Les gliomes sont les tumeurs cérébrales primitives les plus fréquentes de l’adulte. Le glioblastome (grade IV) en est la forme la plus agressive, caractérisé par sa résistance aux traitements actuels (chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie). La mortalité de cette pathologie est quasi constante (survie médiane de 15 mois), ce qui justifie l’importance de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Le challenge est d'arriver à identifier des marqueurs spécifiques pour proposer un schéma thérapeutique alignant des stratégies de thérapies ciblées qui vont améliorer la prise en charge clinique, la survie globale et la survie sans progression des patients atteints de ces pathologies. Deux axes sont au centre des recherches fondamentales, translationnelles et cliniques. Le premier axe se définit autour du développement de molécules inhibitrices des voies de signalisation et le second autour du concept de cellules souches tumorales (CST) de glioblastomes (GBM) découvertes récemment dans le cerveau et qui révolutionnent la conception de la transformation tumorale.ASPM (Abnormal Spindle Like Microcéphaly Associated) est une cible candidate pertinente susceptible de participer au développement des gliomes (Horvath et al., 2007 ; Hagmann et al., 2008). Cette protéine régule la prolifération des neuroblastes, elle est fortement exprimée au stade embryonnaire, mais, reste faiblement exprimée dans le cerveau adulte. Par ailleurs, ASPM est impliquée dans divers processus de cancérisation (surexprimée dans les cancers du sein, du foie et du cerveau…), toute fois, le mécanisme responsable de cette dérégulation n’est pas encore bien caractérisé.Nos études menées sur une série de 169 gliomes humains, sélectionnés à partir de notre cohorte de patients, montrent que le gène ASPM est un marqueur de la progression vers la malignité, les grades les plus élevés exprimant le plus fortement ASPM. En outre, nous avons également montré que le niveau des transcrits d’ASPM est augmenté dans les récidives de gliomes et qu’en in vitro, ASPM contrôle la formation des gliomasphères (CST de GBM) avec une augmentation de l’expression de ses transcrits dans les cultures in vitro au fil des passages. En continuité de ces observations, nous avons alors développé un sh-miR-RNA spécifique d’ASPM permettant l’extinction post-transcriptionnelle de ce gène. Les résultats obtenus in vitro montrent que la perte d’expression d’ASPM conduit à un arrêt de la prolifération et aboutit à une mort cellulaire massive.Actuellement, des modèles de greffe de gliomasphères chez la souris (orthotopique) sont en cours de développement pour confirmer les effets observés in vitro et vérifier in vivo la validité de notre approche thérapeutique. En perspective, nous tenterons d’étudier les effets du silencing d’ASPM sur la voie de signalisation la plus dérégulée (pRB / E2F ou PI3K / AKT). Enfin, nous étudierons le rôle potentiel de cette protéine dans le contrôle du cycle cellulaire, et, in fine la mise en évidence de ses partenaires… / Glioblastoma (GBM) is the most frequent and aggressive form of primary brain tumors in adults; it is characterized by its resistance to current treatments (surgery, chemotherapy and radiotherapy). The prognosis is grim with a median survival of only 15 months underlining the importance to develop new therapeutic strategies. The recent development of the “tumor stem cell” (TSC) concept in hemopathies has been secondarily applied to gliomas with the identification of subpopulations of GBM cells which express neural stem cell markers and fulfill the criteria for stemness. Some evidences also suggest that this subpopulation could play a primary role in resistance to radio- and chemotherapy.ASPM (Abnormal Spindle Like Microcephaly Associated) is a protein regulating the proliferation of neuroblasts, highly expressed in the embryonic stage but weakly expressed in the adult brain. Preliminary reports suggesting that it could be involved in the development of gliomas (Horvath et al., 2007, Hagemann et al., 2008) prompted us to analyze further the role of this protein, focusing on its potential as a relevant candidate therapeutic target. In a series of 175 gliomas samples of various grades, we found that ASPM mRNA expression was strongly correlated with increasing tumor grade. We also found that ASPM expression increased at recurrence when compared to the initial lesion. Subsequently, we could demonstrate in vitro and in vivo that ASPM expression also increased over serial passages in gliomaspheres and in a mouse glioma xenograft model. In a therapeutic perspective, the effect of lentivirus-mediated shRNA post-transcriptional silencing of ASPM was evaluated in two different gliomasphere models and a dramatic proliferation arrest and cell death was observed. Taken together, these data suggest that ASPM is involved in the malignant progression of gliomas, possibly through expansion of a cancer stem cell compartment, and could be an attractive therapeutic target in glioblastoma multiforme.Another potential candidate tumor stem cell target in glioma is the sonic hedgehog pathway (hedgehog-Gli) which is required for GBM growth and stem cell expansion. In a collaborative study, it was found that NANOG, a transcription factor critically involved with self-renewal of undifferentiated embryonic stem cells, modulates gliomasphere clonogenicity, CD133+ stem cell behavior and proliferation. NANOG was regulated by hedgehog-Gli signalling and was essential for GBM tumourigenicity in orthotopic xenografts suggesting that it could also be a useful potential therapeutic target.Conclusions: Accumulating evidences suggest that tumor stem cells play an important role in the oncogenesis of gliomas and in their resistance to treatment. Our data support this concept and suggest that specific stemness markers may become useful targets to improve treatment of this devastating disease.

Ce travail de thèse a pour objectif le traitement local des gliomes malins via l'administration de nanocapsules lipidiques (LNC) par convection enhanced delivery (CED). Deux types de complexes métalliques lipophiles aux propriétés thérapeutiques ont été encapsulés au sein des LNC. Le premier est un complexe radioactif de Rhénium-188 et le second, un agent anticancéreux dérivé du tamoxifène et du ferrocène, le ferrociphénol (Fc-diOH). Les LNC de 188Re permettent une rétention de l'émetteur β- au niveau local et une éradication complète de la tumeur est possible pour une dose de 8Gy puisque 33% des animaux sont de longs survivants. Cette dose optimisée s'est révélée être une dose efficace, intermédiaire entre des doses toxiques (10-12 Gy) ou inefficaces (3-4 Gy). Les LNC-Fc-diOH présentent des taux d'encapsulation élevés, et sont quantitativement internalisées dans les cellules 9L. De plus, l'activité du ferrociphénol est conservée après encapsulation et se révèle très efficace sur des cellules de gliome 9L (IC50=0.6μM). En revanche, l'activité est très réduite sur les astrocytes, cellules au potentiel de division quasiment nul. L'action intratumorale des LNC-Fc-diOH dans un modèle de gliome sous-cutané entraîne une réduction significative des masses et volumes tumoraux. De plus, l'association entre le ferrociphénol et les photons X est une association synergique conférant à Fc-diOH des propriétés de molécule radio-sensibilisante. La médiane de survie du groupe traité par une CED de LNC-Fc-diOH suivie d'une radiothérapie externe de 18Gy (3x6Gy) augmente de 48% par rapport au groupe contrôle avec la présence de 17% de longs survivants.

Les gliomes de haut grade sont des tumeurs cérébrales de très mauvais pronostic. Le traitement standard proposé combine la chirurgie, la radiothérapie et parfois l'utilisation de témozolomide (agent de chimiothérapie). Une limitation majeure de la radiothérapie provient de la radiosensibilité des tissus sains. La radiothérapie stéréotaxique par rayonnement synchrotron est une technique innovatrice dont le principe est de combiner un rayonnement basse énergie (inférieur à 100 keV) à la présence d'atomes lourds dans la zone tumorale afin d'augmenter la dose déposée et ainsi accroître le différentiel de dépôt de dose entre la tumeur et les tissus sains environnants. Dans cette étude, plusieurs composés contenant des atomes lourds tels que les agents de chimiothérapie : cisplatine/carboplatine, un analogue d'une base de l'ADN : la 5-iodo-2'-désoxyuridine (IUdR) ou bien des nanoparticules d'or ont été considérés. Des études cellulaires ont permis de quantifier les facteurs d'augmentation de dose induits par la présence de ces composés dans l'environnement extracellulaire pour certains et intracellulaire pour d'autres. Lors d'études in vivo effectuées sur des rats porteurs de gliomes, la toxicité, cinétique de distribution et la localisation de ces composés a été déterminée, ainsi que l'efficacité potentielle du traitement associant injection cérébrale et irradiation basse énergie.

Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne de grade IV dont le pronostic est de 14,6 mois avec le traitement standard. Le pronostic des patients est difficile à préciser et de meilleures connaissances de révolution de ce cancer nous permettraient d’identifier de nouveaux marqueurs permettant d’estimer plus précisement le stade du cancer et ainsi, la survie des patients. L’équipe du Dr Ju Yan a étudié les profils de longueurs individuelles des télomères des cellules de patients normaux et de patients atteints de leucemie myéloïde chronique (LMC) avec les techniques d’analyse des fragments terminaux de restriction des télomères (TRF) et d’hybridation in situ observée en fluorescence de façon quantitative (Q-FISH). En utilisant les mêmes protocoles sur les GBM, nous avons évalué les longueurs individuelles des télomères et leurs profils. L’analyse complète de onze spécimens de GBM humains et de la lignée cellulaire de glioblastome U-87 MG nous a permis d’observer que les télomères 12p, 16p, 22q, 17p, 17q, 19p et 22q sont maintenus plus longs dans les profils de longueurs individuelles relatives. En comparant avec les données du Dr Yan, nous avons pu déterminer que les télomères 21p et 2q sont fréquemment observés parmi les télomères les plus courts dans les GBM et dans la LMC. Les comparaisons des télomères significativement plus courts à ceux plus longs nous ont permis d’identifier l’allongement des télomères 12p, 16p et 20q de même que le raccourcissement des télomères 3q, 9p et 22q comme étant des événements potentiellement spécifiques à révolution des GBM. Les télomères 12q et 22q ont été observés parmi les télomères les plus courts et parmi les plus longs dans différents cas de GBM et de LMC, suggérant que le maintien de la longueur et le raccourcissement de ces extrémités peuvent jouer un rôle dans l'évolution du cancer. L’utilisation du FISH multicolore (M-FISH) nous a permis d’identifier les chromosomes impliques de façon récurrente parmi les anomalies de nombre et de structure. Nous avons noté les délétions des chromosomes 1, 2, et 20 ainsi que des segments des chromosomes 6, 11q , 13q, 14q et 18. Au niveau des duplications, on retrouve majoritairement le bras court du chromosome 4 et un segment du chromosome 7. Nous avons aussi observé dans nos analyses que les chromosomes 1, 6, 12, 13, 22 et 14 sont particulièrement impliqués dans les réarrangements et leurs télomères sont fréquemment retrouvés dans les plus courts (1p, 1q, 13p, 22p et 6p). Globalement, nous avons observés que les tumeurs décrites comme étant agressives sont associées avec une survie courte après diagnostic et elles présentent des télomères courts et/ou plusieurs anomalies chromosomiques. Les tumeurs décrites comme étant indolentes sont associées avec une survie longue après diagnostic et elles présentent des télomères souvent de longueur normale et un nombre inférieur d’anomalies chromosomiques comparativement aux tumeurs agressives.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) représente un obstacle physiologique à l'acheminement de molécules thérapeutiques dans le traitement des tumeurs cérébrales. Une approche afin de faciliter le transport au-delà de la BHE implique l'activation des récepteurs des kinines. Notre objectif était de caractériser la perméabilisation pharmacologique de la BHE avec des analogues synthétiques stables des récepteurs B1 et B2 des kinines (rB1 et rB2) chez le rat Fischer implanté d'un gliome F98. Pour ce faire, une série de peptides agonistes a été développée et synthétisée dans nos laboratoires. Les meilleurs candidats ont ensuite été sélectionnés pour leur affinité et activité envers leur récepteur spécifique, ainsi que leur durée d'action et leur résistance au métabolisme enzymatique. Nous avons ensuite caractérisé l’expression du rB1 et du rB2 dans notre modèle animal. Les deux sous-types de récepteurs ont été détectés sur les cellules tumorales et les cellules endothéliales de la vascularisation tumorale (RT-PCR et immunohistochimie). Nous avons évalué la perméabilité de la BHE avant et après l'infusion (i.a. ou i.v.) des différents agonistes choisis à l'aide de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) dynamique avec des agents de contraste de différents poids moléculaire (Magnevist™ 0,5 kDa et Gadomer™ 17 kDa). Les images pondérées T[indice inférieur 1] ont été analysées pour la présence ou l'absence d'augmentation du contraste à l'intérieur et aux environs de la tumeur et traitées mathématiquement pour obtenir le volume de distribution de l'agent de contraste (CADV). Ces CADV ont ensuite été comparés pour mettre en évidence une perméabilisation vasculaire induite par les agonistes. Nos résultats montrent que les agonistes du rB1 (NG29) et du rB2 (R523) augmentent, de façon dose-dépendante, les CADV du Gd-DTPA et du Gadomer. L'augmentation du CADV induite par le NG29 a été annulée par l'antagoniste sélectif du rB1 R892 et l'inhibiteur des cyclooxygénases méclofénamate, alors que celle induite par le R523 a été annulée par l'antagoniste sélectif du rB2 HOE140 et l'inhibiteur des NO synthases L-NA. Enfin, nous avons évalué l'impact d'une co-stimulation des deux récepteurs sur la perméabilité de la BHE. Cette double activation a été faite soit par co-injection des agonistes rB1 et rB2, ou à l’aide d'un nouvel agoniste rB1/rB2 hétérodimérique, développé dans nos laboratoires. Ces différentes approches ont un effet additif sur la perméabilité de la BHE. L’ensemble de nos résultats soutiennent l’utilisation des agonistes synthétiques des rB1 et rB2 (administrés seuls ou en combinaison) afin d'améliorer l'acheminement de macromolécules thérapeutiques aux tumeurs cérébrales.

L'IRM joue un rôle extrêmement important dans l'évaluation de nouvelles thérapies anti-tumorale vis-à-vis des gliomes tant en préclinique, qu'en clinique. L'objectif de cette thèse est de déterminer si un ou plusieurs paramètres IRM peuvent être utilisés comme indicateur d'effet thérapeutique sur des modèles de gliomes chez le rat. Nous avons évalué différents paramètres IRM (ADC : coefficient de diffusion apparent de l'eau, BVf : volume sanguin et VSI : index de taille des vaisseaux) sur 6 modèles de gliomes étudiés pour le même volume tumorale, puis au cours d'un suivi longitudinal de 2. Ces 2 études ont permis de valider ces paramètres IRM (robustesse des techniques, validation biologique). Dans une 3ème étude, nous avons suivi l'évolution de ces paramètres en y ajoutant la mesure de la perméabilité des vaisseaux à un agent de contraste, et ce lors du suivi de 2 thérapies (chimiothérapie et anti-angiogénique). Dans une dernière étude nous avons complété ce protocole par la perméabilité quantitative à deux agents de contraste de taille différente ainsi que la mesure de la saturation sanguine en oxygène (lSO2) lors du suivi de l'effet de 2 thérapies (anti-angiogénique et radiothérapie par rayonnement synchrotron) appliquées seules ou en combinaison sur un modèle de gliome. L'IRM multiparamétrique telle que présentée dans les différentes études, apparaît comme une modalité d'imagerie ayant un fort potentiel pour l'évaluation en préclinique de nouveaux médicaments sur les tumeurs cérébrales. Le transfert clinique des nouvelles techniques IRM utilisées durant cette thèse (VSI, perméabilité à 2 agents de contraste, lSO2) peut maintenant être envisagé dans un futur proche.

Une radiothérapie efficace nécessite un dépôt de dose localisé à la tumeur, et donc un contraste entre le tissu tumoral et les tissus sains environnants. Une irradiation de basse énergie monochromatique au synchrotron d'une tumeur chargée en éléments lourds permet de maximiser l'interaction photoélectrique dans la tumeur et d'épargner les tissus sains, car les photoélectrons et les électrons Auger produits ont un TEL très élevé et déposent leur énergie autour des éléments lourds, augmentant fortement le dépôt de dose. Ils peuvent induire des dommages à l'ADN (cassures double brin) fortement létaux. Un autre phénomène permet également de promouvoir l'émission d'électrons Auger et d'augmenter ainsi la dose, l'effet Mössbauer. Cette interaction résonante et sans recul spécifique à certains isotopes dont le 57Fe présente une section efficace 450 fois plus importante que celle de l'effet photoélectrique. Ce travail de doctorat a évalué l'utilisation in vitro de nanoparticules de magnétite combinées à ces deux effets physiques. Les nanoparticules présentent une internalisation et une distribution dans les cellules F98 qui sont très propices à la radiosensibilisation : de grandes concentrations proches du noyau des cellules, et peu de toxicité ont été obtenues. Ceci a permis d'obtenir par photoactivation des NPFe un facteur d'augmentation de 3 ce qui est considérable. Ce travail multidisciplinaire rassemble des expériences de physique, de biologie et de chimie, pour évaluer les applications de nanoparticules de fer à la radiothérapie. / An efficient radiotherapy needs a localized dose to the tumour, which means a high contrast between tumorous and healthy tissues. A synchrotron low energy monochromatic irradiation of a tumour charged in high-Z elements allows maximizing photoelectric interactions in the tumour and spare the healthy tissues. Photoelectrons and high LET Auger electrons thus produced deposit their energy locally, enhancing radiation dose to tumor cells. Another interaction allows to enhance the dose by Auger electrons: the Mössbauer effect. This resonant and recoilless interaction specific to some isotopes like 57Fe has a cross section 450 times bigger than photoelectric effect. This thesis evaluates the in vitro use of magnetite nanoparticles combined with those 2 types of interactions. The nanoparticles evaluated present a high internalisation and a perinuclear distribution inside F98 cells. A dose-enhancement factor of 3 was obtained by photo activation of the iron Nps, this represents a huge increase. This multidisciplinary work encompasses experiments in chemistry, physics and biology in order to evaluate the applications of magnetite nanoparticles to radiotherapy.

Les gliomes de haut-grades sont des les tumeurs primitives les plus fréquentes du système nerveux central. Le traitement de cette pathologie associe chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. Les principales faiblesses de ces traitements sont le caractère infiltrant de la tumeur au sein d’un parenchyme hautement fonctionnel, l’existence de la barrière hémato-encéphalique limitant le passage trans-vasculaire de la chimiothérapie et la radiorésistance naturelle des cellules gliomateuses.Parmi les stratégies proposées pour outre-passer cette barrière hémato-encéphalique, une injection directe au sein du parenchyme a été évoquée. Afin d’optimiser cette délivrance le concept d’infusion convective a été développé, il s’agit d’une injection intra-parenchymateuse à un débit lent et contrôlé.Le bevacizumab est un anticorps dirigé contre le VEGF-A, un des principaux facteurs angiogéniques. Le but de ce traitement est de lutter contre l’ angiogénèse et de freiner la croissance tumorale.Dans un premier temps, la pharmacocinétique d’une injection intracérébrale de bevacizumab a été étudiée en comparaison avec une administration systémique plus classique. Les résultats permettent de mettre en évidence une concentration locale équivalente avec des concentrations systémiques beaucoup plus faibles avec une injection intra-tumorale. Un point important de cette étude est que la concentration dans l’hémisphère controlatéral à l’injection est aussi importante que lors d’une injection systémique.Puis l’efficacité d’une injection intratumorale de bevacizumab a été comparée à un traitement systémique sur un modèle de gliome chez la souris. L’efficacité du traitement est claire sur la survie de l’animal avec un avantage pour une injection intratumorale par rapport à une injection systémique. D’un point de vue microscopique cet avantage de survie peut être corrélé à une angiogénèse et une prolifération tumorale moins importante an cas d’injection directe au sein de la tumeur.Contrairement aux études pré-cliniques chez les rongeurs, les principaux essais cliniques n’ont pas permis de mettre en évidence un avantage d’une injection intra-tumorale directe. Principalement du à une mauvaise délivrance liée à des fuites et des reflux. Une des limites du modèle petit animal est l’absence de sillon cortical, vecteur de fuite. Le développement d’un modèle de gliome anatomiquement pertinent permettrait de simuler au mieux ces fuites et simultanément la mise au point de technologies de délivrance implantable à l’échelle humaine. Nous avons donc développé le premier modèle de gliome chez le porc. L’immunotolérance a été induite par un traitement par ciclosporine, des cellules de gliomes humains U87 et G6 ont été implantés, permettant se développer des tumeurs.Afin de dépister une mauvaise délivrance et anticiper les fuites ou les reflux, nous avons étudié les profils de pression le long de la ligne d’injection corrélés à l’existence de fuites ou de reflux. Nous avons pu identifier un profil pressionnel typique d’une injection de qualité. Les injections ne répondant pas à ces critères ont systématiquement conduits à des fuites ou reflux.L’étape suivante a été l’injection au sein d’une tumeur chez des porcs grâce à un système innovant implanté. Cette injection a été possible sans complication infectieuse avec une bonne tolérance locale et neurologique.La dernière étape de ce travail est l’étude anatomique de la diffusion d’un colorant injecté par une technique d’infusion convective. Cette étude s’intéressait notamment à la diffusion depuis la corona-radiata vers les différentes voies de substance blanche. La diffusion est anisotrope le long des fibres de substance blanche cependant la diffusion suit des voies différentes en fonction de la position du cathéter par rapport à elle. L’injection semble ouvrir des voies d’impédances rhéologiques faibles préférentielles nécessitant une adaptation anatomique aux voies qui seront la cible du traitement. / High grade gliomas are the most frequent primitive central nervous system tumor. The standard treatment is an association of surgery, radiotherapy and chemotherapy. The mains issues with these treatments are the infiltrative properties of the tumour in a highly functional parenchyma, the blood-brain barrier limiting the transvascular transport of chemotherapy and the inherent radioresistance of glioma cells.Upon different strategy to overpass the blood-brain barrier, a direct injection in the brain was advocated. In order to maximize this delivery, the concept of convection enhanced delivery was developed; it consists in a direct injection in the parenchyma with a low flow-rate.Bevacizumab is an anti-VEGF A antibody, VEGF is one of the most important angiogenic factors. The goal of this treatment is to inhibit the angiogenesis and slow down the tumor growth.We propose to study the use of this antibody in a direct intra-cerebral infusion.First, we focalize on the pharmacokinetic properties of an intratumoral injection by convection –enhanced delivery compared to a systemic administration. This shows an equivalent intratumoral concentration with systemic concentrations significantly lower with the intra-tumoral injection. An important result is the similar concentration in the controlateral hemisphere with the two routes of infusion. Convection-enhanced delivery is suitable to carry far from the infusion site high molecular weight proteins. An intra-tumoral bevacizumab may theoretically provide similar efficiency with less systemic side-effect.Then, the efficiency of an intra-tumoral infusion of bevacizumab is compared to a systemic injection on a mouse glioma model. In terms of survival the intra-tumoral treatment is significantly more efficient with an important decrease of angiogenesis and tumoral proliferation.If convection-enhanced delivery rodent study were promising, clinical trials failed to show any efficiency of intra-tumoral injection mainly due to inadequate delivery secondary to backflows and leakages. One of the limits of the rodent model is the absence of cortical sulci, main leakage provider. The development of a model anatomically relevant could simulate real conditions of injection and develop implantable device of injection in realistic conditions. We have developed the first induced model of glioma in a large animal. We choose the pig for the similarity of its brain anatomy and its size. The animals have been treated with ciclosporin to induce an immunosuppression, human glioma cells have been implanted, leading to the development of brain tumor.We have studied the pressure on the infusion line and correlate it to backflow and leakage. We have identified a pattern of pressure for successful infusion. Different pressure pattern have systematically led to backflow or leakage. These pressures criteria could permit to us an early detection of inadequate infusion to replace the catheter and avoid the failure of precedent clinical trials.Next step have been the intra-tumoral injection via an implanted device on pig glioma model. No infectious complication has been related with a good local and neurologic tolerance. The injections have led to a relevant diffusion through the tumor with a rapid flow to the periphery due to the interstitial pressure gradient between the tumor and the periphery.Last step of this work have been the anatomical study of a dye distribution by convection-enhanced delivery in a human encephalon. Indeed if pig brain is similar to human brain, human white matter structure is unique. This work is focalized on the diffusion from the corona-radiata to the main white matter tracts. The distribution is anisotropic following white matter but the diffusion is different depending on the position of the catheter. The infusion seems to open low rheological impedance paths the position of the catheter have to be adapted to the white matter tract to target.

Les gliomes diffus de bas grades sont des tumeurs qui affectent des régions fonctionnelles du cerveau chez des jeunes patients. Malgré leur faible taux de prolifération ces tumeurs peuvent dégénérer en des tumeurs plus agressives après leurs exérèses. Le gène IDH1 est très fréquemment muté dans les DLGG. Cette mutation confère à l’enzyme isocitratedeshydrogénase (IDH1) la propriété de produire du 2-OH-glutarate (2-HG) au lieu de l’α-cétoglutarate (α-KG). L’oncométabolite 2HG rentre alors en compétition avec l’α-KG pour les enzymes de déméthylation conduisant à une hyperméthylation de l’ADN et de l’histone H3 concourant à un blocage de la différenciation cellulaire. Mon projet de thèse consiste à la caractérisation des cellules tumorales et la compréhension des voies de signalisation impliquées dans la progression tumorale ainsi que l’identité du microenvironnement tumoral. Les récepteurs tyrosine kinase, PDGFRα et EGFR, sont abondamment exprimés par les cellules tumorales mais ne sont pas activés. En revanche, une forte phosphorylation de la protéine Erk p42/44 a été détectée dans les tumeurs. Cette phosphorylation a une double origine : les cellules tumorales et leur environnement. L’utilisation d’une série de marqueurs m’a permis de mieux définir l’état de différenciation des cellules tumorales et de mettre en évidence une préférence pour l’expression de Sox8 dans les oligodendrogliomes tandis que Sox9 est prédominant dans les astrocytomes. Dans une seconde partie, j’ai mis au point des méthodes pour la culture des gliomes diffus de bas grade et isolé cinq lignées de gliomes portant la mutation récurente IDH1 R132H. Récemment, la société Agios a identifié des inhibiteurs très spécifiques (notamment l’AGI-5198) de l’enzyme mutée IDH1 qui, utilisés dans un modèle de gliome murin, provoquent une déméthylation des histones H3K9me3 associées à une augmentation de l’expression de gènes de différenciation ainsi qu’à une réduction de la masse tumorale. A contrario, j’ai montré que l’AGI-5198 augmente la croissance cellulaire sur les lignée de patients, modifie la migration cellulaire ainsi que différentes voies de signalisation.Ces travaux apportent un nouvel éclairage sur le phénotype des cellules tumorales, leur diversité et les mécanismes moléculaires régissant leur prolifération. / Low grade gliomas are low proliferating tumors affecting functional regions of young patients. In most cases, they tend to transform into a more malignant state following surgery. These tumors carry a key mutation in isocitrate dehydrogenase (70-80% of DLGG). Gliomas with IDH1 mutation have improved prognosis compared togliomaswith wild type IDH1. IDH1 protein acquires the ability to convert α-Ketoglutarate (α-KG) to 2-OH-glutarate (2-HG). The new onco-metabolite can interfere with the normal function of α-KG, leading to a general hypermethylation of the genome, thus inducing a blockage of the cellular differentiation. Very good reviews on the molecular mechanisms underlying high grade glioma invasion already exist but little is known about the cellular and molecular mechanisms in diffuse low grade gliomas. To that end, I characterized the profile of IDH1 mutated cells in the different types of DLGG. I have demonstrated that the tyrosine kinase, PDGFRα and EGFR receptors are abundantly expressed by tumor cells eventhough they are not activated. In contrast, a strong phosphorylation of Erk p42 / 44 proteins was detected in these tumors. This phosphorylation has a dual origin: tumor cells and their environment. The use of a series of markers allowed me to better define the state of differentiation of cancerous cells and to demonstrate a preferential expression of Sox8 in oligodendrogliomas while Sox9 is predominant in astrocytomas. In a second time, I have developed a method for the culture of low-grade diffuse gliomas and isolated five cell lines carrying the recurrent mutation IDH1 R132H. Recently Agios has identified very specific inhibitors (particularly AGI-5198) of the mutated IDH1 enzyme which, used in a murine glioma model, contributed to the demethylation of H3K9me3 histones with an increased expression of differentiation related genes as well as a reduction of the tumor mass. On the contrary, I have shown that AGI-5198 increases cell growth of patient cell lines, modifies the cellular migration and various signaling pathways.These studies shed new light on the phenotype of tumor cells, their diversity and The molecular mechanisms governing their proliferation.

Glioblastome représente la tumeur la plus courante du cerveau primaire avec une survie de moins de 2 ans. Ces tumeurs sont très infiltrantes et angiogéniques et contiennent une sous population de cellules souches cancéreuses. Nkx2.2 est un homéodomaine facteur de transcription, impliqué dans la formation d'oligodendrocytes au cours du développement. Nkx2.2 joue un rôle central dans la tumorogenèse de Ewing'sarcoma. L'utilisation de la QPCR et de la matrice du tissu de gliome, nous a permis de mettre en évidence la forte expression de Nkx2 dans le glioblastome. Nkx2.2 a également été détecté dans 3 cultures de cellules de gliomes où il est co-exprimé avec des marqueurs de cellules souches tels que CD133 et CD15. Il a été récemment proposé que la surexpression de Nkx2.2 pourrait induire à la différenciation oligodendrocytaire de la cellule du gliome tige-comme et au blocage de la formation des tumeurs dans la xénotransplantation (Cancer Res fév 2011 1; 71 (3): 1135-1145). Pour explorer cette possibilité, nous avons utilisé des rétrovirus pour surexprimer Nkx2.2 dans nos cultures cellulaires. De manière surprenante, nous avons trouvé que Nkx2.2, induit la prolifération des cellules souches du gliome et n'a en conséquent aucun effet de différenciation. Microarray analyses a confirmé que la surexpression de Nkx2.2 n'a en effet aucune influence sur la différenciation des oligodendrocytes. Cette analyse a également révélé que Nkx2.2 était capable d'induire une forte expression de YKL-40 40 dans le surnageant des cellules souches du gliome. YKL-40 est en fait, une glycoprotéine sécrétée et impliquée dans l'inflammation, l'angiogenèse et la prolifération. Elle est souvent associée à un mauvais pronostic dans plusieurs types de cancers. En outre, nous avons effectué une transplantation orthotopique afin d'explorer le rôle de Nkx2.2 dans la gliomagenèse in vivo et avons constaté que Nkx2.2 ne réduit pas l'agressivité du glioblastome.Dans l'autre partie de ma thèse, nous avons utilisé la gamme Taqman à basse densité et la validation des miRNA par la Qpcr afin de chercher ces derniers dans la culture cellulaire du glioblastome humain. Nous avons ensuite étudié le rôle des miARN dans la transcription de 3'UTR de Nkx2.2. Les résultats d'analyse de la mutagénèse dirigée (SDM) et de la double-luciférase ont montré que l'expression de Nkx2.2 est régulée par la diminution de mir-133b ainsi que celle de mir-202. / Glioblastoma represent the most common primary brain tumor with an overall survival of less than 2 years. These tumors are highly infiltrative and angiogenic and contain a sub population of cancer stem cells. Nkx2.2 is a homeodomain transcription factor which is implicated in the formation of oligodendrocytes during development. Nkx2.2 is central in tumorogenesis of Ewing'sarcoma. Using QPCR and glioma tissue array, we found that Nkx2.2 is highly expressed in glioblastoma. Nkx2.2 was also detected in 3 glioma stem-like cell cultures (neurospheres) where it is co-expressed with stem cell markers such as CD133 and CD15. It was recently proposed that overexpression of Nkx2.2 could induce terminal oligodendrocytic differentiation of glioma stem-like cell and inhibit tumor formation in xenotransplantation (Cancer Res. 2011 Feb 1;71(3):1135-45).To explore this possibility further, we used retroviruses to overexpress Nkx2.2 in our cell cultures. Surprisingly, we found that Nkx2.2, induce glioma stem cell proliferation and had no oligodendrocyte differentiating effect. Microarray analyses confirmed that Nkx2.2 overexpression had no influence in oligodendrocyte differentiation. This analysis further revealed that Nkx2.2 was able to induce a strong expression of YKL40 protein in the supernatant of glioma stem cells and increase YKL-40 promoter activity. YKL-40 is a secreted glycoprotein which is involved in inflammation, angiogenesis and proliferation and which is often associated with a bad prognosis in several cancers. In addition, we performed orthotopic transplantation to explore the role of Nkx2.2 in gliomagenesis in vivo and found that Nkx2.2 did not reduce the aggressiveness of glioblastoma. In the other part of my thesis we used Taqman low-density arrays (TLDA) and individual miRNA QPCR validation to find the microRNA (miRNA) signature in human glioblastoma cell cultures. Then we investigated the role of miRNA in the 3'UTR of Nkx2.2 transcript. Site directed mutagenesis (SDM) and dual-Luciferase reporter assay results showed that the Nkx2.2 expression is downregulated by mir-133b and mir-202.