Galectina-3, uma proteína que se liga a -galactosídeos, é expressa por neutrófilos e inúmeras evidências indicam que esta molécula atua como uma possível reguladora da resposta imune. Sabe-se que galectina-3 ao ligar com LPS pode levar a formação de oligômeros, que podem alterar o limiar de ativação de células da resposta imune inata. Apesar de existirem diversos estudos que mostram a influência de galectina-3 na resposta de neutrófilos frente a componentes bacterianos, os resultados são em sua maioria contraditórios e inconclusivos. Para elucidar a influência da galectina-3 na reposta imune inata a patógenos periodontais, o presente trabalho avaliou a atividade antimicrobiana in vitro de neutrófilos, isolados de camundongos selvagens (WT) ou geneticamente deficientes de galectina-3 (Gal-3KO), previamente estimulados com LPS de Aa e Pg. Os resultados não evidenciaram diferenças significativas no número de unidades formadoras de colônia (UFC) recuperadas das culturas de neutrófilos provenientes de animais deficientes de galectina-3 e do grupo controle (WT). Contudo, a estimulação de neutrófilos com LPS por 18 horas levou a redução no número de UFC recuperadas das culturas, quando comparado com as culturas estimuladas com LPS por apenas 3 horas. / Galectin-3, a protein that binds -galactosides, is expressed by neutrophils and numerous evidences indicate that this molecule acts as a possible regulator of the immune response. It is known that galectin-3 binding to LPS can lead to the formation of oligomers and thus changing the activation threshold of cells of the innate immune response. Although there are several studies that show the influence of galectin-3 in neutrophil response against bacterial components, the results are conflicting and inconclusive in their majority. To elucidate the influence of galectin-3 in the innate immune response to periodontal pathogens, the present study evaluated the in vitro antimicrobial activity of neutrophils, isolated from wild-type or galectin-3 deficient mice, previously stimulated with LPS of Aa and Pg. The results showed no significant differences in the number of colony forming units (CFU) recovered from cultured galectin-3 deficient neutrophils or control group. However, in a 18 hours time course of LPS stimulation, we observed reduction in the number of CFU, when compared to 3 hours of LPS stimulation.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9637_1.pdf: 3541837 bytes, checksum: 335946642bbceea47297349a5c09095b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Embora o estudo imunoistoquímico seja um método bastante utilizado na rotina do diagnóstico anatomopatológico, este teste ainda apresenta importantes limitações principalmente quanto a incapacidade de distinção entre alguns tipos de lesões tumorais. Dessa maneira, outras ferramentas vêm sendo desenvolvidas a fim de aumentar a sensibilidade e especificidade da identificação antígeno-anticorpo. Dentre estas, os ensaios quimiluminescentes vem sendo cada vez mais utilizados em estudos para o mapeamento de amostras biológicas para fins diagnósticos. Dentre os inúmeros benefícios da utilização dos métodos quimiluminescentes, podemos citar o limite de detecção ultra-sensível, testes rápidos e um amplo campo de aplicações. O presente estudo buscou elaborar um protocolo para detecção da proteína galectina-3 em tecidos tumorais da tireóide e próstata a partir de anticorpo conjugado ao éster de acridina realizando ensaios imunoquimiluminescentes e compará-los aos resultados da imunoistoquímica convencional. O anticorpo monoclonal antigalectina- 3 foi conjugado ao éster de acridina e esse conjugado foi submetido à ensaios imunoquimiluminescentes em tecidos de próstata e tireóide além da imunohistoquímica convencional. Nossos resultados demonstram a eficiência na conjugação da anti-galectina-3 ao éster de acridina, um shelf-life do conjugado anticorpo/éster de acridina (AC-EA) com aproveitamento de 96,51% após 12 meses e a aplicação desse conjugado em ensaios imunoquimiluminescentes nos tecidos tireoidianos e prostáticos demonstraram padrões diferenciais entre as lesões estudadas e sua contraparte normal. Concluiu-se então, que o ensaio imunoquimiluminescente proposto pode ser utilizado como método diagnóstico alternativo na identificação de antígenos principalmente em amostras teciduais pequenas

Orientador: Paulo Pinto Joazeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T06:40:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_MariaAmaliaCavinato_M.pdf: 2973013 bytes, checksum: eef160eabbd2d1426a9f2e0795702488 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: É reconhecido que a sínfise púbica de algumas espécies de mamíferos, incluindo camundongos, passa por transformações estruturais durante a prenhez e no período pós-parto. Estas transformações incluem o surgimento de um ligamento interpúbico e o amolecimento deste tecido nos dois últimos dias antes do parto. Este ligamento permite a separação dos ossos púbicos, garantindo a passagem segura do feto pelo canal de parto. Após o parto ocorre a involução deste ligamento. Ambos os períodos de remodelação tecidual envolvem grandes modificações da matriz extracelular e de seus componentes, bem como um balanço entre proliferação e morte celular programada. A galectina-3, uma lectina animal com especificidade de ligação por ß-galactosídeos, é uma proteína amplamente distribuída entre diferentes tipos de células e tecidos, podendo ser encontrada dentro das células tanto no núcleo quanto no citoplasma, ou ainda na superfície celular ou no espaço extracelular. Através de interações específicas com diversos ligantes intra e extracelulares, a galectina-3 participa de numerosos processos fisiológicos e patológicos, como por exemplo, desenvolvimento, reações imunes, controle do ciclo celular, apoptose e metástase. Este estudo teve como objetivo localizar a expressão de galectina-3 nas populações celulares que compõem esta articulação durante o período de prenhez, a fim de investigar seu possível envolvimento nos processos de remodelação da sínfise. Foi observado que a galectina-3 está presente em todas as populações celulares que compõem a sínfise púbica e o ligamento interpúbico de todos os grupos estudados. Além disso, a galectina-3 é co-localizada com a a-actina de músculo liso em alguns tipos celulares. A quantificação da detecção de galectina-3 nos permitiu observar que ela é expressa em diferentes concentrações durante o período estudado. Esses resultados nos permitiram concluir que a galectina-3 parece estar envolvida na remodelação da sínfise púbica, através de sua participação na ativação de células semelhantes a fibroblastos, no ciclo celular, na diferenciação e nos processos de morte celular programada. / Abstract: It is recognized that the pubic symphysis of some mammal species, including mice, undergoes structural transformations during pregnancy and post-partum. These transformations include the emerging of an interpubic ligament and softening of this tissue in the two last days of pregnancy. This ligament allows the pelvic bones separation, warranting fetus self passage through the birth channel. After delivery this ligament involutes. Both periods of tissue remodeling involve changes in extracellular matrix and its components, as so a balance between cell proliferation and death. Galectin-3, an animal lectin with specificity for ß-galactosídes, is widely spread among different types of cells and tissues, thus being found inside the cells in the cytoplasm and in the nucleus, on cell surface or in the extracellular space. Through specific interactions with a variety of intra and extracellular ligands galectin-3 participates of numerous physiological and pathological processes, like for example, development, immune reactions, cell cycle control, apoptosis and metastasis. This research had the objective to localize galectin-3's expression in mouse pubic symphysis cells during pregnancy, and to investigate its involvement in the pubic remodeling process. It was observed that galectin-3 is present in all pubic cells populations of all of the studied groups. Besides that, galectin-3 is colocalized with a-smooth muscle actin in some cell types. Quantifying of galectin-3 detection revealed that this protein is expressed in different concentrations during the studied period. These results allowed us to conclude that galectin-3 seems to be involved in mouse pubic symphysis remodeling, probably working in the activation of fibroblast like cells, on cell cycle, on differentiation and in the processes of programmed cell death. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Tumores são definidos como microambientes compostos não só pelas células malignas, mas também por células endoteliais, fibroblastos e leucócitos, que promovem o crescimento tumoral e a angiogênese. Galectina-3, uma proteína que se liga a b- galactosídeos, é abundantemente expressa por monócitos/macrófagos, dentre outros leucócitos. Inúmeras evidências sugerem que galectina-3 atua como uma molécula reguladora da resposta inflamatória. Tendo em vista que o infiltrado inflamatório pode promover a progressão de tumores, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se galectina-3, expressa tanto pela célula tumoral como pelas células estromais, modula o crescimento de melanoma. Para tal, células de melanoma murino Tm1 foram transfectadas com o gene de galectina-3. Ambos clones celulares (galectina-3 positivos e negativos) foram injetados na intrafáscia ou no subcutâneo de camundongos (fêmeas) C57BL/6 selvagens e/ou nocautes para o gene de galectina-3 para análise da implantabilidade e crescimento tumoral. Com relação à implantabilidade, não foi observado diferenças no estabelecimento de uma massa tumoral proliferativa em animais selvagens inoculados com células Tm1 transfectadas ou não com o gene de galectina-3 em animais selvagens. Em relação a taxa de crescimento dos tumores, nenhum animal nocaute inoculado com células Tm1 galectina-3 positivas apresentou tumores de dimensões mensuráveis até o 11º dia pós-inóculo. Independente do nível de expressão de galectina- 3 pela célula tumoral, os tumores originados nos animais nocautes apresentavam menor massa em gramas comparados ao grupo selvagem, sugerindo que galectina-3 expressa pelas células estromais promove o crescimento tumoral. Ainda, os tumores originados nos animais nocautes e no grupo selvagem inoculado com células Tm1 galectina-3 positivas apresentavam menor extensão de área necrótica do que os animais selvagens inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas. Interessantemente, os animais selvagens e nocautes inoculados com células Tm1 galectina-3 positivas apresentaram tumores com menor área vascular e menor número de estruturas vasculares funcionais quando comparados aos animais selvagens inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas. A análise de expressão gênica nos tumores mostrou que os níveis relativos de RNAm de VEFG (fator de crescimento de endotélio vascular) foram menores nos animais inoculados com células Tm1 galectina-3 positivas em relação aos inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas, indicando que galectina-3 expressa pelas células tumorais atua como uma molécula anti-angiogênica. Finalizando, o presente trabalho sugere que galectina-3 pode atuar como uma molécula pró- ou anti-tumoral, dependendo do tipo celular que a expressa no microambiente tumoral. / Tumors have been described as microenvironments composed not only by malignant cells, but also by endothelial cells, fibroblasts and leukocytes, which can promote tumor growth and angiogenesis. Galectin-3, a b-galactoside binding protein, is expressed by monocytes/macrophages and others leukocytes. In fact, several lines of evidence suggest that galectin-3 act as master regulators of the inflammatory response. Based on the fact that the inflammatory infiltrate can promote tumor progression, the proposal of this study was to evaluate if galectin-3, either from tumor or stromal cells could modulate melanoma growth. Tm1 murine melanoma cell line was transfected with the galectin-3 gene. Both clones (galectin-3 negative and positive) were injected in the foot pad or subcutaneous in female C57BL/6 wild-type (WT) and galectin-3 knock-out (KO) mice to tumor engraftment and growth analysis. There was no difference in the tumor engraftment between animas injected with Tm1 galectin-3 positive or negative cells. In addition, any knock-out mice injected with galectin-3 positive cells had measurable tumors up to day 11 post inoculation. Regardless the galectin-3 expression level in the melanoma cell, tumors from galectin-3 KO mice were smaller than those from WT animals, suggesting that galectin-3 expressed by stromal cells promotes tumor growth. Moreover, tumor necrotic area was smaller in KO mice and in wild-type animals injected with Tm1 galectin-3 positive cells compared to wild type animals injected with Tm1 galectin-3 negative cells. Interestingly, both vascular area and the number of functional vessels in animals injected with galectin-3 positive Tm1 cells were smaller in WT as well as in KO mice compared to the same animals injected with galectin-3 negative Tm1 cells. Gene expression analysis showed that VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA levels were smaller in wild type animals injected with Tm1 galectin-3 positive cells compared to those injected with Tm1 galectin-3 negative cells, indicating that galectin-3 expressed by tumor cells can act as an anti-angiogenic molecule. The present study suggests that galectin-3 can act either as a pro or antitumoral molecule, depending on which type of cell (tumoral or stromal) this lectin is expressed within tumor microenvironment.

O melanoma canino é uma neoplasia frequente em cães, tem um caráter maligno, invasivo, com potencial metastático e, neste contexto, estudos acerca do envolvimento das galectinas se justifica para ampliar o conhecimento do microambiente tumoral desta neoplasia. As galectinas são proteínas da família das lectinas animais que apresentam domínios de reconhecimento de carboidratos e podem estar localizadas no núcleo, no citoplasma, na superfície de células e secretadas em diversos tecidos. Acredita-se que principalmente a galectina-1 (gal-1) e a galectina-3 (gal-3) estejam associadas à transformação neoplásica, sobrevivência da célula neoplásica, angiogênese, evasão do sistema imune e formação de metástases. A gal-1 está principalmente relacionada com a transformação tumoral e evasão do sistema imune. A gal-3 está principalmente associada com a angiogênese, desenvolvimento de metástases pelo aumento da motilidade e adesão entre as células neoplásicas e adesão entre as células neoplásicas e o endotélio, além de contribuir para a evasão do sistema imune. O objetivo do estudo foi verificar o padrão de expressão de gal-1 e gal-3 nos diferentes graus de agressividade do melanoma canino, além de avaliar a concentração sérica de gal-3 e comparar com cães clinicamente saudáveis. Foram analisadas a expressão de gal-1 e gal-3 em 30 fragmentos de melanoma canino, seis fragmentos de melanocitoma e nove fragmentos de linfonodos metastáticos. Foi realizada a dosagem sérica de gal-3 em 30 cães com melanoma e comparada a 10 cães clinicamente saudáveis. O melanoma canino expressou gal-1 principalmente no citoplasma e expressou um padrão variável de gal-3 no citoplasma e no núcleo. Em relação à expressão de gal-3 observou-se que conforme a agressividade do melanoma houve diminuição da frequência de células com marcação citoplasmática e um aumento da intensidade de marcação nuclear com concomitante diminuição da frequência de células com marcação nuclear. Os cães com melanoma apresentaram aumento dos níveis séricos de gal-3 antes da exérese da neoplasia quando comparados aos animais clinicamente saudáveis, mostrando o seu potencial uso como biomarcador do melanoma. / Canine melanoma is a frequent neoplasm in dogs. It has a malignant, invasive and metastatic potential. In this context, studies about the involvement of galectins are justified to increase the knowledge of melanoma tumor microenvironment. Galectins are proteins of the animal lectins family, that display carbohydrate recognition domains and may be located in the nucleus, cytoplasm, cell surface, as well as secreted in various tissues. Galectin-1 (Gal-1) and galectin-3 (Gal-3) are associated with neoplastic transformation, neoplastic cell survival, angiogenesis, immune system evasion, and metastasis formation. Gal-1 is mainly related to tumor transformation and immune system evasion. Gal-3 is mainly associated with angiogenesis, development of metastasis by increased motility and adhesion between neoplastic cells and adhesion between neoplastic cells and endothelium, while contributing to the evasion of the immune system. The aim of the study was to ascertain the expression pattern of Gal-1 and Gal-3 in different severity degrees of canine melanoma, as well as to evaluate the serum concentration of Gal-3 and to compare with clinically healthy dogs. Gal-1 and Gal-3 expression was analyzed in 30 canine melanoma fragments, six melanocytoma fragments and nine fragments of metastatic lymph nodes. Serum Gal-3 was measured in 30 dogs with melanoma and compared to 10 clinically healthy dogs. Canine melanoma expressed Gal-1 primarily in the cytoplasm and presented a variable pattern of Gal-3 in the cytoplasm and nucleus. Regarding the expression of Gal-3, it was observed that according to melanoma severity, there was a decrease in the percent frequence of cells with cytoplasmic labeling and an increase in the nuclear marking intensity with concomitant decrease in the percent frequency of nuclear-labeled cells. Dogs with melanoma had increased serum levels of Gal-3 before the excision of the neoplasia when compared to the clinically healthy animals, showing its potential use as a melanoma biomarker.

Assim como tecidos normais, tumores possuem uma demanda de nutrientes e oxigênio, suprida através da vasculatura a eles associada que resulta do processo de angiogênese. Fatores pró-angiogênicos são capazes de atrair monócitos, os quais se diferenciam em macrófagos associados a tumores (TAMs). TAMs comumente apresentam fenótipo M2, cujas características são consideradas pró-tumorais, como a promoção da angiogênese e a degradação de matriz extracelular. Estudos indicam que galectina-3 (gal-3), uma proteína pleiotrópica que se liga a ?-galactosídeos, participa do controle da angiogênese e da infiltração de macrófagos M2 na massa tumoral, mas pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos. No presente estudo, utilizamos um modelo de sarcoma induzido por carcinógeno em camundongos selvagens (WT) e knockout para gal-3 (Gal- 3 KO). Comparando os tumores de animais WT e Gal-3 KO, não observamos diferenças no padrão de crescimento tumoral, na área necrótica relativa, na proliferação celular e na quantificação de fibras de colágeno. Demonstramos que, embora ambos os grupos desenvolvam tumores, a angiogênese foi inibida em um microambiente desprovido de gal-3. Entretanto, não houve diferença na produção do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). As imagens obtidas in vivo indicaram que gal- 3 também influencia na formação estrutural de vasos adjacentes ao tumor. Além de mediar aspectos morfológicos relacionados à angiogênese, demonstramos que gal-3 também contribuiu para a funcionalidade vascular, pois houve uma redução na velocidade de fluxo sanguíneo nos vasos intratumorais de animais Gal-3 KO. Nossos dados sugeriram que há menos macrófagos no tumor que não expressa gal-3 e, dentre os TAMs, há mais M2 em comparação ao tumor gal-3-positivo. A análise do tecido onde o tumor se desenvolve, na fase inicial da tumorigênese, indicou que a ausência de gal-3 está relacionada a uma maior densidade de macrófagos M2. Considerando que a presença maior de macrófagos M2 nos sarcomas gal-3-negativos não resultou em maior produção de VEGF, mas sim na inibição da angiogênese, nossos resultados apontam para uma participação significativa de gal-3 na mediação da angiogênese pelos macrófagos / As well as normal tissues, tumors require nutrients and oxygen, which are supplied by the associated vasculature that results from the process of angiogenesis. Pro-angiogenic factors are able to attract monocytes and they differentiate into tumor-associated macrophages (TAMs). TAMs commonly exhibit M2 phenotype, which has characteristics considered pro-tumoral, such as angiogenesis promotion and degradation of extracellular matrix. Studies show that galectin-3 (gal-3), a pleiotropic ?-galactosidebinding protein, participates in angiogenesis control and M2 macrophage infiltration into the tumor mass, but little is known about the mechanisms involved. In this work, we established a model of carcinogen-induced sarcoma in wild-type (WT) and gal-3 knockout (Gal-3 KO) mice. Comparing tumors from WT and Gal-3 KO animals, there were no differences in the pattern of tumor growth, relative necrotic area, cell proliferation and collagenous fibers. We demonstrated that, although both groups develop tumors, angiogenesis was inhibited in a microenvironment devoid of gal-3. However, there was no difference in the production of vascular endothelial growth factor (VEGF). The images obtained in vivo indicated that gal-3 also influenced the structural formation of vessels adjacent to the tumor. In addition to mediating morphological aspects related to angiogenesis, we demonstrated that gal-3 also contributes to vascular functionality, since there was a reduction in blood flow velocity in intratumoral vessels from Gal-3 KO animals. Our data suggested that there are fewer macrophages in tumors without gal-3 and, among TAMs, there are more M2 compared to gal-3-positive tumors. Analysis of the tissue where the tumor develops, in early stages of tumorigenesis, indicated that the lack of gal-3 is related to an increased density of M2 macrophages. Since the greater number of M2 macrophages in gal-3-negative fibrosarcomas did not result in increased VEGF production, but inhibited angiogenesis, our results suggest a significant role of gal-3 in regulation of angiogenesis by macrophages

A heterogeneidade intratumoral é um fenômeno extremamente importante para entender a progressão tumoral e a resposta à intervenção terapêutica. A galectina-3 pertence à família das lectinas, possuem a função de reconhecimento e ligação à ?-galactosídeos ramificados de glicolipídeos e glicoproteínas, e está envolvida em processos fisiológicos e patológicos como o câncer. Nesse trabalho, a heterogeneidade intratumoral em relação à expressão de galectina-3 foi observada em amostras de diferentes lesões melanocíticas de pacientes. Além disso, o inóculo de células de melanoma murino negativas para galectina-3 em animais gal3-/- gerou tumores constituídos por uma fração de células tumorais que passaram a expressar de novo galectina-3, sugerindo que pressões do microambiente tumoral modulam a expressão dessa lectina em melanomas. A acidose extracelular atuou como regulador negativo de galectina-3 in vitro, diminuindo a expressão dessa lectina tanto em células de melanoma murino e humano quanto em melanócito murino. Entretanto, a hipóxia, seja pela exposição aguda ou intermitente, não alterou a expressão in vitro de galectina-3 em células de melanoma humano. Por fim, tumores originados pelo inóculo de células tumorais positivas e negativas para galectina-3 (mimetizando tumores heterogêneos) obtiveram a maior taxa de crescimento tumoral comparados aos tumores constituídos por uma única população de células, seja positiva ou negativa para galectina-3. Portanto, foram apresentadas evidências de que a heterogeneidade intratumoral em relação à galectina-3 parece estar envolvida com o sucesso evolutivo do melanoma e que a acidose é indicada como uma das pressões microambientais que contribuem para o estabelecimento e manutenção da fração de células tumorais negativas para galectina-3 dentro da massa tumoral / The intratumoral heterogeneity observed in human tumors is extremely important to understand tumor progression and its therapeutic response. Galectin-3 belongs to animal lectin family and it is a ?-galactosidase binding protein which is involved in physiological and pathological processes, including cancer. In this work, an intratumor heterogeneous galectin-3 expression was observed in tissue sessions containing different human melanocytic lesions. Moreover, negative galectin-3 murine cells injected into gal3-/- mice were able to generate tumors composed of a positive galectin-3 cell fraction, suggesting that selective forces in tumor microenvironment modulate galectin-3 expression in melanoma. Extracellular acidosis acts as a negative regulator to galectin-3 in vitro, decreasing its expression in murine and human melanoma cells and even in murine melanocytes. However, intermittent or acute hypoxia exposure did not alter galectin-3 expression in human melanoma cells in vitro. In addition, tumors originated from a mixture of positive and negative galectin-3 cells (mimicking heterogeneous tumors) showed higher growth rate compared to those derived from only galectin-3 positive or negative cells. Therefore, we showed evidences that galectin-3 intratumoral heterogeneity seems to be involved with the evolutionary success of melanoma and that acidosis may be the microenvironmental pressure responsible for the establishment and maintenance of galectin-3 negative cell fraction into the tumor bulk

Galectina-3 é uma lectina animal que apresenta afinidade por b- galactosídeos e que tem sido associada à progressão tumoral e metástase. A expressão de galectina-3 encontra-se alterada durante a progressão tumoral de diferentes neoplasias. Em tumores como carcinoma de tiróide e bexiga a expressão de galectina-3 encontra-se aumentada, enquanto que em tumores como carcinoma de mama e ovário a expressão desta lectina encontra-se diminuída. Neste trabalho nós utilizamos um modelo de progressão tumoral de melanoma murino para investigar os mecanismos envolvidos na perda de expressão de galectina-3. Este modelo é composto por uma linhagem de melanócitos imortalizados (melan-a) e duas linhagens de melanoma de crescimento vertical (Tm1 e Tm5) estabelecidas após submeter a linhagem melan-a a inúmeros ciclos de de-adesão. Enquanto melan-a acumula grandes quantidades de galectina-3, as linhagens Tm1 e Tm5 deixaram de expressar o gene de galectina-3. Análise da região 5\' do gene de galectina-3 demonstrou que esta região apresentava grande conteúdo de dinucleotídeos CpG e vários sítios SP1. O seqüenciamento desta região após tratamento do DNA com bissulfito de sódio mostrou que esta região estava totalmente metilada nas linhagens Tm1 e Tm5 e desmetilada na linhagem melan-a. O tratamento da linhagem Tm1 com 5-Aza-2\'-deoxicitidina (5-Aza-CdR), um inibidor da DNA metiltransferase, provocou um decréscimo significativo nos níveis de metilação da região 5\' do gene de galectina-3 que por sua vez levou a re-expressão do RNAm e da proteína. O tratamento de Tm1 com os inibidores de histono deacetilases tricostatina A e 4-ácido-fenilbutírico em combinação com 5-Aza-CdR não aumentou os níveis de expressão do gene de galectina-3 e curiosamente, reverteu o efeito induzido por 5-Aza-CdR. Em adição, a expressão da enzima DNMT1 apresentou um discreto aumento nas linhagens Tm1 e Tm5 em relação a melan-a. Em conjunto esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos como a metilação estão envolvidos no controle de expressão do gene de galectina- 3 ao longo da progressão tumoral de melanoma murino. / Galectin-3 is a b-galactoside-binding animal lectin, shown to be involved in tumor progression and metastasis. Galectin-3 expression has been found altered along tumor progression of different tumors. In some types of cancers such as thyroid carcinoma and bladder carcinoma, galectin-3 expression has been found increased, whereas in tumors such as breast carcinoma and ovary carcinoma the expression of this lectin has been found decreased along tumor progression. In this study, we have used a murine melanoma model to investigate the mechanisms responsible for the loss of galectin-3 gene expression. This model consists of a cell line of immortalized melanocytes (melan-a) and two cell lines of vertical growth phase melanoma (Tm1 and Tm5) established after submitting melan-a cells to several deadhesion cycles. While melan-a expressed high amounts of galectin-3, both Tm1 and Tm5 cells lost galectin-3 gene expression. Analysis of the 5\' upstream region of the galectin-3 gene demonstrated the presence of a high CpG content and several SP1 binding sites. Bisulfite sequencing of this region showed that it was fully methylated in Tm1 and Tm5 cells and unmethylated in melan-a cells. Treatment of Tm1 cells with 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-Aza-CdR), a DNA methyltransferase inhibitor, led to a marked decrease in the methylation levels of the 5\' upstream region of the galectin-3 gene, which led to transcription of the galectin-3 gene. Treatment of Tm1 cells with the histone-deacetylase inhibitors trichostatin A and 4- acid-phenilbutyrate in combination with 5-Aza-CdR did not increase the levels of galectin-3 gene expression and intriguingly, reverted the effect of 5-Aza-CdR alone. In addition, the expression of DNMT1 showed a modest, but significant increase in Tm1 and Tm5 cells as compared with melan-a cells. Altogether these results indicate that epigenetic mechanisms such as methylation play a role in the regulation of the galectin-3 gene expression along murine melanoma progression.

Os melanomas correspondem a 7% de todas as neoplasias malignas em cães e são principalmente encontrados em cavidade oral e lábios, correspondendo a 33% dos tumores de boca, possuem um prognóstico ruim devido ao fato de serem diagnosticados tardiamente, por sua grande capacidade de invasão local e formação de metástases, além de altas taxas de recidiva após o tratamento cirúrgico. A Galectina-3 (Gal-3) é uma proteína responsável por diversas funções fisiológicas como adesão, apoptose, angiogênese, proliferação e diferenciação. Em medicina veterinária existem poucos estudos relacionando à expressão da Gal-3 com prognóstico e a progressão da neoplasia. Realizamos imuno-histoquímica para Gal-3 em 27 melanomas orais caninos que foram avaliados de maneira semiquantitativa e quantitativa, e comparamos os resultados obtidos com a sobrevida, outros marcadores prognósticos (Ki67, índice mitótico e atipia nuclear), expressão de proteínas relacionadas à apoptose (BCL2 e CASP3) e parâmetros histopatológicos (grau de pigmentação e tipo histológico). Detectamos alta expressão de Gal-3 em melanomas com maior sobrevida pós-cirúrgica e uma alta expressão nuclear de Gal-3 em melanomas com menor sobrevida pós-cirúrgica. Além disso, houve correlação entre as expressões de Gal-3 e BCL2, assim como entre atipia nuclear e sobrevida pós-cirúrgica. É sabido que a Gal-3 é capaz de formar heterodímeros com a BCL2 no citoplasma para atuar na evasão da morte por apoptose, impedindo a liberação da citocromo C. Já no núcleo, a Gal-3 induz à parada do ciclo celular, reduzindo a taxa da proliferação. Apesar do reduzido número amostral devido à dificuldade nos acompanhamentos clínicos nossos dados permitem sugerir que a Gal-3 é possui potencial para ser um marcador prognóstico de sobrevida em casos de melanomas orais caninos. Novos estudos devem ser realizados afim de confirmar nossas observações e elucidar o papel da Gal-3 nesta neoplasia. / Melanomas are almost 7% of all malignant neoplasms in dogs. They are mainly found in the oral cavity and lips, corresponding to 33% of tumors of the oral cavity. They carry a poor prognosis because of late diagnoses, local invasiveness, high metastatic and recurrence rates after surgical treatment. Galectin-3 (Gal-3) is a protein with a variety of biological roles such as in adhesion, apoptosis, angiogenesis, proliferation and differentiation. In veterinary medicine, there are few studies comparing the expression of Gal-3 with prognosis and tumor progression. We performed immunohistochemistry for Gal-3 in 27 canine oral melanomas and evaluated the immunolabelling both semi-quantitatively and quantitatively. The results were compared with survival, other prognostic markers (Ki67, mitotic index and nuclear atypia), expression of proteins related to apoptosis (BCL2 and CASP3) and histopathological parameters (degree of pigmentation and histological type). We detected higher expression of Gal-3 in cases of melanoma that presented longer post-surgical survival and a higher nuclear expression of Gal-3 in dogs with melanoma that had shorter post-surgical survival. In addition, there was correlation between the Gal-3 and BCL2 expressions, as well as between nuclear atypia and post-surgical survival. It is known that Gal-3 is able to form heterodimers with BCL2 in the cytoplasm leading to evasion of apoptosis, through preventing mitochondrial cytochrome C release. Nuclear Gal-3 induces the cell cycle arrest, reducing the proliferation rate. Despite the small sample size due to the difficulty in clinical follow-up, our data suggest that Gal-3 has the potential to be a prognostic marker for survival in cases of canine oral melanomas. Further studies should be performed to confirm our observations and elucidate the role of Gal-3 in this neoplasm.

A galectina-3 (GAL-3) é uma proteína multifuncional que pertence à família das lectinas e liga a carboidratos. A expressão de galectina-3 foi detectada em muitos tipos de tumores, como melanomas, astrocitomas e tumores da bexiga e de ovário. A galectina-3 é expressa por macrófagos e desempenha papel importante na polarização de macrófagos para o fenótipo M2. Sabe-se que macrófagos de fenótipo M2 estão associados com a progressão tumoral. Apesar dos avanços sobre o papel de galectina-3 na progressão tumoral, pouco se sabe sobre o papel desta lectina na ativação de macrófagos durante o desenvolvimento de carcinoma espinocelular (CEC). Desta forma, utilizando o modelo experimental de carcinoma espinocelular induzido quimicamente, testamos a hipótese de que a sinalização mediada por galectina-3 poderia modular a resposta imune e o desenvolvimento tumoral. Os resultados do presente estudo demostraram que a ausência da galectina-3 está associada a menor progressão do carcinoma espinocelular. Além disso, observou-se o aumento nas percentagens de células TCD4+, TCD8+, associada a uma diminuição de células B, células dendríticas e macrófagos em amostras de tecido tumoral de animais Gal3KO. Em relação ao fenótipo dos macrófagos, os resultados evidenciaram uma menor porcentagem de macrófagos M2 em amostras de animais deficientes de galectina 3, bem como de citocinas do perfil Th2. Desta forma, os resultados do presente estudo fornecem evidências de que galectina-3 desempenha um papel importante na progressão do carcinoma espinocelular de pele e pode ser um alvo para futuras modalidades terapêuticas. / Galectin-3 (GAL-3) is a multifunctional protein belonging to the lectin family that binds to carbohydrates. Galectin-3 expression has been detected in many types of tumors, such as melanomas, astrocytomas, and bladder and ovary tumors. Galectin-3 is expressed by macrophages and plays an important role in the polarization of macrophages to the M2 phenotype. In addition, M2 macrophages are associated with tumor progression. Despite advances in the role of galectin-3 in tumor progression, little is known about the role of this lectin in the activation of macrophages during the development of squamous cell carcinoma (SCC). Thus, using the experimental model of squamous cell carcinoma, we tested the hypothesis that galectin-3-mediated signaling could modulate the immune response and tumor development. The results of the present study demonstrated that the absence of galectin-3 is associated with less progression of squamous cell carcinoma. In addition, increased percentages of CD4+ TCD8+ cells, TCD8+, associated with a decrease in B cells, dendritic cells and macrophages were observed in tumor samples from Gal3KO animals. Regarding the macrophages phenotype, the results showed a lower percentage of M2 macrophages in samples of Gal3KO mice, as well as Th2 profile cytokines. Thus, the results of the present study provide evidence that galectin-3 plays an important role in the progression of squamous cell carcinoma and may be a target for future therapeutic modalities.