Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-graduação em Aquicultura, Florianopolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T04:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289375.pdf: 1657113 bytes, checksum: f3a11332cf33ac93794232f436a21281 (MD5) / No estado de Santa Catarina a ostreicultura está representada pela espécie do Pacífico (Crassostrea gigas), que se adaptou bem para o cultivo nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, porém não é apropriada para as regiões de águas quentes e estuarinas, onde se recomenda o uso de espécies nativas. Com o objetivo de avaliar aspectos biológicos da produção de sementes de ostras nativas do Brasil foram utilizados coletores artificiais para captação de sementes em ambiente natural, identificadas geneticamente por meio de padrões de PCR/RFLP de 16S (DNA mitocondrial), foi feita análise de rendimento de sementes de Crassostrea brasiliana (= Crassostrea gasar) produzidas em laboratório e cultivadas em caixas flutuantes, e foram realizados experimentos de fecundação com espécies do gênero Crassostrea. Nos coletores artificiais foram captadas 7.579 sementes ao longo de todo o ano, porém com variações ao longo das estações, nas profundidades do substrato de fixação, em locais de coleta com diferenças significativas para captação de sementes do gênero Crassostrea no verão e do gênero Ostrea no inverno. Também foi observado alto rendimento de sementes de C. brasiliana com 88,5% para o local Sambaqui (27°29'S 48°32'W) e 60,21% para o local Iperoba (26°28'S 48°50'W). Na avaliação da fecundação foi observada melhor eficiência nos 30 minutos iniciais e maior tempo de mobilidade para os espermatozoides de C. gigas quando comparado a C. brasiliana.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T13:49:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225390.pdf: 1106891 bytes, checksum: 2bb5cae7c975eda6d81cab7a182b1ea4 (MD5) / Devido ao hábito alimentar filtrador dos moluscos bivalves, estes organismos podem concentrar, em seus tecidos, microrganismos patogênicos presentes nas águas de cultivo, sendo associados com intoxicações alimentares, como a salmonelose. O Estado de Santa Catarina, por suas características geográficas e da qualidade das águas litorâneas, tornou-se um ambiente ideal para o cultivo de organismos marinhos, especialmente moluscos bivalves, como ostras da espécie Crassostrea gigas. Considerando registros recentes de contaminação por patógenos entéricos em alguns locais de cultivo de moluscos na Ilha de Santa Catarina, a produção e comércio de moluscos necessitam ser monitorados. Com o objetivo de expandir a maricultura na costa do Estado de Santa Catarina e garantir um produto final com alto valor comercial, um sistema de depuração de moluscos foi desenvolvido pela empresa Blue Water Aquaculture e avaliado em relação à eliminação de Salmonella enterica serovar Typhimurium por ostras da espécie C.gigas. Inicialmente, foi padronizado o método para detecção da presença de S. Typhimurium em tecido digestivo de ostras. Esta metodologia consistiu em dissecação do tecido digestivo de ostras, pré-enriquecimento da amostra em meio de cultura não seletivo, extração do DNA bacteriano, e PCR seguida de hibridização molecular utilizando como sonda o produto de PCR de S.Typhimurium marcado com digoxigenina. Como resultado da padronização da metodologia de detecção molecular, foi desenvolvido um método sensível para detectar baixos níveis de S. Typhimurium em tecido digestivo de ostras (0.1UFC/g). Simultaneamente aos trabalhos de depuração, um dos pontos de cultivo de ostras de Florianópolis foi monitorado, no período entre março e outubro de 2005, em relação à qualidade microbiológica da água e da carne dos moluscos ali cultivados. Como resultado foi observado um alto índice de contaminação fecal nas águas e presença de Salmonella spp. nas ostras, enfatizando ainda mais esta necessidade de validação de um sistema de depuração. O sistema de depuração utilizado foi um sistema fechado, no qual 1000 L de água recircularam por 24h. Parâmetros como o tempo de depuração e o tratamento da água utilizada na recirculação foram também avaliados. Durante a recirculação, a água foi esterilizada com luz Ultra Violeta, cloro e associação dos dois tratamentos. Para a validação do sistema de depuração, ostras cultivadas em Santa Catarina (C.gigas) foram inicialmente contaminadas com S. Typhimurium. As ostras foram amostradas após 0, 6, 12, 18 e 24h para avaliar a dinâmica de depuração. Após cada coleta, as amostras foram analisadas por métodos clássicos de microbiologia para quantificar as bactérias viáveis no tecido digestivo das ostras. Os ensaios de depuração com água tratada com UV e Cloro, separadamente, mostraram uma crescente eliminação de bactérias viáveis durante os períodos de depuração, com 90% da contaminação eliminada em 24h. A associação destes tratamentos mostrou a total eliminação das bactérias dentro de 12h. A PCR apresentou uma variável detecção do genoma bacteriano em todos os métodos para esterilização da água, demonstrando que a detecção molecular, nesse caso, não é uma boa metodologia, já que não é indicadora da viabilidade bacteriana, podendo detectar fragmentos de DNA de bactérias inviáveis. Este tipo de trabalho é pioneiro no Brasil e, considerando que o Estado de Santa Catarina apresenta liderança na produção de moluscos no Brasil e que até o momento não há um programa sanitário para regulamentar a exportação da produção, os resultados encontrados apresentam uma grande contribuição para a economia e o desenvolvimento sustentável do país.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Aquicultura. Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:12:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 329616.pdf: 866471 bytes, checksum: fd69d26ed9a17baa3b254f357db9c4e0 (MD5) Previous issue date: 2014 / O esgoto sanitário é uma mistura complexa de compostos químicos, entre eles os produtos farmacêuticos e de higiene pessoal, o que torna preocupante seu impacto para os ecossistemas aquáticos. Apesar de serem detectados na zona costeira, pouco se sabe sobre os efeitos de fármacos em moluscos marinhos. Efeitos subletais causados pelo Ibuprofeno (IBU) e Paracetamol (PAR) foram investigados em ostras Crassostrea gigas expostas por 1, 4 e 7 dias nas concentrações (0 ; 1 e 100 µg.L-1). Foram analisada a viabilidade celular e os índices de dano de DNA nos hemócitos, bem como as atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e glutationa S-transferase (GST) em brânquias. A atividade da CAT aumentou nas ostras tratadas com ambas concentrações de IBU após 4 dias. Foi verificada uma menor atividade da GR nos animais expostos por 4 e 7 dias a 1 µg.L-1 de IBU. A atividade da GST aumentou nos animais tratados com 1 e 100 µg.L-1 de IBU por 4 e 7 dias. Nas ostras tratadas com 100 µg.L-1 de PAR foi observada uma maior atividade da GR após 1 dia de exposição. Após 4 dias de exposição a atividade da GR foi menor nos grupos tratados com as duas concentrações de PAR. Neste tempo também foi observada uma menor atividade da GPx nos animais expostos a 100 µg.L-1 de PAR. Para os demais parâmetros analisados, não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Com base nos resultados obtidos podemos observar que as ostras C. gigas apresentaram um aumento no sistema de defesa antioxidante nas brânquias quando expostas a IBU 1µg. L-1 e PAR 100µg. L-1, mas estes fármacos, nestas condições experimentais não afetaram a viabilidade celular dos hemócitos e nem causaram um aumento no dano ao DNA.<br>

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-09-05T04:11:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348188.pdf: 2173569 bytes, checksum: 5bc8653fa9016ac5fc0c8946e5ce7ee7 (MD5) Previous issue date: 2017 / Nrf2 (do inglês Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) é um fator de transcrição essencial para a indução coordenada dos genes que codi-ficam enzimas de resposta ao estresse oxidativo, incluindo várias defe-sas antioxidantes e enzimas de biotransformação. Sua ação é dependente da ligação ao elemento de resposta antioxidante (ARE) na região promotora dos genes-alvo. A indução da via Nrf2/ARE oferece enorme potencial para a proteção antioxidante, no entanto, não há pesquisa sobre a ativação desta via em bivalves. Desta forma, o presente trabalho investigou a resposta antioxidante nas brânquias e glândula digestiva de ostras do Pacífico, Crassostrea gigas, tratadas com indutores da via Nrf2/ARE (curcumina ou tert-butilhidroquinona, tBHQ). Com a anotação do genoma da ostra Crassostrea gigas analisamos as regiões conservadas do gene do Nrf2 que revelou um domínio típico, a região cap 'n' colar. Os dados indicam que vários domínios, pertencentes ao modulador negativo do Nrf2 (Keap1, do inglês Kelch-like ECH-associated protein 1), também estão conservados em moluscos. Nossos estudos indicam que Nrf2 e Keap1 são conservados em ostras, pois o Keap1 apresentou um alto grau de homologia nas espécies selecionadas de moluscos e vertebrados, incluindo a presença de cisteínas redox-sensíveis que são cruciais para sua função. A análise filogenética agrupou tanto o Nrf2 quanto o Keap1 de C. gigas juntamente com outras sequências de moluscos, mas separadas de vertebrados e artrópodes. As ostras C. gigas foram expostas a 10 ou 30 µM de curcumina ou tBHQ, ativadores clássicos da via Nrf2/ARE, porém o número de cópias de mRNA de Nrf2 e Keap1 não foram modulados na brânquia. Estes dados indicam que estes compostos não modularam transcricionalmente Nrf2 ou Keap1. Apesar deste resultado negativo, a principal forma de ativação do Nrf2 envolve a oxidação das cisteínas sensíveis de seu modulador negativo (Keap1), permitindo seu acúmulo e translocação para o núcleo. Desta forma, ao analisarmos a resposta antioxidante, pode ser observada uma clara indução de defesas antioxidantes nas brânquias, as quais são sabidamente controladas pelo Nrf2. Noventa e seis horas após o início do tratamento, os animais expostos à curcumina (10 e 30 µM), tiveram um aumento nos níveis de ?-glutamil-L-cisteinilglicina (GSH), e na atividade glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx), e glutationa S-transferase (GST). Por outro lado, a glândula digestiva não apresentou amplificação antio-xidante. Os níveis relativos de mRNA que codificam para a enzima glutamato-cisteína ligase, GR, MDR3 e GSTpi foram claramente indu-zidos pelo tratamento com curcumina (30 µM, 24 h). O pré-tratamento com curcumina durante 96 h aumentou a sobrevivência das ostras ao hidroperóxido de cumeno. Da mesma forma, ostras expostas à tBHQ por 96 h apresentaram um claro aumento nas defesas antioxidantes na brânquia e em menor intensidade na glândula digestiva. Esta resposta incluí aumento nos níveis de GSH, e na atividade GST, GPx e GR. Aumento na expressão do mRNA e proteína GR, também foram observadas após tratamento com tBHQ. Interessantemente, a diminuição na atividade GST, GPx e GR no início do tratamento (24 h) pode ser explicada pelo efeito inibitório da tBHQ ou de seus metabólitos. Esta conclusão é baseada na forte inibição in vitro da atividade GR, e em menor intensidade das atividades de GST e GPx. Apesar da ausência de aumento no mRNA do Nrf2, verificamos que: a) tanto o Nrf2 quanto o Keap1 são conservados filogeneticamente em bivalves; b) houve um aumento de defesas antioxidantes dependentes do Nrf2 após o tratamento com dois indutores clássicos do Nrf2 (curcumina ou tBHQ); c) houve uma clara modulação nos níveis de mRNA de vários genes alvos do Nrf2, e d) o tratamento com curcumina aumenta a resistência de ostras desafiadas com um oxidante. Em conjunto, estes dados indicam pela primeira vez a funcionalidade de Nrf2 em bivalves. Este trabalho apresenta novas informação sobre a via Nrf2/ARE em bivalves, as quais permitirão estudos mecanísticos relacionados as defesas antioxidantes e processos de biotransformação.<br> / Abstract : Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) is an essential transcription factor for the coordinated induction of genes encoding oxidative stress response enzymes, including several antioxidant defenses and biotransformation enzymes. Its action is dependent on the binding to the antioxidant response element (ARE) in the promoter region of the target genes. Induction of the Nrf2/ARE pathway offers enormous potential for antioxidant protection, however, there is no research on the activation of this pathway in bivalves. Thus, the present work investigated the antioxidant response in the gills and digestive gland of Pacific oysters, Crassostrea gigas, treated with inducers of the Nrf2/ARE pathway (curcumin or tert-butylhydroquinone, tBHQ). With the annotation of the genome of the Crassostrea gigas oyster we analyzed the conserved regions of the Nrf2 gene that revealed a typical domain, the cap 'n' colar region. The data indicate that several domains, belonging to the negative modulator of Nrf2 (Keap1), are also conserved in mollusks. Our studies indicate that Nrf2 and Keap1 are conserved in oysters because Keap1 presented a high degree of homology to selected species of molluscs and vertebrates, including the presence of redox-sensitive cysteines that are crucial for their function. Phylogenetic analysis grouped both the Nrf2 and Keap1 of C. gigas along with other mollusc sequences but separated from vertebrates and arthropods. C. gigas oysters were exposed to 10 or 30 µM curcumin or tBHQ, classical activators of the Nrf2 / ARE pathway, but the number of mRNA copies of Nrf2 and Keap1 were not modulated in the gill. These data indicate that these compounds do not transcriptally modulate Nrf2 or Keap1. Despite this negative result, the main form of activation of Nrf2 involves the oxidation of the sensitive cysteines of its negative modulator (Keap1), allowing its accumulation and translocation to the nucleus. Thus, when analyzing the antioxidant response, a clear induction of antioxidant defenses can be observed in the gills, which are known to be controlled by Nrf2. Ninety-six hours after initiation of treatment, animals exposed to curcumin (10 and 30 µM) had an increase in ?-glutamyl-L-cysteinyl glycine levels (GSH), and glutathione reductase (GR) activity, glutathione peroxidase (GPx), and glutathione S-transferase (GST). On the other hand, the digestive gland did not present antioxidant amplification. The relative levels of mRNA encoding glutamate-cysteine ligase, GR, MDR3 and GSTpi were clearly induced by curcumin treatment (30 µM, 24 h). Curcumin pre-treatment for 96 h increased oyster survival to cumene hydroperoxide. Likewise, oysters exposed to tBHQ for 96 h showed a clear increase in antioxidant defenses in the gill and lower intensity in the digestive gland. This response included increase in GSH levels, and in GST, GPx and GR activity. Increased mRNA and GR protein expression were also observed after treatment with tBHQ. Interestingly, the decrease in GST, GPx and GR activity at the start of treatment (24 h) may be explained by the inhibitory effect of tBHQ or its metabolites. This conclusion is based on the strong in vitro inhibition of GR activity, and on lower intensity of GST and GPx activity. Despite the lack of increase in the Nrf2 mRNA, we verified that: a) both Nrf2 and Keap1 are conserved phylogenetically in bivalves; B) there was a clear increase of Nrf2-dependent antioxidant defenses following treatment with two classic Nrf2 inducers (curcumin or tBHQ); C) there was a clear amplification at the mRNA level of various target genes of Nrf2, and d) curcumin treatment increased the resistance of oysters challenged with an oxidant. Together, these data indicate for the first time the functionality of Nrf2 in bivalves. This work presents new information about the Nrf2/ARE pathway in bivalves, which will allow mechanistic studies related to the antioxidant defenses and biotransformation processes.

Les activités humaines font peser sur l’écosystème marin de multiples pressions délétères. Pollution chimique, changement climatique, risque d’acidification, débris de plastique et déchets radioactifs ont des impacts sans précèdent. Une pollution de plus en plus reconnu comme majeur est la pollution sonore. La prospection sismique, le battage de pieux et le trafic maritime génèrent des niveaux sonores qui peuvent être extrêmement forts, modifiant fondamentalement le paysage acoustique sous-marin. On sait que de nombreux mammifères marins et poissons entendent le bruit généré par ces activités et que cela altère leur physiologie et leur éthologie. Par contre, chez les invertébrés marins très peu d’études avaient évalué leur capacité à entendre et l’impact de cette pollution sur eux reste à déterminer. Nous avons abordé le problème par une étude de la capacité de perception du son chez l'huître creuse Magallana gigas en utilisant une approche comportementale et physiologique. Nous avons montré que M. gigas entend dans la gamme de fréquences entre 10 et 1000 Hz. Cette analyse nous a permis de caractériser les sources de sons qui contribuent à leur environnement auditif. Au laboratoire, dans un milieu contaminé (i) au cadmium, un métal que nous avons considéré à la fois comme une substance toxique et un marqueur indirect de l'activité ventilatoire, et (ii), par des bruits de cargo, nous montrons un effet répresseur du bruit caractérisé par une diminution de l'activité valvaire, de l'activité ventilatoire et du taux de croissance. Nous rapportons également une diminution de la bioaccumulation du Cd dans les branchies et une modulation de l'expression de certains gènes. Nous avons enfin étudié sur un enregistrement de 2 ans dans le port commercial de Santander, le comportement (incluant les pontes et la croissance) de 3 groupes d’huitres exposés à une forte pollution sonore et à une « qualité de l’eau » considérée dans la littérature comme bonne à très bonne pour une masse d’eau fortement modifiée. Nous avons retrouvé dans notre analyse différents effets que nous avions provoqués ou prédits à partir du travail de laboratoire où nous avions manipulé le bruit seul. Nous concluons que la pollution sonore au sein du port doit diminuer le fitness des huîtres en modifiant leur activité valvaire, la hiérarchie de leurs rythmes biologiques et la croissance. Nos résultats suggèrent que la pollution sonore peut avoir des conséquences importantes sur les invertébrés et présente un risque fort en termes de productivité de l'écosystème. / Human activities introduce multiple harmful pressures on the marine ecosystem. Chemical pollution, climate change, acidification risk, plastic debris and radioactive wastes have significant effects on marine wildlife. Noise pollution is now recognized as a major source of pollution at sea. Seismic exploration, pile driving and marine traffic, among other activities, generate noise at high sound pressure levels altering the underwater acoustic landscape. Many marine mammals and fish hear the noise generated by these activities which have the potential to alter their physiology and ethology. However, very few studies among marine invertebrates had assessed their ability to hear and the impact of noise pollution on them has yet to be determined. We approached the problem by studying sound perception ability in the pacific oyster Magallana gigas using behavioural and physiological techniques. We have shown that M. gigas is sensitive to sound in the frequency range from 10 to 1000 Hz. This characterization allowed us to define sound sources that contribute to their sound landscape. In the laboratory, in an environment contaminated with (i) cadmium, a metal that we considered to be both a toxic agent and an indirect marker of ventilatory activity, and (ii) cargo ship noise, we showed a depressant or repressant effect of noise characterized by a decrease in valve activity, ventilatory activity and growth rate. We also report a decrease in Cd bioaccumulation and some modulation of gene expression. Finally, we studied a 2-year behavioural record performed in the commercial port of Santander (including spawning events and growth) on 3 groups of oysters exposed to high noise pressure levels. In the port of Santander, the "water quality" is otherwise considered by the literature as good to very good for a heavily modified water body. We found in these records different changes that we previously induced and/or produced in the laboratory. We conclude that the noise pollution load occurring within a commercial port must reduce the fitness of oysters by modifying their valve activity, the hierarchy of their biological rhythms and their growth rate. Our results strongly suggest that noise pollution can have significant consequences on invertebrates and presents a high risk in terms of ecosystem productivity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Aquicultura / Made available in DSpace on 2013-06-25T23:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 305340.pdf: 1045261 bytes, checksum: d5716d7f8a16c00a25f0058899695d30 (MD5) / A poluição das águas é uma questão fundamental e preocupante atualmente, sendo que muitas cidades não possuem sistema de abastecimento e tratamento de água e esgoto. Assim, os microrganismos patogênicos são transmitidos por via oral-fecal aos humanos e são comumente encontrados em moluscos bivalves por serem animais filtradores. A capacidade de bioacumulação de xenobióticos em seus tecidos é alta e quando consumidos crus aumenta a probabilidade de contaminação viral e aquisição de outras doenças em humanos. Estudos realizados com tratamentos de depuração utilizando radiação ultravioleta demonstraram ser eficientes contra organismos patogênicos de várias espécies. No presente estudo, realizado na Ilha de Santa Catarina, Brasil, propõe-se a utilização de dois tratamentos de depuração distintos, um com a utilização de radiação ultravioleta e recirculação de água e outro somente com recirculação de água para a melhor compreensão dos mecanismos que envolvem a contaminação, biotransformação e detoxificação de poluentes em ostra, Crassostrea gigas oriundas de dois locais distintos, apto para cultivo e contaminado. Enzimas antioxidantes e genes transcritos foram analisados para verificar a possibilidade de utilização destes como biomarcadores de contaminação aquática em C. gigas após depuração. As respostas enzimáticas apresentaram maior variação nos tecidos de C. gigas provenientes do local contaminado, sofrendo aumento na atividade das enzimas CAT, GPx, G6PDH e GST na brânquia e glândula, e redução da atividade da SOD na brânquia e da atividade da G6PDH na glândula quando aplicado o tratamento de depuração. As ostras oriundas do local apto para cultivo apresentaram uma maior a atividade das enzimas CAT e G6PDH após a depuração e a atividade da GST foi reduzida. Foi observado um padrão de diminuição da taxa de transcrição dos genes, FABP, GSTO e CYP356A1 na brânquia destes organismos. Os resultados sugerem que os tratamentos de depuração podem ser utilizados como sistema complementar de detoxificação dos xenobióticos e microrganismos para organismos presentes em locais de cultivo de ostras C. gigas, pois atuam minimizando o estresse oxidativo causado por poluentes e patógenos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:03:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340539.pdf: 1402213 bytes, checksum: d837e47588ddfd1e5c6857123866eadc (MD5) Previous issue date: 2015 / O estado de Santa Catarina, por suas características geográficas e da qualidade das águas litorâneas, tornou-se um ambiente ideal para o cultivo de organismos marinhos, especialmente moluscos bivalves, como ostras da espécie Crassostrea gigas. O fato de as ostras serem tradicionalmente consumidas in natura, reforça a necessidade de medidas eficientes de controle da produção e de métodos adequados e rápidos para detecção de patógenos. O método de coleta, as condições de armazenamento sob refrigeração e manuseio influenciam sobre a qualidade das ostras comercializadas, sendo que algumas espécies, como Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus são potencialmente patogênicas para o homem, representando riscos à saúde pública. As análises convencionais para detecção e quantificação de Vibrio spp., como a ISO 21872 e Número mais Provável (NMP), apesar de ainda muito utilizadas no Brasil, são técnicas laboriosas, demoradas e de sensibilidade reduzida. Os métodos moleculares atuais, como o PCR em tempo real, por exemplo, são extremamente sensíveis, rápidos e eficientes para a detecção de patógenos alimentares. Com base nisso, esse estudo teve como objetivo comparar os métodos ISO 21872 e PCR em tempo real em amostras de ostras (C. gigas) artificialmente contaminadas com V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus e avaliar os efeitos da temperatura e do tempo no armazenamento de ostras (C. gigas) contaminadas com V. parahaemolyticus. Foram analisadas um total de 70 amostras de ostras contaminadas artificialmente com Vibrio spp. e foi possível obter as seguintes positividades para o método ISO 21872: V. cholerae, 78,6%; V. parahaemolyticus, 71,43%; V. vulnificus, 78,6%; V. cholerae e V. alginolyticus, 64,29%; V. vulnificus e V. mimicus 64,29% e 100% de detecção para todas as amostras pelo método de PCR em tempo real. Os resultados mostraram uma alta sensibilidade do método PCR em tempo real. Com relação aos efeitos da temperatura e do tempo no armazenamento de ostras (C. gigas) contaminadas com V. parahaemolyticus, verificou-se que as ostras contaminadas naturalmente com V. parahaemolyticus, apresentaram um aumento nas contagens no quinto dia de armazenamento, de 1,9 log NMP g-1 para a temperatura de 7ºC e 3,5 log NMP g-1 para temperatura de 20ºC, valores superiores foram observados nas contagens de amostras artificialmente contaminadas no quinto dia de armazenamento, de 3,8 log NMP g-1 para a temperatura de 7ºC, e valores superiores de 5,2 log NMP g-1 paraxivtemperatura de 20ºC, sendo assim, as condições de armazenamento influenciaram sobre a qualidade microbiológica final das ostras.<br> / Abstract : Due the existence of countless environmental preservation areas, such as bays and estuaries, associated with the good quality of the water, the coast of Santa Catarina state, Brazil, has become ideal for marine organisms cultures, especially bivalve mollusks such as the oyster species Crassostrea gigas. The fact that the oysters are traditionally consumed in natura reinforces the need for effective measures to control the production and appropriate methods and rapid detection of pathogens. The method of collection, the storage conditions under refrigeration and handling influence on the quality of commercialized oysters, and some species such as Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus are potentially pathogenic to man, representing a risk to public health. Conventional methods for detection and quantification of Vibrio spp. such as ISO 21872 and Most Probable Number (MPN), still widely used in Brazil, has laborious, hight time consuming and reduced sensitivity. Current molecular techniques, such as real-time PCR, for example, are extremely sensitive, fast and effective for the detection of foodborne pathogens. On that basis, this study aimed to compare the ISO 21872 and real-time PCR methods in oyster samples (C. gigas) artificially contaminated with V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnificus and evaluate the effects of temperature and time in storage oyster (C. gigas) contaminated with V. parahaemolyticus. They analyzed a total of 70 samples oysters artificially contaminated with Vibrio spp. so it was possible to obtain the following positive aspects to the ISO 21872 method: V. cholerae, 78.6%; V. parahaemolyticus, 71.43%; V. vulnificus, 78.6%; V. cholerae and V. alginolyticus, 64.29%; V. vulnificus and V. mimicus 64.29% and 100% detection rate for all samples by PCR method in real time. The results showed a high sensitivity of PCR in real time. In relation to the effects of temperature and time storage of the oysters (C. gigas) contaminated with V. parahaemolyticus, it was found that the oysters contaminated naturally V. parahaemolyticus, showed an increase in counts on the fifth day of storage, 1.9 MPN g-1 for temperature 7°C and 3.5 MPN g-1 for temperature 20°C, higher values were observed in the samples artificially contaminated on the fifth day of storage, 3.8 MPN g-1 for temperature 7°C and higher values of 5.2 MPN g-1 for temperature 20°C and thus storage conditions influenced on the final microbiological quality of oysters.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura. / Made available in DSpace on 2012-10-20T11:55:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 206108.pdf: 730934 bytes, checksum: d428d360f79537556f63429711884947 (MD5) / Sementes da ostra do Pacífico Crassostrea gigas, 2mm em altura, foram cultivadas em diferentes sistemas de berçário (lanternas, baldes e caixas) e em diferentes densidades de estocagem (50, 100 e 200mL de sementes) em Florianópolis, Santa Catarina, Brasil. Diferenças significativas (p<0,05) foram encontradas nas densidades e sistemas de berçário utilizados. Com o aumento da densidade, houve diminuição do crescimento e rendimento das sementes, principalmente no sistema de lanterna berçário. Densidades de 50 e 100mL resultaram em melhores rendimentos nas caixas e baldes. Na maior densidade, o sistema de berçário tipo caixa obteve o melhor rendimento de sementes quando comparado aos sistemas balde e lanterna. Os resultados confirmaram a eficiência do novo sistema de berçário tipo caixa quando comparado aos outros sistemas, especialmente ao padrão tradicional utilizado de densidade de 100mL de sementes em sistema lanterna, que teve aproximadamente 24% de rendimento enquanto, que a caixa nessa densidade atingiu 54%.

O Arapaima gigas, conhecido popularmente como pirarucu é uma espécie de peixe pertencente à ordem dos Osteoglossiformes, nativo da Bacia Amazônica e autóctone da Bacia de São Francisco e do Nordeste. É considerado um dos maiores peixes de água doce do mundo, chegando, na fase adulta, a três metros de comprimento e mais de 200 kg de peso, possuindo, portanto, uma grande importância para a alimentação e o comércio da região. Infelizmente esta espécie pertence à lista de animais sobre explorados do IBAMA, também em perigo de extinção, devido especialmente à pesca predatória e à sua dificuldade reprodutiva em cativeiro. Por estas razões, desenvolvemos o presente trabalho de clonagem e caracterização de um de seus hormônios da reprodução (gonadotrofinas), em particular o hormônio luteinizante (LH). Esta glicoproteína é constituída por duas subunidades ligadas de forma não covalente: a subunidade &alpha; (GTH&alpha;) comum também ao hormônio folículo estimulante (FSH) e a subunidade &beta;, que confere a especificidade de sua ação biológica. Tanto o cDNA do ag-GTH&alpha; quanto aquele do ag-LH&beta; foram sintetizados pela reação de transcriptase reversa (RT) e pela reação de cadeia de polimerase (PCR) utilizando vários primers, a partir do RNA total obtido das glândulas hipofisárias de A.gigas. O cDNA de GTH&alpha; apresentou um comprimento total de 767 pb incluindo uma cadeia poli-A de 20 adeninas. Foi identificada uma região codificante (ORF) de 348 pb iniciando com o primeiro códon (ATG) na posição 58 e o códon de parada (stop) na posição 403. O sinal de poliadenilação (ATTAAA) foi localizado 18 pb antes da cauda poli-A. A região codificante traduz um peptídeo de 115 aminoácidos, com um sítio de clivagem do peptídeo sinalizador situado entre o aminoácido 24 e 25. A proteína apresenta portanto um suposto peptídeo sinal de 24 aminoácidos e um peptídeo maduro de 91 aminoácidos, que quando alinhado com outras espécies de peixes, mostra a conservação de 10 resíduos de cisteína, 3 prolinas e dois potenciais sítios de glicosilação entre os aminoáciodos 51-53 (NIT) e os aminoáciodos 77-79 (NHT). O cDNA de ag-LH&beta; apresenta um comprimento total de 711 pb, incluindo uma cadeia poli-A de 18 adeninas. Foi identificada uma região codificante (ORF) de 426 pb, iniciando com primeiro códon (ATG) na posição 47 e terminando na posição 469. O sinal de poliadenilação (AATAAA) foi localizado 18 pb antes da cadeia poli-A. A região codificante traduz um peptídeo sinalizador situado entre o aminoácido 24 e 25. Com isso, temos um peptídeo sinalizador de 24 e um peptídeo maduro de 117 aminoácidos que apresenta a conservação de 12 resíduos de cisteína, 6 prolinas e um sítio potencial de N-glicosilação identificado entre os aminoácidos 10-12 (NQT), enquanto um segundo possível sítio de N-glicosilação (alterado para QTT), entre os aminoácidos 27-29, foi perdido. Como na subunidade GTH&alpha;, a maior porcentagem de identidade de LH&beta; foi com os Cypriniformes (75.6%) enquanto a menor foi com os Gadiformes (53.8%). A análise filogenética realizada utilizando as sequências de FSH&beta; e LH&beta; de 41 espécies de peixes, incluido o A.gigas, confirmou os dados publicados relativos à subunidade GTH&alpha;, posicionando o A.gigas como grupo irmão dos Clupeocephala e os Elopomorpha (Anguilliformes) como grupo mais basal entre os teleósteos . / Arapaima gigas, popularly known as pirarucu, is a species of fish that belongs to the order of Osteoglossiformes, originating from the Amazon, São Francisco river basin and the North East of Brazil. It is considered one of the largest fresh water fishes in the world, reaching when adult three meters in length and more than 200 kg in weight. It is therefore very important for food and for the regional industry. Unfortunately, this species belongs to the list of overexploited animals from IBAMA and is in danger of disappearing due to fishing exploitation and to its reproductive difficulties, especially in captivity. For these reasons, we developed this project for the cloning and characterization of one of its hormones of reproduction (gonadotropins), namely luteinizing hormone (LH). This glycoprotein is formed by two subunits non-covalently bound: the &alpha; subunit (GTH&alpha;), in common with follicle-stimulating hormone (FSH) and the &beta; subunit, that provides the specificity of its biological action. Both cDNAs of ag-GTH&alpha; and of ag-LH&beta; have been synthesized via reverse transcriptase (RT) and polymerase chain reaction (PCR) utilizing several primers, starting from total RNA extracted from A. gigas pituitary glands. The cDNA of ag-GTH&alpha; showed a total lenght of 767 bp, including a poli-A tail with 20 adenines. A coding reagion (ORF) of 348 bp, was also identified, starting from the first codon (ATG) at position 58, with the stop codon at position 403. The polyadenylation signal (ATTAAA) was identified 18 bp before the poly-A tail. This coding sequence translates a 115 amino acid peptide showing a signal-peptide cleavage site between amino acid 24 and 25. It has therefore a putative signal peptide with 24 and a mature peptide with 91 amino acids that, when aligned with other species of fish, presents 10 conserved residues of cysteine, 3 of proline and two potential glycosylation sites at amino acids 51-53 (NIT) and amino acids 77-79 (NHT). The cDNA of ag-LH&beta; has instead a total length of 711 bp, including a poly-A tail of 18 adenines. A coding region of 426 bp was identified, starting with the first codon (ATG) at position 47 and having the stop codon at position 469. The polyadenylation signal (AATAAA) was found 18 bp before the poly-A tail. The coding region translates a signal-peptide located between amino acid 24 and 25. It has a signal peptide with 24 and a mature peptide with 117 amino acids that presents 12 conserved residues of cysteine, 6 of proline and a potential N-glycosylation site at amino acid 10-12 (NQT), while a second possible N-glycosilation site at amino acid 27-29 (altered into QTT), was last due to the substitution of an asparagine with a glutamine. As for the case of ag-GTH&alpha;, the highest percent of identity was found with Cypriniformes (75.6%), while the lowest was with Gadiformes (53.8%). The phylogenetic analysis carried out with cDNA sequences of LH&beta; and FSH&beta; of 41 different fish species, confirmed previous published data concerning ag-GTH&alpha;, locating A.gigas as the sister group of Clupeocephala and the Elopomorpha (Anguilliformes) as the most basal group of all living teleosts.

O Pirarucu (Arapaima gigas) é um peixe gigante da família Arapaimidae, nativo das bacias amazônicas que pode chegar a dois metros de comprimento e pesar mais de 200 Kg. Está presente no Equador, na Colômbia, no Peru, na Bolívia e no Brasil. Atualmente a espécie está ameaçada de extinção devido à pesca predatória e ao aumento da presença humana em seus viveiros naturais. No presente trabalho, os cDNAs da subunidade (ag-GTH&alpha;) e da subunidade &beta; do hormônio folículo estimulante de A. gigas (ag-FSH) foram isolados e clonados pela primeira vez, possibilitando uma melhor compreensão da diversidade e evolução desta glicoproteína em peixes e a futura síntese biotecnológica deste hormônio para fins reprodutivos e alimentícios. Tanto o cDNA do ag-GTH&alpha; quanto aquele do ag-FSH&beta; foram sintetizados pela reação de transcriptase reversa (RT) e pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como molde RNA total proveniente das glândulas hipofisárias de A. gigas. O cDNA da subunidade ag-GTH&alpha; possui uma sequência codificadora (Open Reading Frame, ORF) de 348 pb, o que corresponde a uma proteína de 115 aminoácidos com um suposto peptídeo sinal de 24 aminoácidos e com um peptídeo maduro de 91 aminoácidos. Dez resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de cinco pontes dissulfeto, dois sítios de N-glicosilação e três resíduos de prolinas apresentaram-se altamente conservados quando comparados com outras espécies de peixes. A comparação baseada em sequências de aminoácidos de GTH&alpha; de 38 espécies de peixes revelou alta identidade do A. gigas com membros das seguintes ordens: Acipenseriformes, Anguiliformes, Siluriformes e Cypriniformes (87,1-89,5%), e, a menor identidade com os Gadiformes e Cyprinodontiformes (55%). A identidade com a análoga sequência de GTH&alpha; de Homo sapiens foi de 67%. Para a subunidade ag-FSH&beta;, a ORF correspondente foi de 381 pb, produzindo uma proteína de 126 aminoácidos com um peptídeo sinal de 18 e um peptídeo maduro de 108 aminoácidos. Quando comparado com as sequências de Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii e Homo sapiens, o peptídeo maduro de ag-FSH&beta; mostrou conter 12 resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de seis pontes dissulfeto, duas prolinas e um sítio de glicosilação perfeitamente conservados, apresentando identidades de 63, 50 e 45% respectivamente em suas sequências de aminoácidos. As árvores filogenéticas construídas mostraram, em geral, que o A. gigas, da ordem dos Osteoglossiformes, se apresenta como grupo irmão dos Clupeocefala, enquanto os Elopomorpha (Anguiliformes) formam o grupo mais basal de todos os teleósteos aqui analisados. / Pirarucu (Arapaima gigas) is a giant fish of the Arapaimidae family native to the Amazon river basin, that can reach 3 meters in length, weighing up to 250 Kg. It is present in Equador, Colombia, Peru, Bolivia and Brazil. This species is in danger of disappearing due to exploitation by the fishing industry and increasing human presence in its natural habitat. In the present work the cDNAs of the gonadotropin -subunit (ag-GTH) and of follicle-stimulating hormone &beta; subunit (ag-FSH&beta;) were isolated and cloned for the first time. As a consequence, a better understanding of the diversity and evolution of this glycoprotein in fish and its future biotechnological synthesis for reproductive and alimentary purposes will be possible. Both cDNAs of ag-GTH&alpha; and ag-FSH&beta; have been synthesized via reverse transcriptase reaction (RT-PCR) and polymerase chain reaction (PCR) using as a template total RNA extracted from A. gigas pituitary glands. Ag-GTH&alpha;- subunit has a coding sequence (open reading frame, ORF) of 348 bp, corresponding to a 115 amino acid protein, with a putative signal peptide of 24 aminoacids and a mature peptide of 91 amino acids. Ten cysteine residues, responsible for the formation of five disulfide linkages, two N-glycosylation sites and three proline residues were found highly conserved when compared to other fish species. A comparison based on the amino acid sequence of the GTH&alpha;- subunit from 38 different species of fish showed high identity of A. gigas with members of the following orders: Acipenseriformes, Siluriformes and Cypriniformes (87.1-89.5%), while the lowest identity was found with Gadiformes and Cyprinodontiformes (55%). In comparison with the analogous sequence of Homo sapiens an identity of 67% was found. For the ag-FSH&beta; subunit an ORF of 381 bp, coding for a 126 amino acid protein, with a signal peptide of 18 and a mature peptide of 108 amino acids, was found. When compared with the Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii and Homo sapiens, the mature peptide of ag-FSH&beta; showed the presence of the twelve cysteine residues responsible for the formation of six disulfide linkages, two proline residues and one glycosylation site, all of them perfectly conserved. The identity with the mentioned species were 63, 50 and 45% respectively. The obtained phylogenetic trees have shown, in general, that A. gigas of the order of Osteoglossiformes appears as sister group of Clupeocephala, while Elopomorpha (Anguilliformes) forms the most basal group of all analyzed teleosts.