, e não demonstrou diferença estatisticamente significativa quando avaliadas separadamente. Quando a análise foi controlada pela idade materna apenas o polimorfismo C677T do gene MTHFR apresentou tal associação (p=0,05). Os genótipos combinados 677CT ou TT e 1298AA do gene MTHFR aumentaram o risco de SD na prole em quase duas vezes (OR= 1,99; IC95% 1,11-3,55). Além disto, mães que possuem um ou dois genótipos de risco - relacionados a outros polimorfismos que não os do gene MTHFR - têm 4,62 e 5,02 vezes mais chances de ter um filho com SD quando comparadas a mães contoles (IC 95% 1,22-17,46 e 1,36-18,55, respectivamente). A combinação dos genótipos MTHFR CT+TT e MTRR AG+GG foi associada a um aumento de 1,55 (IC95% 1,03-2,35) vezes no risco de ter um filho com SD. Mães de crianças com SD que possuem o alelo 677T apresentaram menores níveis plasmáticos de vitamina B12 (p<0,02). Adicionalmente, a presença do alelo 677T em mães casos resultou em um aumento de 2,07 vezes no risco de ter um filho com SD e defeito congênito do coração (p<0,01). Mães de crianças com SD e malformações cardíacas que possuem os genótipos 677CT ou TT, associado ao não uso de ácido fólico periconcepcional tiveram um aumento de 2,26 vezes no risco de ter um filho com SD e malformações cardíacas. Conclusões: Nossos resultados mostraram que apenas o alelo 677T do gene MTHFR parece estar relacionado à etiologia da SD quando considerado isoladamente. Igualmente, o efeito das combinações de genótipos de risco entre os genes MTR, MTRR, CBS e RFC podem ser considerados fatores de risco pra SD em nossa população. Finalmente, o alelo materno 677T pode estar associado ao aumento na ocorrência de defeitos congênitos do coração em crianças com SD. Pode-se supor que mulheres que possuem este polimorfismo possam obter benefícios a partir da suplementação vitamínica contendo ácido fólico na gestação para proteção contra malformações cardíacas em seus filhos com SD. / Introduction: Down syndrome (DS) is a complex genetic disorder attributed to the presence of three copies of chromosome 21. The extra chromosome derives from the mother in almost 95% of cases and is due to abnormal chromosome segregation during meiosis. Except for advanced age at conception, maternal risk factors for meiotic nondisjunction are not well established. A preliminary study suggested that abnormal folate metabolism and the C677T polymorphism in MTHFR gene may be maternal risk factors for DS. Objectives: This study evaluated the association between genetic factors - related to the polymorphisms in genes that encode enzymes of folic acid/homocysteine metabolism; and environmental factors - related to folate and B12 vitamin, besides maternal habits during pregnancy- as possible risk factors for DS and their major malformations. Material and Methods: We analyzed the polymorphisms C677T and A 1298C of MTHFR gene, A2756G of MTR gene, A66G of MTRR gene, 844ins68 of CBS gene and A80G of RFC-1 gene in 239 mothers of child with DS and 197 normal children, through a casecontrol study. Dosages of folate and B12 vitamin in 150 case mothers and 148 control mothers where also done. Results: The distribution of these genotypic variants was similar between mothers of DS children and control mothers of normal children, and didn’t show statistical significant differences when considered alone. When this analyze was controlled for maternal age, just the C677T polymorphism of MTHFR gene presented a significant association (p=0.05). The combined genotypes 677CT or TT and 1298AA increased the risk of DS offspring (OR= 1.99; 95%CI 1.11-3.55). Besides that, mothers that have one or two risk genotypes - related to other polymorphisms than MTHFRs - have 4.62 and 5.02 more chances of having a child with DS when compared to control mothers. The combined genotypes MTHFR CT+TT e MTRR AG+GG was associated with na incresed risk of de 1.55 fold (IC95% 1,03-2,35) in the risk of having a DS child. Mothers of DS that carry the 677T allele presented the lowest plasmatic levels of B12 vitamin (p<0.02). Additionally, the presence of the 677T allele in case mothers resulted in a 2.07-fold higher risk of congenital heart defects (CHD) in the offspring (p<0.01). In 57 mothers of CHD affected DS child who carry MTHFR 677CC or TT genotypes in combination with no use of periconceptional folate intake had a 2.26 fold increased risk of having any CHD affected DS child in offspring. Conclusions: Our results show that only the 677T allele of MTHFR gene seems to be involved with the etiology of Down syndrome in our population when considered alone. Equally, the effect of risk genotypes combinations among genes MTR, MTRR, CBS and RFC may be considered as a risk factor for DS in our population. And finally, maternal 677T allele may be associated to increased occurrence of congenital heart anomalies in DS child in our population. We can also expect that women who carry this polymorphism can have benefits from periconceptional folate supplementation to protect against CHD in DS offspring.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-18T21:33:03Z No. of bitstreams: 1 Caroline de Carvalho Urpia. Estudo dos polimorfismos 677CT e 1298 AC do gene da Metilenotetrahidrofolato redutase...pdf: 552380 bytes, checksum: 91d6ebe69a0ed7ae7a359552eb75e555 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-18T21:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caroline de Carvalho Urpia. Estudo dos polimorfismos 677CT e 1298 AC do gene da Metilenotetrahidrofolato redutase...pdf: 552380 bytes, checksum: 91d6ebe69a0ed7ae7a359552eb75e555 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A Síndrome de Down (SD) é a mais freqüente anormalidade cromossômica em nativivos e é causada pela presença de um cromossomo 21 extra. A prevalência é de aproximadamente 1/600 nascidos vivos. Polimorfismos nos genes da Metilenetetrahidrofolato Redutase (MTHFR) e da Metionina Sintase Redutase (MTRR), enzimas centrais do metabolismo do folato que afetam a metilação e síntese do DNA, podem ser fatores de risco para a ocorrência da SD. Detectar as freqüências dos polimorfismos 677C >T e 1298A>C do gene da MTHFR e 66A>G do gene da MTRR e associar com a ocorrência de SD. Para o estudo de caso-controle, DNA genômico foi isolado a partir de sangue periférico de 61 mães de crianças com SD, 56 afetados, 28 pais e 102 mulheres controles. Para estudo de corte transversal, 300 amostras de DNA pertencentes de indivíduos da população geral de Salvador foram analisadas. Para análise dos polimorfismos, foram utilizadas as técnicas de PCR e RFLP. Resultados: No estudo de caso-controle, a freqüência do alelo T, da mutação 677C>T da MTHFR, foi de 0,24 entre as crianças com SD; 0,3 entre as mães e 0,25 entre os pais. A freqüência do alelo C, da mutação 1298A>C da MTHFR, foi de 0,2 entre as crianças com SD; 0,16 entre as mães e 0,16 entre os pais. A freqüência do alelo G, da mutação MTRR 66A>G foi de 0,33 entre as crianças com SD; 0,35 entre as mães e 0,46 entre os pais. Entre as mulheres controles, as freqüências dos alelos T, C e G dos genes da MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C e MTRR66A>G foram de 0,25; 0,15 e 0,25, respectivamente. Comparando as freqüências alélicas das mães de crianças com SD e com as controles, não foi observada diferença estatisticamente significante, sugerindo que neste estudo os polimorfismos investigados não influenciam na ocorrência da SD, bem como a idade materna não sugere ser fator de risco aumentado para a SD, uma vez que a maioria dos filhos com SD eram provenientes de mães com idade materna inferior a 35 anos. No estudo de corte transversal, as freqüências dos alelos T, C e G dos genes da MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C e MTRR66A>G foram de 0,21; 0,26 e 0,28, respectivamente. Observou-se que ao separar os pacientes por sexo, houve uma tendência das mulheres controle possuírem o genótipo mutante para os polimorfismos MTHFR 1298A>C e MTRR 66A>G e quando comparados os grupos das mães observou-se risco aumentado para SD em 4,9 vezes em mães caso para o genótipo mutante MTRR 66GG.

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) é um dos principais motivos de mortalidade e morbidade perinatal. Diferentes causas estão associadas à HI, tais como: interrupção do fluxo sanguíneo, ineficientes trocas gasosas pela placenta, prematuridade, pré-eclâmpsia (PE), entre outras. Achados prévios do nosso grupo, utilizando o ácido fólico (AF) como estratégia terapêutica na HI, mostraram que o tratamento foi efetivo em amenizar alguns danos em animais submetidos ao modelo de encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI). Os objetivos do presente estudo foram investigar os efeitos/consequências do tratamento/suplementação com AF durante: (i) a EHI em ratos submetidos ao modelo Rice-Vannucci, e (ii) o tratamento com tert-butil-hidroperóxido (TBH) em células trofoblásticas humanas (linhagem BeWo e HTR-8 SV/neo), simulando o estresse oxidativo ocasionado por PE. Para a realização do experimento in vivo, aos sete dias de vida ratos Wistar foram divididos em quatro grupos experimentais: controle salina (CT-S), controle ácido fólico (CT-AF), hipóxico-isquêmico salina (HI-S) e hipóxico-isquêmico ácido fólico (HI-AF). Para o experimento in vitro células das linhagens BeWo e HTR-8 SV/neo foram cultivadas, suplementadas com três distintas concentrações de AF (deficiente, fisiológica e supra-fisiológica) e expostas durante 24 horas ao TBH. Nossos resultados demonstraram que a EHI dificultou a memória e aprendizado nos testes do labirinto aquático de Morris e do ox-maze, reduziu a atividade da Na+, K+-ATPase em animais adultos, causou atrofia em importantes áreas encefálicas como estriado e hipocampo, contribuiu para o desequilíbrio das enzimas antioxidantes SOD e CAT, além de causar um aumento da reatividade astrocitária em diferentes períodos do desenvolvimento animal. No entanto, quando observado o efeito do tratamento com AF nos diferentes parâmetros analisados foi constatado que este contribuiu para o déficit cognitivo no teste do labirinto aquático, enquanto que esse efeito foi amenizado no teste do ox-maze. Também, observou-se que, enquanto o tratamento com AF contribuiu para a inibição da enzima Na+, K+ -ATPase nos animais HI adolescentes, este foi efetivo em reverter essa inibição nos adultos. Além do mais, o tratamento com AF promoveu a recuperação parcial da atrofia hipocampal, aumentou a atividade das enzimas SOD e CAT e atrasou a formação da cicatriz glial. No modelo in vitro com exposição ao TBH, o tratamento com AF foi responsável pelo aumento da peroxidação lipídica, da carbonilação proteica e dos níveis de glutationas. Além disso, houve também um efeito antiproliferativo, antimigratório e citotóxico. Interessantemente, todos esses resultados foram intensificados quando observados nas células cultivadas sob a concentração supra-fisiológica de AF. Tendo em vista que cerca de 1 a 8% das gestantes desenvolvem pré-eclâmpsia e essas normalmente estão expostas a altas dosagens de AF devido à suplementação e à ingestão de alimentos fortificados, mais atenção é necessária especialmente na população de risco para essa doença. Os resultados obtidos neste estudo contribuem para o avanço das pesquisas nesta área e destacam a importância de mais investigações a fim de esclarecer até que ponto a suplementação com AF e sua dosagem adequada trariam benefícios para neonatos com EHI e gestantes com PE. / Hypoxia-ischemia (HI) is one of the main causes of perinatal death and morbidity. There are many imbalances related to the onset of HI, such as: interrupted blood flow, placenta gas exchange insufficiency, prematurity, preeclampsia (PE), among others. Previously, our group have investigated folic acid (FA) as a therapeutic agent of HI and showed it was able to reduce some deficits observed in animals submitted to the hypoxic-ischemic encephalopathy model (HIE). The aim of this study was the investigation of the effects and consequences of the treatment/supplementation with FA during (i) the HIE in rats subject to the Rice-Vannucci model, and (ii) the treatment of human trophoblastic cells (BeWo and HTR-8SV/neo) with tert-butyl-hydroperoxide (TBH) chemical agent, which mimics the oxidative stress during PE. During the in vivo experiment, seven-days Wistar rats were divided into four groups, as follows: control saline (CT-S), control folic acid (CT-FA), hypoxia-ischemia saline (HI-S) and hypoxia-ischemia folic acid (HI-FA). During the in vitro experiment BeWo and HTR-8 SV/neo cells were cultured under three distinct FA concentrations (deficient/physiological/supra-physiological) and exposed to TBH during 24 hours. Results showed HIE promoted memory and learning impairments as observed during the Moris water maze and ox-maze tests, reduced the activity of Na+, K+ -ATPase in adult rats, promoted atrophy in important areas as striatum and hippocampus, contributed to the imbalances in the oxidative enzymes SOD and CAT, and promoted the increase of astrocytic reactivity in distinct periods of development. Nevertheless, the treatment with FA contributed to the cognitive deficits observed in the water maze, while this effect was reduced in the ox-maze test. It was also observed that while FA treatment contributed to the inhibition of Na+, K+ -ATPase in HI adolescent rats, it was effective to recover this activity in HI adult rats. Moreover, FA treatment was able to partially recover hippocampal atrophy, to increase the activity of SOD and CAT enzymes and to delay the glial scar. The FA treatment in the in vitro model, where cells were challenged with TBH, was responsible for the increase in lipid peroxidation, protein cabonilation and glutathione levels. Moreover, it was observed antiproliferative, antimigration and cytotoxic effect. Interestingly, these outcomes were more intense when cells were cultured under a supra-physiological concentration of FA. Considering that about 1-8% of pregnant women suffer from PE and are often exposed to high doses of FA due to the supplementation and the ingestion of fortified food, more attention should be given to this group of risk. Results obtained during this work contribute to the improvement of research in this field and highlight the need of further studies to better understand to each extent the FA supplementation and daily dose intake are beneficial to EHI newborns and pregnant women with PE.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2012-10-26T09:12:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T20:51:38Z : No. of bitstreams: 1 303645.pdf: 9475186 bytes, checksum: 3d80bbcacf30841413e148634107a75b (MD5) / Ácido fólico é essencial para o funcionamento do sistema nervoso central, uma vez que desempenha um importante papel na neuroplasticidade e manutenção da integridade neuronal. O ácido fólico apresenta muitas propriedades importantes, como neuroprotetora, antidepressiva e cognitiva. O presente trabalho realizado através de estudos in vivo e in vitro avaliou os efeitos tipo-antidepressivo (teste do nado forçado, TNF, ou estresse agudo de contenção), cognitivo (TRO, teste do reconhecimento de objeto) e neuroprotetor (protocolos de morte celular induzidas por dexametasona ou glutamato) do ácido fólico. Os resultados dos estudos in vivo mostram que uma dose sub-ativa de ácido fólico (10 mg/Kg, p.o.) combinada com doses sub-ativas de inibidores da GSK-3? (glicogênio sintase cinase-3?) (AR-A014418 ou lítio), agonista PPAR? (receptor ativado por proliferador peroxissomal-?) (rosiglitazona) ou inibidores de canais de potássio (K+) (glibenclamida, caribdotoxina ou apamina), produziram um efeito tipo-antidepressivo sinérgico no TNF em camundongos. Por outro lado, o pré-tratamento dos animais com um inibidor da PI3K (fosfoinositol 3-cinase) (LY294002), um agonista PPAR? (GW-9662) ou um ativador de canais de K+ (cromacalim) reverteu o efeito tipo-antidepressivo de uma dose ativa de ácido fólico (50 mg/Kg, p.o.). Além disso, outro estudo in vivo mostrou que o ácido fólico (50 mg/kg, p.o.) administrado 1 h antes do estresse de contenção foi capaz de proteger contra o aumento do tempo de imobilidade induzido pelo estresse no TNF, mas não foi efetivo contra o prejuízo de memória no TRO. Adicionalmente, o estresse agudo de contenção promoveu aumento dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e das atividades da catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) no córtex cerebral e hipocampo, e aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) somente no hipocampo. O tratamento com ácido fólico restaurou a atividade da SOD, CAT, GR e GPx e reduziu os níveis de TBARS no hipocampo. Contudo, glutationa (GSH), um antioxidante não-enzimático não foi alterada pelo estresse, nem mesmo pelo ácido fólico. Além disso, um estudo in vitro mostrou que o pré-tratamento com ácido fólico (10-300 µM) reduziu a toxicidade induzida por dexametasona (1mM), de maneira concentração-dependente, em linhagem de células neuroblastoma humano SH-SY5Y. Este efeito neuroprotetor foi revertido por um inibidor da PI3K/Akt (LY294002), proteína cinase dependente de Ca2+/calmodulina II (CaMKII, KN-93) e proteína cinase A (PKA, H-89), mas não pelo inibidor da proteína cinase ativada por mitógeno/cinase regulada por sinal extracelular (MEK 1/2, PD98059) e proteína cinase C (PKC, queleritrina).Um adicional estudo in vitro, também mostrou que o tratamento de fatias hipocampais de ratos com ácido fólico (100 µM) reduziu significativamente a morte celular e a liberação de D-[3H]aspartato induzidos pelo glutamato (1mM), os quais foram abolidos pela presença de LY294002. Além disso, as fatias hipocampais incubadas por 30 minutos com ácido fólico per se induziu fosforilação da GSK-3?. Adicionalmente, ácido fólico na presença de glutamato (decorridos 6 h de incubação das fatias em meio, depois da retirada do glutamato), induziu fosforilação da GSK-3? e expressão da ?-catenina. O ácido fólico também reverteu o aumento da expressão da iNOS (óxido nítrico sintase induzida) promovido por glutamato. Estes resultados em conjunto, indicam que o efeito tipo-antidepressivo do ácido fólico no TNF pode ser dependente da modulação da via PI3K/Akt/GSK-3?, inibição de canais de K+ e ativação do receptor PPAR?, bem como, desempenhar um específico perfil antidepressivo, pelo menos em parte, devido ao seu papel antioxidante. Além disso, o efeito neuroprotetor do ácido fólico contra os estímulos tóxicos, dexametasona ou glutamato, pode ser dependente PI3K/GSK-3?/?-catenina e iNOS, respectivamente / Folate is essential for the functioning of the nervous system, since it plays an important role in neuroplasticity and in the maintenance of neuronal integrity. Many roles for folic acid have been reported, including neuroprotective, antidepressant and cognitive properties. The present work using an in vivo and in vitro approach evaluated the antidepressant-like (forced swimming test, FST or acute restraint stress), cognitive (ORT, object recognition test) and neuroprotective (dexamethasone or glutamate-induced cell death protocols) effects of folic acid. The results from in vivo studies showed that a sub-effective dose of folic acid (10 mg/Kg, p.o.) combined with sub-effective doses of GSK-3? (glycogen synthase kinase-3?) inhibitors (AR-A014418 or lithium), PPAR? (peroxisome proliferator-activated receptor-?) agonist (rosiglitazone) or potassium (K+) channel inhibitors (glibenclamide, charibdotoxin or apamin), elicited synergistic antidepressant-like effect in the mouse FST, while the pre-treatment of animals with a PI3K (phosphoinositide 3-kinase) inhibitor (LY294002), a PPAR? antagonist (GW-9662) or a K+channel opener (cromakalim) reversed the antidepressant-like effect of an active dose of folic acid (50 mg/Kg, p.o.). Moreover, another in vivo study showed that folic acid (50 mg/kg, p.o.) administred 1 h before restraint stress was able to protect against the stress-induced depressive-like effect in the FST, but not the memory impairment in the ORT. Moreover, acute restraint stress increased thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) levels and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activities in the cerebral cortex and hippocampus, and superoxide dismutase (SOD) activity in the hippocampus. Folic acid treatment restored the activity of SOD, CAT, GR and GPx and reduced TBARS levels in the hippocampus. Glutatione (GSH), a non-enzymatic antioxidant was not altered by stress and/or folic acid administration. Additionaly, an in vitro study found that folic acid pretreatment (10-300 µM) reduced dexamethasone (1mM)-induced toxicity in a concentration dependent manner in SH-SY5Y neuroblastoma cell line. This neuroprotective effect was reversed by the PI3K/Akt (LY294002), calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII, KN-93) and protein kinase A (PKA, H-89) inhibitors, but not the mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase (MEK 1/2, PD98059) and protein kinase C (PKC, Chelerythrine) inhibitors. A further in vitro study, also showed that the treatment of hippocampal slices with folic acid (100 µM) significantly reduced glutamate (1mM)-induced cell death and D-[3H]aspartate release, which were abolished by LY294002. Moreover, hippocampal slices incubated with folic acid per se for 30 minutes induced GSK-3? phosphorylation. Furthermore, folic acid in presence of glutamate insult, in hippocampal slices maintained for an additional period of 6 h in fresh culture medium without glutamate and/or folic acid, induced phosphorylation of GSK-3? and ?-catenin expression. In addition, folic acid was able to reverse the increase on iNOS expression induced by glutamate. Altogether, these results indicate that the antidepressant-like effect of folic acid in the FST might be dependent on the modulation of PI3K/Akt/GSK-3? pathway, inhibition of K+ channels and activation of PPAR?. In addition, the antidepressant activity of folic acid in the restraint stress paradigm may be at least partly due to its antioxidant role. Moreover, the neuroprotective effect of folic acid against the toxic insults, dexametasone or glutamate, might be dependent on signaling pathway that involves PI3K/Akt, CaMKII and PKA or PI3K/GSK-3?/?-catenin and iNOS, respectively

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-28Bitstream added on 2014-06-13T18:07:28Z : No. of bitstreams: 1 guarizafilho_o_dr_arafo.pdf: 1240531 bytes, checksum: c7e1cb0f17d9a4a706f95d4f47284151 (MD5) / O objetivo deste trabalho foi elucidar os mecanismos do ácido fólico em prevenir o aparecimento de fenda palatina teratogenicamente induzida pela dexamatasona em ratos. Para tanto, foram usadas um total de 13 ratas do tipo Holtzman. G1) 3 ratas receberam 3mg/Kg Dex. Intramuscular (i.m.) do 14o ao 17o dia de prenhez. G2) 4 ratas receberam 3mg/Kg Dexa (i.m.) do 14o ao 17o dia de prenhez, e uma dose de 5mg/kg de ácido fólico (via oral) do dia 14o até 17o de prenhez. G3) 3 ratas receberam 3mg/Kg Dexa (i.m.) do 14o ao 17o dia de gravidez e uma dose de 5mg/kg de ácido fólico (via oral) do início até o final da prenhez. G4) 3 ratas receberam 3mg/Kg Dex (i.m.) do 14o ao 17o dia de prenhez e uma dose de 5mg/kg de ácido fólico (via oral) desde 5 dias antes da concepção até o final da gravidez. As cabeças dos fetos foram removidas no 19o dia de prenhez e estudadas. Foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. O resultados mostraram o seguinte: G1) dos 27 fetos, (96,30%) apresentaram fenda total, e apenas 1 apresentou fenda parcial. G2) Dos 23 fetos apenas (8,7%) com fenda total, (43,35%) com ausência de fenda e (47,80%) apresentaram fenda parcial. G3) Observou-se 88,24% apresentaram fenda incompleta, 5,88% apresentaram fenda completa e 5,88% ausência de fenda. G4) dos 31 animais, (54,4%) apresentaram fenda incompleta, e 32,26% apresentaram fenda completa e (12,9%) sem fenda. / The aim of the present study is to determine whether (FA) prevented cortisone-induced cleft palate (CP) in the Holtzman mouse. The animals were divided in 4 groups: G1- 3 pregnant mice had 3mg/Kg of Dex intramuscularly administrated (IA) from the 14th to 17th day of gestation; G2- 4 pregnant mice had 3mg/Kg of Dex IA from the 14th to 17th day of gestation, with a daily dose (dd) of 5mg/kg FA oral administrated (OA) from 14th to 17th day of gestation; G3- 3 pregnant mice had 3mg/Kg of Dex IA from the 14th to 17th day of gestation, with a (dd) of 5mg/kg FA OA from day 0 until 17th day of gestation; G4- 3 pregnant mice had 3mg/Kg of Dex IA from 14th to 17th day of gestation, with a (dd) of 5mg/kg FA OA 5 days before the fertilization until the 17th day of gestation. The fetuses were examined on 19th day of gestation. The data was analyzed by not paired Kruskal-Wallis test, and showed statistical difference among average score values. The results demonstrated that (96,3%) (G1) had total CP, and only 1 partial CP. In the (G2), (8,7%) showed total CP, (47,8%) partial CP and (43,35%) showed no CP. The (G3) showed (5,88%) had total CP, (88,24%) partial CP and (5,88%) had no CP. In the (G4), (54,4%) showed partial CP and (32,26%) total CP. Only (12,9%) had no CP. These results indicated that FA reduces the incidence of Dex-induced cleft palate independently on the period of the administration.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-07Bitstream added on 2014-11-10T11:58:20Z : No. of bitstreams: 1 000774432_20150530.pdf: 1155206 bytes, checksum: 75ba8f4ab9965441201ba92669b126ba (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:44Z: 000774432_20150530.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:10Z : No. of bitstreams: 1 000774432.pdf: 2712576 bytes, checksum: 93c3b29a0b848195159ba8b85d09eed4 (MD5) / Neste trabalho desenvolveu-se um método eletroanalítico em superfície de eletrodo sólido com filme intermetálico Ag2Hg3.02 (AgSIE), para a determinação do ácido fólico (FA). O AgSIE foi utilizado em substituição ao eletrodo de Hg líquido de modo a atender ao conceito da “química verde”. Aplicou-se a técnica de Voltametria de Onda Quadrada Adsortiva de Redissolução (SWAdSV - do inglês: Square Wave Adsorptive Stripping Voltammetry), considerando-se a frequência analítica, seletividade e sensibilidade do método. O FA apresentou um pico de redução em -0,6 V vs. Esce , com características de processo adsortivo. Otimizou-se os parâmetros experimentais e as curvas analíticas (n= 5) foram construídas por diluição da solução padrão, no intervalo de 0,2 x 10-7 a 10,6 x 10-7 mol L-1. Os limites de detecção e de quantificação obtidos para o FA foram LD= 6,79 x 10-10 mol L-1 e LQ= 2 x 10-8 mol L-1, respectivamente. O método de adição de padrão foi aplicado para a determinação do FA em fármacos de ácido fólico contendo 5,0 mg/tablet, resultando numa recuperação de R%= 98,4  2,7 %, (m= 4,9 ± 0,1) mg (FAFI), R%= 99,9  2,9 %, (m= 4,9 ± 0,15) mg (FAFII) e para o multivitamínico de 0,25 mg/tablete: R%= 99,4  1,54 % (m= 0,24 ± 0,03) mg (FAFIII) e nas amostras de sucos de frutas in natura e industrializados, foram obtidas as concentrações de 0,3 a 84,4 g L-1. A técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC - do inglês: High Performance Liquid Chromatography), foi utilizada na determinação de FA em fármacos e sucos de frutas para comparação dos resultados, assim, foi conduzida em coluna ODS-C18, de 150 x 4,6 mm (5 m), fase móvel de ACN/HAC-KOH, eluição por gradiente (10:90, v/v), pH 2,88, fluxo 0,5 mL min -1 e detector UV-vis máx. 280 nm. A curva analítica (n= 3) do ácido fólico, foi construída no intervalo de 1,41 x 10-6 a 4,53 x 10-5 mol L-1 e calculou-se... / In this work we developed na electroanalytical method on the surface of solid intermetallic electrode film Ag2Hg3.02 (AgSIE) for the determination of folic acid (FA). The AgSIE was used instead of liquid Hg electrode in order to attend to the concept of green chemistry . We applied the technique of square wave voltammetry toAdsorptive Stripping Voltammetry (SWAdSV), considering the analytical frequency selectivity and sensitivity of the method. The FA showed a peak reduction in -0,6 vs. Esce, with characteristics of adsorptive process. Optimized the experimental parameters and the analytical curves (n = 5) were constructed by diluting the standard solution in the range from 0.2 x 10-7 to 10.6 x 10-7 mol L- 1. The limits of detection and quantification were obtained for the FA LD = 6.79 x 10-10 mol L -1 and LQ = 2 x 10-8 mol L- 1, respectively. The standard addition method was used for determination of FA in folate pharmaceutical containing 5.0 mg / tablet , resulting in recovery of R % = 98.4  2.7% (mean = 4.9 ± 0 1 ) mg ( FAFI ), R = 99.9 %  2.9% (mean = 4.9 ± 0.15) mg ( FAFII ) and the multivitamin 0.25 mg / tablet : R % = 99.4  1.54 % ( m = 0.24 ± 0.03 ) mg ( FAFIII) and in samples of fruit juices in natura and processed , the concentrations from 0.3 to 84.4 mg L- 1 were obtained. The technique of High Efficiency Liquid Chromatography (HPLC), was utilized in the determination of FA in pharmaceutical and fruit juices for comparison, so the results was conducted in ODS - C18 column, 150 x 4.6 mm ( 5 m) mobile phase ACN / HAC-KOH, elution gradient (10:90, v / v ), pH 2.88, flow of 0.5 mL min -1 and UV-vis detector máx. 280 nm. The analytical curve (n = 3) of folic acid was built in the range from 1.41 x 10-6 to 4.53 x 10-5 mol L- 1 and calculated, LD = 8.38 x 10-8 mol L- 1 and LQ = 2.49 x 10-7 mol L- 1 . Accuracy was assessed pharmaceutical (5.0 mg / tablet ) for two dilutions 5:10 g mL -1, FAFI in obtaining the...

Introdução: A Síndrome de Down (SD) é um distúrbio genético complexo atribuído à presença de três cópias do cromossomo 21. O cromossomo 21 extra é de origem materna em quase 95% dos casos, originado por um erro na segregação cromossômica durante a meiose. O único fator de risco reconhecido para erros devido a não-disjunção é a idade materna avançada na concepção. Um estudo preliminar sugeriu que alterações no metabolismo do folato e o polimorfismo C677T do gene MTHFR poderiam ser considerados fatores de risco materno para SD. Objetivos: Este estudo procurou associar alguns fatores genéticos - relacionados aos polimorfismos em genes que codificam enzimas que participam do metabolismo do ácido fólico/homocisteína - e fatores ambientais - relacionados a dosagens de folato e vitamina B12, além de hábitos maternos durante a gestação - como possíveis fatores de risco para SD e suas malformações maiores. Material e Métodos: Foram analisados os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR, A2756G do gene MTR, A66G do gene MTRR, 844ins68 do gene CBS e A80G do gene RFC-1 em 239 mães de crianças com SD e 197 mães de crianças normais, através de um estudo caso-controle. Também foram feitas dosagens de folato e vitamina B12 em 150 mães casos e 148 mães controle. Resultados: A distribuição das variantes genotípicas foi comparada entre mães de crianças com SD e mães controle, e não demonstrou diferença estatisticamente significativa quando avaliadas separadamente. Quando a análise foi controlada pela idade materna apenas o polimorfismo C677T do gene MTHFR apresentou tal associação (p=0,05). Os genótipos combinados 677CT ou TT e 1298AA do gene MTHFR aumentaram o risco de SD na prole em quase duas vezes (OR= 1,99; IC95% 1,11-3,55). Além disto, mães que possuem um ou dois genótipos de risco - relacionados a outros polimorfismos que não os do gene MTHFR - têm 4,62 e 5,02 vezes mais chances de ter um filho com SD quando comparadas a mães contoles (IC 95% 1,22-17,46 e 1,36-18,55, respectivamente). A combinação dos genótipos MTHFR CT+TT e MTRR AG+GG foi associada a um aumento de 1,55 (IC95% 1,03-2,35) vezes no risco de ter um filho com SD. Mães de crianças com SD que possuem o alelo 677T apresentaram menores níveis plasmáticos de vitamina B12 (p<0,02). Adicionalmente, a presença do alelo 677T em mães casos resultou em um aumento de 2,07 vezes no risco de ter um filho com SD e defeito congênito do coração (p<0,01). Mães de crianças com SD e malformações cardíacas que possuem os genótipos 677CT ou TT, associado ao não uso de ácido fólico periconcepcional tiveram um aumento de 2,26 vezes no risco de ter um filho com SD e malformações cardíacas. Conclusões: Nossos resultados mostraram que apenas o alelo 677T do gene MTHFR parece estar relacionado à etiologia da SD quando considerado isoladamente. Igualmente, o efeito das combinações de genótipos de risco entre os genes MTR, MTRR, CBS e RFC podem ser considerados fatores de risco pra SD em nossa população. Finalmente, o alelo materno 677T pode estar associado ao aumento na ocorrência de defeitos congênitos do coração em crianças com SD. Pode-se supor que mulheres que possuem este polimorfismo possam obter benefícios a partir da suplementação vitamínica contendo ácido fólico na gestação para proteção contra malformações cardíacas em seus filhos com SD. / Introduction: Down syndrome (DS) is a complex genetic disorder attributed to the presence of three copies of chromosome 21. The extra chromosome derives from the mother in almost 95% of cases and is due to abnormal chromosome segregation during meiosis. Except for advanced age at conception, maternal risk factors for meiotic nondisjunction are not well established. A preliminary study suggested that abnormal folate metabolism and the C677T polymorphism in MTHFR gene may be maternal risk factors for DS. Objectives: This study evaluated the association between genetic factors - related to the polymorphisms in genes that encode enzymes of folic acid/homocysteine metabolism; and environmental factors - related to folate and B12 vitamin, besides maternal habits during pregnancy- as possible risk factors for DS and their major malformations. Material and Methods: We analyzed the polymorphisms C677T and A 1298C of MTHFR gene, A2756G of MTR gene, A66G of MTRR gene, 844ins68 of CBS gene and A80G of RFC-1 gene in 239 mothers of child with DS and 197 normal children, through a casecontrol study. Dosages of folate and B12 vitamin in 150 case mothers and 148 control mothers where also done. Results: The distribution of these genotypic variants was similar between mothers of DS children and control mothers of normal children, and didn’t show statistical significant differences when considered alone. When this analyze was controlled for maternal age, just the C677T polymorphism of MTHFR gene presented a significant association (p=0.05). The combined genotypes 677CT or TT and 1298AA increased the risk of DS offspring (OR= 1.99; 95%CI 1.11-3.55). Besides that, mothers that have one or two risk genotypes - related to other polymorphisms than MTHFRs - have 4.62 and 5.02 more chances of having a child with DS when compared to control mothers. The combined genotypes MTHFR CT+TT e MTRR AG+GG was associated with na incresed risk of de 1.55 fold (IC95% 1,03-2,35) in the risk of having a DS child. Mothers of DS that carry the 677T allele presented the lowest plasmatic levels of B12 vitamin (p<0.02). Additionally, the presence of the 677T allele in case mothers resulted in a 2.07-fold higher risk of congenital heart defects (CHD) in the offspring (p<0.01). In 57 mothers of CHD affected DS child who carry MTHFR 677CC or TT genotypes in combination with no use of periconceptional folate intake had a 2.26 fold increased risk of having any CHD affected DS child in offspring. Conclusions: Our results show that only the 677T allele of MTHFR gene seems to be involved with the etiology of Down syndrome in our population when considered alone. Equally, the effect of risk genotypes combinations among genes MTR, MTRR, CBS and RFC may be considered as a risk factor for DS in our population. And finally, maternal 677T allele may be associated to increased occurrence of congenital heart anomalies in DS child in our population. We can also expect that women who carry this polymorphism can have benefits from periconceptional folate supplementation to protect against CHD in DS offspring.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo caracterizado, bioquimicamente, pela deficiência da enzima cistationina-β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos e vasculares característicos, como retardo mental e arteriosclerose, cuja fisiopatologia é desconhecida. No presente trabalho, avaliamos os efeitos in vitro e in vivo da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos. Primeiramente, observamos o efeito in vitro da exposição de homogeneizados de córtex parietal de ratos ao ácido fólico, avaliando a inibição causada pela homocisteína sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas plasmáticas. Nos estudos in vivo, investigamos o efeito do pré-tratamento com ácido fólico sobre a inibição das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase em córtex parietal e em soro de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia aguda, respectivamente. Considerando que a Na+,K+-ATPase é suscetível ao ataque de radicais livres, nós determinamos o efeito da hiperhomocisteinemia aguda sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo total de grupos tióis em córtex parietal de ratos. Finalmente, investigamos o efeito do ácido fólico sobre a redução da atividade da Na+,K+-ATPase em córtex parietal e sobre o aumento do índice de dano ao DNA em sangue total de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia crônica. Nossos resultados mostraram que a homocisteína in vitro reduz, significativamente, a atividade da Na+,K+-ATPase e que o ácido fólico previne esse efeito. Estudos cinéticos com o substrato ATP revelaram que a homocisteína inibe de forma não-competitiva a enzima Na+,K+-ATPase. Os estudos in vivo confirmaram que a hiperhomocisteinemia aguda diminui as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase e que o pré-tratamento com ácido fólico também previne os efeitos causados pela homocisteína. Por outro lado, a hiperhomocisteinemia aguda não alterou os parâmetros de estresse oxidativo analisados. A hiperhomocisteinemia crônica inibiu a Na+,K+-ATPase em córtex parietal e aumentou o índice de dano ao DNA em sangue total de ratos e, novamente, o tratamento com ácido fólico previne tais efeitos. Esses resultados, em conjunto, revelam os efeitos da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos e colaboram com o entendimento da fisiopatologia da homocistinúria. Além disso, os resultados sugerem que o ácido fólico, já utilizado por alguns pacientes homocistinúricos, poderá ser uma importante ferramenta terapêutica utilizada na prevenção dos efeitos neurológicos e vasculares da homocisteína.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / O envelhecimento acarreta um declínio funcional que atinge a expressiva maioria dos organismos vivos. A deficiência ou suplementação de vitaminas, como o ácido fólico (AF) durante a gestação pode interferir no processo de envelhecimento. Portanto, o objetivo do trabalho foi avaliar parâmetros de memória e inflamação na prole adulta e idosa de ratas com deficiência ou suplementação de AF na gestação. Foram utilizadas 50 ratas e 50 ratos Wistar para acasalamento. Após, a ratas prenhas permaneceram durante 28 dias de gestação com diferentes dietas: dieta AIN 93 ou controle, dieta deficiente em AF, dieta AIN 93 + AF 5 mg/kg, dieta AIN 93 + AF 10 mg/kg e dieta AIN 93 + AF 50 mg/kg. A prole fêmea de todos os grupo experimentais quando jovens adultas (2 meses) e somente a prole de ratas com AIN 93, deficientes de AF e AIN 93 + AF 10mg/kg, quando idosas (18 meses) foram submetidas ao teste de habituação ao campo aberto e córtex e hipocampo foram utilizados para as análises bioquímicas. Os resultados mostram que a deficiência de AF no período gestacional, não altera a memória de habituação na prole adulta. Na prole com 18 meses, o grupo controle e o grupo deficiente em AF apresentaram dano na memória de habituação. Porém, a prole com 18 meses do grupo AF 10 mg/kg apresentou proteção contra este efeito. O AF 50 mg/kg induziu dano na memória de habituação na prole jovem. Foi observado também que os níveis de TNF-α e IL-1β foram aumentados no hipocampo da prole com 18 meses do grupo controle e com deficiência de AF. No grupo AF 10 mg/kg não foi observado este aumento. A prole com 2 meses do grupo AF 50 mg/kg apresentou redução dos níveis de IL-1β no hipocampo. Não foram observadas alterações nos níveis de TNF-α e IL-1β no córtex frontal da prole. Além disso, no córtex frontal, foi observado que a prole com 2 meses do grupo AF 10 mg/kg mostrou aumento da IL-4 e na grupo AF 50 mg/kg ocorreu redução da IL-4. No córtex frontal de animais idosos foi observado redução da IL-4 no grupo controle, já no grupo AF 10 mg/kg, foi observado aumento desta interleucina. No hipocampo, a prole com 2 meses do grupo deficiente e do grupo AF 50 mg/kg apresentaram redução dos níveis de IL-4. Já a prole jovem do grupo AF 10 mg/kg apresentou aumento dos níveis de IL-4. Juntos, os resultados indicam que a suplementação com AF durante a gestação pode proteger a prole idosa contra o dano cognitivo do envelhecimento, que pode ser explicado, pelo menos em parte, pela redução dos níveis de TNF-α e IL-1β e aumento de IL-4 em tecido cerebral. Também, foi observado que a suplementação de ratas com altas doses de AF na gestação pode provocar dano cognitivo na prole com idade adulta, podendo ser explicado, pelo menos em parte, pela redução dos níveis de IL-4 no córtex frontal e hipocampo destes animais.