Orientador: Ciro Moraes Barros / Resumo: Em células da teca e da granulosa, de folículos bovinos, foram detectados quatro transcritos alternativos do receptor do hormônio luteinizante (LHR). Apenas dois deles são traduzidos em proteínas funcionais com afinidades distintas em relação aos ligantes. Em humanos e símios, a isoforma completa ("full-length") tem afinidade pelo LH e hCG, enquanto que a isoforma que apresenta deleção do exon 10 tem afinidade somente pelo hCG. Além disso, isoformas com deleção do exon 3 foram observadas em ratos, embora nenhum outro estudo tenha investigado essa região do gene bovino. Objetivouse com este trabalho caracterizar o padrão da expressão do gene do LHR nas células da teca e da granulosa de folículos antrais bovinos. Ovários foram coletados em matadouro, os folículos (5-14 mm) foram dissecados e as células da teca e da granulosa separadas para extração de RNA total com Trizol. As concentrações de esteróides no fluido folicular foram determinadas por radioimunoensaio (RIE). A expressão gênica do LHR foi mensurada por RTPCR semiquantitativo com oligonucleotídeos iniciadores ("primers") específicos para amplificar o fragmento entre o final da região extracelular e o final da intracelular (LHRBC; "primers" posicionados nos exons 9 e 11). A ocorrência de transcritos alternativos oriundos do início da região extracelular (LHRA; "primers" posicionados nos exons 2 e 9) foi investigada mediante amplificação por RT-PCR. Como controle interno no PCR, utilizou-se a expressão da GAPDH. Paralelamente, células da granulosa cultivadas in vitro foram tratadas com 1 ou 10 ng de FSH no meio de cultura. Mediante RT-PCR, foi investigada a expressão das isoformas do LHRBC nas células da granulosa cultivadas e tratadas com FSH... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Growth of dominant follicle in the absence of circulating FSH and the events following the LH surge that culminate in ovulation, are dependent on the interaction between LH and its receptor (LHR). Four LHR alternative transcripts were described in theca and granulosa cells from bovine follicles. Only two of them can be translated to functional proteins (receptors coupled with G protein) with different affinities to their ligands. In humans and marmosets, the full-length isoform has affinity to both LH and hCG molecules, whereas the isoform with deletion of only exon 10 has affinity to hCG exclusively. Additionally, isoforms with deletion of exon 3 were observed in rats, although no previous report have investigated this region of the bovine gene. The objective of this study was to characterize the pattern of gene expression of the LHR in theca and granulosa cells from bovine antral follicles. Additionally, LHR expression was determined in cultured granulosa cells under FSH treatment. From ovaries collected in abattoir, antral follicles were dissected (5 to 14mm of diameter), and samples of theca and granulosa cells were obtained to total RNA extraction (Trizol protocol). Steroids concentrations in the follicular fluid were determined by RIA. Gene expression of LHR was measured by semiquantitative RT-PCR with specific primers to amplify part of extracellular region (LHRA; primers annealing on exons 2 and 9) and the fragment from the end of extracellular region, including the transmembrane domain and finishing near the end of intracellular region (LHRBC; primers annealing on exons 9 and 11). As internal control of the PCR, it was used GAPDH expression. Cultured granulosa cells were treated with 0, 1 or 10 ng of FSH (3 replicates each dose). As in vivo and positive control, theca cell sample was utilized to comparison... (Complete abstract, access undermentioned electronic address) / Doutor

Introdução: A reserva ovariana (RO) refere-se à quantidade e, para alguns autores, à qualidade de folículos presentes nos ovários em um dado momento. É a medida pela qual se avalia a produção de oócitos e consequente potencial reprodutivo. Ela pode ser inferida mediante dosagem dos níveis séricos do hormônio folículo estimulante (FSH), estradiol, inibina B e hormônio antimülleriano (HAM), e ainda, ultrassonograficamente, através da contagem de folículos antrais (CFA). Na década de 50 observou-se que mulheres submetidas à quimioterapia (QT) apresentavam falência ovariana mais precocemente, efeito atribuído à gonadotoxicidade quimioterápica. Objetivos: Estudar o HAM como marcador da RO em mulheres com câncer de mama expostas à QT gonadotóxica comparando-o com outros marcadores da RO e determinar preditores de risco da ocorrência de anovulação (amenorreia ou ciclos irregulares) nessas mulheres. Métodos: Foi realizado estudo de coorte com 52 mulheres com diagnóstico de câncer de mama e necessidade de QT com ciclofosfamida, com idade até 40 anos, ciclos menstruais regulares e sem histórico de tratamento quimioterápico prévio. As pacientes realizaram coleta de sangue e ultrassonografia pélvica transvaginal (USTV) antes da QT (T1) e 2 (T2) e 6 (T3) meses após seu término. Resultados: A idade média das pacientes estudadas foi 35,3 ± 3,8 anos e o tempo médio de seguimento foi de 14 ± 3 meses. A prevalência de anovulação foi de 40% durante a QT, 85% 2 meses após o término da QT (4 a 6 ciclos de ciclofosfamida) e de 60% 6 meses após a QT. A média de idade das pacientes que se tornaram anovulatórias foi de 36,5 ± 3,8 anos, enquanto que nas que permaneceram ovulatórias foi de 32,9 ± 3,5 anos com p = 0,02. O FSH acompanhou o status menstrual, apresentando aumento e queda significativos em T2 e T3. O HAM diminuiu significativamente de T1 (2,53 (1 - 5,31) ng/mL) para T2 (valores abaixo do detectável) com p < 0,0001 e não se modificou de T2 para T3, mesmo com uma parcela de pacientes retomando a ciclicidade menstrual. CFA em T1 foi 11 (8 - 13,5) folículos, sendo estatisticamente maior que nos tempos T2 e T3 (p < 0,0001). Entre T2 e T3 não houve diferença. As pacientes que mantiveram ciclos ovulatórios após o término da QT apresentaram no final do estudo níveis significativamente mais baixos de HAM do que previamente à QT (1,46 (< 0,08 - 4,31) ng/ml versus 6,17 (3,19 - 10,07) ng/mL) e CFA (7 (5,5 - 10) folículos versus 13 (11 - 15,5) folículos). HAM e CFA apresentaram correlação negativa e significativa com a idade. Trinta e dois anos foi a idade que apresentou sensibilidade de 96% e especificidade de 39% para predição de anovulação, mesmo que sem amenorreia, com área sob a curva (ASC) ROC de 0,77. Os marcadores de RO e os respectivos pontos de corte com poder de predizer ocorrência de anovulação em pacientes expostas à QT foram HAM < 3,32 ng/ml (sensibilidade de 85%, especificidade de 75% e ASC de 0,86) e CFA < 13 folículos antrais (sensibilidade de 81%, especificidade de 62% e ASC de 0,81). Para a predição de amenorreia exclusivamente, o HAM teve como ponto de corte o valor de 1,87 ng/ml (sensibilidade de 82%, especificidade de 83% e ASC de 0,84) e a CFA valor de 9 folículos (sensibilidade de 71%, especificidade de 78% e ASC de 0,73 ). As avaliações dos marcadores de RO não foram influenciadas pelo número de ciclos de QT (4 ou 6 ciclos), nem pela dose de quimioterápico utilizado por área corporal. Conclusão: O HAM e a CFA são igualmente capazes de determinar a queda da RO em pacientes submetidas à QT gonadotóxica. Pacientes com diagnóstico de câncer de mama que necessitam de QT com ciclofosfamida devem ser alertadas para o risco de amenorreia especialmente quando a idade for de 32 anos ou mais, dosagens séricas de HAM abaixo de 3,32 ng/ml, CFA < 13, devendo receber informações a respeito da preservação da fertilidade. Dentre esses marcadores, o HAM foi o de maior poder em predizer a ocorrência de amenorreia. / Introduction: Ovarian reserve (OR) refers to quantity and, to some authors, quality of follicles present in ovaries at a given time. It is the measure used to assess the capacity of the ovary to produce oocytes. Its evaluation is trough serum analysis of FSH, estradiol, inhibin and anti-Müllerian hormone (AMH) and trough ultrassonography to count de antrals follicles (AFC). In the 50s, it was observed that women exposed to chemotherapy experienced premature ovarian failure, effect attributed to chemotherapy. Objectives: To ascertain OR by means of AMH in young women with breast cancer exposed to chemotherapy comparing them with another ovarian reserve tests. To define risk predictors of anovulation (oligomenorrhea or amenorrhea) in those women. Methods: A cohort study with 52 eumenorrheic patients (age < 40years) with breast cancer who received chemotherapy with cyclophosphamide. Assessment was carried out with serum samples and pelvic ultrasonography before chemotherapy (T1), and 2 (T2) and 6 (T3) months after chemotherapy. Results: Mean age was 35.3 ± 3.8 years. Mean duration of follow-up was 14 ± 3 months. Anovulation was present in 40% of women during the chemotherapy, 85% 2 months after and 60% 6 months after chemotherapy. Mean age of anovulatory women in T3 was 36.5 ± 3.8 years. Women with regular cycles was 32.9 ± 3.5 years (p = 0.02). FSH levels rises and decreased significantly in T2 and T3. AMH levels declined significantly, down to undetectable levels at T2 from a median of 2.53 (1 –5.31 ng/mL) at T1 (p < 0.0001) and remained unchanged from T@ and T3, even though some patients resumed normal menses. Median AFC was 11 ( 8.0 – 13.5) follicles at T1 and significantly lower at T2 and T3 (p < 0.0001). No difference was found between T2 and T3 in patients who resumed ovulation cycles after completion of chemotherapy, AMH and AFC levels were significantly lower as compared with baseline: 1.46 (< 0.08 – 4.31) ng/mL vs. 6.17 (3.19 – 10.07) ng/mL and 7 (5.5 - 10) follicles vs. 13 (11 – 15.5) follicles. In patients who remained ovulatory during chemotherapy or resumed normal menses, FSH and estradiol levels remained unchanged relative to baseline. AMH and AFC presented significantly negative correlation with age. The age of thirty-two years presented 96% of sensitivity and 39% of specificity to predict anovulation with ROC area under the curve (AUC) of 0.77. The ovarian reserve (OVR) tests with power to predict anovulation in women exposed to CT were AMH < 3.32 ng/mL (sensitivity of 85%, specificity of 75% and AUC of 0.87) and AFC < 13 follicles (sensitivity of 81%, specificity of 62% and AUC of 0.81). The AMH cut off to predict amenorrhea was 1,87 ng/mL (sensitivity of 82%, specificity of 83% and AUC of 0,84) and the AFC cut off was 9 follicles (sensitivity of 71%, specificity of 78% and AUC of 0.73 ). The analysis was not influenced by the number of cycles or dose of CT. Conclusions: AMH and AFC are equally able to determine the OVR decline in chemotherapy exposed women. FSH is not adequate for this purpose, except in women who become amenorrheic. Thirty-two year old or older women, AMH levels < 3.32 ng/mL and AFC < 13 follicles determined significantly higher risk of anovulation after CT with cyclophosphamide. These women should be encouraged to preserve their fertility. Among the OVR tests, AMH was the powerful to predict the anovulation.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste estudo foi investigar a expressÃo do sistema interleucina 1 (proteÃnas e RNAm de ligantes e receptores) e sua distribuiÃÃo nos ovÃrios de vacas cÃclicas, bem como avaliar os efeitos da IL-1&#946; na sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais in vitro. Os ovÃrios foram processados para a localizaÃÃo do sistema interleucina 1 em folÃculos prÃ-antrais e antrais utilizando as tÃcnicas de imunohistoquÃmica, qPCR e anÃlise de Western blot. Para os estudos in vitro, fragmentos ovarianos foram cultivados em &#945;-MEM+ suplementado com IL-1&#946; (0, 1, 10, 50 ou 100 ng/mL), e apÃs 6 dias foram processados para anÃlise histolÃgica. Os resultados de imunohistoquÃmica mostraram que a proteÃna para os integrantes do sistema interleucina I (IL-1&#946;, IL-1RA, IL-1RI e IL-1RII) foram detectados em diferentes compartimentos foliculares. Infelizmente, o anticorpo testado para localizaÃÃo de IL-1&#945; nÃo reagiu em ovÃrios bovinos. Todas as proteÃnas testadas foram observados no citoplasma dos oÃcitos e nas cÃlulas da granulosa de todas as categorias foliculares, e nas cÃlulas da teca de folÃculos antrais, com a exceÃÃo da IL-1&#945;, que nÃo foi encontrada em nenhuma das cÃlula analisados. Foram observados nÃveis variÃveis de RNAm para o sistema interleucina 1 nas diferentes categorias foliculares analisadas. ApÃs 6 dias de cultivo, a presenÃa de IL-1&#946; (10 ou 50 ng/mL) foi capaz de manter a percentagem de folÃculos normais e de promover a ativaÃÃo dos folÃculos primordiais. Em conclusÃo, os componentes do sistema de interleucina 1 sÃo expressos diferencialmente em cÃlulas ovarianas de acordo com a fase do desenvolvimento folicular. AlÃm disso, a IL-1&#946; promove o desenvolvimento de folÃculos primordiais in vitro. Estes resultados sugerem um importante papel do sistema interleucina 1 na regulaÃÃo da foliculogÃnese em bovinos. / This study aims to investigate the expression of interleukin 1 system (proteins and mRNA of ligands and receptors) and its distribution in ovaries of cyclic cows, as well as to evaluate the effects of IL-1&#946; on the survival and activation of primordial follicles in vitro. The ovaries were processed for localization of interleukin 1 system in preantral and antral follicles by immunohistochemical, qPCR and western blot analysis. For in vitro studies, ovarian fragments were cultured in &#945;-MEM+ supplemented with IL-1&#946; (0, 1, 10, 50 or 100 ng/mL), and aftes 6 days the tissues cultured were processed for histological analysis. Immunohistochemical results showed that the proteins for interleukin 1 system (IL-1&#946;, IL-1RA, IL-1RI and IL-1RII) were detected in the various follicular compartments. Unfortunately, IL-1&#945; antibodies tested did not react in bovine ovaries. All the proteins tested were observed in the cytoplasm of oocytes and granulosa cells from all follicular categories, and theca cells of antral follicles, with the exception that IL-1&#945; has not been found in any analyzed cell. Variable levels of mRNA for the interleukin 1 system in the follicular size and classes analysed. After 6 days of culture, the presence of IL-1&#946; (10 or 50 ng/mL) was effective in maintaining the percentage of normal follicles and in promoting primordial follicle activation. In conclusion, interleukin 1 system is differentially expressed in the ovarian cells according to the stage of follicular development. Moreover, IL-1&#946; promotes the development of primordial follicles. These results suggest an important role of the interleukin 1 system in the regulation of folliculogenesis in bovine species.

O objetivo desse estudo foi avaliar as características do tecido conjuntivo de 11 folículos pericoronários, 12 cistos dentígeros e de 14 tumores odontogênicos ceratocísticos (TOCs). A amostra foi submetida às técnicas de Hematoxilina e Eosina, Tricrômico de Masson, Picrosírius, Direct Blue e Orceína. Tricrômico de Masson foi utilizado para avaliação de diferenças de densidade e de paralelismo das fibras colágenas, bem como presença de infiltrado linfoplasmocitário. Picrosírius serviu para mensuração da quantidade de fibras colágenas; Direct Blue e Orceína, para identificação do sistema de fibras elásticas. Lâminas coradas por essas três últimas técnicas foram visualizadas em microscopia confocal a laser. Os resultados mostraram semelhança entre o folículo pericoronário e o TOC: paralelismo de fibras colágenas arranjadas em um padrão eminentemente denso, podendo conter uma camada de densidade frouxa junto ao tecido epitelial. As cápsulas de cistos dentígeros eram compostas por fibras colágenas desorganizadas, ou não paralelas, em um arranjo frouxo com presença de infiltrado linfoplasmocitário. Não foi observada marcação para fibras do sistema elástico. Com base nos resultados, conclui-se que a cápsula do TOC representa o estroma da lesão, desempenhando função de suporte e que, diferentemente, o tecido conjuntivo do cisto dentígero é parte da resposta inflamatória. / The aim of this study was to evaluate the connective tissue features of pericoronal follicles, dentigerous cysts and keratocystic odontogenic tumor. The sample was submitted to Hematoxylin-eosin, Masson Trichrome, Picrosirius, Direct Blue and Orcein stains. Masson Trichrome was performed to distinguish collagen fibers density and parallelism, as well as chronic infiltrate presence. Picrosirius was performed to collagen fibers quantification; Direct Blue and Orcein, to elastic system fibers identification. Picrosirius, Direct Blue and Orcein staining slides were observed by means confocal laser scanning microscope. Results showed similar features between pericoronal follicle and keratocystic odontogenic tumor: parallel collagen fibers, more tightly packed collagen fibers, and sometimes a soft layer beneath epithelial tissue. Dentigerous cyst capsule was composed by wound collagen fibers, soft packed, associated to chronic inflammatory infiltrate. It was not observed elastic system fibers labeling. Based on results, it was concluded that keratocystic odontogenic tumor capsule represent the lesion stroma, playing a support role. This finding is different from dentigerous cyst where connective tissue is produced by inflammatory response.

O entendimento dos mecanismos de ação hormonal envolvidos com o crescimento do pêlo são de grande relevância na área médica e podem representar novas perspectivas no tratamento para distúrbios de crescimento de pêlos. A aromatase, enzima que converte androgênios em estrogênios, é uma das enzimas-chave relacionadas com o metabolismo intra-tecidual de hormônios sexuais. O objetivo desse estudo foi determinar a expressão gênica da enzima aromatase em folículos pilosos do vértice do escalpo de mulheres com ciclos regulares e ovulatórios e em pacientes com PCOS, verificando possíveis associações com variáveis hormonais e metabólicas dessas mulheres. Cinqüenta e quatro mulheres no menacme preencheram os critérios de inclusão (23 com PCOS e 31 com ciclos regulares e ovulatórios) e completaram avaliação antropométrica, hormonal e metabólica. Uma sub-amostra de 16 mulheres (11 com ciclos regulares e ovulatórios e 5 com PCOS) foi selecionada para coleta de folículos pilosos através da técnica do arrancamento. A expressão do gene da aromatase foi avaliada por PCR em tempo real, e os resultados foram normalizados em relação ao gene constitutivo b2-microglobulina. A expressão do gene da aromatase foi observada nos folículos pilosos da região do escalpo de mulheres dos dois grupos em estudo. A expressão deste gene foi de intensidade baixa e variável entre as amostras estudadas e não houve diferença estatisticamente significativa da relação dos genes aromatase/b2-microglobulina entre o grupo de mulheres com ciclos regulares [80 (35,31 – 138,25) e o grupo PCOS [52,11 (5,68 – 84,8), P = 0,157]. A expressão do gene da aromatase em folículos pilosos do escalpo de mulheres correlacionou-se negativamente e com significância estatística com os níveis séricos de LH (P = 0,008, r = -0,653) e esta correlação foi independente de testosterona ou SHBG. Esses resultados demonstram, pela primeira vez, que folículos pilosos da região do vértice do escalpo de mulheres expressam o gene da aromatase. A correlação negativa e independente de LH com a expressão gênica da aromatase pode estar refletindo o microambiente hormonal nos folículos pilosos e, em especial, o conjunto das alterações metabólicas e hormonais característico de pacientes com PCOS. É possível que a expressão gênica dessa enzima seja mais evidente na papila dérmica (porção dos folículos pilosos não analisada nesse estudo) e que a regulação do balanço estrogênico no metabolismo local não seja tão pronunciada na porção epitelial dos folículos pilosos que é obtida pela técnica do arrancamento. A análise da expressão protéica da enzima, a seleção de pacientes hirsutas de outras etiologias e de mulheres portadoras de alopecia, e a coleta de outras regiões pilosas hormônio-dependentes estão entre as perspectivas para a confirmação do padrão de expressão gênica da aromatase nos folículos pilosos. / The knowledge of hormonal mechanisms of action that are involved with hair growth is of great relevance on medical research and could represent new approaches on therapeutics for hair growth disturbs. Aromatase, the enzyme that converts androgens into estrogens, is one of the key enzymes related to sexual hormones metabolism and may act on different target tissues, like the hair follicle. The aim of this study was to determine the aromatase gene expression on hair follicles from the vertex portion of the scalp of women with regular and ovulatory cycles, and patients with PCOS. We were also interested on the possible association among the gene expression and hormonal/metabolic parameters of these women. Fifty-four women at reproductive age were included (23 with PCOS and 31 with regular and ovulatory cycles), and were submitted to anthropometric, hormonal, and metabolic evaluation. A minor group of 16 women (11 with regular and ovulatory cycles and 5 with PCOS) were selected for hair follicle’s molecular analysis, using the plucking technique. Aromatase gene expression was analyzed by using real time PCR, and the results were normalized with the housekeeping gene b2-microglobuline. Aromatase gene expression was observed at the scalp’s hair follicles from the two groups of women. The intensity of the gene expression was low and variable among the samples. There was not a statistically significant difference between the women with regular cycles [80 (35,31 – 138,25) and patients with PCOS [52,11 (5,68 – 84,8), P = 0,157]. Aromatase gene expression in the plucked hairs from the vertex portion of the scalp of women was negatively correlated with circulating LH levels (P = 0,008, r = -0,653), and was also independent of testosterone or SHBG levels. The present results show, for the first time, that plucked hairs from the vertex portion of the scalp of women express the gene of aromatase. The negative and independent correlation between LH and aromatase gene expression may reflect the hormonal microenvironment of the hair follicle, and also the hormonal and metabolic alterations characteristics of women with PCOS. Aromatase gene expression may be more evident at the dermal papilla (not analyzed in this study), and the local metabolism could not be so pronounced on the epithelial portion of hair follicles, when obtained by the plucking method. Aromatase protein expression, plucked hair from other hormone-dependent areas and from women with other clinical conditions like androgenetic alopecia, are some of the perspectives for the confirmation of the pattern of aromatase gene expression on hair follicles.

Introdução: A reserva ovariana (RO) refere-se à quantidade e, para alguns autores, à qualidade de folículos presentes nos ovários em um dado momento. É a medida pela qual se avalia a produção de oócitos e consequente potencial reprodutivo. Ela pode ser inferida mediante dosagem dos níveis séricos do hormônio folículo estimulante (FSH), estradiol, inibina B e hormônio antimülleriano (HAM), e ainda, ultrassonograficamente, através da contagem de folículos antrais (CFA). Na década de 50 observou-se que mulheres submetidas à quimioterapia (QT) apresentavam falência ovariana mais precocemente, efeito atribuído à gonadotoxicidade quimioterápica. Objetivos: Estudar o HAM como marcador da RO em mulheres com câncer de mama expostas à QT gonadotóxica comparando-o com outros marcadores da RO e determinar preditores de risco da ocorrência de anovulação (amenorreia ou ciclos irregulares) nessas mulheres. Métodos: Foi realizado estudo de coorte com 52 mulheres com diagnóstico de câncer de mama e necessidade de QT com ciclofosfamida, com idade até 40 anos, ciclos menstruais regulares e sem histórico de tratamento quimioterápico prévio. As pacientes realizaram coleta de sangue e ultrassonografia pélvica transvaginal (USTV) antes da QT (T1) e 2 (T2) e 6 (T3) meses após seu término. Resultados: A idade média das pacientes estudadas foi 35,3 ± 3,8 anos e o tempo médio de seguimento foi de 14 ± 3 meses. A prevalência de anovulação foi de 40% durante a QT, 85% 2 meses após o término da QT (4 a 6 ciclos de ciclofosfamida) e de 60% 6 meses após a QT. A média de idade das pacientes que se tornaram anovulatórias foi de 36,5 ± 3,8 anos, enquanto que nas que permaneceram ovulatórias foi de 32,9 ± 3,5 anos com p = 0,02. O FSH acompanhou o status menstrual, apresentando aumento e queda significativos em T2 e T3. O HAM diminuiu significativamente de T1 (2,53 (1 - 5,31) ng/mL) para T2 (valores abaixo do detectável) com p < 0,0001 e não se modificou de T2 para T3, mesmo com uma parcela de pacientes retomando a ciclicidade menstrual. CFA em T1 foi 11 (8 - 13,5) folículos, sendo estatisticamente maior que nos tempos T2 e T3 (p < 0,0001). Entre T2 e T3 não houve diferença. As pacientes que mantiveram ciclos ovulatórios após o término da QT apresentaram no final do estudo níveis significativamente mais baixos de HAM do que previamente à QT (1,46 (< 0,08 - 4,31) ng/ml versus 6,17 (3,19 - 10,07) ng/mL) e CFA (7 (5,5 - 10) folículos versus 13 (11 - 15,5) folículos). HAM e CFA apresentaram correlação negativa e significativa com a idade. Trinta e dois anos foi a idade que apresentou sensibilidade de 96% e especificidade de 39% para predição de anovulação, mesmo que sem amenorreia, com área sob a curva (ASC) ROC de 0,77. Os marcadores de RO e os respectivos pontos de corte com poder de predizer ocorrência de anovulação em pacientes expostas à QT foram HAM < 3,32 ng/ml (sensibilidade de 85%, especificidade de 75% e ASC de 0,86) e CFA < 13 folículos antrais (sensibilidade de 81%, especificidade de 62% e ASC de 0,81). Para a predição de amenorreia exclusivamente, o HAM teve como ponto de corte o valor de 1,87 ng/ml (sensibilidade de 82%, especificidade de 83% e ASC de 0,84) e a CFA valor de 9 folículos (sensibilidade de 71%, especificidade de 78% e ASC de 0,73 ). As avaliações dos marcadores de RO não foram influenciadas pelo número de ciclos de QT (4 ou 6 ciclos), nem pela dose de quimioterápico utilizado por área corporal. Conclusão: O HAM e a CFA são igualmente capazes de determinar a queda da RO em pacientes submetidas à QT gonadotóxica. Pacientes com diagnóstico de câncer de mama que necessitam de QT com ciclofosfamida devem ser alertadas para o risco de amenorreia especialmente quando a idade for de 32 anos ou mais, dosagens séricas de HAM abaixo de 3,32 ng/ml, CFA < 13, devendo receber informações a respeito da preservação da fertilidade. Dentre esses marcadores, o HAM foi o de maior poder em predizer a ocorrência de amenorreia. / Introduction: Ovarian reserve (OR) refers to quantity and, to some authors, quality of follicles present in ovaries at a given time. It is the measure used to assess the capacity of the ovary to produce oocytes. Its evaluation is trough serum analysis of FSH, estradiol, inhibin and anti-Müllerian hormone (AMH) and trough ultrassonography to count de antrals follicles (AFC). In the 50s, it was observed that women exposed to chemotherapy experienced premature ovarian failure, effect attributed to chemotherapy. Objectives: To ascertain OR by means of AMH in young women with breast cancer exposed to chemotherapy comparing them with another ovarian reserve tests. To define risk predictors of anovulation (oligomenorrhea or amenorrhea) in those women. Methods: A cohort study with 52 eumenorrheic patients (age < 40years) with breast cancer who received chemotherapy with cyclophosphamide. Assessment was carried out with serum samples and pelvic ultrasonography before chemotherapy (T1), and 2 (T2) and 6 (T3) months after chemotherapy. Results: Mean age was 35.3 ± 3.8 years. Mean duration of follow-up was 14 ± 3 months. Anovulation was present in 40% of women during the chemotherapy, 85% 2 months after and 60% 6 months after chemotherapy. Mean age of anovulatory women in T3 was 36.5 ± 3.8 years. Women with regular cycles was 32.9 ± 3.5 years (p = 0.02). FSH levels rises and decreased significantly in T2 and T3. AMH levels declined significantly, down to undetectable levels at T2 from a median of 2.53 (1 –5.31 ng/mL) at T1 (p < 0.0001) and remained unchanged from T@ and T3, even though some patients resumed normal menses. Median AFC was 11 ( 8.0 – 13.5) follicles at T1 and significantly lower at T2 and T3 (p < 0.0001). No difference was found between T2 and T3 in patients who resumed ovulation cycles after completion of chemotherapy, AMH and AFC levels were significantly lower as compared with baseline: 1.46 (< 0.08 – 4.31) ng/mL vs. 6.17 (3.19 – 10.07) ng/mL and 7 (5.5 - 10) follicles vs. 13 (11 – 15.5) follicles. In patients who remained ovulatory during chemotherapy or resumed normal menses, FSH and estradiol levels remained unchanged relative to baseline. AMH and AFC presented significantly negative correlation with age. The age of thirty-two years presented 96% of sensitivity and 39% of specificity to predict anovulation with ROC area under the curve (AUC) of 0.77. The ovarian reserve (OVR) tests with power to predict anovulation in women exposed to CT were AMH < 3.32 ng/mL (sensitivity of 85%, specificity of 75% and AUC of 0.87) and AFC < 13 follicles (sensitivity of 81%, specificity of 62% and AUC of 0.81). The AMH cut off to predict amenorrhea was 1,87 ng/mL (sensitivity of 82%, specificity of 83% and AUC of 0,84) and the AFC cut off was 9 follicles (sensitivity of 71%, specificity of 78% and AUC of 0.73 ). The analysis was not influenced by the number of cycles or dose of CT. Conclusions: AMH and AFC are equally able to determine the OVR decline in chemotherapy exposed women. FSH is not adequate for this purpose, except in women who become amenorrheic. Thirty-two year old or older women, AMH levels < 3.32 ng/mL and AFC < 13 follicles determined significantly higher risk of anovulation after CT with cyclophosphamide. These women should be encouraged to preserve their fertility. Among the OVR tests, AMH was the powerful to predict the anovulation.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-01-15T13:51:53Z No. of bitstreams: 2 Tese - Kele Amaral Alves - 2014.pdf: 3078200 bytes, checksum: a734ef24de50dd8371530cfbd9e5c3d4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-18T08:47:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Kele Amaral Alves - 2014.pdf: 3078200 bytes, checksum: a734ef24de50dd8371530cfbd9e5c3d4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-18T08:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Kele Amaral Alves - 2014.pdf: 3078200 bytes, checksum: a734ef24de50dd8371530cfbd9e5c3d4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-12-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Studies with equine preantral follicles are scarce and the follicular dynamics features remain unclear. The mare’s ovarian function (e.g., folliculogenesis) has similarities with woman’s cycle and based on these aspects, this species can be considered an animal model for comparative studies and techniques with preantral follicles to preserve female fertility. The purpose of the first project was to determine methodologies that might speed up the process of histological evaluation of preantral follicle population. On the second project, we evaluated the follicular population features considering the follicular density factor by means of a mathematical model, to determine the appropriate experimental design to estimate the follicular density in ovarian fragments. The third project, analyzed the effects of reproductive phases, ovary, and ovarian structures on the quality, classification, follicular and cellular densities in ovarian fragments. The results allowed an establishment of the best thickness of histological sections and the ideal number of fragments and sections to estimate the equine preantral follicle density. Furthermore, it was observed a low follicular density associated with a high heterogeneity within and among animals. Moreover, we demonstrated the best scenario (diestrous phase with the presence of a functional corpus luteum) to collect ovarian fragments with higher follicular and cellular densities. In summary, this study demonstrated: (i) advance on the knowledge of equine follicular dynamic on the preantral phase; (ii) the concept of the mare as an animal model to study the reproductive challenges on woman; and (iii) provided basic information for future biotechnology research with the aim to preserve or improve the reproductive capability as cryopreservation, in vitro culture, and transplants of ovarian tissue. / Estudos com folículos pré-antrais equinos são escassos e as características da dinâmica folicular pré-antral permanecem pouco elucidadas. A função ovariana (ex. foliculogênese) da égua possui diversas similaridades com a mulher e, baseado nestes aspectos, podemos considerá-la como modelo animal para estudos comparativos e técnicas que utilizam folículos pré-antrais na preservação da fertilidade feminina. O primeiro projeto teve a proposta de definir metodologias para agilizar o processo de avaliação histológica da população folicular pré-antral. No segundo projeto, avaliou-se as características da população folicular considerando o fator densidade folicular, determinando por meio de modelo matemático, o apropriado desenho experimental para estimar a densidade em fragmentos ovarianos. No terceiro projeto, analisou-se os efeitos da fase reprodutiva, ovário e estruturas ovarianas sobre a qualidade, classificação, densidade folicular e celular em fragmentos ovarianos. Os resultados permitiram estabelecer a melhor espessura de secção histológica e o número de fragmentos e de secções suficientes para estimar a densidade de folículos pré-antrais equinos. Adicionalmente, observou-se uma baixa densidade folicular associada a alta heterogeneidade dentre e entre os animais. Além disso, determinou-se afase de diestro com a presença de corpo lúteo ativo como o melhor cenáriopara a coleta de fragmentos ovarianos com maior densidade folicular e celular. Finalmente, dos resultados originados deste trabalho, pode-se concluir: (i) obteve-se avanço no conhecimento da dinâmica folicular pré-antral equina; (ii) o conceito da égua como modelo animal para estudos de desafios reprodutivos na mulher foi reforçado; e (iii) ocorreu a geração de informações básicas para futuras pesquisas com biotecnologias que visam preservar ou implementar a capacidade reprodutiva como a criopreservação, cultivo in vitro e transplantes de tecido ovariano.

O objetivo deste estudo foi determinar o papel do GDF-9 sozinho ou em combinaÃÃo com FSH sobre a viabilidade, crescimento e expressÃo do RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, versican e perlecan em folÃculos secundÃrios bovinos cultivados in vitro. Para estudos in vitro, folÃculos secundÃrios bovinos foram isolados e cultivados por doze dias, na presenÃa de MEM sozinho ou suplementado com GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL e de D7-D12: 500 ng/mL) ou ambos. DiÃmetro folicular, viabilidade e formaÃÃo de antro foram avaliados durante o cultivo. Para avaliar os nÃveis de RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, perlecan e versican em folÃculos apÃs 12 dias de cultivo, o RNA total foi extraÃdo e o cDNA foi sintetizado. Os nÃveis de RNAm foram quantificados por PCR em tempo real. O teste Kruskal-Wallis foi usado para comparar o diÃmetro folicular. O teste Qui-quadrado foi utilizado para comparar a porcentagem de viabilidade e formaÃÃo de antro de folÃculos apÃs o cultivo in vitro (p<0,05), enquanto ANOVA seguido pelo teste de Tukey foram utilizados para avaliar os dados de expressÃo do RNAm nos folÃculos cultivados (p<0,05). Os resultados mostram que apÃs 6 dias de cultivo, FSH sozinho ou associado com GDF-9 aumentaram o diÃmetro folicular em relaÃÃo ao meio controle. AlÃm disso, apÃs 12 dias de cultivo, FSH promoveu um aumento no diÃmetro folicular, enquanto a associaÃÃo de FSH com GDF-9 reduziu significativamente o diÃmetro folicular quando comparado com folÃculos cultivados em MEM acrescido de FSH. AlÃm disso, FSH e GDF-9 aumentaram a formaÃÃo de antro apÃs 12 dias de cultivo (P<0,05). Apesar de GDF-9 ter reduzido significativamente os nÃveis de RNA para HAS 1 quando comparado ao MEM, esse fator aumentou os nÃveis de versican e perlecan. AlÃm disso, a presenÃa de ambos FSH e GDF-9 aumentaram os nÃveis de RNAm para HAS 2, porÃm, reduziu os nÃveis de RNAm para PCNA. AlÃm disso, FSH tambÃm atua reduzindo os nÃveis de RNAm para o PCNA. Em conclusÃo, FSH e/ou GDF-9 promovem o crescimento folicular e formaÃÃo de antro, e GDF-9 estimula a expressÃo de versican e perlecan e interage positivamente com FSH para o aumento da expressÃo de HAS 2. / The aim of this study was to determine the role of GDF-9 alone or in combination with FSH on growth, viability and on the mRNA expression of PCNA, HAS 1, HAS 2, versican and perlecan in bovine secondary follicles cultured in vitro. For in vitro studies, bovine secondary follicles were isolated and cultured for twelve days in the presence of MEM alone or supplemented with GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL and of D7-D12: 500 ng/mL) or both. Follicular diameter, viability and antrum formation were evaluated during culture. To evaluate the mRNA levels for PCNA, perlecan, versican, HAS 1 and 2 in follicles after 12 days of culture, total RNA was extracted and cDNA was synthesized. The levels of mRNA were quantified by real time PCR. Kruskal-Wallis test were used to compare the follicular diameter. The chi-square test was used to compare the percentage of viability and antrum formation of follicles after in vitro culture (p<0.05), whereas ANOVA followed by Tukey's test were used to evaluate the mRNA expression data in cultured follicles (p<0.05). The results show that after 6 days of culture, FSH alone or associated with GDF-9 increased follicular diameter in relation to control medium. Moreover, after 12 days of culture, FSH promoted an increase in follicular diameter, while the association of FSH with GDF-9 significantly reduced follicular diameter when compared with follicles cultured in MEM plus FSH. Furthermore, FSH and GDF-9 increased the antrum formation after 12 days of culture (P<0.05). Despite GDF-9 had significantly reduced the levels of mRNA for HAS 1 when compared to MEM, this factor has increased the levels of versican and perlecan. In addition, the presence of both FSH and GDF-9 increased mRNA levels for HAS 2, but reduced level those for PCNA. In addition, FSH also acts by reducing mRNA levels for PCNA. In conclusion, FSH and/or GDF-9 promotes the follicular growth and antrum formation, and GDF-9 stimulates the expression of versican and perlecan and interact positively with FSH to the increased expression of HAS 2

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Humberto Luis Del Hoyo NeriDissertacao.pdf: 1155571 bytes, checksum: 3a98af31a9aa3f9225c0359f68b2db8e (MD5) Previous issue date: 2013-06-27 / Progesterone (P4) is an important steroid hormone in FTAI programs. Hormonal protocols used in FTAI programs involve considerable financial values, in which P4 represents 43% of the total cost. The P4 release process from vaginal implants occurs by passive diffusion, i.e., the drug release is driven by concentration gradient and enhanced by the contact area between the implant and vaginal epithelium. Given the importance of P4 in the protocols and the significance of this steroid in the treatment costs, several studies described the reutilization of P4 vaginal implants as an alternative to make this technology feasible. However, the results are controversial and the pattern of P4 releasing from vaginal implants used in cows with different luteal activity (amount of endogenous P4 synthesis) is not yet described. The aim of the present study was to evaluate the P4 profile in cows with different luteal activity treated with a new vaginal implant (1g of P4) for 8 days; evaluate and compare to each other and to a new vaginal implant the P4 releasing from implant previously used in females with different endogenous progesterone conditions; and correlate progesterone releasing from new and used (second use) implants with follicular dynamics. For this purpose, two experiments were performed. Experiment 1: Group 1(G1a) with corpus luteum during all treatment period; Group 2 (G2a) with corpus luteum during half of treatment period; Group 3 (G3a) without corpus luteum. At the beginning of treatment (D0), G1a and G2a animals had a functional corpus luteum which was formed eight days prior to implant insertion. Three day after implant insertion (D3), 0.15 mg of D-cloprostenol were administered in G2a animals. The G3a animals (n=10) started the treatment without ovarian luteal activity. Blood samples were collected on D0 in the morning and afternoon, D3, D5 and D8. P4 concentrations were determined by radioimmunoassay (RIA). Average P4 concentrations in each collection were compared by Tukey s test. G1a and G2a was different from G3a on D0 (5,3+3,1a; 5,3+1,4a and 0,6+0,3b ng/mL, respectively (p<0,05)) and on D3 (5,7+2,6a; 5,4+1,95a and 3,6+0,8b ng/mL, respectively (p<0,05)). On D5, 36 hours after PGF administration, P4 concentration of G2a became similar to G3a and both were different from G1a (G1a=3,3+1,6a, G2a=2,4+0,9b and G3a=2,1+0,7b ng/mL (p<0,05)). On D8, the groups maintained the same characteristics (G1a=3,1+1,3a, G2a=1,8+0,8b and G3a=1,6+0,6b ng/mL (p<0,05)). Furthermore, the difference in the P4 serum concentration between D3 and D0 were lower in G1a and G2a than in G3a (G1a=0,4+1,8a; G2=0,2+1,4a e G3=2,8+0,9b ng/mL (p<0,05)). In experiment 2, the same animals were reallocated into 4 groups without CL. Group 1(G1b) implants from G1a of Exp1; Group 2 (G2b) implants from G2a of Exp1; Group 3 (G3b) implants from G3a of Exp1; and Group 4 (G4b) new implants. There is no difference in the number of animals with P4 lower than 1 ng/mL (G1b = 16.7%, G2b = 66%, G3b = 50% and, G4b = 0; P=0,14) and in the number of times that this occurred in relation to the amount of samples evaluated (G1b = 12.5 %, G2b = 22.9 %, G3b = 12.5 % and, G4b = 0; P=0,07), i.e., there were no P4 releasing pattern from used implants and only new implants properly maintained the concentration of this hormone. The average follicular growth rate (G1b = 1,0+0,5; G2b = 1,0+0,3; G3b = 0,7+0,5 e G4b = 0,8+0,3) mm/day) and the diameter of the largest follicle on D8 (G1b = 13,0+3,3; G2b = 12,0+2,3; G3b = 10,5+2,9 e G4b = 11,4+0,6 mm) were also not affected by the releasing pattern of the implants. In conclusion, animals with CL and endogenous P4 during FTAI protocols consumed less P4 from the implants when compare to animals without CL; new P4 vaginal implants maintained adequate levels of P4 for TFAI, regardless the physiological condition of the treated animal; implants previously used by animals with different ovarian activity did not maintain the P4 profile similar to that observed with new implants; follicular dynamics was not changed by the lack of P4 releasing pattern from the used implants when compared to new implants; despite the greater progesterone release, did not affect follicular development pattern in heifers. / A progesterona (P4) é imprescindível para a aplicação da técnica de Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF). Os protocolos hormonais utilizados para a IATF movimentam importante valor financeiro, em que a P4 representa 43 % do custo total. A liberação da P4 pelos dispositivos vaginais ocorre por difusão passiva, ou seja, a droga é liberada obedecendo gradiente de concentração, potencializado pela área de superfície de contato entre o dispositivo e o epitélio vaginal. Dada a importância desse esteroide nos protocolos, vários estudos descrevem a reutilização dos dispositivos como uma alternativa de viabilizar a técnica. No entanto, os resultados são controversos e não há uma descrição sobre o padrão de liberação da P4 de implantes utilizados em vacas em diferentes etapas do ciclo estral. Os objetivos foram: 1) avaliar o perfil de P4, de implantes novos contendo 1g de P4, utilizados por 8 dias, em fêmeas com diferentes condições de atividade ovariana luteal; 2) avaliar e comparar entre si e em relação a um dispositivo novo, a liberação de P4 de implantes previamente usados em fêmeas com diferentes condições de progesterona endógena e 3) correlacionar a liberação de progesterona de implantes de 1º e 2º uso com a dinâmica de desenvolvimento folicular. Para isso, foram realizados dois experimentos. Exp. 1: Grupo 1 (G1a): com corpo lúteo durante todo o tratamento; Grupo 2 (G2a): com corpo lúteo a metade do tratamento e Grupo 3 (G3a): sem corpo lúteo. Os animais dos Grupos G1a e G2a iniciaram o tratamento (D0) com um corpo lúteo funcional, formado oito dias antes da inserção do implante. No G2a, foi aplicada , três dias após a inserção do implante, D3, (0,15 mg de D-cloprostenol) visando luteólise. Os 10 animais do G3a iniciaram o tratamento sem atividade ovariana luteal. Duas amostras de sangue foram coletadas no D0, pela manhã e à tarde, e no D3, no D5 e no D8, à tarde. O nível de P4 foi obtido por radioimunoensaio (RIA). As médias de P4 das amostras foram comparadas pelo teste de tukey. G1a e G2a diferenciaram de G3a no D0 (5,3+3,1a; 5,3+1,4a e 0,6+0,3b ng/mL, respec. (p<0,05)) e no D3 (5,7+2,6a; 5,4+1,95a e 3,6+0,8b ng/mL, respec. (p<0,05)). Em D5, 36 horas após a PGF do G2a, este passou a níveis semelhantes a G3a e ambos se diferenciaram de G1a (G1a=3,3+1,6a, G2a=2,4+0,9b e G3a=2,1+0,7b ng/mL (p<0,05)) e no D8 os grupos mantiveram as mesmas características (G1a=3,1+1,3a, G2a=1,8+0,8b e G3a=1,6+0,6b ng/mL (p<0,05)). Além disso, a diferença entre o nível sérico de D3 e D0 também foi diferente de G1a e G2a quando comparadas com G3a (G1a=0,4+1,8a; G2=0,2+1,4a e G3=2,8+0,9b ng/mL (p<0,05)). Exp. 2: Os mesmos animais foram redistribuídos e, desta vez, divididos em quatro grupos sem a presença de CL. Grupo 1 (G1b): implantes do G1a, Exp. 01; Grupo 2 (G2b): implantes do G2a, Exp. 01; Grupo 3(G3b): dispositivos de G3a, Exp. 1 e Grupo 4(G4b): implantes novos. Não houve diferença no percentual de animais que apresentaram P4 abaixo de 1 ng/mL durante o tratamento (G1b = 16,7%; G2b = 66%; G3b = 50% e G4b = 0; (p=0,14)) e no número de vezes que isso ocorreu em relação à quantidade de amostras avaliadas (G1b = 12,5 %; G2b = 22,9 %; G3b = 12,5 % e G4b = 0; (p=0,07)), ou seja, não houve padrão na liberação de P4 de implantes reutilizados e somente os implantes novos mantiveram níveis adequados desse hormônio. A média das taxas de crescimento folicular (mm/dia) (G1b = 1,0+0,5; G2b = 1,0+0,3; G3b = 0,7+0,5 e G4b = 0,8+0,3) e o diâmetro (mm) do maior folículo em D8 (G1b = 13,0+3,3; G2b = 12,0+2,3; G3b = 10,5+2,9 e G4b = 11,4+0,6) também não foram alterada pelo perfil de liberação a partir dos dispositivos. Diante desses resultados, conclui-se que animais com a presença de CL e P4 endógena durante o protocolo de IATF consomem menor quantidade de P4 dos implantes que animais sem CL; implantes de P4 novos mantêm níveis satisfatórios de P4 para a IATF, independentemente da condição fisiológica da fêmea tratada; dispositivos reutilizados oriundos de animais em diferentes condições de ciclicidade não mantêm perfis de progesterona semelhantes àqueles do uso prévio (1º uso); a dinâmica folicular não foi alterada em função da ausência de padrão na liberação de P4 dos implantes reutilizados quando comparados a implantes novos e que Implantes novos, a despeito da maior liberação de progesterona, não interferem no padrão de desenvolvimento folicular em novilhas.

La cryoconservation de cortex ovarien est la seule technique envisageable pour les patientes pré-pubères et les femmes dont la pathologie nécessite l’administration d’un traitement hautement gonadotoxique dont l’initiation ne peut être différée. L’autotransplantation est jusqu’à présent la seule méthode disponible de réutilisation du tissu ovarien cryoconservé, et a permis d’obtenir plus de 130 naissances dans le monde, dont trois au CHRU de Besançon. Toutefois, en cas de pathologie néoplasique à risque de localisation métastatique ovarienne, cette technique peut présenter un risque de réintroduction de cellules malignes susceptibles d’être présentes dans le greffon. Des méthodes alternatives à l’autogreffe de tissu ovarien cryopréservé fondées sur l’utilisation de follicules ovariens isolés sont actuellement en développement. L’objectif de cette thèse a été de développer un protocole permettant l’isolement et la qualification de follicules ovariens qui pourront être utilisés en thérapie cellulaire à usage humain. Dans un premier temps, une validation de la technique d’isolement de follicules ovariens a été réalisée à partir de la dissociation de fragments de cortex ovarien, issus de patientes ayant subit une résection percœlioscopique, à l’aide d’une collagénase NB6 produite selon les bonnes pratiques de fabrication. Les follicules ainsi obtenus ont été analysés en termes de viabilité (immédiate et après culture in vitro), rendement, morphologie et état prolifératif. Dans un deuxième temps, la sécurité carcinologique des suspensions folliculaires obtenues après isolement a été évaluée par cytométrie en flux multicouleurs à l’aide d’une modélisation ayant consisté en la contamination de suspensions folliculaires avec des cellules leucémiques issues de patients souffrant de leucémies aigües myéloïdes (LAM) ou lymphoblastiques (LAL) d’immunophénotype connu. La collagénase NB6 a permis l’isolement d’un grand nombre de follicules vivants, principalement au stade primordial, et dont la majorité était non activée, même après trois jours de culture in vitro dans un gel de fibrine. La technique d’isolement suivie de trois lavages a permis d’éliminer les cellules leucémiques préalablement ajoutées aux suspensions folliculaires dans 23 cas sur 24, sans endommager les follicules isolés. La cytométrie en flux multicouleurs est une technique d’analyse efficace pour évaluer la contamination, par des cellules leucémiques, de suspensions contenant des follicules ovariens isolés. Le protocole d’isolement de follicules ovariens humains, ayant été réalisé avec la collagénase NB6 de grade clinique, peut être envisagé pour une reconstruction ovarienne à visée thérapeutique humaine. / The cryopreservation of ovarian cortex is the only technique available for prepubertal girls and women when their pathology requires the administration of a highly gonadotoxic treatment whose initiation cannot be delayed. Autotransplantation has so far been the only available method to re-use cryopreserved ovarian tissue, and has resulted in more than 130 births worldwide, including three at the Besançon Hospital. However, in cases of neoplastic disease with a risk of ovarian metastatic localization, this technique may present a risk of reintroducing malignant cells likely to be present in the graft. Alternative methods to cryopreserved ovarian tissue autograft based on the use of isolated ovarian follicles are currently under development. The aim of this thesis was to develop a protocol allowing the isolation and the qualification of ovarian follicles that can be used in cell therapy for human purposes. In a first step, a validation of the technique to isolate ovarian follicles was carried out from the dissociation of cortical ovarian fragments, taken from patients undergoing a laparoscopic ovarian drilling, using collagenase NB6 which is produced according to good manufacturing practices. Follicles thus obtained were analyzed in terms of viability (before and after in vitro culture), yield, morphology and proliferative state. In a second step, the carcinologic safety of follicular suspensions obtained after isolation was evaluated by multicolor flow cytometry using a model involving the contamination of follicular suspensions with leukemic cells from patients suffering from acute myeloid leukemia (AML) or acute lymphoblastic leukemia (LAL) with known immunophenotype. Collagenase NB6 has allowed the isolation of a large number of viable follicles, mostly at the primordial stage and the majority of which were unactivated even after three days of in vitro culture in a fibrin matrice. Our isolation technique followed by three washes has allowed the elimination of leukemic cells previously added to follicular suspensions, in 23 out of 24 cases, without damaging isolated follicles. Multicolor flow cytometry is an effective analytical technique for assessing leukemic cell contamination of suspensions containing isolated ovarian follicles. The protocol to isolate human ovarian follicles, performed with the clinical grade collagenase NB6, may be considered for an ovarian reconstruction to human therapeutic purposes.