moderadas, ela proporciona efeitos benéficos sobre as funções cognitivas na vida adulta e no decorrer do envelhecimento. No entanto, a ingestão crescente de bebidas contendo cafeína por adolescentes tem causado preocupação, pois os efeitos desta substância sobre as funções cognitivas e a maturação do encéfalo durante a adolescência são pouco conhecidos. A cafeína atravessa a placenta e a barreira hemato-encefálica e o seu consumo tem sido associado ao maior risco de aborto espontâneo e baixo peso ao nascer. Portanto, nos estágios iniciais do desenvolvimento encefálico o consumo de cafeína também carece de maiores eslcarecimentos. Nesta tese, o impacto do consumo de cafeína durante diferentes fases de desenvolvimento do encéfalo foi investigado sobre o comportamento e proteínas sinápticas em ratos. No primeiro capítulo, ratos adolescentes machos consumiram cafeína na água de beber nas doses de 0,1; 0,3 e 1,0 g/L (correspondendo ao consumo baixo, moderado e elevado, respectivamente) somente durante o seu período ativo (das 19 às 7 horas). Nenhuma das doses testadas teve efeito sobre a atividade locomotora, porém todas desencadearam efeitos ansiogênicos. A cafeína (0,3 e 1,0 g/L) melhorou o desempenho na tarefa de reconhecimento ao objeto, enquanto na dose mais elevada (1,0 g/L) os animais não habituaram ao campo aberto, uma forma de avaliar o aprendizado não-associativo. Todas as doses testadas reduziram a densidade de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e proteína associada ao sinaptossoma (SNAP-25) sem causar alterações na imunorreatividade da proteína nuclear específica para neurônios (NeuN) no hipocampo e no córtex cerebral No hipocampo, a cafeína (em todas as doses testadas) aumentou a densidade de receptor de adenosina A1 e reduziu a do factor neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) e sua forma precursora (proBDNF) (1,0 g/L). No córtex cerebral, a cafeína (1,0 g/L) reduziu a densidade do receptor A1 e aumentou a do BDNF e do proBDNF (0,3 e 1,0 g/L). Estes resultados revelam que o consumo de cafeína por ratos adolescentes exacerba a ansiedade, mas provoca diferentes efeitos sobre a memória, melhorando a de reconhecimento e prejudicando o aprendizado não associativo. Parte destes efeitos foi associada às mudanças nos níveis de BDNF, GFAP e SNAP-25, porém sem perda da viabilidade neuronal aparente no hipocampo e no córtex cerebral. No segundo capítulo, o impacto do consumo de cafeína (0,1; 0,3 e 1,0 g/L na água de beber, das 19 às 7 horas) foi investigado sobre o comportamento e proteínas sinápticas na vida adulta dos animais que consumiram cafeína no decorrer do desenvolvimento encefálico. O consumo de três diferentes doses de cafeína iniciou 15 dias antes do acasalamento e permaneceu durante a prenhez e lactação. A partir do desmame os animais foram divididos em dois grupos: os que consumiram cafeína até a vida adulta (ao longo da vida) e os que interromperam o consumo (desenvolvimento). Esses dois grupos também foram subdivididos e analisados de acordo com o sexo. Foram comparados os efeitos destes protocolos sobre o comportamento e a densidade de proteínas sinápticas do hipocampo e córtex de fêmeas e machos adultos. A memória de reconhecimento foi prejudicada nas fêmeas que receberam cafeína (0,3 e 1,0 g/L) durante o desenvolvimento, o que coincidiu com o aumento do proBDNF e níveis inalterados de BDNF no hipocampo Ambos os protocolos de exposição causaram hiperlocomoção nos machos, enquanto que nas fêmeas somente a exposição ao longo da vida aumentou a atividade locomotora de forma significativa. Já no comportamento relacionado à ansiedade, ambos os sexos apresentaram um perfil ansiolítico ao consumir cafeína (1,0 g/L) ao longo da vida. Ambos os regimes de administração diminuíram os níveis de GFAP e SNAP-25 no hipocampo dos ratos machos. A densidade do receptor de TrkB foi reduzida no hipocampo em ambos os sexos e protocolos de exposição. No córtex cerebral BDNF e proBDNF aumentaram com o consumo de cafeína ao longo da vida nos machos. Nas fêmeas houve aumento no BDNF, mas não no proBDNF, em ambos regimes de administração. O receptor TrkB diminuiu no córtex dos ratos machos que receberam cafeína somente durante o desenvolvimento. Ambas proteínas – GFAP e SNAP-25 – aumentaram suas densidades nos machos que receberam ambos regimes de administração. Estes resultados revelaram que o consumo de cafeína ao longo da vida pode recuperar o prejuízo na memória de reconhecimento das fêmeas que consumiram a substância durante o desenvolvimento e indicam que a exposição durante um período específico do desenvolvimento do encéfalo promove alterações comportamentais dependentes do sexo, as quais nós relacionamos com modificações na sinalização BDNF. Os resultados desta tese destacam a importância de controlar o consumo de cafeína em períodos críticos para o desenvolvimento encefálico de ratos, e aponta para um efeito dependente do sexo. No entanto, mais estudos são necessários para ampliar nosso conhecimento sobre as possíveis vias de sinalização envolvidas nestes processos. / Caffeine is the most consumed psychostimulant substance worldwide, with benefits for cognitive functioning. Caffeine intake at moderate doses also prevents age-related cognitive decline. However, health experts have raised concerns about the growing intake of caffeine-containing drinks by adolescent population. In fact, the effects of caffeine on cognitive functions and neurochemical aspects of late brain maturation during adolescence are poorly understood. In addition, caffeine consumption in the early stages of fetal development has been associated with miscarriage and low birth weight, since it penetrates placenta and blood-brain barrier during pregnancy. Therefore, the impact of caffeine intake was investigated during different stages of brain development. In the first chapter of this thesis, adolescent male rats consumed caffeine in the drinking water (0.1; 0.3 and 1.0 g/L corresponding to low, moderate and high doses, respectively) only during their active period (from 7:00 p.m. to 7:00 a.m.). None of the doses tested had effect on locomotor activity, whereas all triggered anxiogenic effects. Caffeine (0.3 and 1.0 g/L) improved the performance in the object recognition task, but the higher dose of caffeine (1.0 g/L) decreased habituation in open field arena, suggesting a non-associative learning impariment. All tested doses reduced glial fibrillary acidic protein density (GFAP) and synaptosome-associated protein (SNAP-25) without causing any changes in immunoreactivity for neuronspecific nuclear protein (NeuN) in the hippocampus and cerebral cortex. In the hippocampus, caffeine (all doses tested) increased adenosine A1 receptor density and reduced brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and proBDNF (1.0 g/L). In the cerebral cortex, caffeine (1.0 g/L) reduced adenosine A1 receptor and increased BDNF and proBDNF density (0.3 and 1.0 g/L) These findings document the effects of caffeine consumption in adolescent rats with a dual impact on anxiety and recognition memory, associated with changes in BDNF, GFAP and SNAP-25 levels without apparent neuronal loss in hippocampus and cerebral cortex. In the second chapter, it was tested whether caffeine consumption (0.1; 0.3 and 1.0 g/L in drinking water, from 7:00 p.m. to 7:00 a.m) throughout life may reverse the negative effects caused by the consumption of caffeine in the early stages of development. For this, we used exposure protocols with the end in postnatal days (PND) 21 (development) or 90 (throughout life); both protocols starting 15 days before mating. The effects of these protocols on the behavior and hippocampal synaptic proteins density of adult female and male rats were compared. Recognition memory was impaired in females receiving caffeine (0.3 and 1.0 g/L) during development, which coincided with increased proBDNF levels and unchanged BDNF in the hippocampus. Both exposure protocols caused hyperlocomotion in males, whereas in females only the exposure throughout life significantly increased locomotor activity. Considering the anxiety related behavior, both sexes presented an anxiolytic profile when consuming caffeine (1.0 g/L) throughout life. Both exposure regimens decreased hippocampal GFAP and SNAP-25 of male rats. The hipocampal TrkB receptor was reduced in both sexes and protocols of exposure In the cortex, both proBDNF and BDNF increased in males receiving caffeine throughout life as well as GFAP and SNAP-25 increased in both treatments regimen. The results revealed that caffeine consumption throughout life can recover the impairment in recognition memory of females that consumed caffeine during development and indicate that exposure for a specific period of brain development promotes sex-dependent behavioral changes, which we relate to alterations in BDNF signaling. The results of this thesis emphasize the importance of controlling caffeine intake during critical periods of brain development of rats and points to a sex dependent effect. However, more studies are needed to expand our knowledge about the possible signaling pathways involved in these processes.

A linhagem de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) tem sido utilizada para como modelo animal para hipertensão humana, uma vez que estes animais desenvolvem pressóricos aumentados, hipertrofia ventricular esquerda, aumento de colágeno intersticial e disfunção diastólica. Embora o excesso de colágeno fibrilar tenha sido bem estudado neste modelo e esteja envolvido na insuficiência cardíaca observada, não há estudos quantitativos acurados (baseados na estereologia) para avaliar precisamente o volume tecidual ocupado pelo colágeno fibrilar e o remodelamento das fibrilas de colágeno segundo seu diâmetro uma vez que variações no diâmetro das fibrilas têm grande impacto funcional Mais ainda, nunca foi estudado neste modelo o remodelamento das fibras do sistema elástico (oxitalânicas, elaunínicas e elásticas propriamente ditas), que juntamente com o componente colagênico são responsáveis pelas características biomecânicas do tecido. Assim sendo, os corações de ratos Wistar (WIS), Wistar Kyoto (WKY) e SHR foram submetidos a análise hemodinâmicas e foram processados para microscopia de luz e eletrônica, segundo amostragem estereológica. Cortes corados com HE foram utilizados para avaliação do diâmetro dos cardiomiócitos e do volume absoluto do coração e do ventrículo esquerdo; cortes corados com Picrossirius-hematoxilina foram utilizados para a avaliação da fração de volume ocupada por colágeno no ventrículo esquerdo e volume absoluto de colágeno; cortes ultra-finos foram utilizados para avaliação do diâmetro das fibrilas de colágeno cortadas transversalmente e para avaliação da distribuição das fibras oxitalânicas, elaunínicas e elásticas. Os resultados mostram que a hipertrofia ventricular dos animais SHR deveu-se à hipertrofia dos cardiomiócitos associada à maior quantidade de colágeno fibrilar (3,8 x maior no SHR que no WIS). A análise ultraestrutural mostrou que as fibrilas de colágeno no endomísio variam, em nanômetros, de 31 a 53 nos animais WIS, de 36 a 67 nos WKY e de 31 a 85 nos SHR, com medianas respectivamente de 39,58, 48,38 e 54,39, sendo que do ponto de vista estatístico a distribuição dos diâmetros das fibrilas colágenas dos animais SRH é diferente das outras duas linhagens.A análise uttra-estrutural das fibras do sistema elástico mostrou que as fibras oxitalânicas, elaunínicas e elásticas apresentam uma distribuição diferencial nos diversos compartimentos da parede cardíaca dos animais, sendo que nas três linhagens há fibras elásticas propriamente ditas no endocárdio e epicárdio; no entanto, no perimísio as fibras elásticas e elaunínicas aparecem raramente nos ratos SRH e com maior freqüência nos WIS e WKY; no endomísio dos ratos SRH não foi possível observar a mesma riqueza de fibras elásticas e elaunínicas presentes nas outras linhagens, havendo assim um predomínio de fibras oxitalânicas no vi endomísio dos animais SHR. Os resultados mostram que, além das modificações quantitativas no conteúdo de colágeno no miocárdio do ventrículo esquerdo dos animais SHR, há também uma alteração qualitativa na população de fibrilas colagênicas que passa a ser constituída por fibrilas mais grossas. Mais ainda, os resultados mostram que, em relação às fibras do sistema elástico, a predominância de fibras oxitalânicas no endomísio dos animais SHR sugere que as forças de tensão maiores no coração destes animais modulem não somente o sistema colagênico mas também o sistema elástico no sentido de acumular fibras que suportam melhor as cargas, contribuindo para a perda da complacência da parede ventricular / The strain of spontaneously hypertensive rats (SHR) has been used as an animal model for human hypertension, since these animals develop increased blood pressure, left ventricular hypertrophy, increased interstitial collagen and diastolic dysfunction. Although excess fibrillar collagen has been well studied in this model and is involved in observed heart failure, there are no accurate quantitative studies (i.e., based on stereology) to precisely assess the volume of tissue occupied by fibrillar collagen neither the remodeling of collagen fibrils with respect to their diameters, and such studies are very important because variations in the diameter of the fibrils have a major functional impact. Moreover, the remodeling of elastic system fibers (oxytalan, elauninic and elastic proper), which together with the collagenous component are responsible for biomechanical features of the tissue, has never been studied in this model. Thus, the hearts of Wistar (WIS), Wistar Kyoto (WKY) and SHR rats went through hemodynamic analysis and were processed for light and electron microscopy, according to stereological sampling criteria. HE-stained sections were used to evaluate the diameter of the cardiomyocytes and the absolute volume of the heart while left ventricular sections stained by Picrosirius-hematoxylin were used to evaluate the volume fraction occupied by collagen in the left ventricle as well as its absolute volume of collagen; ultra-thin sections were used for evaluation of the diameter of transversally sectioned collagen fibrils and for evaluation of the distribution of oxytalan, elauninic and elastic proper fibers. The results show that the ventricular hypertrophy of SHR rats was due to cardiomyocyte hypertrophy associated with a higher amount of fibrillar collagen (3.8 times as high as in the WIS rats). The ultrastructural analysis showed that the collagen fibrils in the endomysium range in nanometers, from 31 to 53 in WIS animals, 36 to 67 in the WKY and 31 to 85 in SHR, with medians 39.58, 48.38 and 54.39, respectively. The distribution of diameters of collagen fibrils is statistically different in SRH animals when compared to the other two strains. The ultrastructural analysis of the fibers of the elastic system showed that oxytalan, elauninic and elastic fibers present a differential distribution across the various compartments of the heart wall of the animals. In the three strains there are elastic fibers proper in the endocardium and epicardium, while in the perimysium, the elastic fibers proper and the elauninic fibers rarely appear in SRH rats, being more frequent in WIS and WKY rats; the endomysium of SRH rats did not exhibit the same richness of elastic fibers proper and elauninic fibers present in other strains, occurring thus a predominance of oxytalan fibers in the endomysium of SHR rats. viii The results also show that, in addition to the quantitative changes in collagen content of left ventricular myocardium of SHR rats, there is a qualitative alteration in the population of collagen fibrils that is richer in thicker fibrils. Moreover, the results show that, with respect to the fibers of the elastic system, the predominance of the oxytalan fibers in the endomysium of SHR rats suggests that the higher tensile forces in the hearts of these animals modulate not only the collagenous system but also the elastic system, entailing accumulation of fibers suited to better support the loads, contributing to the loss of ventricular wall compliance

Astrócitos são células gliais com fundamental importância no sistema nervoso central (SNC), tanto em condições fisiológicas quanto patológicas. Estas células são essenciais na plasticidade neural, no metabolismo de neurotransmissores, na defesa antioxidante, na regulação do metabolismo energético, na homeostase iônica, na resposta inflamatória, na manutenção da barreira sangue-cérebro, na migração neuronal e na estabilização da comunicação entre as células. Assim, alterações em funções astrocitárias (como as que ocorrem no envelhecimento) estão relacionadas a importantes alterações na funcionalidade cerebral. Desta forma, esta tese teve por objetivo demonstrar que a cultura de astrócitos derivada de ratos Wistar adultos, desenvolvida e caracterizada pelo nosso grupo de pesquisa, pode ser um modelo de estudo fidedigno e versátil das propriedades celulares astrocitárias. Nossos resultados apontam que esta metodologia pode ser utilizada para elucidar o perfil de aminoácidos e gliotransmissores assim como da atividade enzimática glial e gerenciamento de neurotransmissores. Também demonstramos que a cultura adulta não é derivada de progenitores neurais e que parâmetros mitocondriais observados no cérebro adulto foram reproduzidos in vitro. A análise de respostas a estímulos demonstrou ser variável, dependendo da idade dos animais. Da mesma forma, o uso de culturas de diferentes idades revelou o efeito antienvelhecimento da guanosina, sugerindo sua atividade glioprotetora. Finalmente, demonstramos que culturas preparadas a partir de animais neonatos submetidas a um modelo de senescência in vitro apresentam respostas diferentes das apresentadas por culturas preparadas a partir de animais adultos e/ou envelhecidos, demonstrando que o modelo mais adequado para elucidar propriedades astrocitárias do cérebro maduro é o derivado de animais adultos. Portanto, demonstramos com este estudo a importância da disponibilidade de uma ferramenta como a cultura de astrócitos adultos e elucidamos características bioquímicas, celulares e moleculares desta ferramenta, evidenciando algumas de suas diferenças em comparação à cultura preparada a partir de ratos neonatos. Assim, ampliamos a compreensão das propriedades e funções celulares desta ferramenta, fornecendo respostas mais aproximadas às respostas fornecidas por astrócitos do cérebro maduro in vivo, especialmente no estudo do envelhecimento e das doenças neurodegenerativas. / Astrocytes are glial cells of pivotal importance in the central nervous system (CNS), both in physiological and pathological conditions. Some of their roles include neural plasticity, neurotransmitter metabolism, antioxidant defenses, control of energy metabolism, ionic homeostasis, inflammatory response, formation and maintenance of blood-brain barrier, neuronal migration and cellular communication. Thus, changes in astrocytic function (such as occurs in aging) are related to changes in brain function. The aim of this thesis was to demonstrate that astrocyte cultures from adult Wistar rats (developed and characterized by our research group) might be a reliable and versatile tool for studying astrocytic cellular properties. Our results suggest that this culture model is suitable to study the amino acids content and gliotransmitters, as well as glial enzymatic activity and neurotransmitter management. Next, we showed that the astrocyte cultures are not derived from neural progenitors and tissue mitochondrial parameters were reproduced in in vitro cultures. Responses to stimulus were variable, depending on the animals’ age. Accordingly, guanosine presented an anti-aging effect, indicating its glioprotective activity. Finally, we showed that cultures prepared from newborn rats submitted to an in vitro senescence model presented different responses when compared with mature animals, indicating that our culture model is the most suitable model to represent astrocytic properties in the mature brain. Therefore, this study demonstrates the relevance of this tool to understanding the biochemical, cellular and molecular properties of adult astrocytes, showing some differences related to the culture prepared from newborn animals. Thus, we amplify the comprehension about cellular functions of this tool, providing closer responses related to mature brain in vivo, especially regarding studies about aging and neurodegenerative diseases.

The aim of this study was to investigate whether exercise could improve motor behavioral deficits and alter expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in dorsal striatum in a 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of Parkinson’s disease (PD). To this end, animals were randomly divided into 4 groups: sham sedentary (SS, n = 7); sham trained (ST, n=8); lesioned sedentary (LS, n=8) and lesioned trained (LT, n = 8). Rats were unilaterally lesioned with 6-OHDA (10 μg/3 μg) injected into the left medial forebrain bundle and sham groups were only injected with vehicle solution. The treadmill training protocol consisted of running with progressive increase in velocity, 5 days/week, during 4 weeks. Behavioral tasks were applied to asses the motor abilities of all animals prior to 6-OHDA injection and at 8th and 29th days post-injection. The tyrosine hydroxylase (TH - in substantia nigra pars compacta) and GFAP (in dorsal striatum) immunostaining was evaluated by semiquantitative analysis of the intensity (optical density - OD). The 6-OHDA lesion decreased the OD of TH and increased the OD of GFAP. In addition, the 6-OHDA lesion increased the number of ipsilateral rotations induced by methylphenidate (40 mg/kg, i.p., 30 min) and caused motor behavioral deficits. On the other hand, the treadmill training resulted in an increase in maximal exercise capacity in both trained groups (ST and LT). The training was able to reduce the number of ipsilateral rotations and ameliorated the motor behavioral deficits on 8th and 29th days postlesion. Interestingly, the exercise led to a significant increase in OD of GFAP in the LT group while there was no such effect in ST group. Our results indicate that treadmill training can improve motor behavioral deficits and suggest that the effects of exercise may be directly or, indirectly, mediated by astrocytes, as an increase in GFAP was observed in the dorsal striatum. Nevertheless, these are the first data showing an increase in GFAP expression post-exercise in this model and further research is needed to determine the precise action of exercise on astrocytes in Parkinson’s disease.

moderadas, ela proporciona efeitos benéficos sobre as funções cognitivas na vida adulta e no decorrer do envelhecimento. No entanto, a ingestão crescente de bebidas contendo cafeína por adolescentes tem causado preocupação, pois os efeitos desta substância sobre as funções cognitivas e a maturação do encéfalo durante a adolescência são pouco conhecidos. A cafeína atravessa a placenta e a barreira hemato-encefálica e o seu consumo tem sido associado ao maior risco de aborto espontâneo e baixo peso ao nascer. Portanto, nos estágios iniciais do desenvolvimento encefálico o consumo de cafeína também carece de maiores eslcarecimentos. Nesta tese, o impacto do consumo de cafeína durante diferentes fases de desenvolvimento do encéfalo foi investigado sobre o comportamento e proteínas sinápticas em ratos. No primeiro capítulo, ratos adolescentes machos consumiram cafeína na água de beber nas doses de 0,1; 0,3 e 1,0 g/L (correspondendo ao consumo baixo, moderado e elevado, respectivamente) somente durante o seu período ativo (das 19 às 7 horas). Nenhuma das doses testadas teve efeito sobre a atividade locomotora, porém todas desencadearam efeitos ansiogênicos. A cafeína (0,3 e 1,0 g/L) melhorou o desempenho na tarefa de reconhecimento ao objeto, enquanto na dose mais elevada (1,0 g/L) os animais não habituaram ao campo aberto, uma forma de avaliar o aprendizado não-associativo. Todas as doses testadas reduziram a densidade de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e proteína associada ao sinaptossoma (SNAP-25) sem causar alterações na imunorreatividade da proteína nuclear específica para neurônios (NeuN) no hipocampo e no córtex cerebral No hipocampo, a cafeína (em todas as doses testadas) aumentou a densidade de receptor de adenosina A1 e reduziu a do factor neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) e sua forma precursora (proBDNF) (1,0 g/L). No córtex cerebral, a cafeína (1,0 g/L) reduziu a densidade do receptor A1 e aumentou a do BDNF e do proBDNF (0,3 e 1,0 g/L). Estes resultados revelam que o consumo de cafeína por ratos adolescentes exacerba a ansiedade, mas provoca diferentes efeitos sobre a memória, melhorando a de reconhecimento e prejudicando o aprendizado não associativo. Parte destes efeitos foi associada às mudanças nos níveis de BDNF, GFAP e SNAP-25, porém sem perda da viabilidade neuronal aparente no hipocampo e no córtex cerebral. No segundo capítulo, o impacto do consumo de cafeína (0,1; 0,3 e 1,0 g/L na água de beber, das 19 às 7 horas) foi investigado sobre o comportamento e proteínas sinápticas na vida adulta dos animais que consumiram cafeína no decorrer do desenvolvimento encefálico. O consumo de três diferentes doses de cafeína iniciou 15 dias antes do acasalamento e permaneceu durante a prenhez e lactação. A partir do desmame os animais foram divididos em dois grupos: os que consumiram cafeína até a vida adulta (ao longo da vida) e os que interromperam o consumo (desenvolvimento). Esses dois grupos também foram subdivididos e analisados de acordo com o sexo. Foram comparados os efeitos destes protocolos sobre o comportamento e a densidade de proteínas sinápticas do hipocampo e córtex de fêmeas e machos adultos. A memória de reconhecimento foi prejudicada nas fêmeas que receberam cafeína (0,3 e 1,0 g/L) durante o desenvolvimento, o que coincidiu com o aumento do proBDNF e níveis inalterados de BDNF no hipocampo Ambos os protocolos de exposição causaram hiperlocomoção nos machos, enquanto que nas fêmeas somente a exposição ao longo da vida aumentou a atividade locomotora de forma significativa. Já no comportamento relacionado à ansiedade, ambos os sexos apresentaram um perfil ansiolítico ao consumir cafeína (1,0 g/L) ao longo da vida. Ambos os regimes de administração diminuíram os níveis de GFAP e SNAP-25 no hipocampo dos ratos machos. A densidade do receptor de TrkB foi reduzida no hipocampo em ambos os sexos e protocolos de exposição. No córtex cerebral BDNF e proBDNF aumentaram com o consumo de cafeína ao longo da vida nos machos. Nas fêmeas houve aumento no BDNF, mas não no proBDNF, em ambos regimes de administração. O receptor TrkB diminuiu no córtex dos ratos machos que receberam cafeína somente durante o desenvolvimento. Ambas proteínas – GFAP e SNAP-25 – aumentaram suas densidades nos machos que receberam ambos regimes de administração. Estes resultados revelaram que o consumo de cafeína ao longo da vida pode recuperar o prejuízo na memória de reconhecimento das fêmeas que consumiram a substância durante o desenvolvimento e indicam que a exposição durante um período específico do desenvolvimento do encéfalo promove alterações comportamentais dependentes do sexo, as quais nós relacionamos com modificações na sinalização BDNF. Os resultados desta tese destacam a importância de controlar o consumo de cafeína em períodos críticos para o desenvolvimento encefálico de ratos, e aponta para um efeito dependente do sexo. No entanto, mais estudos são necessários para ampliar nosso conhecimento sobre as possíveis vias de sinalização envolvidas nestes processos. / Caffeine is the most consumed psychostimulant substance worldwide, with benefits for cognitive functioning. Caffeine intake at moderate doses also prevents age-related cognitive decline. However, health experts have raised concerns about the growing intake of caffeine-containing drinks by adolescent population. In fact, the effects of caffeine on cognitive functions and neurochemical aspects of late brain maturation during adolescence are poorly understood. In addition, caffeine consumption in the early stages of fetal development has been associated with miscarriage and low birth weight, since it penetrates placenta and blood-brain barrier during pregnancy. Therefore, the impact of caffeine intake was investigated during different stages of brain development. In the first chapter of this thesis, adolescent male rats consumed caffeine in the drinking water (0.1; 0.3 and 1.0 g/L corresponding to low, moderate and high doses, respectively) only during their active period (from 7:00 p.m. to 7:00 a.m.). None of the doses tested had effect on locomotor activity, whereas all triggered anxiogenic effects. Caffeine (0.3 and 1.0 g/L) improved the performance in the object recognition task, but the higher dose of caffeine (1.0 g/L) decreased habituation in open field arena, suggesting a non-associative learning impariment. All tested doses reduced glial fibrillary acidic protein density (GFAP) and synaptosome-associated protein (SNAP-25) without causing any changes in immunoreactivity for neuronspecific nuclear protein (NeuN) in the hippocampus and cerebral cortex. In the hippocampus, caffeine (all doses tested) increased adenosine A1 receptor density and reduced brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and proBDNF (1.0 g/L). In the cerebral cortex, caffeine (1.0 g/L) reduced adenosine A1 receptor and increased BDNF and proBDNF density (0.3 and 1.0 g/L) These findings document the effects of caffeine consumption in adolescent rats with a dual impact on anxiety and recognition memory, associated with changes in BDNF, GFAP and SNAP-25 levels without apparent neuronal loss in hippocampus and cerebral cortex. In the second chapter, it was tested whether caffeine consumption (0.1; 0.3 and 1.0 g/L in drinking water, from 7:00 p.m. to 7:00 a.m) throughout life may reverse the negative effects caused by the consumption of caffeine in the early stages of development. For this, we used exposure protocols with the end in postnatal days (PND) 21 (development) or 90 (throughout life); both protocols starting 15 days before mating. The effects of these protocols on the behavior and hippocampal synaptic proteins density of adult female and male rats were compared. Recognition memory was impaired in females receiving caffeine (0.3 and 1.0 g/L) during development, which coincided with increased proBDNF levels and unchanged BDNF in the hippocampus. Both exposure protocols caused hyperlocomotion in males, whereas in females only the exposure throughout life significantly increased locomotor activity. Considering the anxiety related behavior, both sexes presented an anxiolytic profile when consuming caffeine (1.0 g/L) throughout life. Both exposure regimens decreased hippocampal GFAP and SNAP-25 of male rats. The hipocampal TrkB receptor was reduced in both sexes and protocols of exposure In the cortex, both proBDNF and BDNF increased in males receiving caffeine throughout life as well as GFAP and SNAP-25 increased in both treatments regimen. The results revealed that caffeine consumption throughout life can recover the impairment in recognition memory of females that consumed caffeine during development and indicate that exposure for a specific period of brain development promotes sex-dependent behavioral changes, which we relate to alterations in BDNF signaling. The results of this thesis emphasize the importance of controlling caffeine intake during critical periods of brain development of rats and points to a sex dependent effect. However, more studies are needed to expand our knowledge about the possible signaling pathways involved in these processes.

Mesmo a isquemia sendo a terceira causa de morte em países industrializados, os mecanismos relacionados a esta doença ainda continuam polêmicos e obscuros. Utilizou-se a técnica de privação de oxigênio e glicose (OGD) em fatias do hipocampo de rato para investigar parâmetros mitocondriais, neurais, astrogliais e metabólicos no período de isquemia e durante o período de reoxigenação. Os resultados mostraram uma diminuição na atividade mitocondrial durante o período isquêmico que foi mantido durante todo o período de reoxigenação. Analisando o sobrenadante destas fatias submetidas à OGD, foi observado que os níveis de LDH, NSE e GFAP se elevaram. Com relação aos níveis de lactato, verificou-se sua diminuição durante todos os períodos. Os níveis de S100B estavam elevados somente durante o período de reoxigenação. Este aumento pode ser tanto um mecanismo de neuroproteção desta proteína frente ao insulto ou ainda uma liberação por dano celular astrocitário. Além disso, foi observado um grande aumento nos níveis de glutamato durante a isquemia e este aumento retornou no período de reoxigenação. Por fim, houve uma diminuição na captação de glutamato somente no período de reoxigenação. Todos estes resultados podem ser conseqüência de uma hiper-estimulação dos receptores glutamatérgicos devido ao insulto isquêmico. Em resumo, nosso estudo mostrou alterações em diversos parâmetros neuroquímicos específicos tanto no período isquêmico quanto na reoxigenação, mostrando que cada tipo celular, reage diferentemente frente ao insulto isquêmico na técnica de OGD in vitro. / Stroke is the third cause of mortality in industrialized countries, and the mechanisms related to this disease are polemic and unclear. Oxygen and glucose deprivation (OGD) in acute rat hippocampal slices was performed to investigate mitochondrial, neural, astroglial and metabolic neurochemical parameters at different ischemic and reoxygenation periods. Results showed the mitochondrial activity decrease due energy failure during ischemic insult and reoxygenation time. In the supernatant medium, LDH, NSE and glutamate levels were increased and the lactate decrease by the lack of energy observed in the ischemic period. Parameters such as GFAP, S100B and glutamate uptake suffered alterations only at the reoxygenation period. These results have shown the vulnerability of neurons facing ischemic insult. Meanwhile, it was also observed a delayed injure of astrocytes only at reoxygenation time, which demonstrate the difference between cell types at OGD. In summary, our finding has shown altered at specific neurochemical parameters in OGD in vitro which features the ischemic episodes and reoxygenation periods.

Astrócitos são células gliais com fundamental importância no sistema nervoso central (SNC), tanto em condições fisiológicas quanto patológicas. Estas células são essenciais na plasticidade neural, no metabolismo de neurotransmissores, na defesa antioxidante, na regulação do metabolismo energético, na homeostase iônica, na resposta inflamatória, na manutenção da barreira sangue-cérebro, na migração neuronal e na estabilização da comunicação entre as células. Assim, alterações em funções astrocitárias (como as que ocorrem no envelhecimento) estão relacionadas a importantes alterações na funcionalidade cerebral. Desta forma, esta tese teve por objetivo demonstrar que a cultura de astrócitos derivada de ratos Wistar adultos, desenvolvida e caracterizada pelo nosso grupo de pesquisa, pode ser um modelo de estudo fidedigno e versátil das propriedades celulares astrocitárias. Nossos resultados apontam que esta metodologia pode ser utilizada para elucidar o perfil de aminoácidos e gliotransmissores assim como da atividade enzimática glial e gerenciamento de neurotransmissores. Também demonstramos que a cultura adulta não é derivada de progenitores neurais e que parâmetros mitocondriais observados no cérebro adulto foram reproduzidos in vitro. A análise de respostas a estímulos demonstrou ser variável, dependendo da idade dos animais. Da mesma forma, o uso de culturas de diferentes idades revelou o efeito antienvelhecimento da guanosina, sugerindo sua atividade glioprotetora. Finalmente, demonstramos que culturas preparadas a partir de animais neonatos submetidas a um modelo de senescência in vitro apresentam respostas diferentes das apresentadas por culturas preparadas a partir de animais adultos e/ou envelhecidos, demonstrando que o modelo mais adequado para elucidar propriedades astrocitárias do cérebro maduro é o derivado de animais adultos. Portanto, demonstramos com este estudo a importância da disponibilidade de uma ferramenta como a cultura de astrócitos adultos e elucidamos características bioquímicas, celulares e moleculares desta ferramenta, evidenciando algumas de suas diferenças em comparação à cultura preparada a partir de ratos neonatos. Assim, ampliamos a compreensão das propriedades e funções celulares desta ferramenta, fornecendo respostas mais aproximadas às respostas fornecidas por astrócitos do cérebro maduro in vivo, especialmente no estudo do envelhecimento e das doenças neurodegenerativas. / Astrocytes are glial cells of pivotal importance in the central nervous system (CNS), both in physiological and pathological conditions. Some of their roles include neural plasticity, neurotransmitter metabolism, antioxidant defenses, control of energy metabolism, ionic homeostasis, inflammatory response, formation and maintenance of blood-brain barrier, neuronal migration and cellular communication. Thus, changes in astrocytic function (such as occurs in aging) are related to changes in brain function. The aim of this thesis was to demonstrate that astrocyte cultures from adult Wistar rats (developed and characterized by our research group) might be a reliable and versatile tool for studying astrocytic cellular properties. Our results suggest that this culture model is suitable to study the amino acids content and gliotransmitters, as well as glial enzymatic activity and neurotransmitter management. Next, we showed that the astrocyte cultures are not derived from neural progenitors and tissue mitochondrial parameters were reproduced in in vitro cultures. Responses to stimulus were variable, depending on the animals’ age. Accordingly, guanosine presented an anti-aging effect, indicating its glioprotective activity. Finally, we showed that cultures prepared from newborn rats submitted to an in vitro senescence model presented different responses when compared with mature animals, indicating that our culture model is the most suitable model to represent astrocytic properties in the mature brain. Therefore, this study demonstrates the relevance of this tool to understanding the biochemical, cellular and molecular properties of adult astrocytes, showing some differences related to the culture prepared from newborn animals. Thus, we amplify the comprehension about cellular functions of this tool, providing closer responses related to mature brain in vivo, especially regarding studies about aging and neurodegenerative diseases.

The aim of this study was to investigate whether exercise could improve motor behavioral deficits and alter expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in dorsal striatum in a 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of Parkinson’s disease (PD). To this end, animals were randomly divided into 4 groups: sham sedentary (SS, n = 7); sham trained (ST, n=8); lesioned sedentary (LS, n=8) and lesioned trained (LT, n = 8). Rats were unilaterally lesioned with 6-OHDA (10 μg/3 μg) injected into the left medial forebrain bundle and sham groups were only injected with vehicle solution. The treadmill training protocol consisted of running with progressive increase in velocity, 5 days/week, during 4 weeks. Behavioral tasks were applied to asses the motor abilities of all animals prior to 6-OHDA injection and at 8th and 29th days post-injection. The tyrosine hydroxylase (TH - in substantia nigra pars compacta) and GFAP (in dorsal striatum) immunostaining was evaluated by semiquantitative analysis of the intensity (optical density - OD). The 6-OHDA lesion decreased the OD of TH and increased the OD of GFAP. In addition, the 6-OHDA lesion increased the number of ipsilateral rotations induced by methylphenidate (40 mg/kg, i.p., 30 min) and caused motor behavioral deficits. On the other hand, the treadmill training resulted in an increase in maximal exercise capacity in both trained groups (ST and LT). The training was able to reduce the number of ipsilateral rotations and ameliorated the motor behavioral deficits on 8th and 29th days postlesion. Interestingly, the exercise led to a significant increase in OD of GFAP in the LT group while there was no such effect in ST group. Our results indicate that treadmill training can improve motor behavioral deficits and suggest that the effects of exercise may be directly or, indirectly, mediated by astrocytes, as an increase in GFAP was observed in the dorsal striatum. Nevertheless, these are the first data showing an increase in GFAP expression post-exercise in this model and further research is needed to determine the precise action of exercise on astrocytes in Parkinson’s disease.

Mesmo a isquemia sendo a terceira causa de morte em países industrializados, os mecanismos relacionados a esta doença ainda continuam polêmicos e obscuros. Utilizou-se a técnica de privação de oxigênio e glicose (OGD) em fatias do hipocampo de rato para investigar parâmetros mitocondriais, neurais, astrogliais e metabólicos no período de isquemia e durante o período de reoxigenação. Os resultados mostraram uma diminuição na atividade mitocondrial durante o período isquêmico que foi mantido durante todo o período de reoxigenação. Analisando o sobrenadante destas fatias submetidas à OGD, foi observado que os níveis de LDH, NSE e GFAP se elevaram. Com relação aos níveis de lactato, verificou-se sua diminuição durante todos os períodos. Os níveis de S100B estavam elevados somente durante o período de reoxigenação. Este aumento pode ser tanto um mecanismo de neuroproteção desta proteína frente ao insulto ou ainda uma liberação por dano celular astrocitário. Além disso, foi observado um grande aumento nos níveis de glutamato durante a isquemia e este aumento retornou no período de reoxigenação. Por fim, houve uma diminuição na captação de glutamato somente no período de reoxigenação. Todos estes resultados podem ser conseqüência de uma hiper-estimulação dos receptores glutamatérgicos devido ao insulto isquêmico. Em resumo, nosso estudo mostrou alterações em diversos parâmetros neuroquímicos específicos tanto no período isquêmico quanto na reoxigenação, mostrando que cada tipo celular, reage diferentemente frente ao insulto isquêmico na técnica de OGD in vitro. / Stroke is the third cause of mortality in industrialized countries, and the mechanisms related to this disease are polemic and unclear. Oxygen and glucose deprivation (OGD) in acute rat hippocampal slices was performed to investigate mitochondrial, neural, astroglial and metabolic neurochemical parameters at different ischemic and reoxygenation periods. Results showed the mitochondrial activity decrease due energy failure during ischemic insult and reoxygenation time. In the supernatant medium, LDH, NSE and glutamate levels were increased and the lactate decrease by the lack of energy observed in the ischemic period. Parameters such as GFAP, S100B and glutamate uptake suffered alterations only at the reoxygenation period. These results have shown the vulnerability of neurons facing ischemic insult. Meanwhile, it was also observed a delayed injure of astrocytes only at reoxygenation time, which demonstrate the difference between cell types at OGD. In summary, our finding has shown altered at specific neurochemical parameters in OGD in vitro which features the ischemic episodes and reoxygenation periods.

moderadas, ela proporciona efeitos benéficos sobre as funções cognitivas na vida adulta e no decorrer do envelhecimento. No entanto, a ingestão crescente de bebidas contendo cafeína por adolescentes tem causado preocupação, pois os efeitos desta substância sobre as funções cognitivas e a maturação do encéfalo durante a adolescência são pouco conhecidos. A cafeína atravessa a placenta e a barreira hemato-encefálica e o seu consumo tem sido associado ao maior risco de aborto espontâneo e baixo peso ao nascer. Portanto, nos estágios iniciais do desenvolvimento encefálico o consumo de cafeína também carece de maiores eslcarecimentos. Nesta tese, o impacto do consumo de cafeína durante diferentes fases de desenvolvimento do encéfalo foi investigado sobre o comportamento e proteínas sinápticas em ratos. No primeiro capítulo, ratos adolescentes machos consumiram cafeína na água de beber nas doses de 0,1; 0,3 e 1,0 g/L (correspondendo ao consumo baixo, moderado e elevado, respectivamente) somente durante o seu período ativo (das 19 às 7 horas). Nenhuma das doses testadas teve efeito sobre a atividade locomotora, porém todas desencadearam efeitos ansiogênicos. A cafeína (0,3 e 1,0 g/L) melhorou o desempenho na tarefa de reconhecimento ao objeto, enquanto na dose mais elevada (1,0 g/L) os animais não habituaram ao campo aberto, uma forma de avaliar o aprendizado não-associativo. Todas as doses testadas reduziram a densidade de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e proteína associada ao sinaptossoma (SNAP-25) sem causar alterações na imunorreatividade da proteína nuclear específica para neurônios (NeuN) no hipocampo e no córtex cerebral No hipocampo, a cafeína (em todas as doses testadas) aumentou a densidade de receptor de adenosina A1 e reduziu a do factor neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) e sua forma precursora (proBDNF) (1,0 g/L). No córtex cerebral, a cafeína (1,0 g/L) reduziu a densidade do receptor A1 e aumentou a do BDNF e do proBDNF (0,3 e 1,0 g/L). Estes resultados revelam que o consumo de cafeína por ratos adolescentes exacerba a ansiedade, mas provoca diferentes efeitos sobre a memória, melhorando a de reconhecimento e prejudicando o aprendizado não associativo. Parte destes efeitos foi associada às mudanças nos níveis de BDNF, GFAP e SNAP-25, porém sem perda da viabilidade neuronal aparente no hipocampo e no córtex cerebral. No segundo capítulo, o impacto do consumo de cafeína (0,1; 0,3 e 1,0 g/L na água de beber, das 19 às 7 horas) foi investigado sobre o comportamento e proteínas sinápticas na vida adulta dos animais que consumiram cafeína no decorrer do desenvolvimento encefálico. O consumo de três diferentes doses de cafeína iniciou 15 dias antes do acasalamento e permaneceu durante a prenhez e lactação. A partir do desmame os animais foram divididos em dois grupos: os que consumiram cafeína até a vida adulta (ao longo da vida) e os que interromperam o consumo (desenvolvimento). Esses dois grupos também foram subdivididos e analisados de acordo com o sexo. Foram comparados os efeitos destes protocolos sobre o comportamento e a densidade de proteínas sinápticas do hipocampo e córtex de fêmeas e machos adultos. A memória de reconhecimento foi prejudicada nas fêmeas que receberam cafeína (0,3 e 1,0 g/L) durante o desenvolvimento, o que coincidiu com o aumento do proBDNF e níveis inalterados de BDNF no hipocampo Ambos os protocolos de exposição causaram hiperlocomoção nos machos, enquanto que nas fêmeas somente a exposição ao longo da vida aumentou a atividade locomotora de forma significativa. Já no comportamento relacionado à ansiedade, ambos os sexos apresentaram um perfil ansiolítico ao consumir cafeína (1,0 g/L) ao longo da vida. Ambos os regimes de administração diminuíram os níveis de GFAP e SNAP-25 no hipocampo dos ratos machos. A densidade do receptor de TrkB foi reduzida no hipocampo em ambos os sexos e protocolos de exposição. No córtex cerebral BDNF e proBDNF aumentaram com o consumo de cafeína ao longo da vida nos machos. Nas fêmeas houve aumento no BDNF, mas não no proBDNF, em ambos regimes de administração. O receptor TrkB diminuiu no córtex dos ratos machos que receberam cafeína somente durante o desenvolvimento. Ambas proteínas – GFAP e SNAP-25 – aumentaram suas densidades nos machos que receberam ambos regimes de administração. Estes resultados revelaram que o consumo de cafeína ao longo da vida pode recuperar o prejuízo na memória de reconhecimento das fêmeas que consumiram a substância durante o desenvolvimento e indicam que a exposição durante um período específico do desenvolvimento do encéfalo promove alterações comportamentais dependentes do sexo, as quais nós relacionamos com modificações na sinalização BDNF. Os resultados desta tese destacam a importância de controlar o consumo de cafeína em períodos críticos para o desenvolvimento encefálico de ratos, e aponta para um efeito dependente do sexo. No entanto, mais estudos são necessários para ampliar nosso conhecimento sobre as possíveis vias de sinalização envolvidas nestes processos. / Caffeine is the most consumed psychostimulant substance worldwide, with benefits for cognitive functioning. Caffeine intake at moderate doses also prevents age-related cognitive decline. However, health experts have raised concerns about the growing intake of caffeine-containing drinks by adolescent population. In fact, the effects of caffeine on cognitive functions and neurochemical aspects of late brain maturation during adolescence are poorly understood. In addition, caffeine consumption in the early stages of fetal development has been associated with miscarriage and low birth weight, since it penetrates placenta and blood-brain barrier during pregnancy. Therefore, the impact of caffeine intake was investigated during different stages of brain development. In the first chapter of this thesis, adolescent male rats consumed caffeine in the drinking water (0.1; 0.3 and 1.0 g/L corresponding to low, moderate and high doses, respectively) only during their active period (from 7:00 p.m. to 7:00 a.m.). None of the doses tested had effect on locomotor activity, whereas all triggered anxiogenic effects. Caffeine (0.3 and 1.0 g/L) improved the performance in the object recognition task, but the higher dose of caffeine (1.0 g/L) decreased habituation in open field arena, suggesting a non-associative learning impariment. All tested doses reduced glial fibrillary acidic protein density (GFAP) and synaptosome-associated protein (SNAP-25) without causing any changes in immunoreactivity for neuronspecific nuclear protein (NeuN) in the hippocampus and cerebral cortex. In the hippocampus, caffeine (all doses tested) increased adenosine A1 receptor density and reduced brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and proBDNF (1.0 g/L). In the cerebral cortex, caffeine (1.0 g/L) reduced adenosine A1 receptor and increased BDNF and proBDNF density (0.3 and 1.0 g/L) These findings document the effects of caffeine consumption in adolescent rats with a dual impact on anxiety and recognition memory, associated with changes in BDNF, GFAP and SNAP-25 levels without apparent neuronal loss in hippocampus and cerebral cortex. In the second chapter, it was tested whether caffeine consumption (0.1; 0.3 and 1.0 g/L in drinking water, from 7:00 p.m. to 7:00 a.m) throughout life may reverse the negative effects caused by the consumption of caffeine in the early stages of development. For this, we used exposure protocols with the end in postnatal days (PND) 21 (development) or 90 (throughout life); both protocols starting 15 days before mating. The effects of these protocols on the behavior and hippocampal synaptic proteins density of adult female and male rats were compared. Recognition memory was impaired in females receiving caffeine (0.3 and 1.0 g/L) during development, which coincided with increased proBDNF levels and unchanged BDNF in the hippocampus. Both exposure protocols caused hyperlocomotion in males, whereas in females only the exposure throughout life significantly increased locomotor activity. Considering the anxiety related behavior, both sexes presented an anxiolytic profile when consuming caffeine (1.0 g/L) throughout life. Both exposure regimens decreased hippocampal GFAP and SNAP-25 of male rats. The hipocampal TrkB receptor was reduced in both sexes and protocols of exposure In the cortex, both proBDNF and BDNF increased in males receiving caffeine throughout life as well as GFAP and SNAP-25 increased in both treatments regimen. The results revealed that caffeine consumption throughout life can recover the impairment in recognition memory of females that consumed caffeine during development and indicate that exposure for a specific period of brain development promotes sex-dependent behavioral changes, which we relate to alterations in BDNF signaling. The results of this thesis emphasize the importance of controlling caffeine intake during critical periods of brain development of rats and points to a sex dependent effect. However, more studies are needed to expand our knowledge about the possible signaling pathways involved in these processes.