Master of Science / Department of Plant Pathology / John P. Fellers / Allan K. Fritz / Leaf rust is caused by Puccinia triticina and is one of the most widespread diseases of wheat worldwide. Breeding for resistance is one of the most effective methods of control. Lr16 is a leaf rust resistance gene that provides partial resistance at the seedling stage. One objective of this study was to use RNA-seq and in silico subtraction to develop new resistance gene analog (RGA) markers linked to Lr16. RNA was isolated from the susceptible wheat cultivar Thatcher (Tc) and the resistant Thatcher isolines TcLr10, TcLr16, and TcLr21. Using in silico subtraction, Tc isoline ESTs that did not align to the Tc reference were assembled into contigs and analyzed using BLAST. Primers were designed from 137 resistance gene analog sequences not found in Tc. A population of 260 F[subscript]2 lines derived from a cross between the rust-susceptible cultivar Chinese Spring (CS) and a Thatcher isoline containing Lr16 (TcLr16) was developed for mapping these markers. Two RGA markers XRGA266585 and XRGA22128 were identified that mapped 1.1 cM and 23.8 cM from Lr16, respectively. Three SSR markers Xwmc764, Xwmc661, and Xbarc35 mapped between these two RGA markers at distances of 4.1 cM, 10.7 cM, and 16.1 cM from Lr16, respectively. Another objective of this study was to use genotyping-by-sequencing (GBS) to develop single nucleotide polymorphism (SNP) markers closely linked to Lr16. DNA from 22 resistant and 22 susceptible F[subscript]2 plants from a cross between CS and TcLr16 was used for GBS analysis. A total of 39 Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) markers were designed from SNPs identified using the UNEAK and Tassel pipelines. The KASP marker XSNP16_TP1456 mapped 0.7 cM proximal to Lr16 in a TcxTcLr16 population consisting of 129 F[subscript]2 plants. These results indicate that both techniques are viable methods to develop new molecular markers. RNA-seq and in silico subtraction were successfully used to develop two new RGA markers linked to Lr16, one of which was more closely linked than known SSR markers. GBS was also successfully used on an F[subscript]2 population to develop a KASP marker that is the most closely linked marker to Lr16 to date.

Species of Valerianaceae in South America represent one of the best examples of rapid diversification on a continental scale. The phylogeny of Valerianaceae has received a lot of attention within the last 10 years, but relationships among the South American species are fairly unresolved. Results from previous studies have not been well resolved with traditional genetic markers, most likely due to its recent and rapid radiation. Species in this clade exhibit a variety mating systems and inflorescence types. For the first part of this research I used several traditional plastid markers, and 3 new low copy nuclear markers to better resolve the phylogeny and then explore mating system evolution within the clade. For the second part of this research I collected high-throughput “next-generation” genomic sequence data from reduced representation libraries obtained using genotyping-by-sequencing (GBS) protocols, along with several phylogenetic methods, to try to further resolve the phylogeny of this group.

Les poux sont de véritables marqueurs pour l'étude de l'évolution humaine car ils ont été associés à l’homme depuis nos ancêtres et se sont dispersés à travers le monde avec ses différentes migrations. Les poux de tête et les poux de corps ont été étudiés morphologiquement depuis longtemps. Les poux de tête vivent et pondent leurs lentes dans les cheveux tandis que les poux de corps vivent et pondent leurs lentes dans les vêtements. Ces derniers sont associés à une mauvaise hygiène de vie et sont responsables de la transmission du typhus épidémique, de la fièvre des tranchées et de la fièvre récurrente. L’un des objectifs de ma thèse était d'accroître les connaissances sur les poux de tête et les poux de corps de l’homme afin d’assurer un meilleur contrôle. Il est essentiel de déterminer si les poux de tête et les poux de corps sont allopatriques ou s’ils pourraient exister en sympatrie. Ainsi, les études d'ADN mitochondrial ont montré qu'il y a trois clades clairement divergents des poux de tête (A, B et C) et un seul clade des poux de corps qui est partagé avec les poux de tête (clade A). Chaque clade a une répartition géographique bien déterminée. / Lice are effective markers for studying human evolution because they have been parasitizing humans since the emergence of our hominid ancestors and have been dispersed throughout the world by early human migrations. Human head and body lice have been studied morphologically for a long time. Head lice live and lay their eggs in human hair. Body lice live and lay their eggs in clothes, are associated with poor hygiene in clothing and are responsible for the transmission of epidemic typhus, trench fever and relapsing fever. One aim of my thesis was to increase the knowledge of human head lice and body lice for a better control. It is critical to determine if head lice and body lice are allopatric, with distinct epidemiology, or if they might exist in sympatry. Then, mitochondrial DNA studies have shown that there are three clearly divergent clades of head lice (A, B and C) and that only one clade of body lice is shared with head lice (clade A). Each clade has a unique geographic distribution. During the thesis work, extensive literature survey was done to write a review. Then we aimed to establish a molecular tool in order to distinguish between head and body lice. We found that only one gene (Phum_PHUM540560 gene) was able to differentiate the two ecotypes of Pediculus humanus. Moreover, we aimed to estimate the correlation between phenotypes and genotypes among human lice, and we found that the lice phylogeny (based on intergenic spacers) was correlated to the geographic origin of lice, but no correlation between the color and the phylogeny.

The main objective of the present thesis was to propose a procedure to optimize genotypic information value in small dairy cattle populations and investigate the impacts of including genotypes and phenotypes of cows chosen by different strategies over the performance of genome-wide association studies and genomic selection. The first study was designed to propose innovative methods that could support alternative inference over population structure in livestock populations using graph theory. It reviews general aspects of graphs and how each element relates to theoretical and practical concepts of traditional pedigree structure studies. This chapter also presents a computational application (PedWorks) built in Python 2.7 programming language. It demonstrates that graph theory is a suitable framework for modeling pedigree data. The second study was aimed asses how graph community detection algorithms could help unraveling population partition. This new concept was considered to develop a method for stablishing new cow genotyping strategies (community-based). Results obtained showed that accounting for population structure using community detection for choosing cows to get included in the reference population may improve results from genomic selection. Methods presented are easily applied to animal breeding programs. The third study aimed to observe the impacts of different genotyping strategies (including the proposed community-based) over the ability to detect quantitative trait loci in genome-wide association studies. Distinct models for genomic analysis were also tested. Results obtained showed that including cows with extreme phenotypic observations proportionally sampled from communities can improve the ability to detect quantitative trait loci in genomic evaluations. The last chapter was designed study possible deleterious impacts of the presence of preferential treatment (in different levels) in a small dairy cattle population environment over accuracy and bias of genomic selection. Different proportions of cows with artificially increased phenotypic observations were included in the reference population. Observed results suggest that both accuracy and bias are affected by the presence of preferential treatment of cows in the evaluated population. Preferential treatment is expected to have much more effect on the performance of genomic selection in small than in large dairy cattle populations for the higher (proportional) value of the information from cows in such reduced-size breeds. / O principal objetivo da presente tese foi propor um procedimento capaz de otimizar o valor da informação genotípica em pequenas populações de gado de leite e investigar os impactos da inclusão de genótipos e fenótipos de vacas escolhidas por diferentes estratégias sobre o desempenho de estudos de associação genômica ampla e seleção genômica. O primeiro estudo foi delineado para elaborar um método que permita uma inferência alternativa sobre a estrutura populacional de populações de animais de produção usando como base a teoria de grafos. Este revê os aspectos gerais de grafos e como cada elemento se relaciona com conceitos teóricos e práticos de estudos de estrutura de pedigree tradicionais. Este capítulo também apresenta um aplicativo computacional (PedWorks) construído em linguagem de programação Python 2.7. Resultados observados demonstraram que a teoria de grafos é uma estrutura adequada para modelar dados de pedigree. O segundo estudo teve como objetivo avaliar como os algoritmos de detecção de comunidades de grafos poderiam ajudar revelar o particionamento de uma população. Este novo conceito foi considerado para desenvolver um método para o estabelecimento de novas estratégias de genotipagem de vacas (baseadas em comunidades). Os resultados obtidos mostraram que a contabilização da estrutura populacional usando a detecção de comunidades para a escolha de vacas a serem incluídas na população de referência pode melhorar os resultados da seleção genômica. Os métodos apresentados sugerem ser facilmente introduzidos em programas de melhoramento animal. O terceiro estudo teve como objetivo observar os impactos de diferentes estratégias de genotipagem (incluindo a anteriormente proposta baseada em comunidades) sobre a capacidade de detectar locos relacionados características quantitativas por meio de estudos de associação genômica ampla. Modelos distintos para análise genômica também foram testados. Os resultados obtidos mostraram que incluir vacas com observações fenotípicas extremas amostradas proporcionalmente das comunidades pode melhorar a capacidade de detectar locos de características quantitativas em avaliações genômicas. O último capítulo foi desenhado para estudar possíveis impactos deletérios da presença de tratamento preferencial no ambiente de pequenas populações de gado leiteiro sobre resultados da seleção genômica. Diferentes proporções de vacas com observações fenotípicas aumentadas artificialmente foram incluídas na população de referência. Os resultados observados sugerem que tanto a acurácia quanto o viés são afetados pela presença de tratamento preferencial de vacas na população avaliada. Espera-se que o tratamento preferencial tenha muito mais efeito sobre o desempenho da seleção genômica em populações pequenas de gado de leite que em grandes populações devido a maior relevância das informações de vacas em raças de tamanho reduzido.

Orientador: José Paes de Oliveira Filho / Resumo: O estudo das doenças de origem genética em animais domésticos se torna cada vez mais relevante, sobretudo em cães, uma vez que estes animais podem servir como modelos experimentais para certas doenças em humanos. Além disso, o reconhecimento clínico de algumas destas enfermidades pode ser um entrave ao Médico Veterinário e em algumas ocasiões o teste genético que confirmaria a etiologia não está disponível no país. A Nefropatia Familiar (FN) causada pela mutação c.115A>T no gene colágeno tipo 4α4 (COL4A4), e a Atrofia Progressiva da Retina (prcd-PRA), causada pela mutação c.5G>A no gene da degeneração cone-bastonete progressiva (PRCD), se destacam entre as principais enfermidades hereditárias de origem genética que acometem cães da raça Cocker Spaniel Inglês (CSI). Até o momento a prevalência destas enfermidades nesta raça não havia sido verificada no Brasil, sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a frequência alélica destas mutações no CSI. Para tanto, foram genotipados 220 e 216 CSI para a prcd-PRA e FN, respectivamente. Fragmentos do DNA, contendo cada uma das mutações, foram amplificados por reação em cadeia da polimerase e submetidos ao sequenciamento gênico direto. A frequência alélica da mutação c.115A>T no gene COL4A4 foi de 0,9% e da mutaçao c.5G>A no gene PRCD foi de 25,5%. Tais valores enfatizam a importância da realização dos testes de genotipagem nos cães da raça CSI como método de diagnóstico precoce principalmente para a orientação dos acasalamentos v... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The study of genetic diseases in domestic animals has become more relevant, especially in dogs, once these animals can serve as experimental models in the study of some human genetic diseases. Besides, these diseases can be hard to recognize on their clinical signs by the practitioners, and the genetic tests that can confirm them are usually available only abroad. Familial Nephropathy (FN) due to the mutation c.115A> T in the 4α4 collagen gene (COL4A4), and Progressive Retinal Atrophy (prcd-PRA) due to the mutation c.5G> A in the progressive rod cone degeneration gene (PRCD), are important genetic diseases of English Cocker Spaniel dogs (ECS) dogs. Since the prevalence of these diseases wasn’t verified in Brazil so far, this study aims to evaluate the allelic frequencies of the mutations c.115A>T in the COL4A4 gene and c.5G>A in the PRCD gene in English Cocker Spaniel dogs. For that, purified DNA from blood samples or buccal swab from 220 and 216 ECS for prcd-PRA and FN, respectively. DNA fragments with the mutation region were amplified by polymerase chain reaction and submitted to direct genomic sequencing. The allelic frequency of the mutation c.115A>T in the COL4A4 gene was 0.9% and the c.5G>A in the PRCD gene was 25.5%. The results in this study emphasizes the importance to realize the genotyping test in ECS as an early diagnostic test, not only for trying an improvement of the affected dogs’ life quality but also for breeding orientation to avoid clinical cases of the d... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

As manifestações bucais da AIDS têm sido relacionadas a diversas características clínicas da infecção pelo HIV como decréscimo de células T CD4+, aumento de carga viral e falha terapêutica, entre outras. Os avanços recentes da medicina mostram que a falha terapêutica, nesses pacientes, está diretamente vinculada a mutações na transcriptase reversa (TR) e na protease (PR). O objetivo deste estudo foi descrever, em pacientes HIV+ apresentando falha terapêutica, o perfil de mutações do vírus e o perfil de resistência a antirretrovirais, e correlacioná-los as manifestações bucais da imunodeficiência. Foram acessados prontuários, laudos de genotipagem e informações de bancos de dados digitais de pacientes com AIDS, que se submeteram a genotipagem no Centro de Referência e Treinamento em Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS (CRT-DST/AIDS), entre 2003 e 2010. Os dados foram transferidos para o Epiinfo, onde foi construído um banco de dados informatizado para posterior análise estatística. O evento lesões orais foi escolhido como variável dependente. Calculou-se o odds ratio para cada variável independente, utilizando intervalo de confiança de 95%. Foram cruzados dados sobre mutações encontradas no vírus e resistência às medicações com a presença e tipo de manifestações bucais. O teste de Bartlett foi utilizado para testar a normalidade dos dados. Para variáveis sem distribuição normal foram aplicados os testes de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis. Para comparação entre frequências e proporções, foi utilizado o Teste de Exato de Fisher ou o Qui quadrado. O nível de significância foi estabelecido como 0,05 ou 5%. A análise de características sociocomportamentais e clínico laboratoriais permitiu verificar que a presença de lesões orais pode ser relacionada estatisticamente a baixas taxas de CD4 (p<0,05), faixa de carga viral (p=0,048) e ao uso prévio de mais de cinco esquemas antirretrovirais diferentes (p=0,021). Verificou-se maior prevalência de lesões virais (75%) e bacterianas (66,7%) do que de lesões fúngicas (37,3%) apenas em pacientes que apresentavam resistência a inibidores de protease (IP) (p=0,02). Foram encontradas 146 mutações diferentes nos pacientes que apresentavam lesões orais, dentre essas, quatro (101E, 20T, 188L, 93L) apresentaram correlação negativa com a presença de lesões orais (respectivamente, p=0,01, p=0,01, p=0,03, p=0,03) e oito (215Y, 118I, 20R, 44D, 71I, 82I E 84V) apresentaram correlação positiva (respectivamente p=0,04, p=0,05, p=0,03, p=0,01, p=0,01, p=0,04, p=0,0004). Subsequentemente, as mutações que apresentaram correlação positiva com a presença de lesões orais foram avaliadas para verificar se sua presença estaria realmente associada a resistência aos ARVs (aos quais seriam supostamente resistentes). Foram excluídas dessa avaliação as mutações 71I e 82I, por apresentarem uma quantidade extremamente pequena de ocorrências. Todas as mutações apresentaram correlação estatística positiva para a resistência aos respectivos antirretrovirais (p<0,05). Em pacientes HIV+, que apresentavam falha terapêutica e manifestações bucais, foram identificadas as mutações 84V e 20R na PR e as mutações 215Y, 44D e 118I na TR e a presença dessas mutações foi associada a resistência a inibidores de protease e inibidores de transcriptase reversa nucleosídeos, respectivamente. / Oral manifestation of AIDS have been associated with several clinical characteristics of HIV infection such as reduction in T CD4+ cells, increase in viral load and treatment failure, among others. Recent advances have shown that treatment failure in these patients is directly linked to mutations in reverse transcriptases (RT) and in proteases (PR). The objective of the present study was to describe the profile of virus mutations and of resistance to antiretroviral drugs in HIV+ patients in treatment failure, and to correlate mutations to the oral manifestations of the immunodeficiency. Patient charts, genotyping results and information from digital databases of AIDS patients, who underwent genotyping at the Sexually Transmissible Diseases and AIDS Training and Reference Center (CRT-DST/AIDS) between 2003 and 2010, were accessed. Data were transferred to the Epiinfo program, in which a computerized database was built for statistical analysis. The event oral lesions was chosen as a dependent variable. Odds ratio for each independent variable was calculated, using a 95% confidence interval. Data found on virus mutations and drug resistance was analyzed to check for correlation with presence and type of oral manifestations. The Bartlett test was used to test normality of data. Mann-Whitney or Kruskal-Wallis tests were used for variables without a normal distribution. The Fisher Exact or Chi-square Tests were used to compare frequencies and proportions. A 0.05 or 5% significance level was established. The analysis of socio-behavioral and clinical-laboratorial characteristics allowed concluding that the presence of oral lesions may be related to statistically low CD4 rates (p<0.05), viral load range (p=0.048) and previous use of more than five different antiretroviral regimens (p=0.021). A higher prevalence of viral (75%) and bacterial (66.7%) lesions in relation to fungal lesions (37.3%) was observed only in patients who were resistant to protease inhibitors (PI) (p=0.02). We found 146 different mutations in patients with oral lesions, among which, four (101E, 20T, 188L, 93L) with a negative correlation with the presence of oral lesions (p=0.01, p=0.01, p=0.03, p=0.03, respectively) and eight (215Y, 118I, 20R, 44D, 71I, 82I E 84V) with a positive correlation (p=0.04, p=0.05, p=0.03, p=0.01, p=0.01, p=0.04, p=0.0004, respectively). Subsequently, mutations with a positive correlation with the presence of oral lesions were assessed to check if their presence would really be associated with resistance to ARVs (to which they supposedly would be resistant to). Mutations 71I and 82I were excluded from this assessment because they had an extremely low frequency. All mutations had a statistically positive correlation for resistance to their respective antiretroviral drugs (p<0.05). Mutations 84V and 20R were identified in PR, and mutations 215Y, 44D and 118I in TR of HIV+ in patients undergoing treatment failure and presenting oral manifestations. Moreover, the presence of these mutations was associated with resistance to protease inhibitors and to nucleoside reverse transcriptase inhibitors, respectively.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar astrovírus em amostras fecais coletadas de crianças com e sem diarréia, em São Paulo, Brasil, e divididas em dois grupos, EPM e HU, de acordo com a origem. A detecção foi realizada utilizando-se RT-PCR, com primers específicos. Os resultados para as amostras EPM mostram que 66/234 (28,2%) foram positivas para astrovírus. Para as amostras HU, 18/187 (9,6%) foram positivas. A genotipagem foi realizada com a técnica de nested/RT-PCR. De 66 amostras positivas (EPM), 19 (28,7%) foram caracterizadas como HAstV-1, 4 (6,0%) como HAstV-2, 2 (3,0%) como HAstV-3, 1 (1,5%) como HAstV-5 e 3 (4,5%) como HAstV-8. Das 18 positivas do HU, 1 (5,5%) amostra foi caracterizada como HAstV-1, 7 (38,8%) como HAstV-2 e 1 (5,5%) como HAstV-8. As amostras genotipadas em ambos os grupos foram submetidas ao seqüenciamento de nucleotídeos para confirmação dos resultados. Detecção e genotipagem de astrovírus em casos de diarréias pediátricas são técnicas são importantes e descrevem como esse vírus está circulando em São Paulo, Brasil. / The purpose of this study was to characterize astrovirus in faecal samples collected from children with and without diarrhea in São Paulo city, Brazil, and grouped into two distinct groups, EPM and HU. Detection was carried out using RT-PCR with specific primers. Results for EPM set showed that 66/234 (28,2%) were positive. In the HU set of samples, 18/187 (9,6%) were positive for astrovirus. Genotyping was carried out with nested/RT-PCR. Out of 66 astrovirus positive EPM samples, 19 (28,7%) were characterized as HAstV-1, 4 (6,0%) as HAstV-2, 2 (3,0%) as HAstV-3, 1 (1,5%) as HAstV-5 and 3 (4,5%) as HAstV-8. Among 18 astrovirus positive HU samples, 1 (5,5%) was characterized as HAstV-1, 7 (38,8%) as HAstV-2 and 1 (5,5%) as HAstV-8. Genotyped samples were confirmed by nucleotide sequencing. Detection and genotyping of astrovirus in pediatric diarrhea are important and describes how this virus is circulating in São Paulo, Brazil.

Introdução - Giardia é um protozoário que parasita o intestino de quase todas as classes de vertebrados, podendo causar giardíase. Dentre os sete agrupamentos da espécie G. duodenalis, nomeados de A a G, apenas A e B foram encontrados no homem. Por se tratar de um patógeno de veiculação hídrica, a pesquisa de cistos desse microorganismo em água e esgoto é de interesse para a saúde pública. Uma vez que os métodos convencionais utilizados para a detecção desse protozoário em amostras ambientais não permitem diferenciar os isolados de Giardia potencialmente patogênicos para o homem dos demais, o emprego de técnicas que possibilitam a caracterização molecular do parasita em questão se torna necessário, principalmente no Brasil, onde as informações sobre os genótipos de Giardia do ambiente são escassas. Objetivos - Detectar a presença e identificar os genótipos de Giardia sp. em amostras de água e esgoto provenientes do estado de São Paulo, discutindo a importância dos achados para a saúde pública, bem como elaborar uma estratégia que possibilite a realização de tal proposta. Método - Amostras de esgoto bruto (5) e tratado (6), de águas superficiais (11), de poço (3) e de nascente (1) foram coletadas e concentradas pela técnica de membrana filtrante modificada ou por centrifugação. O DNA genômico foi extraído pelo método de fenol/clorofórmio/álcool-isoamílico. A amplificação do fragmento de 890pb do gene gdh, que codifica a produção de glutamato desidrogenase, foi realizada por nested PCR, seguida por clonagem e seqüenciamento de nucleotídeos. Resultados - Onze dentre as vinte e seis amostras analisadas (42,3por cento) foram confirmadas como sendo positivas para a presença de Giardia duodenalis. Os agrupamentos A, genótipo AII, e B foram encontrados. Conclusão - Esses achados indicam que, no estado de São Paulo, isolados de Giardia associados a giardíase humana estão presentes em esgoto tratado e em água superficial e de poço, de modo que o contato com esse tipo de matriz pode representar risco para a saúde pública. Além disso, a estratégia proposta possibilita a caracterização molecular de isolados de Giardia de amostras de água e esgoto. / Introduction - Giardia is a protozoan that parasitizes almost all classes of vertebrates, causing giardiasis. Among the seven assemblages of G. duodenalis, named A to G, only A and B have been found in humans by this moment. As considered a waterborne pathogen, the detection of cysts in water and sewage samples is of interest for public health. Once conventional methods are not able to distinguish Assemblages A and B of G. duodenalis from others, the application of techniques that allow a molecular characterization of Giardia isolates is an important issue, especially in Brazil, where there is scarce information about the genotypes of this parasite in the environment. Objective - To detect and identify Giardia genotypes in water and sewage samples from São Paulo state, discussing the importance of findings for public health, as well as develop a strategy that makes it possible. Method - Raw (5) and treated (6) sewage, surface (11), well (3) and spring (1) water samples were collected and concentrated by modified membrane filtration technique or centrifugation. Genomic DNA was extracted using phenol/chloroform/isoamilic alcohol method. A 890bp fragment of gdh gene, that codes the glutamate dehydrogenase production, was amplified by nested PCR. Cloning and sequencing were subsequently done. Results - 11 out of 26 (42,3 per cent) samples were confirmed to be positive for the presence of G. duodenalis. Assemblages A, genotype AII, and B were found. Conclusions - These findings indicate that, in São Paulo state, Giardia isolates associated to human giardiasis are present in treated sewage and in surface and well water. Thereby, the contact with these matrices can offer risk for public health. Besides, the approach described here allows the molecular characterization of Giardia isolates from water and sewage samples.

As doenças causadas por patógenos emergentes e oportunistas são uma grande preocupação para os profissionais de Saúde Pública. A criptosporidiose é uma doença cosmopolita, cujo agente etiológico é o protozoário coccídia Cryptosporidium. Este parasita emergiu como um importante patógeno de veiculação hídrica, responsável por surtos em diferentes países e atualmente é considerado um problema para indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes. A taxonomia do gênero, baseada em aspectos morfológicos, é de difícil realização devido ao reduzido tamanho dos oocistos e também devido à perda de suas características morfológicas, principalmente em amostras ambientais. Essa limitação estimulou a aplicação de métodos moleculares na identificação das espécies destes microrganismos. Neste estudo, amostras de águas superficiais foram submetidas à ested-PCR para detecção de Cryptosporidium. No total 30 amostras de águas de 10 pontos de coleta situados no estado de São Paulo foram analisadas. Cryptosporidium foi detectado em 30% das amostras analisadas e a genotipagem permitiu a identificação de C. hominis, C. meleagridis e C. andersoni. Embora a identificação de Cryptosporidium em amostras ambientais seja uma tarefa complexa, os métodos moleculares são essenciais para determinação de espécies, ajudando a elucidar a epidemiologia deste protozoário em nosso país. / The illnesses caused by emerging and opportunist pathogens are a great concern for Public Health professionals. Criptosporidiosis is a cosmopolitan disease, whose etiologic agent is the coccidian protozoan Cryptosporidium. This parasite has emerged as an important waterborne pathogen, responsible for outbreaks in different countries, and it is currently considered a problem for immunocompromised and immunocompetent patients. The taxonomy of the genus, based on morphologic aspects, is of difficult accomplishment due to the small size of the oocysts, and also due to loss of its characteristics, mainly in environmental samples. This limitation has estimulated the application of molecular methods for species identification of these microorganisms. In this study, superficial water samples were submitted to nested-PCR to detect the presence of Cryptosporidium. A total of 30 water samples, from 10 points located in the state of São Paulo, were analyzed. Cryptosporidium was detected in 30% of the studied samples and genotyping allowed the identification of C. hominis, C. meleagridis and C. andersoni. Although the identification of Cryptosporidium in environmental samples is a complex task, molecular methods are essential for the species determination, helping to elucidate the epidemiology of this protozoan in our country.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:39:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antoniella Fernanda Mendanha Sousa.pdf: 2903899 bytes, checksum: ec3428888f580d02453116414b41e866 (MD5) Previous issue date: 2008-04-11 / Cancer arises as a consequence of genetic or epigenetic alterations in genes that have a variety of different influences on the cell cycle, including cell growth, proliferation, differentiation, and apoptosis. Nowadays, cancer is among the most prevalent, costly, and preventable of all health problems. In Brazil, it represents the second cause of death of the adult population. Penile cancer is a rare disease, generally more prevalent in poor populations from developing countries, associated with precarious hygiene habits, especially of uncircumcised men. Penile cancer incidence varies across Brazilian geographical regions and it is more common on the North and Northeast regions. Penile cancer usually develops between the fourth and seventh decade of life and Squamous Cell Carcinoma accounts for up to 97% of all penile cancers. Molecular and epidemiological data has found strong evidence of the presence of HPV genome associated with penile carcinomas. The prevalence of HPV genome has been reported to be as high as 80%, depending on the sensitivity of the detection method and the selection of the tumor type. High-oncogenic-risk viral genotypes 16 and 18 are the most common types detected in association with penile tissue. The general objective of the current study was to detect and genotype HPV genome associated with penile cancer tissue using the polymerase chain reaction (PCR) assay. Furthermore, the potential association between the presence of HPV in the samples and the clinicopathological aspects of all cases was also investigated. The study group comprised of 29 cases diagnosed with penile carcinomas at the Urology Department/Hospital Araújo Jorge in Goiânia from 2001 to 2006. Total DNA was isolated from frozen tumor tissue and HPV DNA amplification was performed using GP5+/6+ primer pairs. Samples identified as positive for HPV DNA were genotyped with type-specific primer pairs. Appropriate positive and negative PCR controls were run with all reactions. As an internal control, a fragment of the GAPDH gene was also amplified. In our study, the mean age at the diagnosis was 61,5 years. With respect to tumor topography, 24% was present on the penile shaft, 28% on the glans, 16% on glans and foreskin as the three most frequent observations. Regarding Jackson s staging, 32% of the cases were J-I, 36% J-II, 24% JIII, and 8% J-IV. Partial penectomy was the most frequent surgical approach during treatment, 32% of all cases had metastasis and phimosis was present in 72% of the patients. HPV genome was amplified in 34,5% (10/29) of samples, and HPV-16 was the most prevalent. HPV role in penile cancer must be investigated and viral infection should be considered an import risk facto for penile cancer development, most likely to be implicated in tumor initiation, and should be investigated in association with the occurrence of phimosis, poor hygiene habits, chronic smoking, and individual promiscuity. / O Câncer é uma conseqüência de alterações genéticas ou epigenéticas em uma variedade dos genes que são fundamentais ao processo de crescimento, proliferação, diferenciação e morte programada da célula. Atualmente, essa doença, configura-se um dos principais problemas da saúde mundial, e no Brasil, representa a segunda causa de óbito na população adulta. O câncer de pênis é um tipo raro de neoplasia, que acomete indivíduos de países subdesenvolvidos com baixo nível social e precários hábitos de higiene associado à fimose e não circuncizados. No Brasil a incidência varia conforme a região estudada: 5,5% a 16% nas regiões Norte e Nordeste de 1 a 4% nas regiões Sul e Sudeste e 3,8% na região Centro-Oeste. Este tipo de câncer ocorre freqüentemente entre a quarta e sétima décadas de vida, com 97% dos casos representados pelo carcinoma epidermóide. No entanto, indivíduos jovens também podem ser afetados. Estudos epidemiológicos e moleculares têm identificado a associação entre o Papilomavírus Humano (HPV) e carcinoma de pênis. O genoma desse vírus já foi identificado em 15-80% dos casos desse tipo de tumor, sendo os subtipos de alto risco oncogênico (16 e 18), os mais freqüentes. Os objetivos do estudo foram detectar e genotipar HPV em espécimes biológicos de tumor de pênis e determinar as possíveis associações existentes entre a persença dos tipos virais e os aspectos clínico patológicos (ACP) dos pacientes diagnosticados com câncer de pênis no Serviço de Urologia do Hospital Araújo Jorge (SU-HAJ), no período de 2001 a 2006 e identificar o genoma do HPV pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram diagnosticados 29 pacientes no SU-HAJ e os ACP foram obtidos a partir dos prontuários e tabulados com estatística descritiva. As amostras de tecido com carcinoma peniano foram submetidas à extração de DNA e posteriormente realizada as reações de PCR. Nestas, utilizou-se os primers GAPDH, GP5+/6+ e tipo-específicos, como controle interno da reação, detecção de qualquer tipo de HPV e genotipagem, respectivamente. A média das idades foi de 61,5 anos. Para topografia, observou-se 24% para haste, 28% para glande, 16% para glande e prepúcio, 12% para glande e haste, 8% para prepúcio e 12% para outras especificações. A morfologia de maior prevalência foi carcinoma escamoso invasor variando do grau I ao IV. No estadiamento (classificação de Jackson), foi verificado 32% para Jackson I, 36% para Jackson II, 24% para Jackson III e 8% para Jackson IV. O tratamento de escolha para a maioria dos casos foi a penectomia parcial, sendo que 32% dos pacientes apresentaram metástases e 72% dos pacientes apresentaram fimose. Na avaliação molecular, o conjunto de primers GAPDH mostrou-se amplificado em todas as amostras analisadas, demonstrando eficácia na extração de DNA. A amplificação para o genoma viral com os primers GP5+/6+ foi observada em 34,48% (10/29) e o tipo mais freqüente de HPV foi o 16. Os estudos sobre a associação entre o HPV e os tumores de pênis são importantes, pois podem avaliar a relação desse vírus com o processo de iniciação e promoção de tumores, junto a outros fatores de risco, como a fimose, má higiene, o tabagismo e a promiscuidade.