O presente trabalho discute a história da genética no Brasil desde sua institucionalização até o desenvolvimento da genética humana, entre 1920 e 1970. No Brasil, os primeiros estudos de genética remontam à década de 1920 nas escolas agrícolas, em especial o Instituto Agronômico de Campinas (IAC) e a Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), em Piracicaba. Em 1934, a partir da formação da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras da Universidade de São Paulo (USP), que incorporou a ESALQ, se iniciou a institucionalização da genética no Departamento de Biologia Geral daquela Faculdade e a criação da primeira escola de genética de populações de Drosophila de espécies tropicais. Esta escola foi denominada de Dreyfus-Dobzhansky e sua origem esteve ligada ao plano de ação da Fundação Rockefeller para a ciência na América Latina. A Fundação Rockefeller patrocinou a vinda do evolucionista Theodosius Dobzhansky, considerado um pioneiro na genética de populações de Drosophila e na teoria sintética da evolução. Na década de 1940 e 50, o desenvolvimento da genética de populações sob a liderança de André Dreyfus, Theodosius Dobzhansky e Crodowaldo Pavan fez do Departamento de Biologia Geral da USP um centro nacional de pesquisas de genética de populações e evolução, além de atuar na formação de inúmeros pesquisadores que foram posteriormente fazer pós-graduação com Dobzhansky na Universidade de Columbia. A evolução nas pesquisas de populações de Drosophila resultou no reconhecimento internacional da genética no Brasil, através de suas publicações, e na formação de novos centros de estudo de genética disseminados por todo o país. Novas áreas de pesquisa também foram desenvolvidas, como a genética humana e a genética de micro-organismos. A partir de 1960, pesquisadores brasileiros liderados por Oswaldo Frota-Pessoa, Newton Freire-Maia, Pedro Henrique Saldanha, Willy Beçak, Cora de Moura Pedreira, entre outros, desenvolveram importantes pesquisas na área de genética de populações humanas. Os centros de pesquisa de genética humana estabeleceram parcerias em projetos internacionais nos estudos voltados para os grupos sanguíneos das populações indígenas e aos efeitos da radiação nos seres humanos estes em cooperação com a World Health Organization. Esta tese analisa os principais aspectos desta história da genética no Brasil. Um de seus resultados é a descoberta de um plano nacional de desenvolvimento para a genética, que se deu a partir de parcerias internacionais e renomados cientistas. Os geneticistas brasileiros reelaboraram suas pesquisas de forma original, estudando por exemplo, a consanguinidade e as doenças genéticas das populações brasileiras. Este grupo se disseminou numa influente rede de pesquisas internacionais, tornando-se um dos mais respeitados staffs de genética mundial nas décadas de 1960 e 70. / The present study discusses the history of genetics in Brazil from its institutionalization to the development of human genetics between 1920 and 1970. The first genetic studies in Brazil date back to the 1920s in agricultural schools, especially the Agronomic Institute of Campinas (IAC) and the Luiz de Queiroz College of Agriculture (ESALQ) in Piracicaba. In 1934, as of the formation of the Faculty of Philosophy, Sciences and Arts of the University of São Paulo (USP), which introduced ESALQ, the institutionalization of genetics was begun in the Department of General Biology of that Faculty and the creation of the first school of genetics of Drosophila populations of tropical species. This school was named Dreyfus-Dobzhansky and its origin was linked to the action plan of the Rockefeller Foundation for science in Latin America. The Rockefeller Foundation sponsored the evolutionist Theodosius Dobzhanskys coming, who is considered a pioneer in the Drosophila populations genetics and in the synthetic theory of evolution. In the 1940s and 1950s, the development of population genetics under the leadership of André Dreyfus, Theodosius Dobzhansky and Crodowaldo Pavan made the Department of General Biology of USP a national center for population genetics and evolution research, as well as training of countless researchers who were later doing postgraduate studies with Dobzhansky at Columbia University. The development of Drosophila population research has resulted in the international recognition of genetics in Brazil, through its publications, and in the formation of new genetic study centers spread throughout the country. New areas of research have also been developed, such as genetics of microorganisms and human genetics. Since 1960, Brazilian researchers led by Oswaldo Frota-Pessoa, Newton Freire-Maia, Pedro Henrique Saldanha, Willy Beçak and Cássio Bottura have developed important research in the area of genetics of human populations. Human genetics research centers have established partnerships in international projects in studies focusing on blood groups and the effects of radioactivity in humans - in cooperation with the World Health Organization. This study analyzes the main aspects of this history of genetics in Brazil. One of the results is the discovery of a national development plan for genetics, which has come from international partnerships and renowned scientists. Brazilian geneticists reworked their research in an original way, for example, studying the inbreeding and genetic diseases of Brazilian populations. This group spread to an influential international research network, becoming one of the world\'s most respected genetics staff in the 1960s and 1970s.

A tese aborda diferentes dimensões da relação entre centros e periferias na produção, circulação e legitimação do conhecimento, a partir de um estudo de caso que se debruça sobre a área da genética humana e médica no Brasil. Busca-se discutir as razões, estratégias, contingências e constrições das colaborações internacionais realizadas pelas(os) pesquisadoras(es) brasileiras(os) em um contexto disciplinar percebido como estruturalmente desigual. Trata-se de explorar as potencialidades do estudo de caso para a identificação em termos mais específicos de fatores e processos que têm sido descritos de modo generalizante nos discursos contemporâneos sobre a internacionalização da ciência e a transformação dos modos de produção de conhecimento científico. Para tanto, foi feito um trabalho de campo que compreendeu a seleção de uma amostra de pesquisadoras(es) da genética humana e médica no Brasil, que levou à identificação dos programas de pós-graduação de excelência na área, localizados em quatro universidades públicas: Universidade de São Paulo campus Ribeirão Preto; Universidade Estadual de Campinas; Universidade Federal do Pará; e Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Essa seleção baseou-se na Avaliação Trienal da Capes 2010-2012 (que eram os dados mais recentes disponíveis quando do desenho da pesquisa). Foram então realizadas 46 entrevistas semiestruturadas com pesquisadoras(es) pertencentes às instituições em que esses Programas estão sediados, a grande maioria delas realizada in loco, para cuja análise foi utilizado o programa Atlas Ti. A exploração desse material, devidamente localizado no contexto histórico do desenvolvimento da área no país, permitiu analisar as representações das(os) pesquisadoras(es) em termos de estratégias negociadas e renegociadas no cotidiano das colaborações nacionais e internacionais e a constituição das agendas de pesquisa, simultaneamente em consonância e em tensão com os padrões e parâmetros do que se convencionou chamar de ciência internacional. Os dados balizam a discussão sobre as possibilidades de reconhecimento da pesquisa em genética humana e médica realizada por brasileiras(os), que explora as tensões entre o local e o internacional, considerando os aspectos que marcam as formas contemporâneas de competição no interior de atividade científica em um campo disciplinar específico. A análise revela a pluralidade das relações entre centros e periferias, em dinâmicas sociais que transformam e recriam desigualdades nacionais, regionais e globais no campo contemporâneo da produção de conhecimento em genética humana e médica. / This doctoral dissertation deals with different dimensions of the relation between centres and peripheries in the production, circulation and legitimation of knowledge, departing from a case study looking at human and medical Genetics in Brazil. Its aims are to discuss the reasons, strategies, contingencies and constrictions of international collaborations taken through by Brazilian researchers in a disciplinary context perceived as structurally unequal. Thus it is about exploring the potentialities of this case study to identify under more specific terms the factors and processes that have been hitherto described in a generalizing manner throughout contemporary discourses on internationalization of science and the transformation of the modes of production of scientific knowledge. To achieve this, a fieldwork has been taken through, comprehending the selection of a sample of researchers in the field of human and medical Genetics in Brazil, therefore leading to the identification of graduate programmes of excellence, located in four public research universities: Universidade de São Paulo campus Ribeirão Preto; Universidade Estadual de Campinas; Universidade Federal do Pará, and Universidade Federal do Rio Grande do Sul. This selection based itself upon the 2010- 2012 Triennial Evaluation Process of Capes (which were the most recent data available at the moment when the research happened to be designed). After this first preparatory step, 46 semi-structured interviews were held with researchers belonging to the institutions hosting these programmes, the most part of them in loco, after which the software Atlas Ti was used to analyse them. Exploring this material, duly situated in the historical context of the areas development in Brazil, allowed to analyse the representations of these researchers in terms of the strategies employed to negotiate and renegotiate in everyday national as well as international collaborations, alongside the constitution of research agendas, all of them simultaneously in consonance and tension regarding patterns and parameters of what has been agreed upon to receive the name of international science. This data appears as a yardstick to evaluate the discussion concerning the possibilities of recognizing research in human and medical Genetics performed by Brazilian researchers, examining tensions between the local and the international, taking into consideration the aspects that characterize contemporary forms of competition among scientific activity in a specific disciplinary field. The investigation and concurrent analysis reveal the plurality of relations between centres and peripheries, paying special attention to social dynamics that produce and recreate national, regional and global inequalities in the contemporary field of knowledge production in human and medical genetics.

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As células descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metabólico pelo MTT e de unidades formadoras de colônias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservação das células CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparação com a solução padrão de criopreservação. Já na segunda fase do estudo, após as análises de todos os testes vimos que a solução que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manutenção da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A solução que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparável com seu controle (2,5%DMSO), porém quando avaliamos a solução que continha apenas trealose intracelular não obtivemos resultados satisfatórios. A catalase pode atuar sobre a redução dos níveis ERO na solução de criopreservação das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das células durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clínicos futuros, ela poderá ser um potencial crioprotetor das células-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da solução de criopreservação, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infusão de produtos criopreservados nos pacientes. / The umbilical cord blood (UCB) has been used as a source of primitive hematopoietic stem cells (HSC) to reconstitute the hematopoiesis. Most often, it is required the cryopreservation of HSC, which remain frozen in banks for possible future use. For cryopreservation of HSC, the chemical reagent dimethylsulfoxide (DMSO) has been used as a cryoprotectant. Many organisms in nature have a capacity of survive freezing and dehydration by accumulating disaccharides, so the trehalose, has been actively investigated as an alternative cryoprotector, other damage which is very common during freezing is oxygen free radicals formation which decreases the cellular viability after thawing, so the addition of bioantioxidants in the solution of cryopreservation of cells is very important. This study was divided into two phases: first, we evaluated the results obtained with the addition of antioxidants in the solution for cryopreservation of cord blood cells and the second phase: evaluate the hypothesis that the cryopreservation solution containing intracellular and extracellular trehalose improves recovery and viability of cord blood stem cells after cryopreservation. UBC was processed and subjected to cryopreservation solutions containing for the first phase: solutions with different concentrations of DMSO (10%, 5% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (5%, 2.5 %) with a disaccharide (60 mmol/L), ascorbic acid and/or catalase (10mg/mL), and for the second phase: solutions containing different concentrations of DMSO (10% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (2.5%) with intracellular trehalose (trehalose was introduced into the cell by means of liposomes) and solutions containing extra and intracellular trehalose without DMSO, stored for two weeks in N2L, and thawed. The thawed cells were assessed by flow cytometry, MTT and colony forming units (CFU) assays. In the first phase of the study our analysis showed catalase improved the preservation CD34+ and CD123+ cells, cell viability and CFU compared to standard cryopreservation solution. In the second phase, after testing of all test we observed that the solution containing intra/extracellular trehalose and DMSO showed superior capacity of maintaining the cell viability/integrity in relation to the others, the solution containing intra-and extracellular trehalose without DMSO, obtained a result that can be compared with its control (2.5% DMSO), and that the solution containing only intracellular trehalose did not generate satisfactory results. The catalase can act on reducing the levels of reactive oxygen species in the solution for cryopreservation of HSC of UCB reducing the damage it caused, trehalose must be present on both sides of the cells during the freezing process. Future clinical trials are needed to confirm that it may be a potential cryoprotectant of stem cells from cord blood, which can totally replace the DMSO in cryopreservation solution, eliminating the side effects from the infusion of cryopreserved products in patients already suffering from the disease base.

Introdução: Pacientes hipertensos resistentes (HR) são indivíduos com pressão arterial não controlada - apesar do tratamento com um diurético e dois anti-hipertensivos com mecanismos de ação diferentes em doses adequadas. Há duas áreas de interesse nesse contexto: a ancestralidade genética que, a princípio, poderia impactar em controles pressóricos, e a farmacometabolômica que, conceitualmente, é um conjunto de mudanças em concentrações de metabólitos - um novo campo que pode esclarecer mecanismos de variações de respostas farmacológicas. Assim, nossos principais objetivos foram: associar mensurações séricas de fármacos anti-hipertensivos e seus metabólitos às respostas farmacoterapêuticas em pacientes hipertensos e analisar a ancestralidade genética em pacientes hipertensos a fim de verificar uma possível associação com as respostas farmacoterapêuticas e a hipertensão resistente. Métodos: Foram utilizadas amostras de 1.597 pacientes, sendo 187 HR. A preparação e a análise da amostra foram realizadas usando uma coluna com nanotubos de carbono de acesso restrito (RACNTs) em um sistema de cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massa (UPLC-MS/MS), em modo column switching. A ancestralidade genética foi realizada usando um painel de 192 marcadores polimórficos; três referências foram usadas (europeia, ameríndia e africana). A raça foi determinada pela autodeclaração, segundo IBGE (branco, pardo, negro e outros). Resultados: O método foi totalmente validado de acordo com as diretrizes da Food and Drug Administration (FDA). O tempo de execução total para cada análise foi de 12,0 min - incluindo a preparação da amostra. Não foram encontradas diferenças significativas nas concentrações de cada analito de acordo com pacientes responsivos e não responsivos, possivelmente, por causa do número de amostra ainda baixo (n total de 171 amostras). As médias das mensurações no grupo dos respondedores foram: clonidina 1,308microg/L; amlodipina 44,044microg/L; enalapril 67,706microg/L; enalaprilato 44,144microg/L; losartana 202,622microg/L; ácido carboxílico de losartana 65,99microg/L, glicuronídeo N-2 de losartana 43,4microg/L e espironolactona 85,87microg/L. Para o grupo dos não respondedores, obtivemos: clonidina 1,4microg/L; amlodipina 78,89microg/L; enalapril 87,821microg/L; enalaprilato 78,878microg/L; losartana 148,026microg/L, ácido carboxílico de losartana 83,535microg/L, glicuronídeo N-2 de losartana 122,452microg/L e espironolactona 79,72microg/L. A raça autodeclarada foi associada aos componentes da ancestralidade genética desses pacientes (p<0,001). A ancestralidade genética, disponível para 1.503 pacientes, teve média geral de 0,53, para europeia; 0,11, para ameríndia; e 0,35, para africana. Não foram encontradas diferenças estatísticas nas médias de ancestralidade de acordo com os grupos respondedor ou HR. Conclusões: O método analítico foi validado e a ancestralidade genética foi realizada, ambos não associados à farmacoterapêutica e à hipertensão resistente / Background: Resistant hypertensive (RH) patients are individuals with uncontrolled blood pressure - despite treatment with one diuretic and two antihypertensives with different mechanisms of action in adequate doses. There are two areas of interest in this context: genetic ancestry that could initially impact on blood pressure controls, and pharmacometabolomics, which conceptually is a set of changes in metabolite concentrations - a new field that can clarify mechanisms of pharmacological response variation. Thus, our main objectives were: to associate serum measurements of antihypertensive drugs and their metabolites to the pharmacotherapeutic responses in hypertensive patients and to analyze genetic ancestry in hypertensive patients in order to verify a possible association with pharmacotherapeutic responses and resistant hypertension. Methods: Samples of 1,597 patients were used, being 187 RH. Sample preparation and analysis were performed using a column with restricted access carbon nanotubes (RACNTs) in a liquid chromatography coupled to mass spectrometer (UPLC-MS/MS) in column switching mode. Genetic ancestry was performed using a panel of 192 polymorphic markers; three references were used (European, Amerindian and African). The race was determined by self-declaration, according to IBGE (white, brown, black and others). Results: The method has been fully validated according to the guidelines of the Food and Drug Administration (FDA). The total run time for each analysis was 12.0 min including sample preparation. No significant differences were found in the concentrations of each analyte according to responsive and nonresponsive patients, possibly because of the still low number of samples (total n of 171 samples). The means of the measurements in the responders group were: clonidine 1.308microg/L; amlodipine 44.044microg/L; enalapril 67.706microg/L; enalaprilat 44.144microg/L; losartan 202.622microg/L; losartan carboxylic acid 65.99microg/L, N-2 glucuronide of losartan 43,4microg/L and spironolactone 85.87microg/L. For the group of non-responders, we obtained: clonidine 1.4 microg/L; amlodipine 78.89microg/L; enalapril 87.821microg/L; enalaprilat 78.878microg/L; losartana 148.026microg/L, losartan carboxylic acid 83.535microg/L, N-2 glucanide of losartan 122.452microg/L and spironolactone 79.72microg/L. Self-reported race was associated with the components of the genetic ancestry of these patients (p<0.001). Genetic ancestry, available for 1,503 patients, had an overall mean of 0.53 for European; 0.11 for Amerindian; and 0.35 for African. No statistical differences were found in the means of ancestry according to responder or RH groups. Conclusion: The analytical method was validated and genetic ancestry was performed, both unrelated to pharmacotherapeutic and resistant hypertension

Orientador: Ana Elizabete Silva / Banca: Maria Inês Moura Pardini / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: O câncer gástrico é a segunda causa de morte por câncer no mundo e o quinto tipo com maior prevalência no Brasil, sendo previstos 21.800 casos novos em 2008. Esta neoplasia apresenta etiologia bastante complexa, envolvendo fatores genéticos e ambientais. Os fatores etiológicos de maiores destaques incluem a infecção pela bactéria Helicobacter pylori, a ingestão de determinados alimentos, como defumados, enlatados e com elevada quantidade de sal, além do estilo de vida dos indivíduos, associado ao consumo de cigarro e álcool. Uma lesão pré-cancerosa importante no desenvolvimento da neoplasia gástrica é a metaplasia intestinal, podendo aumentar o seu risco em até 10 vezes. Atualmente é reconhecida a participação de alterações epigenéticas como metilação aberrante do DNA, que atua de forma igualmente relevante e complementar no processo de desenvolvimento e progressão do câncer. Vários genes com papel importante no controle do ciclo celular, reparo do DNA, apoptose, angiogênese e adesão celular podem apresentar expressão alterada devido metilação aberrante de sua região promotora, assim a investigação do padrão de metilação de genes envolvidos com o processo neoplásico pode ser uma estratégia interessante para a indicação de marcadores moleculares que possam auxiliar no diagnóstico precoce do câncer. Desta forma, no presente trabalho foi investigado o padrão de metilação dos genes WT1 e RARß em metaplasia intestinal (35 amostras) e suas respectivas mucosas gástricas normais, em comparação com o câncer gástrico (8 amostras) também com suas respectivas mucosas normais, através da técnica MS-PCR (Methylation Specific PCR). Devido à participação da infecção pela H. pylori na carcinogênese gástrica, foi investigada molecularmente a presença dessa bactéria nas amostras...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Worldwide, the gastric cancer is the second cause of death by cancer. In Brazil, it is the fifth type with more abundant, foreseen 21.800 new cases in 2008. This neoplasia presents very complex etiology involving genetic and environmental factors. The main etiologic factors include: infection by H. pylori, intake of specific foods such as curing food, canned food, and high consumption of salt wealthy food, besides people life style associated to alcohol and cigarette consumptions. An important previous-cankered lesion in development of gastric neoplasia is the intestinal metaplasia, what can increase your risk in ten times. At this moment, it is recognized the participation of epigenetic alterations like ADN aberrant methylation, which actuate in a same way considerable and complementary in development process and cancer evolution. Many genes with important role in control of cellular cycle, ADN repair, apoptosis, angiogenesis and cellular adhesion can present changed expression due aberrant metthylation of your promoter region. In this manner, the investigation of metithyation pattern of genes involved with the neoplasic process can be an interesting strategy for the indication of molecular markers that can help in cancer precocious diagnosis. Thus, in this present study were investigated the metthylation pattern of RARß and WT1genes (35 samples) and their respective normal mucous gastrics by technic MSPCR (Methylation Specific PCR). Due to participation of infection by H. pylori in gastric carcinogenesis, it was too molecular investigated the presence of this bacterium in the studied samples and the possible association with the metthylation pattern presented by both genes. The results showed high pattern of methylation in both valued lesions, that is, 97% and 100%, respectively of methylated samples in metaplasia group ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Agnes Cristina Fett Conte / Banca: Roseli Maria Zechi Ceide / Banca: Luiz Carlos de Mattos / Resumo: Os defeitos congênitos resultam de causas genéticas e não genéticas, afetam cerca de 3 a 5% dos recém-nascidos e são reconhecidos como uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no primeiro ano de vida, além de serem a causa de muitas mortes embrionárias e fetais. Possuem etiologia e fatores de risco variados, muitos ainda desconhecidos. Dados epidemiológicos brasileiros são escassos. O estudo dos fatores epidemiológicos pode ampliar o conhecimento sobre tais defeitos e propiciar estratégias de prevenção, além do Aconselhamento Genético adequado para as famílias envolvidas. O presente trabalho realizou um estudo genético clínico prospectivo de todos os recém-nascidos e natimortos com defeitos congênitos atendidos no período de um ano no Hospital de Base de São José do Rio Preto/SP (HB), com o objetivo de estimar a prevalência, caracterizar em tipos de doenças, diagnósticos ou categorias diagnósticas, verificar as possíveis causas e consequências dos defeitos. Para cada criança foi realizada a análise cariotípica (nos casos indicados), a avaliação física, o registro fotográfico, análise de dados de prontuário médico e coleta de informações complementares com a família. Foram estudados 110 indivíduos, 103 recém-nascidos e sete natimortos. A prevalência foi de 2,8%. Em 82% dos casos o diagnóstico específico pode ser sugerido. Os defeitos congênitos de etiologia genética foram mais frequentes que os de etiologia não genética. Os de herança multifatorial foram os mais freqüentes (29%), seguidos dos de etiologia heterogênea (22%), monogênica (19%), desconhecida (13,5%), cromossômica (12%) e ambiental (4,5%). A idade materna, a consangüinidade parental e a predisposição familial (presença de defeitos congênitos na família) foram alguns fatores de risco identificados. A maioria dos afetados eram prematuros e a hospitalização... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Birth defects, resulting from genetic and non-genetic causes, affect about 3 to 5% of newborns and are recognized as a major cause of morbidity and mortality within the first year of life, as well as being the cause of many embryonic and fetal deaths. Not infrequently the varied etiology and risk factors remain unknown. Brazilian epidemiological data are scarce. The study of epidemiological factors may increase knowledge about these defects and make prevention strategies and genetic counseling possible for affected families. This work constitutes a prospective clinical genetic study of all newborn and stillborn infants with birth defects seen over one year in Hospital de Base in São José do Rio Preto, Sao Paulo, in order to estimate the prevalence, characterize the disease types, diagnoses or diagnostic categories and evaluate possible causes and consequences of the defects. Karyotypic analysis, a physical assessment, photographic records, an analysis of the patients' medical records and the collection of additional information with the family was performed for each infant. The study assessed 103 newborn and 7 stillborn subjects. The prevalence of birth defects was of 2.8%. A specific diagnosis was suggested in 82% of cases. Genetically-related birth defects were more prevalent than those with non-genetic etiology. Infants with multifactorial inheritance patterns were the most common (29%), followed by heterogeneous etiology (22%), monogenic inheritance patterns (19%), unknown (13,5%), chromosomal etiologies (12%) and environmental factors (4.5%). Maternal age, parental consanguinity and family susceptibility (the presence of defects in the family) were some of the identified risk factors. Most affected infants were premature and the most commonly observed consequences were prolonged hospital stays and death. Hence, birth defects are frequent in the population; several causes are... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

En aquesta tesi s’ha realitzat una aproximació terapèutica per a la malaltia de Gaucher, basada en xaperones farmacològiques. La malaltia de Gaucher és una malaltia d’acúmul lisosòmic d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim anterior, la Saposina C. Fins al moment s'han descrit més de 300 mutacions en el gen GBA causants de la malaltia de Gaucher, que han permès desenvolupar un diagnòstic molecular de la malaltia, i unes poques en el gen PSAP. Aquestes mutacions produeixen una deficiència en alguna d'aquestes dues proteïnes, la glucocerebrosidasa o la Saposina C, que estan implicades en la via de degradació dels glicoesfingolípids. La manca d’una bona correlació genotip-fenotip fa que els estudis d’expressió puguin aprofundir en el coneixement sobre la fisiopatologia de la malaltia de Gaucher. En aquest treball presentem els estudis cel•lulars que han permès expressar els al•lels mutats en cèl•lules COS així com establir l’origen de l’al•lel doble D409H;H255Q. A més a més, hem confirmat l’efecte negatiu acumulatiu d’aquestes dues mutacions a nivell d’activitat enzimàtica, gràcies a l’expressió heteròloga dels al•lels únics i doble mutant. Una de les teràpies que actualment s'està utlitzant en la malaltia de Gaucher és la teràpia de reducció de substrat com a complement o alternativa a la teràpia de reemplaçament enzimàtic. En els darrers anys, una nova estratègia terapèutica basada en l’ús de xaperones farmacològiques ha aparegut. Aquesta nova aproximació es basa en la hipòtesi que les xaperones farmacològiques impedeixen que els enzims amb mutacions que impedeixen el bon plegament podien estabilitzar-se i arribar a seu destí, el lisosoma. Els dos objectius principals han estat: 1. L’expressió in vitro, mitjançant cèl•lules COS-7, de diversos al•lels mutats del gen GBA i la caracterització de les proteïnes GBA mutades. 2. Assajar l’efecte dels iminosucres (NN-DNJ i NB-DNJ), aminociclitols i dels seus derivats com a possibles xaperones farmacològiques sobre les proteïnesmutades, tant en cèl•lules COS-7 transfectades amb cDNAs mutats com en fibroblasts de pacients. Els resultats s’han presentat en els articles següents: 1. Homozygosity for the double D409H+H255Q allele in type II Gaucher disease Autors: Helen Michelakakis, Marina Moraitou, Evagelia Dimitriou, Raül Santamaria, Gessamí Sànchez, Laura Gort, Amparo Chabás, Daniel Grinberg, Maria Dassopoulou, Spyros Fotopoulos, Lluïsa Vilageliu. Publicació: Journal of Inherited and Metabolic Diseases (2006) 29:591 2. Haplotype Analysis Suggests a Single Balkan Origin for the Gaucher Disease [D409H;H255Q] Double Mutant Allele Autors: Raül Santamaria, Helen Michelakakis, Marina Moraitou, Evangelia Dimitriou, Silvia Dominissini, Serena Grossi, Gessamí Sánchez-Ollé, Amparo Chabás, María Gabriela Pittis, Mirella Filocamo, Lluïsa Vilageliu, Daniel Grinberg Publicació: HUMAN MUTATION Mutation in Brief #1010, 29:E58-E67, 2008 3. Promising results of the chaperone effect caused by imino sugars and aminocyclitol derivatives on mutant glucocerebrosidases causing Gaucher disease. Autors: Gessamí Sánchez-Ollé, Joana Duque, Meritxell Egido-Gabás, Josefina Casas, Montserrat Lluch, Amparo Chabás, Daniel Grinberg, Lluïsa Vilageliu Publicació: Blood Cells, Molecules, and Diseases 42 (2009) 159–166 4. Chaperone effects caused by new aminocyclitol derivatives on mutant glucocerebrosidases causing Gaucher disease. Autors: Lucía Díaz, Gessamí Sánchez-Ollé, Josefina Casas, Daniel Grinberg, Antonio Delgado and Lluïsa Vilageliu Publicació: In press. Les dades recents presentades fan pensar que les xaperones farmacològiques podrien arribar a ser un tractament tant per les formes no neuronopàtiques com per a les neuronopàtiques de la malaltia de Gaucher. / Lysosomal storage diseases are a group of disorders caused by the loss of function of lysosomal enzymes, which leads to the intralysosomal storage of non-degraded substrates. Gaucher disease (GD, OMIM 230800) is the most prevalent sphingolipidosis caused by deficiency of glucocerebrosidase (GBA, E.C. 3.2.1.45), which produces the progressive accumulation of glucosylceramide. Clinically, GD is classified into three major types depending on the absence (Type I) or presence (Type II and III) of central nervous system involvement. The main symptoms of GD are anaemia, thrombocytopenia, hepatosplenomegaly and skeletal disease. Two disease-specific therapies have been approved to treat GD. Enzyme replacement therapy (ERT) has been applied for more than 15 years and has proved successful mainly for symptoms of type I patients. The other approved treatment is substrate reduction therapy, which is based on the inhibition of glucosylceramide synthase (GCS), the rate-limiting first step in the glycosphingolipid biosynthetic pathway, by the oral administration of N-butyl-deoxynojirimycin (NB-DNJ). This reduction therapy is used for type I patients for whom ERT is not a therapeutic option. The small size of NB-DNJ makes it of potential use for neurological cases. To date, other alternative strategies, such as gene therapy, have had very limited success in the treatment of GD. However, new experimental approaches in cellular and animal models have been assayed either for conventional gene therapy or based on the partial inhibition of the GCS gene using siRNAs. Recently, a new line of research, using small molecules that act as chemical chaperones, has emerged. This approach is based on the assumption that some mutations cause the misfolding of lysosomal enzymes after their synthesis. Misfolding is responsible for enzyme degradation in the endoplasmic reticulum (ER), thereby preventing enzyme transport to the lysosome. In this scenario, the chaperone stabilizes the mutant protein, thereby allowing that, at least, some molecules reach their final destination. Here we analyzed the effect of iminosugars NB-DNJ and NN-DNJ and aminocyclitols, on COS cells transfected with either the wild-type or mutant GBA cDNAs. The effect of these compounds was also tested on the residual β-glucosidase activity of fibroblasts from patients with diverse genotypes.

Neurofibromatosis type 1 patients present a high variability in their clinical expressivity. The most common manifestation is the appearance of dermal neurofibromas, benign tumors that arise in the peripheral nervous system. They appear at puberty and increase their number throughout life, with patients showing a great variation in their number, ranging from tens to thousands. The main objective of this thesis consisted in the identification of genes and variants influencing the number of dermal neurofibromas developed by NF1 patients. We centered our studies only to Schwann cells (neurofibromas develop due to a double inactivation of the NF1 gene, but only Schwann cells bear it), and the HR mechanism (HR has been found to be responsible for a high percentage of somatic NF1 inactivations in neurofibromas). In the first part of this project we characterized our cohort of 117 NF1 patients at clinical (age, sex, the number of dermal neurofibromas developed) and tumor molecular (estimating the LOH frequencies together with the identification of the mechanisms generating these LOHs) level. 23.7% of tumors showed LOH. 37% of tumors exhibited LOH due to deletion, and 63% due to HR. LOH frequencies were very variable, ranging from less than 10% to more than 50% of LOH. In addition, our studies suggested that patients with the highest rates of HR frequency showed the highest rates of nº of dNFs (with a p value close to significance). We developed the Microsatellite Multiplex PCR Analysis (MMPA) that improved and facilitated neurofibroma analysis. With this technique it was possible to obtain: data regarding the tumor sample allelic imbalance (AI) status and extension, the percentage of normal cells present in the tumor sample, the copy-number status of specific alleles of heterozygous loci showing AI and the mechanisms generating these AIs, in only one PCR reaction. The re-analysis of 29 neurofibromas showed a good agreement between the information generated by MMPA and the data generated for the same tumors by other techniques. In the second part of this project we selected candidate genes, involved in the HR mechanism, as possible modifiers of the number of dermal neurofibromas. We developed the HoReYe assay to model HR in yeast. With this technique we were able to determine the HR rate for the yeast strain BMA64. Once more yeast strains were characterized for the HR rate, the X-QTL assay would be performed to determine genetic variation responsible for high or low HR rates. In addition, due to the complexity of the HoReYe setting up, a surrogate of this technique was proposed to determine, in an easier way, the HR rate of yeast strains. In the third part of this project genetic variation of candidate genes would be analyzed by direct sequencing to identify both common and rare variants. Sanger sequencing was first used to analyze the BLM gene in 12 NF1 patients, but not variant found was affecting the protein structure. We would employ Next-generation sequencing to analyze genetic variation the 18 NF1 patients characterized. However, until now, only data from patient P027 was recovered showing 845 variants, which will be further analyzed in the near future. This thesis has established the basis to identify candidate genes related to HR rate, which will be studied in the NF1 patients previously characterized in order to identify allelic variants responsible for the number of dermal neurofibromas developed. / Els pacients amb Neurofibromatosi tipus 1 presenten una gran variabilitat en les seves manifestacions clíniques. El tret més característic és l’aparició de neurofibromes dèrmics, els quals poden aparèixer a decenes o milers en un pacient. L’objectiu principal de la present tesi ha estat identificar aquells gens i variants al•lèliques responsables del nombre de neurofibromes desenvolupats pels pacients NF1. Per a realitzar aquest treball ens hem centrat en estudiar les cèl•lules de Schwann, les portadores de la doble inactivació del gen NF1, i el mecanisme de recombinació homòloga, responsable d’un alt percentatge de les inactivacions somàtiques del gen NF1. En la primera part del treball vam caracteritzar els pacients NF1 de forma clínica, analitzant el sexe, edat i el nombre de neurofibromes desenvolupats, i molecular a nivell tumoral, determinant la presència de LOH i els mecanismes mutacionals generadors d’aquesta. Així, vam establir una prevalença de LOH als pacients d’un 23.7%, éssent el mecanisme de recombinació homòloga el més frequent, i vam obtenir una possible correlació entre tenir un elevat percentatge de recombinació homòloga generant LOHs i un elevat nombre de neurofibromes desenvolupats. A més, vam desenvolupar la tècnica de MMPA per a facilitar l’anàlisi de neurofibromes dèrmics, la qual pot ser aplicada a l’anàlisi d’altres tumors. La segona part del treball consistia en identificar gens candidats responsables del nombre de neurofibromes desenvolupats pels pacients NF1. Vam decidir utilitzar el llevat com a organisme model per a estudiar el mecanisme de recombinació homòloga, i obtenir gens candidats relacionats amb aquest mecanisme. Vam desenvolupar la tècnica HoReYe per a obtenir la taxa de recombinació homòloga en diferents soques de llevat. A més, vam idear les tècniques que s’haurien d’utilitzar posteriorment per a determinar les variants al•lèliques responsables d’aquestes taxes. En la tercera part del treball els gens candidats es van analitzar, tant per sequenciació per Sanger, com per seqüenciació de próxima generació. La intenció era trobar variants tant rares com comunes, per a no perdre cap tipus de variabilitat en l’anàlisi. En aquest treball s’han introduit les bases per a identificar, en pacients prèviament caracteritzats, els gens responsables del nombre de neurofibromes desenvolupats en pacients NF1.

Several approaches using molecular biology techniques and the social sciences has been employed in order to clarify the involvement of Africans and their descendants in the history of Brazil. The African presence in America dates back to the sixteenth century when men and women were sold as slaves to serve as manpower in the colonies of Europe. It is estimated that since that time more than 15 million people have been brought forcibly to the Americas, 40% had Brazil as a destination. These Africans and their descendants started swapping genes with Europeans and Indians who inhabited the region. However, is not yet known in detail the participation of Africans in shaping history and genetics of population. Difficult access to detailed history of Africans and their descendants in Brazil is due largely to lack of documents and other historical data and geography, and only recently modern techniques of molecular biology have allowed a detailed analysis of the origin and migration of peoples. Quilombo communities are remnants of Quilombo, which were groups of runaway slaves and freedmen, located in remote and inaccessible. Quilombo is a Bantu word which means warrior camp in the forest. This study aimed to determine the polymorphism of 11 microsatellite markers on the Y chromosome in the maroon communities of the State of Alagoas. We analyzed 11 microsatellite loci of 211 men in nine maroon communities of the State of Alagoas, identified 108 haplotypes. The haplotype diversity varied from 0.7464 ± 0.0907 (Muquém) to 0.9794 ± 0.0594 (Carrasco), suggesting that there is significant founder effect in these communities. Analysis of molecular variance (AMOVA) revealed that populations have maroon marked heterogeneity, with 25.4% of the variation due to differences among the 74.6% and intrapopulation differences. The ancient African lineages, Amerindian and European is quite varied, noting that some populations are genetically closer to European and other populations of African populations. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / Diversas abordagens utilizando técnicas de biologia molecular e de ciências sociais tem sido empregadas com a finalidade de esclarecer a participação dos africanos e seus descendentes na historia do Brasil. A presença do africano na América remonta ao século XVI, quando homens e mulheres foram comercializados como escravos para servirem de mão-de-obra nas colônias européias. Estima se que desde essa época mais de 15 milhões de pessoas tenham sido trazidas forçadamente para o continente americano, sendo que 40% delas tiveram o Brasil como destino. Esses africanos e seus descendentes iniciaram troca de genes com europeus e índios que já habitavam a região. No entanto, ainda não se conhece em detalhes a participação dos africanos na formação histórica e genética da população brasileira. A dificuldade de acesso à historia detalhada dos africanos e seus descendentes no Brasil se deve em grande parte a escassez de documentos e outros dados histórico-geográficos, e só recentemente técnicas modernas de biologia molecular permitiram uma análise detalhada da origem e migração dos povos. Quilombolas são comunidades remanescentes dos quilombos, que eram agrupamentos de escravos fugitivos e libertos, localizados em regiões isoladas e de difícil acesso. Quilombo é um termo Banto, que quer dizer acampamento guerreiro na floresta. O presente trabalho teve como propósito a determinação do polimorfismo de 11 marcadores microssátelites do cromossomo Y nas comunidades quilombolas do Estado de Alagoas. Foram analisados 11 locos de microssatélites de 211 homens em nove comunidades quilombolas do Estado de Alagoas, sendo identificado 108 haplótipos. A diversidade haplotípica variou de 0,7464±0,0907 (Muquém) a 0.9794±0,0594 (Carrasco), sugerindo que não existe efeito fundador significativo nessas comunidades. A análise da variância molecular (AMOVA) revelou que as populações quilombolas apresentam acentuada heterogeneidade, com 25,4% da variação devido a diferenças interpopulacionais e 74,6% a diferenças intrapopulacionais. As linhagens ancestrais africanas, ameríndias e européias é bastante variado, observando-se que algumas populações se aproximam geneticamente de populações européias e outras de populações africanas.

The slave trade across the Atlantic brought an estimated four million Africans to Brazil since the beginning of the XVI century until mid-XIX century, thus contributing to the significant miscegenation of Brazil s population. The current genetic condition is a result of the interbreeding process between the Native American (Amerindian), European populations and the African population. Presently, despite this population s elevated heterogeneity, small isolated groups can still be found, as is the case of the Quilombolas, who are the product of the resistant movement against slavery imposed by Portuguese colonization. With the objective of conducting research of the genetic composition and the origin of paternal lineages in nine Afro-descendent communities of Alagoas, Brazil, 15 Y-SNP markers were analyzed by applying the SNaPshot (Applied Biosystems) method. Utilizing the updated nomenclature of the Y-Chromosome Phylogenetic Tree, it was possible to identify nine haplogroups of the Y-Chromosome in a total of 209 individuals. The calculated genetic diversity ranged from 0.2000 to 0.7190, thus evidencing against a standardized composition of this population. As a result of patriarchal domination of the Portuguese economic model of colonization in Brazil, haplogroup R1b1b2*-M269, of European origin, was observed in all populations at a frequency of 5.26 - 79.17%. Haplogroup F*(xK)-M213 was found at a rate of 4.17% and 36.84%, suggesting an origin of European male ancestry in these individuals. Seven populations corresponded to haplogroup E1b1a1*-M2, of Sub-Saharan African descent, which presented a frequency above Alagoas population diversity, varying from 13.3% to 90.0%. However, Q1a3a*-M3, of the Amerindian group was observed in only 2 chromosomes. Sub-clades of Haplogroup E, of African descent, including E1b1b1b1*M81, E1b1b1a1*-M78 and E1b1b1c*-M123 were considerably frequent among the Portuguese. Applying AMOVA test, occurrences of heterogeneity among Alagoas Quilombola population (FST=0.23964, P=0,00000±0,00000) were verified, had a genetic intrapopulation variation of 23.96%. The study revealed no significant genetic variances between populations from Alagoas, Rio de Janeiro, Portugal and the Quilombola populations of Jacu, Palmeira dos Negros, Paus Pretos, Poços do Lunga and Carrasco. However, Cajá dos Negros, Muquém, Filus and Povoado Cruz presented distinct genetic constituents, thereby highlighting the hypothesis that the aforementioned communities were originally places of refuge for slaves. An analysis of hierarchies pertaining to Y-SNP markers improved the basis of knowledge of Afro-descendant populations in Alagoas, and in union with historical and anthropological facts and demographics, establishes itself as an important instrument in the field of population genetics. / O tráfico de escravos no Atlântico trouxe cerca de quatro milhões de africanos para o Brasil desde o início do século XVI até meados do século XIX, contribuindo para demasiada miscigenação da população brasileira. O cenário genético atual é resultante do processo de mistura entre a população nativa americana (ameríndios), as populações européias e de origem africana. Atualmente, apesar da elevada heterogeneidade desta população, pequenos grupos humanos isolados ainda podem ainda ser encontrados, como é o caso das populações remanescentes de quilombos, fruto da resistência ao regime escravista imposto na então colônia pelos portugueses. Objetivando estudar a composição genética e a origem das linhagens paternas em 9 comunidades afro descendentes de Alagoas, Brasil, foram analisados 15 marcadores Y-SNPs pelo método SNaPshot (Applied Biosystems), possibilitando a identificação de 9 haplogrupos do cromossomos Y em um total de 209 indivíduos, de acordo com a nomenclatura atualizada da Árvore Filogenética do Cromossomo Y. A estimativa de diversidade genética variou de 0,2000 a 0,7190, atestando não haver uniformidade na composição genética destas populações. De origem européia, o haplogrupo R1b1b2*-M269 foi observado em todas as populações, com frequências entre 5,26 - 79,17%, resultado da dominação patriarcal resultante do modelo econômico português de colonização do Brasil. O haplogrupo F*(xK)- M213 foi encontrado com frequências entre 4,17 e 36,84%, sugerindo origem européia aos ancestrais masculinos destes indivíduos. Sete populações apresentaram para o haplogrupo E1b1a1*-M2, de origem subsaariana, frequências acima das observadas na população miscigenada de Alagoas, variando entre 13,3% e 90,0%. Já Q1a3a*-M3, característico de ameríndios, foi observado apenas em 2 cromossomos. Foram observados ainda E1b1b1b1*-M81, E1b1b1a1*-M78 e E1b1b1c*-M123, ramos do haplogrupo E, de origem africana, porém apresentando frequências consideráveis entre os portugueses. Usando o teste de AMOVA, verificou-se a ocorrência de heterogeneidade entre as populações quilombolas de Alagoas (FST=0,23964, P=0,00000±0,00000), com variação genética interpopulacional de 23,96%. O estudo revelou não haver distâncias genéticas significativas entre as populações de Alagoas, Rio de Janeiro, Portugal e as populações quilombolas de Jacu, Palmeira dos Negros, Paus Pretos, Poços do Lunga e Carrasco, enquanto que Cajá dos Negros, Muquém, Filus e Povoado Cruz apresentam-se com distintas constituições genéticas, reforçando a hipótese de que estas comunidades foram originadas de locais de refúgio de escravos. As análises hierárquicas com marcadores Y-SNPs aprimoraram o conhecimento sobre as populações afro descendentes de Alagoas e, em conjunto com dados históricos, demográficos e antropológicos, constituem uma importante ferramenta na área da genética de populações.