O Glioblastoma Multiforme (GBM) é o tipo de tumor cerebral maligno com maior incidência na população. A perda do gene PTEN (fosfatase e tensina homóloga) é uma alteração comum associada ao GBM (até 60%) e esse gene codifica uma enzima que antagoniza a ação de PI3K, inibindo a fosforilação de AKT e, desse modo, regulando vias de sinalização relativas à sobrevivência celular e proliferação. Mutações em PTEN têm sido associadas à instabilidade genômica e ao aumento no número de quebras de fita dupla, além de serem relacionadas também à redução da expressão de RAD51, a qual é uma proteína-chave da via de reparo por recombinação homóloga (HR). Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar se o status de PTEN interfere na expressão de RAD51 e proteínas parálogas (RAD51C e RAD51B) e, consequentemente, se PTEN é capaz de influenciar a eficiência de HR. Com o objetivo de induzir a formação de quebras de fita duplas (DSBs) no DNA, as células foram tratadas com a droga antitumoral etoposídeo, que produz quebras no DNA, principalmente duplas (DSBs). Duas linhagens de GBM com status diferentes de PTEN foram utilizadas: T98G (PTEN mutado) e LN18 (PTEN tipo selvagem). As células de GBM foram tratadas com etoposídeo em diferentes experimentos ou ensaios: proliferação celular, quantificação da necrose e apoptose, cinética do ciclo celular, imunofluorescência da proteína ?- H2AX, quantificação dos níveis de expressão de RAD51 e parálogas e o silenciamento de PTEN na linhagem LN18. Os resultados mostraram que a linhagem LN18 foi mais sensível à droga nos tempos iniciais (24 e 72 h) (até 61,2% de redução), em comparação com a T98G (até 12,3% de redução); no tempo mais tardio de análise (120 h), ambas as linhagens sofreram redução acentuadana proliferação. Adicionalmente, a LN18 exibiu maior porcentagem de células apoptóticas e necróticas, em comparação com a linhagem T98G, nos tempos de24, 72 e 120 horas após o tratamento. O ensaio de imunofluorescência revelou maior indução de células positivas para ?-H2AX na linhagem LN18 em relação à T98G (p =<0,001), após tratamento com etoposídeo (50 e 75 ?M). Nessas concentrações, a análise da cinética do ciclo celular mostrou um bloqueio na fase G2 em ambas as linhagens (p<0,01) nos tempos analisados (24, 48 e 72h), mas apenas a linhagem LN18 revelou bloqueio na fase S. A expressão de RAD51, RAD51B e C foi mais elevada em LN18 em comparação com a T98G e U87MG, nas células tratados (75?M) e controles. PTEN foi silenciado (siRNA-PTEN) na linhagem LN18 para verificar se a redução da expressão desse gene reduziria também a expressão de RAD51 e parálogas. Após 72 horas de silenciamento, com 69,9% de inibição de PTEN, a expressão de RAD51 e RAD51C também se mostrou reduzida em relação ao grupo controle. Em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo indicam que o status de PTEN é crucial para as vias de sobrevivência, controle do ciclo celular e indução de apoptose nas células de GBM, indicando a relação entre PTEN e RAD51 e parálogas nas células de GBM tratadas com um indutor de quebras no DNA. Adicionalmente, outras ferramentas de estudo são requeridas para investigar as vias moleculares e possíveis interações e complexos proteicos envolvendo a participação de PTEN e RAD51 e suas proteínas parálogas / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor. Loss of PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) gene is the most frequent alteration associated with GBM and encodes a phosphatase enzyme that antagonizes the PI3K, by inhibiting AKT phosphorylation thereby regulating signaling pathways related to cell survival and proliferation. PTEN deficiency has been associated with genomic instability and increased endogenous DSBs, as well as reduced expression of RAD51, which is a key gene with crucial role in HR. In this study, we aimed to evaluate whether the PTEN status in GBM cell lines can affect RAD51 expression and HR efficiency under conditions of treatment with the antineoplastic drug etoposide, which targets the DNA topoisomerase II enzyme, thus leading to the production of DNA breaks. T98G (PTEN mutated) and LN18 (PTEN wild-type) cells were treated with etoposide, and several assays were carried out: cell proliferation, detection and quantification of necrosis and apoptosis, cell cycle kinetics, immunofluorescence staining, RAD51 (and paralogs) protein expression, and PTEN silencing in LN18 cell line, by using the siRNA method. LN18 cells showed a greater reduction in cell proliferation, compared to T98G after treatments (25, 50, 75 e 100 µM) at 24, 72 and 120h. Both cell lines showed a significant increase (p=<0.001) in cell death induction, but LN18 presented a greater percentage of apoptotic and necrotic cells than T98G (24, 72 and 120h). The induction of DSB was analyzed by immunostaining (with ?-H2AX antibody), and for the concentrations (50 and 75 µM) tested, LN18 showed higher levels of ?-H2AX positive cells than that observed for T98G (p=<0.001). The analysis of cell cycle kinetics performed for cells treated with etoposide (50 and 75 µM) and collected at 24, 48 and 72h, LN18 presented a greater G2-blockage, as compared to T98G; only LN18 showed a blockage at the S-phase. The expression of RAD51, RAD51B and C was higher in LN18 compared to T98G and U87MG cells treated with etoposide (75 µM) and controls. When we silenced PTEN in LN18 linage, to check if PTEN silencing may reduce the expression of RAD51 and its paralogs, we found a 69.9% reduction in PTEN protein expressions, and the expression of RAD51 and RAD51C was also found reduced, compared to the control group. Taken together, the results obtained in this study indicate that the status of PTEN is critical for survival pathways, cell cycle control and induction of apoptosis in GBM cells, confirming the relationship between PTEN and RAD51 and its paralogs in GBM cells treated with an inducer of DNA breaks. These results contribute with relevant information for further studies on molecular pathways underlying the interaction between PTEN and RAD51 and its paralogs

O glioma de grau IV (geralmente chamado de Glioblastoma Multiforme - GBM) é o tumor mais agressivo e maligno do sistema nervoso central. A elevada mortalidade e baixa expectativa de vida proporcionado por esta doença, tem direcionado os esforços de muitos pesquisadores no desenvolvimento de novas formas de diagnóstico precoce, assim como a busca por terapias inovadoras. A galectina-3, uma proteína ligante de glicanas, é expressa diferencialmente em tecido normal vs. neoplásico e possui um papel importante na adesão, diferenciação, imunomodulação, apoptose, ciclo celular, assim como processos de transformação e progressão neoplásica. Diversos estudos têm demonstrado que a interferência nas funções exercidas pela galectina-3 pode representar uma estratégia promissora no tratamento de vários tipos de tumores, incluindo o glioblastoma. De fato, tem se verificado que a administração da forma truncada de galectina-3 em modelos experimentais murinos, possui um efeito antitumoral significativo quando administrada em conjunto com quimioterápicos. No entanto, ainda não se encontra esclarecido se a interferência com as funções da galectina-3 endógena são exercidas diretamente no microambiente tumoral ou de maneira sistêmica. Dessa forma, neste trabalho buscou-se um entendimento mais profundo e completo sobre o papel anti-tumoral de galectina-3 nativa e truncada em associação com o quimioterápico temozolamida num modelo de glioblastoma humano. Adicionalmente, as ferramentas de PET-SPECT, assim como imagem molecular ótica por fluorescência ou bioluminescênca foram utilizadas para se avaliar a biodistribuição da galectinas-3 em camundongos Balb/c nude inoculados com tumor. Inicialmente demonstrou-se que, nas células U87 de glioblastoma humano, a galectina-3 nativa e não a galectina-3 truncada apresenta efeito antitumoral in vitro quando associada com temozolamida com valores de IC50 de 0.008 mM e 1.893 mM respectivamente. Os testes in vivo foram dessa forma prosseguidos com a galectina-3 nativa. Através da técnica de imagem ótica por bioluminescência, observou-se que o tratamento simultâneo de galectina-3 com temozolamida levou a uma redução do crescimento do tumor gerado pelas células U87-Luc2 (U87 transfectadas com o gene reporter da luciferase) em camundongos Balb/c nude. Esta redução foi observada mesmo após a parada do tratamento (período de acompanhamento). Curiosamente, no tratamento com apenas galectina-3 observou-se uma redução do crescimento tumoral das células U87-luc2 cujo efeito foi anulado após a suspensão do tratamento. Através de análises por PET-SPECT avaliou-se a biodistribuição da galectina-3 marcada com 99mTc (99mTc-HYNIC/Gal-3) em camundongos Balb/c nude previamente inoculados com a linhagem U87. Demonstrou-se que esta proteína migra principalmente para os rins e, em menores quantidades para o baço, não ligando todavia no tumor. Devido à meia-vida do 99mTc-HYNIC/Gal-3 não permitir estudos prolongados, a galectina-3 conjugada com VivoTag 680XL foi utilizada para se avaliar a biodistribuição por 48h, 96h e 14 dias em camundongos Balb/c nude inoculados com a linhagem de glioblastoma U87. Além de se confirmar o padrão de distribuição acima descrito, observou-se que a galectina-3 não liga no tumor independentemente do modelo tumoral utilizado. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que galectina-3 possui um efeito antiproliferativo quando administrada em conjunto com temozolamida num modelo de glioblastoma humano (células U87). Surpreendentemente, foi possivel observar pela primeira vez que o efeito antiproliferativo de galectina-3 não se deve à sua atuação direta no tumor. Nossos dados sugerem que, quando administrada in vivo, a galectina-3 atua em locais distintos do microambiente tumoral como os rins e baço, afetando portanto de maneira indireta o crescimento tumoral / Grade IV glioma or glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive and malignant tumor of the central nervous system. The high mortality and low life expectancy provided by this disease have directed the efforts of many researchers to develop innovative therapeutic strategies and early diagnosis tools. Galectin-3 is a glycan-binding protein differentially expressed in normal and neoplastic tissue and has an important role in adhesion, differentiation, immune modulation, apoptosis, cell cycle, tumor transformation and neoplastic progression. Several studies have shown that interference with the functions performed by galectin-3 could represent a promising strategy in the treatment of several kinds of tumors, including glioblastoma. Indeed, it has been found that galectin-3 truncated form has a significant antitumor effect when associated with chemotherapy in murine experimental models. However, it\'s not clear yet whether the interference with galectin-3 endogenous functions is performed directly in the tumor microenvironment or systemically. Thus, this study aimed to understand the anti-tumor effect of truncated and native galectin-3 in combination with temozolomide chemotherapy in a human glioblastoma model. Additionally, PET, SPECT and bioluminescence tools were used to evaluate the biodistribution of galectin-3 in Balb / c nude mice inoculated with the U87 glioblastoma cell line. Here it was shown that in U87 cells, native galectin-3 and not the truncated form has anti-tumor effect in vitro when associated with temozolomide with IC50 values of 0.008 mM and 1.893 mM, respectively. Therefore the in vivo studies were pursued with native galectin-3. Using the optical bioluminescence technique, it was observed that the simultaneous treatment of galectin-3 with temozolomide led to a reduction of tumor growth generated by U87- Luc2 cells (U87 cells transfected with the luciferase reporter gene) in Balb / c nude. This reduction was observed even after stopping treatment (follow-up period). Interestingly, treatment of U87-Luc2 derived-tumor with only galectin-3 led to a reduction of tumor growth whose effect was abolished after discontinuation of treatment. The biodistribution of 99mTc labeled-galectin-3 (99mTc-HYNIC / Gal-3) was performed by molecular image tools (PET-SPECT scan) in mice BALB/c nude previously inoculated with the U87 line. It was shown that this protein migrates primarily to the kidneys and, in a smaller amount to the spleen, but doesn\'t bind the tumor. Because the half-life of 99m Tc-HYNIC / 3-Gal doesn\'t allow prolonged studies, galectin-3 conjugated with VivoTag 680XL was used to assess in vivo biodistribution at 48h, 96h and 14 days in Balb / c nude mice inoculated with the human glioblastoma cell line U87. Besides confirming the distribution pattern described above, it was found that galectin-3 doesn\'t bind to the tumor, regardless the tumor model. This study shows that galectin-3 has an antiproliferative effect when associated with temozolomide in the human glioblastoma model U87. Surprisingly, it was observed, that the in vivo antiproliferative effect of galectin-3 is not due to its direct binding to tumor cells. Our data suggest that when administered in vivo, galectin-3 acts in distinct locations of the tumor microenvironment such as the kidneys and spleen, thus indirectly affecting tumor growth

Muitos genes têm sido indicados como responsivos ao estresse genotóxico, mas devido à necessidade de validação, a busca por marcadores gênicos continua. Vários genes são relacionados ao sistema ubiquitina-proteassomo (UPS), o qual é responsável pela remoção seletiva de proteínas, sendo que falhas no UPS têm sido relacionadas a doenças neurodegenerativas e ao câncer. Assim, o presente trabalho teve como objetivo a busca e confirmação de marcadores gênicos de resposta ao estresse genotóxico, por meio do estudo da expressão transcricional e protéica dos genes ERN1, EIF2AK3, GADD153 e TRAF2, visando à confirmação das respostas em linhagens de fibroblastos (GM07492A e AS405) e de glioblastoma (U87MG), sob tratamentos com peróxido de hidrogênio (H2O2) e Bleomicina (Blm). Foram utilizados o Ensaio Cometa, a análise de expressão gênica transcricional por qPCR em tempo real e de expressão gênica ao nível protéico (imunofluorescência). Os resultados mostraram que os tratamentos empregados foram capazes de induzir danos no DNA, sendo que a sensibilidade ao tratamento e a capacidade de recuperação das linhagens foi variável dependendo do agente testado. A análise de expressão gênica mostrou que GM07492A apresentou indução dos genes ERN1 e GADD153 após tratamento com H2O2 (resposta precoce, zero e 2 h) e Blm (durante todo pós-tratamento). A linhagem AS405 exibiu indução de ERN1 e GADD153 para H2O2, enquanto que para Blm foram induzidos os genes EIF2AK3 e GADD153. Para U87MG, a indução de EIF2AK3 pelo H2O2 ocorreu de modo tardio, enquanto GADD153 mostrou-se induzido após ambos os tratamentos. A proteína ERN1 apresentou expressão discreta e pontual, inclusive nos pontos onde não houve indução transcricional, indicando uma expressão basal. Essa proteína se expressou em GM07492A no tratamento com Blm em zero hora, diferentemente de AS405. Para U87MG tratada com H2O2 observou-se discreta expressão de ERN1, sendo mais evidente para Blm. Quanto à proteína GADD153, esta foi expressa em fibroblastos nos vários tempos analisados. No entanto, U87MG mostrou expressão nuclear apenas nas células tratadas, sendo mais evidente para H2O2 comparativamente à Blm. Assim, as alterações observadas nos perfis de expressão gênica são compatíveis com a indução de danos no DNA, indicando o envolvimento de genes do UPS nas respostas celulares ao estresse genotóxico. Em conjunto, os resultados estimulam uma avaliação mais detalhada desses genes como marcadores de resposta ao estresse e evidencia a sua importância no cenário da via UPS. / Many genes have been reported as responsive to genotoxic stress, but due to the need of validation, the search for genetic markers still continues. Several genes are related to the ubiquitin-proteasome system (UPS), which is responsible for the selective removal of proteins, and UPS failures have been associated to neurodegenerative diseases and cancer. Thus, this study aimed the search and confirmation of genetic markers that were responsive to genotoxic stress. For this, we evaluated the transcriptional or protein expression of the genes ERN1, EIF2AK3, GADD153 and TRAF2, seeking confirmation of responses in fibroblast cell lines (GM07492A and AS405) and glioblastoma (U87MG) under treatment with hydrogen peroxide (H2O2) and bleomycin (BLM). We used the Comet Assay, the transcriptional analysis of gene expression by quantitative real-time PCR and protein expression byimmunofluorescence. The results showed that the treatments employed were able to induce DNA damage, and that cell sensitivity to treatments and recovery capability of cell lines varied according to the tested agent. The gene expression analysis showed that GM07492A presented induction of ERN1 and GADD153 genes after treatment with H2O2 (early response, zero and 2 h) and Blm (throughout the post-treatment). The cell line AS405 showed induction of GADD153 and ERN1 after H2O2, whereas with Blm the genes induced were EIF2AK3 and GADD153. For U87MG, the induction of EIF2AK3 by H2O2 occurred at a later stage, while GADD153 was promptly induced after both treatments. The protein ERN1 showed discreet and punctual expression, even at time point without transcriptional induction, indicating a basal expression. This protein was expressed in GM07492A by treatment with Blm at zero hour, differently of AS405. For U87MG treated with H2O2, ERN1 showed a slight expression, being more evident for Blm. Regarding GADD153, protein expression was observed in fibroblasts at all time point. However, U87MG showed nuclear expression only in cells treated with H2O2, being more evident that in BLM-treated cells. Thus, the observed changes in gene expression profiles are consistent with the induction of DNA damage, which indicates the participation of UPS genes in cellular responses to genotoxic stress. Together, the results encourage further evaluation of these genes as markers of stress response, demonstrating its importance in the UPS acting scope.

Ziel: Den Einfluss der Radikalität der Resektion eines Glioblastoma multiforme in Kombination mit einer adjuvanten Chemotherapie auf das Survival heraus zu arbeiten. Methoden: Zwischen 1997 und 2000 wurden 55 Patienten, die an einem primären Glioblastoma multiforme erkrankten, einer Tumorresektion unterzogen. Von den 55 Patienten waren 36 männlich und 19 weiblich. Im Mittel erkrankten die Patienten mit 56 Jahren. Tumorresektion und Radiatio wurden bei allen Patienten durchgeführt. 20 Patienten wurden darüber hinaus noch mit einer adjuvanten Chemotherapie behandelt. Ergebnisse: Die Patienten, die mit einer Chemotherapie behandelt wurden, zeigten ein signifikant längeres Überleben (85 versus 44 weeks). Und die Patienten mit einem postoperativen Resttumor profitierten am meisten von der adjuvanten Chemotherapie (75 versus 39 weeks). Zusammenfassung: Patienten, die mit einer adjuvanten Chemotherapie behandelt wurden zeigten ein signifikant längeres Überleben als die Patienten ohne diese Therapie. / Objective: To evaluate the influence of resection of a glioblastoma multiforme in combination with adjuvant chemotherapy regarding survival. Methods: From 1997 to 2000, 55 patients with primary glioblastoma multiforme underwent a tumor resection. Of the 55 patients 36 were male, 19 female, with an average age of 56 years. Tumor resection and radiatio were performed in all patients. 20 patients were treated additionally with chemotherapy. Results: Patients treated with chemotherapy displayed a significant longer survival (85 versus 44 weeks). And the patients with a residual postoperative tumor mass did benefit from adjuvant chemotherapy (75 versus 39 weeks). Conclusion: Patients treated with adjuvant chemotherapy had a significant longer survival then those without this therapy.

Die vorliegende Arbeit ist eine retrospektive Kohortenstudie, welche alle Patienten einschloß, die im Zeitraum von 07/1988 bis 06/1997 aufgrund eines anaplastischen Astrozytoms oder eines Glioblastoma multiforme im damaligen Rudolf-Virchow-Klinikum in Berlin eine Strahlentherapie des Kopfes erhielten. Von den 111 Patienten erlitten im Beobachtungszeitraum 85 ein radiologisches Rezidiv. Die mediane Überlebenszeit betrug 9 Monate. 69 der Rezidive waren Zentralrezidive, 7 Randrezidive und 9 Fernrezidive. Auch die Rand- und Fernrezidive rezidivierten zusätzlich am Ort der Primärläsion. Es konnte gezeigt werden dass ein Sicherheitsabstand von 2-3 cm ausreicht um 90% der Rezidive vollständig zu erfassen und dass die lokale Kontrolle weiterhin das Hauptproblem bei der Behandlung dieser malignen Gliome ist. / This retrospective study reviews the data of 111 patients treated from 07/1988 to 06/1997 at the Rudolf-Virchow-Klinikum in Berlin. Both patients with anaplastic astrocytoma and glioblastoma multiforme were included. 85 patients showed radiological recurrence of tumour. Median survival was 9 months. 69 recurrences were central, 7 near and 9 distant recurrences. Near and distant recurrences were always multifocal, i. e. they recurred also at central locations. It was shown that a safety margin of 2-3 cm is sufficient to completely cover 90% of recurrent tumour. Local failure is still the primary difficulty in treating these malignant glioma.

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais comum e agressivo em adultos. Uma combinação de terapia padrão com outras terapias baseadas no conhecimento de sua biologia é necessária para melhorar a sobrevida de pacientes com GBM. Muitos estudos foram desenvolvidos em busca de proteínas de membrana expressas em GBM, pois são potenciais alvos para imunoterapia. A proteína transmembrânica CD99 foi descrita como altamente expressa em astrocitomas de diferentes graus de malignidade. Embora seu mecanismo de ação ainda não seja totalmente compreendido, CD99 está envolvido na adesão e migração celular em diferentes tipos de tumores. O gene CD99 codifica duas proteínas distintas, denominadas isoforma 1, maior, de 32 kDa, e isoforma 2, gerada por splicing alternativo e menor, de 28 kDa. No presente estudo, foi demonstrada a expressão predominante da isoforma 1 em astrocitomas de diferentes graus de malignidade em comparação com o cérebro normal, bem como na linhagem celular de GBM humano U87MG. O transcriptoma das células U87MG transfectadas com siRNA para CD99 foi analisado em relação ao controle. Um total de 2.670 genes diferencialmente expressos foi identificado. Uma análise de enriquecimento no banco de dados DAVID revelou os seguintes processos como os mais significativos: junções aderentes célula-célula; adesão célula-célula envolvendo ligação de caderina e adesão celular. Ensaios funcionais baseados nestes achados (migração, invasão e adesão) foram realizados com células U87MG após o silenciamento de CD99 com dois shRNAs diferentes. A eficiência de silenciamento foi de 80 e 97%, para o shCD991 e 2, respectivamente, confirmada a nível de expressão do gene e da proteína. O silenciamento de CD99 reduziu a migração e invasão para ambos os shRNAs, com diminuição mais acentuada da migração para o shCD99 2, com maior nível de silenciamento de CD99. No ensaio de adesão, a linhagem U87MG shCD99 1 apresentou propriedades adesivas mais baixas que o controle, enquanto o shCD99 2 apresentou resultado oposto, com maior adesão celular do que seu controle. Provavelmente o silenciamento de CD99 afetou a redução da adesão celular em um padrão distinto, sugerindo que o resultado pode ser dependente do nível de expressão remanescente de CD99. Além disso, o CD99 e a faloidina colocalizaram nos lamelipódios e filopódios, sugerindo um papel importante no rearranjo do citoesqueleto. Foi demostrado, ainda, que o silenciamento de CD99 levou à redução da proliferação celular in vitro e diminuição do tumor in vivo. Camundongos imunodeficientes nos quais foram implantadas células silenciadas no cérebro apresentaram uma maior sobrevida que os animais que receberam células controle. A via de sinalização pela qual CD99 modula a proliferação no GBM ainda precisa ser elucidada. Migração, invasão e proliferação são as principais características do GBM que limitam uma ressecção cirúrgica completa e, consequentemente, levam frequentemente à recorrência. Portanto, análises posteriores das vias ativadoras do CD99 no contexto da migração, invasão, proliferação celular e apoptose são válidas para revelar novas estratégias terapêuticas para limitar a progressão do GBM / Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive malignant brain tumor in adults. A combination of standard therapy with other biologically based therapies is necessary to improve the survival of patients with GBM. Many studies have been developed in pursuit of expressed membrane proteins in GBM, which are potential targets for immunotherapy. The transmembrane protein CD99 is highly expressed in different malignant grades of astrocytomas. Although its mechanism of action is not still fully understood, CD99 is involved in cell adhesion and migration in different type of tumors. The CD99 gene encodes two distinct transmembrane proteins, named isoform 1, longer with 32 kDa, and isoform 2, generated by alternative splicing, shorter with 28 kDa. In the present study, we demonstrated predominant expression of isoform 1 in astrocytomas of different malignant grades compared to normal brain, and in the human GBM cell line U87MG. The transcriptome of U87MG cell line transfected with siRNA for CD99 was analyzed in relation to control. A total of 2.670 differentially expressed genes were identified. An enrichment analysis by DAVID Bioinformatics Database revealed the following processes as the most significant: cell-cell adherens junction; cadherin binding involved in cell-cell adhesion and cell-cell adhesion. Functional assays based on these findings (migration, invasion and adhesion) were performed with U87MG cells after knocking down CD99 with two different shRNAs. The CD99 silencing efficiency was 80 and 97%, for shCD99 1 and 2, respectively, confirmed at gene and protein level. The CD99 knockdown reduced migration and invasion for both shRNA, with the highest decrease of migration observed in the higher CD99 knocked down cells. In adhesion assay, shCD99 1 U87MG showed lower adhesive properties than the control, whereas shCD99 2 cells presented opposite results, with higher cell adhesion than control. Probably CD99 knockdown affected in the reduction of cell adhesion in a distinct pattern, suggesting that the result is dependent on CD99 remaining expression level. Additionally, CD99 and phalloidin colocalized at lamellipodia and filopodia, sugesting that CD99 plays an important role to cytoskeleton rearrangement. It has also been demonstrated that CD99 silencing caused reduction of cell proliferation in vitro and decreased tumor in vivo. Immunodeficient mice in which knocked down cells were implanted in the brain had a longer survival than animals that received control cells. The signaling pathway by which CD99 modulates proliferation in GBM still needs to be elucidated. Migration, invasion and proliferation are major characteristics of GBM, which limits the complete surgical tumor resection, and consequently leads to tumor recurrence. Therefore, further analysis of CD99 activating pathways in the context of cell migration, invasion, proliferation and apoptosis is worthwhile to unveil new therapeutic strategies to halt GBM progression

O Glioblastoma (GBM) é um astrocitoma grau IV, representando o glioma de maior malignidade e o tumor cerebral primário mais frequente em humanos. A terapia indicada para o GBM é a ressecção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia, todas com baixíssima eficiência devido a agressividade e as características do GBM. Consequentemente, a sobrevida dos pacientes indicados aos tratamentos convencionais é pouco mais de um ano. A inflamação é, sabidamente, uma das características que participa de modo decisivo do desenvolvimento tumoral, incluindo do GBM, e as relações entre mediadores inflamatórios e câncer são alvos de pesquisa nos últimos anos. Diversos estudos apontam um papel da via dos eicosanoides na modulação de processos patológicos envolvidos na inflamação e no câncer. Os eicosanoides são mediadores lipídicos bioativos, envolvidos em diversos processos fisiológicos e patológicos, em especial os associados à resposta inflamatória. As principais vias de produção de eicosanoides (ciclooxigenases, lipoxigenases, e citocromo P450), assim como seus produtos, são frequentemente alterados em diversos tipos de tumor, associados ao crescimento e a progressão tumoral. Contudo, o perfil dessas vias é consideravelmente pouco compreendido em GBM. O objetivo deste estudo foi analisar in vitro o perfil e o papel das três vias de eicosanoides e seus produtos (eicosanoides ou não) nas linhagens de GBM (U251-MG, U87-MG, A172, T98G e U138-MG), modulando a atividade de enzimas chaves com drogas especificas para, então, analisar parâmetros de proliferação, migração e morte celular. Nossos resultados mostram, em todas as linhagens analisadas, um perfil heterogêneo das enzimas e receptores chaves das três vias. O perfil lipídico evidencia a produção de 13-HODE, produto de 15-lipoxigenase-1 em todas as linhagens, bem como ausência de leucotrienos e 5-HETE do eixo de 5-lipoxigenase. Os inibidores farmacológicos para 15-LOX e 12-LOX/15-LOX foram capazes de reduzir o crescimento, modular o ciclo celular e a migração celular das linhagens U251-MG, U87-MG e A172. O mesmo é visto com a inibição de mPGES-1. A inibição de 5-LOX por outro lado não afetou nenhum parâmetro nas mesmas linhagens. Todos os resultados apontam, portanto, para um papel do eixo de 15-LOX e COX no crescimento e na migração das células de GBM humano. / Glioblastoma (GBM) is a grade IV astrocytoma, the most malignant and the most frequent primary brain tumour in humans. Standard therapies for treating GBM are surgical resection, chemotherapy and radiotherapy, all with low efficiency due to GBM aggressiveness and characteristics. Therefore, patient survival after conventional treatments is about one year. Inflammation is one of the main characteristics that plays a decisive role in tumour development, including in GBM. The relationships between inflammatory mediators and cancer have been the subject of research in recent years. Several studies point to the eicosanoid pathways as modulators of pathological processes between inflammation and cancer. Eicosanoids are bioactive lipid mediators, involved in various physiological and pathological processes, especially those associated with the inflammatory response. The major eicosanoid pathways (cyclooxygenases, lipoxygenases, and cytochrome P450) as well as their products, are frequently altered in several tumours, associated with tumour growth and progression. However, the profile of these pathways is poorly understood in GBM. The objective of this study was to analyse, in vitro, the profile and role of eicosanoid pathways and their products (eicosanoids or not) in GBM cell lines (U251-MG, U87-MG, A172, T98G and U138-MG), modulating the key enzymes with inhibitors, analysing proliferation, migration and cell death. Our results show, in all analysed cell lines, a heterogeneous profile for the key enzymes and receptors of the three pathways. The lipid profile shows the production of 13-HODE, a product of 15-lipoxygenase-1, as well the absence of leukotrienes and 5-HETE of the 5-lipoxygenase axis. The pharmacological inhibitors for 15-LOX and 12-LOX / 15-LOX led to changes in cell cycle, reduced growth, reduced migration of U251-MG, U87-MG and A172 cell lines. The same was seen with the inhibition of mPGES-1. Inhibition of 5-LOX, on the other hand, did not affect any of these parameters in the same cell lines. All results, therefore, point to an important role of 15-LOX and COX pathways in the growth and migration of human GBM cells.

Os receptores do tipo Toll (TLRs) são as primeiras proteínas do sistema imune a identificarem distúrbios, reconhecem patógenos como bactérias, fungos e vírus. Como o processo inflamatório possui um importante papel em diversas doenças, os TLRs foram considerados potenciais alvos em estratégias terapêuticas, incluindo o tratamento de câncer. No entanto, o papel dos TLRs permanece ambíguo. Esse estudo teve como objetivos analisar os níveis de expressão dos TLRs presentes em membrana plasmática, TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6) em astrocitomas de diferentes graus de malignidade (grau II-IV), tumor mais prevalente do Sistema Nervoso Central (SNC). Nós demonstramos que a expressão dos TLRs foi mais alta em amostras de astrocitomas comparadas com tecido cerebral não-neoplásico, por qRT-PCR. A expressão gênica e proteica foi observada em células de linhagem de glioblastoma (GBM) U87MG e A172, mostrando sua presença em células tumorais. Foi observada expressão associada entre os heterodímeros TLR1- TLR2. Em GBMs, o subtipo mesenquimal mostrou maior nível de expressão dos TLRs comparados aos subtipos clássico e proneural. Com o objetivo de identificar o papel dos TLRs nas células tumorais, foi selecionado dentre os TLRs o que apresentou maior nível de expressão, o TLR4, e realizamos ensaios funcionais estimulando a U87MG com LPS, um agonista natural para TLR4. A taxa de proliferação da célula tratada com LPS foi similar a não tratada. No entanto, foi observado a ativação do NF-kB após 12hrs do estímulo com LPS. Quando a sinalização do receptor foi inibida por um composto químico (VGX-1027), o nível de proliferação da U87MG decaiu. Adicionalmente, análise in silico revelou uma forte associação dos TLRs hiperexpressos com aumento da expressão de genes relacionados à sinalização do ciclo celular, inflamassoma e ripoptossoma. O que sugere serem os TLRs alvos para complementação do tratamento do câncer / Toll-like receptors (TLRs) are the first to identify disturbances in the immune system, recognizing pathogens such as bacteria, fungi, and viruses. Since the inflammation process plays an important role in several diseases, TLRs have been considered potential therapeutic targets, including treatment for cancer. However, TLRs\' role in cancer remains ambiguous. This study aims to analyze the expression levels of plasmatic cell membrane TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, and TLR6) in different grades (II-IV) of human astrocytoma, the most prevalent tumor of CNS. We demonstrated that TLR expressions were higher in astrocytoma samples compared to non-neoplastic brain tissue, by qRT-PCR. The genes and proteins expressions were observed in U87MG and A172 GBM cell lines, proving their presence in the tumor cells. Associated expressions between the known heterodimers TLR1-TLR2 were found in diffusely infiltrative astrocytoma. In GBM, the mesenchymal subtype showed higher levels of TLR expressions in relation to classical and proneural subtypes. Aiming to indentify the role of TLRs in tumor cells, we chose the highest TLR expressed in GBM cells, the TLR4, and performed functional assays stimulating U87MG-GBM cell line with LPS, a natural agonist for TLR4. The proliferation rate was similar in treated and non-treated cell with LPS. However, NF-kB activation was detected after 12hrs of LPS stimulation. When TLR4 signaling pathway was inhibited by a chemical compound (VGX-1027) a decrease in the proliferation rate was observed. Additionally, in silico analysis revealed a strong association of TLRs upregulation with increased expression level of genes related to cell cycle, inflammasome and ripoptosome pathways, further highlighting TLRs as interesting targets for cancer complementary treatment

Les gliomes malins sont les tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central. Les glioblastomes représentant plus de 50% des gliomes, constituent la forme la plus agressive et sont particulièrement résistants à la radiochimiothérapie. Au sein de ces tumeurs réside une sous-population de cellules souches tumorales (CSG) qui pourrait être responsable de leurs initiation, progression et résistance aux traitements. Ces processus sont gouvernés par des voies de signalisation, pour la plupart activées de manière constitutive et dont l’étude est nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la gliomagenèse. L’objectif de ces travaux de thèse consistait en l’exploration des voies de signalisation STAT3 et Hippo dans les gliomes dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. La première partie de ces travaux a montré que la phosphorylation S727 de STAT3 jouait un rôle important dans la radioresistance des CSG et que son inhibition pharmacologique induisait leur radiosensibilisation. Dans un second temps, ces travaux ont montré que deux effecteurs de la signalisation Hippo, YAP1 et TEAD3, sont associés à un mauvais pronostic et qu’ils seraient impliqués dans la prolifération cellulaire et le phénotype des CSG notamment par inhibition de la signature proneurale. Ainsi, ces travaux visent à proposer de nouvelles pistes thérapeutiques, d’une part l’inhibition de la pS727-STAT3 afin de potentialiser les effets de la radiothérapie et d’autre part, les effecteurs de la signalisation Hippo comme biomarqueurs pronostiques et potentielles cibles thérapeutiques. / Malignant gliomas are the most common tumors of central nervous system. Glioblastomas represent more than 50% of all glioma and constitute the most aggressive form of the tumor which is particularly resistant to radiotherapy. The presence of the subpopulation of glioblastoma stem cells (GSC) could be involved in tumor initiation, progression and therapeutic resistance. Hence, these processes are governed by signaling pathways which are mostly constitutively activated and their study is necessary for a better understanding of gliomagenesis. The aim of this PhD thesis was to assess STAT3 and Hippo signaling pathways in glioma to identify new prognostic markers and potential therapeutic targets. The first part on this work showed that pS727 phosphorylation of STAT3 could be involved in radioresistance and its inhibition induced GCS radiosensitization. Additionally, this work showed that YAP1 and TEAD3, two effectors of Hippo signaling, are associated with poor patient survival and could be involved in GSC proliferation and phenotype maintenance by inhibiting proneural gene signature. Thereby, this work aims to offer new therapeutic avenues, on the one hand the inhibition of pS727-STAT3 for radiotherapy potentiation and on the other hand the effectors of Hippo signaling as prognostic biomarkers and potential therapeutic targets.

O glioma de grau IV (geralmente chamado de Glioblastoma Multiforme - GBM) é o tumor mais agressivo e maligno do sistema nervoso central. A elevada mortalidade e baixa expectativa de vida proporcionado por esta doença, tem direcionado os esforços de muitos pesquisadores no desenvolvimento de novas formas de diagnóstico precoce, assim como a busca por terapias inovadoras. A galectina-3, uma proteína ligante de glicanas, é expressa diferencialmente em tecido normal vs. neoplásico e possui um papel importante na adesão, diferenciação, imunomodulação, apoptose, ciclo celular, assim como processos de transformação e progressão neoplásica. Diversos estudos têm demonstrado que a interferência nas funções exercidas pela galectina-3 pode representar uma estratégia promissora no tratamento de vários tipos de tumores, incluindo o glioblastoma. De fato, tem se verificado que a administração da forma truncada de galectina-3 em modelos experimentais murinos, possui um efeito antitumoral significativo quando administrada em conjunto com quimioterápicos. No entanto, ainda não se encontra esclarecido se a interferência com as funções da galectina-3 endógena são exercidas diretamente no microambiente tumoral ou de maneira sistêmica. Dessa forma, neste trabalho buscou-se um entendimento mais profundo e completo sobre o papel anti-tumoral de galectina-3 nativa e truncada em associação com o quimioterápico temozolamida num modelo de glioblastoma humano. Adicionalmente, as ferramentas de PET-SPECT, assim como imagem molecular ótica por fluorescência ou bioluminescênca foram utilizadas para se avaliar a biodistribuição da galectinas-3 em camundongos Balb/c nude inoculados com tumor. Inicialmente demonstrou-se que, nas células U87 de glioblastoma humano, a galectina-3 nativa e não a galectina-3 truncada apresenta efeito antitumoral in vitro quando associada com temozolamida com valores de IC50 de 0.008 mM e 1.893 mM respectivamente. Os testes in vivo foram dessa forma prosseguidos com a galectina-3 nativa. Através da técnica de imagem ótica por bioluminescência, observou-se que o tratamento simultâneo de galectina-3 com temozolamida levou a uma redução do crescimento do tumor gerado pelas células U87-Luc2 (U87 transfectadas com o gene reporter da luciferase) em camundongos Balb/c nude. Esta redução foi observada mesmo após a parada do tratamento (período de acompanhamento). Curiosamente, no tratamento com apenas galectina-3 observou-se uma redução do crescimento tumoral das células U87-luc2 cujo efeito foi anulado após a suspensão do tratamento. Através de análises por PET-SPECT avaliou-se a biodistribuição da galectina-3 marcada com 99mTc (99mTc-HYNIC/Gal-3) em camundongos Balb/c nude previamente inoculados com a linhagem U87. Demonstrou-se que esta proteína migra principalmente para os rins e, em menores quantidades para o baço, não ligando todavia no tumor. Devido à meia-vida do 99mTc-HYNIC/Gal-3 não permitir estudos prolongados, a galectina-3 conjugada com VivoTag 680XL foi utilizada para se avaliar a biodistribuição por 48h, 96h e 14 dias em camundongos Balb/c nude inoculados com a linhagem de glioblastoma U87. Além de se confirmar o padrão de distribuição acima descrito, observou-se que a galectina-3 não liga no tumor independentemente do modelo tumoral utilizado. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que galectina-3 possui um efeito antiproliferativo quando administrada em conjunto com temozolamida num modelo de glioblastoma humano (células U87). Surpreendentemente, foi possivel observar pela primeira vez que o efeito antiproliferativo de galectina-3 não se deve à sua atuação direta no tumor. Nossos dados sugerem que, quando administrada in vivo, a galectina-3 atua em locais distintos do microambiente tumoral como os rins e baço, afetando portanto de maneira indireta o crescimento tumoral / Grade IV glioma or glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive and malignant tumor of the central nervous system. The high mortality and low life expectancy provided by this disease have directed the efforts of many researchers to develop innovative therapeutic strategies and early diagnosis tools. Galectin-3 is a glycan-binding protein differentially expressed in normal and neoplastic tissue and has an important role in adhesion, differentiation, immune modulation, apoptosis, cell cycle, tumor transformation and neoplastic progression. Several studies have shown that interference with the functions performed by galectin-3 could represent a promising strategy in the treatment of several kinds of tumors, including glioblastoma. Indeed, it has been found that galectin-3 truncated form has a significant antitumor effect when associated with chemotherapy in murine experimental models. However, it\'s not clear yet whether the interference with galectin-3 endogenous functions is performed directly in the tumor microenvironment or systemically. Thus, this study aimed to understand the anti-tumor effect of truncated and native galectin-3 in combination with temozolomide chemotherapy in a human glioblastoma model. Additionally, PET, SPECT and bioluminescence tools were used to evaluate the biodistribution of galectin-3 in Balb / c nude mice inoculated with the U87 glioblastoma cell line. Here it was shown that in U87 cells, native galectin-3 and not the truncated form has anti-tumor effect in vitro when associated with temozolomide with IC50 values of 0.008 mM and 1.893 mM, respectively. Therefore the in vivo studies were pursued with native galectin-3. Using the optical bioluminescence technique, it was observed that the simultaneous treatment of galectin-3 with temozolomide led to a reduction of tumor growth generated by U87- Luc2 cells (U87 cells transfected with the luciferase reporter gene) in Balb / c nude. This reduction was observed even after stopping treatment (follow-up period). Interestingly, treatment of U87-Luc2 derived-tumor with only galectin-3 led to a reduction of tumor growth whose effect was abolished after discontinuation of treatment. The biodistribution of 99mTc labeled-galectin-3 (99mTc-HYNIC / Gal-3) was performed by molecular image tools (PET-SPECT scan) in mice BALB/c nude previously inoculated with the U87 line. It was shown that this protein migrates primarily to the kidneys and, in a smaller amount to the spleen, but doesn\'t bind the tumor. Because the half-life of 99m Tc-HYNIC / 3-Gal doesn\'t allow prolonged studies, galectin-3 conjugated with VivoTag 680XL was used to assess in vivo biodistribution at 48h, 96h and 14 days in Balb / c nude mice inoculated with the human glioblastoma cell line U87. Besides confirming the distribution pattern described above, it was found that galectin-3 doesn\'t bind to the tumor, regardless the tumor model. This study shows that galectin-3 has an antiproliferative effect when associated with temozolomide in the human glioblastoma model U87. Surprisingly, it was observed, that the in vivo antiproliferative effect of galectin-3 is not due to its direct binding to tumor cells. Our data suggest that when administered in vivo, galectin-3 acts in distinct locations of the tumor microenvironment such as the kidneys and spleen, thus indirectly affecting tumor growth