OBJETIVO: Determinar asociación entre la calidad del sueño y el control glicémico en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 del Hospital Vitarte desde junio hasta setiembre del 2016. MATERIAL Y METODOS: Estudio de tipo observacional, analítico, transversal, prospectivo. Se trabajó con 155 pacientes que acudieron a consulta por endocrinología y medicina interna en el Hospital Vitarte. La variable dependiente fue la calidad de sueño medido con la escala de Pittsburgh, y la independiente fue el control glicémico medido con el promedio de los dos últimos controles de glucosa de cada paciente. Se realizó la prueba de chi cuadrado usando un valor p significativo de menos de 0,05; asimismo, se obtuvieron los OR con sus respectivos intervalos de confianza al 95%. RESULTADOS: De los 155 encuestados, 52,9 % eran del sexo femenino. La prevalencia de mala calidad de sueño fue del 59%. Esa se asoció a control glicémico, edad, tiempo de enfermedad y comorbilidades como el EPOC, la HTA y la anemia. La frecuencia de adherencia al tratamiento fue del 49,68 %. CONCLUSION: El pobre control glicémico, la edad, el tiempo de enfermedad y la comorbilidad de HTA, EPOC y anemia son factores de riesgo para mala calidad de sueño en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 del Hospital Vitarte desde junio hasta setiembre del 2016. PALABRAS

D.L. A 455-2007

CICYT (BIO-093-0600-C04-03); Generalitat Valenciana (GV-1170/93)

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química. Ingeniera Civil en Biotecnología / La nutrición es un tema muy importante en la sociedad, ya que muchos alimentos consumidos por el ser humano difieren en su aporte nutricional, y se ve reflejado en aspectos físicos, fisiológicos y neurológicos. A partir de esto, se formuló la pregunta ¿cuáles son los efectos sistémicos de la dieta en C. elegans? Para responder a esta interrogante se utilizó como modelo de estudio biológico al nematodo bacterívoro Caenorhabditis elegans que, con una anatomía simple, posee 6 neuronas responsables de la respuesta al tacto. En el laboratorio, C elegans puede ser alimentado con una series de cepas y especies de bacterias. Alterando la dieta de C. elegans se puede afectar a un número de rasgos, incluyendo esperanza de vida, fecundidad y la tasa de bombeo faríngeo. El presente trabajo de investigación tuvo por objetivo evaluar la actividad in vivo de diferentes dietas bacterianas suplementadas con azúcares sobre el desarrollo, la fertilidad y la integridad neuronal del gusano. Para lograr lo anterior se utilizan dos mutantes de C. elegans: un modelo de degeneración neuronal (mec-4d), que corresponde a un gusano que lleva una mutación en el canal MEC-4, que se expresa sólo en las neuronas del tacto y es responsable de regular el ingreso de sodio. Esta mutación provoca que el canal se abra constitutivamente provocando la muerte progresiva en esas neuronas; y un modelo de C. elegans asociado a la vía de señalización de la insulina. En este mutante a 25°C se bloquea el receptor de insulina DAF-2/IGF-1 evitando las fosforilaciones y por tanto, permitiendo la entrada del factor de transcripción DAF-16/FOXO al núcleo incrementando la capacidad celular antioxidativa. Con los mutantes antes mencionados se hicieron ensayos de fecundidad, de crecimiento y para observar la morfología neuronal en presencia de bacterias con diferente calidad nutricional y de azúcares. Los resultados muestras que los azúcares no alteran los rasgos estudiados, ya que los efectos de las dietas en sí y las mutaciones en C. elegans tiene un impacto mayor que no se ve alterado por la presencia de monosacáridos. Por otro lado, se observa que el mutante mec-4d en presencia de dietas bacterianas de mejor calidad, la protección contra la degeneración neuronal es mayor, la tasa de desarrollo se ve acelerada y la fertilidad se ve favorecida con el aumento en la deposición de huevos. En cuanto al mutante daf-2(ts);mec-4d, se observa que la degeneración neuronal es casi completamente evitada, independiente de la calidad de la alimentación. Pero, la tasa de desarrollo no se ve influenciada, y la fertilidad se ve disminuida con esta mutación. Finalmente, C. elegans permitió estudiar con éxito los rasgos de historia de vida del nematodo influenciados por dietas bacterianas de diferente calidad nutricional. Sin embargo, es necesaria la identificación de los compuestos que hacen la diferencia.

Doctor en ciencias Biomédicas / Physical activity plays a protective role in the development of chronic non-communicable diseases. Molecular adaptations explain the beneficial effects of exercise in diverse tissues such as skeletal muscle, adipose tissue, and heart. One of the multiple signals involved in the benefits of exercise are the oxidation-reduction reactions called redox signaling. Reversible and non-reversible posttranslational modifications of cysteine residues are capable of changing the function, localization, or stability of diverse proteins. In skeletal muscle, reactive oxygen species (ROS) are continuously produced and cleared during resting and contracting conditions. There is substantial evidence indicating that redox signaling plays a role in some of the health-benefits elicited by endurance training, however, the precise mechanism has been long unknown. The aim of the current Ph.D. thesis was therefore to study the involvement of NOX2 and redox signals in the regulation of exercise-stimulated glucose transport and adaptive gene expression in mature skeletal muscle. A combination of pharmacological inhibitors and murine NOX2-deficient models were used to address the necessity of NOX2 for glucose transport and adaptive signals induced by acute exercise. The current Ph.D. thesis demonstrated for the first time that NOX2 is activated during moderateintensity endurance exercise in skeletal muscle and it is a major source of ROS under those conditions. Furthermore, the analyses of genetic mouse models lacking the regulatory NOX2 subunits p47phox and Rac1 revealed striking phenotypic similarities, including severely impaired exercise-stimulated glucose uptake and GLUT4 translocation, indicating that NOX2 is a requirement for this classic acute myocellular adaptation to exercise. Overall, NOX2 is thus a major ROS source regulating adaptive responses to exercise in skeletal muscle. / La actividad física juega un papel protector en el desarrollo de enfermedades crónicas no transmisibles. Las respuestas moleculares explican los efectos beneficiosos del ejercicio en diversos tejidos como el músculo esquelético, el tejido adiposo y el corazón. Una de las múltiples señales involucradas en los beneficios del ejercicio son las reacciones de oxidación-reducción llamadas señalización redox. Las modificaciones postraduccionales reversibles e irreversibles de residuos de cisteína son capaces de cambiar la función, localización o estabilidad de diversas proteínas. En el músculo esquelético, las especies de oxígeno reactivo (ROS) se producen y eliminan continuamente durante las condiciones de reposo y contracción. Existe evidencia sustancial que indica que la señalización redox juega un papel en algunos de los beneficios para la salud provocados por el entrenamiento de resistencia, sin embargo, el mecanismo preciso ha sido desconocido durante mucho tiempo. El objetivo de la presente la tesis fue estudiar la participación de NOX2 en la regulación del transporte de glucosa durante el ejercicio y la expresión de genes adaptativos en el músculo esquelético adulto. Se utilizó una combinación de inhibidores farmacológicos y modelos deficientes en NOX2 ratón para abordar la necesidad de NOX2 para el transporte de glucosa y las señales adaptativas inducidas por el ejercicio agudo. Esta tesis demostró por primera vez que el NOX2 se activa durante el ejercicio de resistencia de intensidad moderada en el músculo esquelético y es una fuente importante de ROS en esa condición. Además, los análisis de modelos de ratones genéticos que carecen de las subunidades reguladoras NOX2 p47phox y Rac1 revelaron sorprendentes similitudes fenotípicas, incluida la captación de glucosa estimulada por el ejercicio y la translocación de GLUT4, lo que indica que NOX2 necesaria para esta respuesta fisiológica durante el ejercicio. En resumen, NOX2 es, por lo tanto, una importante fuente de ROS que regula las respuestas de adaptación al ejercicio en el músculo esquelético. / 22/03/2020

OBJETIVOS: La diabetes gestacional (DG) es una entidad que se ha relacionado con un mayor riesgo de complicaciones gestacionales. Los objetivos de este estudio fueron: 1) determinar el impacto de la hiperglucemia leve, 2) evaluar las asociaciones entre las complicaciones gestacionales y el grado de tolerancia a la glucosa, obesidad maternal pregestacional, 3) conocer cuál es el rol del sexo fetal en el desarrollo del propio feto en relación a la presencia de DG y obesidad materna pregestacional, y 4)conocer la prevalencia de la DG según los diferentes criterios diagnósticos (criterios de la National Diabetes Data Group y de la Asociación Americana de Diabetes). MÉTODOS: Estudio poblacional prospectivo multicéntrico, que incluyó 9.270 mujeres gestantes con feto único y sin diabetes pregestacional conocida que dio lugar a 4.793 recién nacidos de sexo masculino y 4.477 de sexo femenino. Las mujeres fueron categorizadas según el grado de tolerancia a la glucosa y según IMC pregestacional. Se evaluó el riesgo de macrosomía, tasa de cesáreas y de otras 7 complicaciones gestacionales, mediante modelos de regresión logística múltiple y se calculó el riesgo atribuible en la población. RESULTADOS-CONCLUSIONES: 1) Las mujeres con hiperglucemia leve presentaron una asociación con la presencia de complicaciones similar al grupo control, por lo que no se aconseja un cambio en los criterios diagnósticos. 2) En términos de riesgo absoluto y en términos de freceuncia del riesgo atribuible en la población la contribución de la hiperglucemia leve en las complicaciones gestacionales fue inferior a la presentada por la obesidad materna. 3) Se demostró un dimorfismo sexual en la frecuencia de las complicaciones gestacionales. La presencia de DG sólo se relacionó con morbilidad fetal exclusivamente en el sexo masculino. 4) La prevalencia de DG fue del 8,8% con los criterios NDDG y del 11,6% con los criterios de Carpenter y Coustan (incremento relativo del 31.8%). / OBJECTIVE: Gestational diabetes mellitus (GDM) increases the risk of adverse complications for both mother and child during pregnancy. The objectives of this study were: 1) To evaluate the potential impact of mild hyperglycemia on GDM outcomes; 2) To evaluate the associations among adverse gestational outcomes and glucose tolerance status and maternal obesity; 3) To elucidate whether the adverse gestational outcomes is influenced by maternal obesity and abnormal glucose tolerance differently in male and female fetuses. 4) To know GDM prevalence according to the different diagnostic criteria (National Diabetes Data Group and American Diabetes Association criteria). Methods: A population study in 16 general hospitals from the Spanish National Health Service -that included 9,270 consecutive women with singleton pregnancies and without a former diagnosis of diabetes mellitus delivering 4,793 male and 4,477 female newborns- was conducted. Women were categorized according to glucose tolerance status and pregestational body mass index (BMI). Fetal macrosomia, caesarean section and seven secondary outcomes were evaluated. Logistic regression analyses were performed to predict the effect of maternal BMI category and glucose tolerance on gestational outcomes. The population-attributable fractions (PAf) of predictor variables were also calculated. RESULTS/CONCLUSIONS: 1) The contribution of mild hyperglycemia to adverse GDM outcomes was not significantly different to that of control group. Therefore a change in diagnostic criteria was not warranted in our setting. 2) Pregestational maternal BMI (both the absolute risk and PAf) exhibited a much stronger influence on macrosomia, Caesarean section, pregnancy-induced hypertension and large-for-gestational-age newborns than glucose tolerance status. 3) There was a sexual dimorphism in the risk of abnormal birth weight attributed to maternal glucose tolerance status. A closer surveillance of fetal growth might be warranted in pregnant women with abnormal glucose tolerance carrying a male fetus. 4) Of 9,270 pregnant women screened for GDM, 819 (8.8%) met National Diabetes Data Group criteria. If the threshold for defining GDM had been lowered to ADA criteria, an additional 2.8% of women would have been defined as having the condition (relative increase of 31.8%).

En el presente trabajo se estudiaron, en perras en ayuno, los efectos de la diabetes mellitus espontánea y/o del ciclo sexual sobre el comportamiento de los niveles de glucemia, insulinemia, glicerolemia, trigliceridemia y ácidos grasos no esterificados séricos, basalmente y durante las pruebas endovenosas de glucosa e insulina. También se estudiaron la colesterolemia y la concentración de lípidos totales séricos, en esos animales. Dichas variables no se afectaron por el ciclo y hubo hiperlipemia e hipercolesterolemia en las diabéticas. En las perras normales, durante la prueba de glucosa, la hiperglucemia fue apenas mayor en el anestro; no se observó hiperinsulinemia en dicha fase, pero sí durante el ciclo, siendo más intensa en la fase estrogénica; en el anestro hubo un descenso en el nivel de ácidos grasos no esterificados séricos que no se modificó con el ciclo; se observó hipertrigliceridemia e hiperglicerolemia durante la prueba en las tres condiciones sexuales. Durante la prueba de insulina la hipoglucemia e hiperinsilunemia fue similar en las tres fases no hubo cambios en el nivel de ácidos grasos no esterificados y sí una moderada hiperglicerolnemia durante el ciclo sexual; en el anestro se detectó hipertrigliceridemia e hiperglicerolemia durante la prueba, que se mantuvieron en el ciclo. En las perras diabéticas todas las variables se agravaron, basalmente o en el curso de las pruebas mencionadas, en distinto grado y con empeoramiento de los signos especialrmente durante el ciclo. / The action of spontaneous Diabetes Mellitus and/or estrous cycle on glycemia, insulinemia, triglyceridemia, glycerolemia and plasma nonesterified fatty acid levels, in the course of intravenous glucose and insuline tests, in normal and diabetic bitches was studied. Both basal cholesterolemia and plasma lipid concentrations in the normal and diabetic female dogs were evaluated. Both variables were not affected by the cycle, but increased in diabetes. Normal bitches during intraveneus glucose tolerance test showed a higher glycemia in anestrous than the cycle (estrogenic and luteal phases). There was not hyperinsulinemia in anestrous, but there was during the cycle, more intense during the estrogenic phace. Plasma nonesterified fatty acid levels were decreased. Hypertriglyceridemia and hiperglycerolemia were present in every aspect of the cycle. In every phase during insulin test showed that hypoglycemia and hyperinsulinemia were similar. There was no change in plasma nonsterified fatty acid levels and a moderated hyperglicerolemia during the cycle was detected. During anestrous hypertriglyceridemia was observed which continued throughout the whole estrous cycle. In diabetc dogs all the measurements changes to a variable extent showing deterioration of the clinical signs, particularly during the estrous cycle.

Actualmente las proteasas alcalinas son ampliamente utilizadas en la industria del cuero, en distintas formulaciones de detergentes, también en el proceso de recuperación de plata, y en la producción de hidrolizados de proteínas. Comúnmente, todas estas proteasas se obtienen de fuentes microbianas que crecen en sustrato relativamente caros. Muchos estudios demuestran que cerca del 40% del costo de producción de estas enzimas está relacionada con la composición del medio de cultivo. Para reducir el costo de producción es importante la búsqueda de microorganismos capaces de crecer y de producir suficiente cantidad de la enzima usando sustratos baratos. En este sentido desechos de naturaleza queratínica tienen un enorme potencial para ser utilizacos como sustrato para la producción de un grupo de enzimas proteolíticas llamado queratinasas, las cuales presentan la capacidad de hidrolizar la queratina, proteína sumamente resistente a la degradación por su estructura y por la presencia en su molécula de puentes disulfuro. En el presente trabajo de tesis seis cepas de hongos no patógenos aislados de suelos alcalinos de la provincia de Buenos Aires, Argentina, (Acremonium murorum, Aspergillus sidowii, Cladosporium cladosporioides, Neurospora tetrasperma, Purpureocillium lilacinum (ex Paecilomyces lilacinus) y Westerdikella dispersa) fueron evaluados de acuerdo a su capacidad de producir enzimas queratinolíticas. Entre estas cepas, P. lilacinum resultó ser el hongo con mayor producción de actividad proteolítica y queratinolítica, tanto en fermentación en sustrato solido como en sumergido, siendo seleccionado para continuar con este trabajo. Se establecieron las condiciones óptimas de cultivo para la producción enzimática utilizando diseños experimentales y la metodología de superficie de respuesta. Las condiciones óptimas fueron: 7,10 g/l de glucosa; 0.0065 mg/l de CaCl<SUB>2</SUB> y pH inicial de 5.60; en estas condiciones de cultivo, el rendimiento máximo para la producción de queratinasas predijo por el modelo fue de 26,7 U azo/ml. La validación del modelo demostró que, tanto el polinomio como las correspondientes superficies de respuesta obtenidas describen adecuadamente la influencia de la concentración de glucosa, de calcio y el pH inicial en la producción de queratinasas. Luego de la optimización del medio de cultivo se procedió a la purificación de la enzima, las etapas involucradas en la purificación fueron la precipitación con sulfato de amonio y distintas técnicas cromatográficas de intercambio iónico y permeación en gel, con un factor de purificación de 19.8 veces y una actividad específica de 1430 U/mg de proteína. El peso molecular de la enzima, determinado por SDS-PAGE, fue de 37 kDa. La queratinasa extracelular de P. lilacinum se caracteriza por su apreciable estabilidad en un amplio intervalo de pH (4.0 a 9.0), y hasta 65°C. La inhibición que presenta frente a PMSF (98,2% de la inhibición) sugiere su naturaleza serínica. La enzima es activa y estable en presencia de solventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, metanol, e isopropanol; ciertos tensioactivos como Triton X-100, dodecilsulfato de sodio, y Tween 85, y agentes oxidante como el peróxido de hidrógeno. Sus parámetros cinéticos de inactivación térmica fueron estimados bajo diferentes condiciones y fue posible observar cómo afectan calcio, el glicerol y el propilenglicol a la estabilidad térmica de la enzima. Se investigó la inmovilización covalente de la queratinasa pura sobre un soporte de quitosán, optimizando la concentración de los agentes entrecruzantes glutaraldehído y genipina, así como también el tiempo de activación. La enzima inmovilizada presentó mayor estabilidad frente a pH y temperaturas extremas en comparación con la enzima libre, además retiene 61.37 % de la actividad enzimática inicial después de cinco ciclos de hidrolisis. Se estudiaron las potenciales aplicaciones biotecnológicas del extracto enzimático, entre ellas se estudió por su compatibilidad y estabilidad frente a detergentes comerciales (7 mg/ml) como Ariel y Skip, observándose que éste retiene más de 70 % de su actividad proteolítica inicial después de 1 h de incubación a 40ºC. La simulación de lavado reveló que el extracto era capaz de eliminar eficazmente las manchas de sangre. Se estudió también la posibilidad de utilizar este extracto enzimático en la recuperación de plata a partir de placas radiográficas usadas. En dosis de enzima de 6,9 U azoc/ml y a 60ºC, la eliminación completa de la capa de gelatina con la liberación completa de las partículas de plata se alcanzó en 6 min a pH 9.0. Por último, P. lilacinum además de producir enzimas queratinolíticas con la producción de paralela de amonio, mostró la capacidad producir sideróforos y ácido indolacético (IAA) al crecer con residuo pelo como sustrato en presencia de Trp y baja concentración de hierro. Se realizaron ensayos a nivel de invernadero con plantas de tomate, encontrándose que, en términos de peso seco, el hidrolizado mostró un efecto similar al del fertilizante de referencia. Además, el hidrolizado demostró poseer actividad antifúngica contra varios patógenos de las plantas. Estos resultados indican el potencial biotecnológico tanto del extracto enzimático como el de la enzima pura de P. lilacinum siendo interesante además la capacidad del hongo de producir esta enzima utilizando un como sustrato un residuo de valor nulo, con lo cual sería de esperar que su costo de producción resulte relativamente bajo.

En aquest treball s'ha posat a punt el protocol per a l'obtenció d'adipòcits aïllats de truita irisada (Oncorhynchus mykiss) i d'orada (Sparus aurata). Les preparacions obtingudes van mostrar una viabilitat adequada que va permetre l'estudi de la lipòlisi i la captació de glucosa. La lipòlisi, mesurada com l'alliberació de glicerol en el medi va augmentar proporcionalment amb el temps d'incubació i la concentració cel.lular. El següent objectiu fou estudiar la regulació nutricional i el paper de la insulina i el glucagó sobre la lipòlisi dels adipòcits per amdues espècies. A més, en el cas de l'orada es va analitzar el paper de l'hormona de creixement i l'efecte de dietes amb proteïnes de diferent origen. En la truita irisada, la insulina va disminuïr la lipòlisi dels adipòcits mentre que el glucagó fou lipolític. A més, el dejuni acompanyat d'una hipoinsulinemia, així com la injecció de glucagó van incrementar la lipòlisi mesurada en adipòcits. De forma similar, la lipòlisi dels adipòcits d'orades dejunades fou superior a la dels adipòcits d'orades alimentades. En aquesta espècie, el glucagó i l'hormona de creixement van estimular la lipòlisi mentre que la insulina no va tenir cap efecte. Finalment, els adipòcits d'orades alimentades amb una dieta amb proteïna 100% d'origen vegetal van mostrar una lipòlisi més elevada que la dels adipòcits d'orades alimentades amb una dieta amb proteïna majoritàriament procedent de farina de peix. El següent objectiu fou analitzar el paper del factor de necrosi tumoral alfa (TNF-alfa) sobre la lipòlisi d'adipòcits de truita irisada. El TNF-alfa&#61472;va estimular la lipòlisi de forma dosi i temps depenent. L'efecte estimulador fou parcialment bloquejat utilitzant inhibidors de les MAP-quinases: MEK1/2 i p38 suggerint una implicació d'aquestes vies de senyalització. A més, adipòcits incubats amb medis de macròfags de truita irisada estimulats amb lipopolisacàrid (LPS) presentaren una lipòlisi més elevada que la d'adipòcits incubats amb medis condicionats control. Finalment, l'adminstració in vivo de LPS va provocar un augment de la lipòlisi en els adipòcits incubats 24 hores després de la injecció. En aquest temps, el LPS va inhibir significativament l'activitat lipoproteïna lipasa (LPL) en el teixit adipós. La segona part d'aquest treball es va concentrar en l'estudi de la regulació nutricional i el paper de la insulina en l'activitat lipoproteïna lipasa en la truita irisida i l'orada. En la truita irisada, l'activitat LPL va augmentar després de la ingesta en el teixit adipós però no en el múscul. D'altrabanda, el dejuni va produïr, en ambdues espècies, una disminució de l'activitat LPL en el teixit adipòs mentre que l'activitat no va variar en el múscul vermell. L'adminstració in vivo d'insulina va estimular l'activitat LPL en el teixit adipós a les 3 hores tant en truita irisada com en orada. En aquesta espècie, el canvi observat en l'activitat fou acompanyat per un augment dels nivells d'ARN missatger, tot i que aquest efecte no fou significatiu fins les 18 hores. En truita irisada, els estudis in vitro, amb trossos de teixit adipós, van mostrar com la insulina augmentava la proporció d'enzim LPL extracel.lular actiu. Finalment, es va establir la metodologia per a l'estudi de la captació de glucosa en adipòcits aïllats de truita irisada. La captació de 2-deoxiglucosa va augmentar amb la concentració cel.lular i amb el temps d'incubació. El transport fou inhibible per citocalasina B, indicant que la captació es dóna a través de transportadors de glucosa de difusió facilitada. La insulina i especialment el factor de creixement tipus insulina van estimular la captació de glucosa. Aquest efecte estimulador de la insulina fou totalment bloquejat per la wortmanina suggerint que la via de la PI3K/Akt és la principal via de senyalització implicada. / In the present work, we have established the conditions for obtaining adipocytes of rainbow trout ("Oncorhynchus mykiss") and gilthead seabream ("Sparus aurata"). Lipolysis increased proportionally with cell concentration and incubation time. In rainbow trout, insulin decreased lipolysis while glucagon was lipolytic. Moreover, in both species, fasting and an "in vivo" injection of glucagon in rainbow trout increased lipolysis measured in adipocytes. In gilthead seabream, glucagon, growth hormone and diets rich in vegetal proteins were lipolytic. The next objective was to analyse the role of tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) on lipolysis of rainbow trout adipocytes. TNF-alpha&#61472;increased lipolysis in a dose and time dependent manner. Adipocytes incubated with supernatants of rainbow trout macrophages stimulated with lipopolisacarid (LPS) showed a higher lipolysis. The stimulatory effect of TNF-alpha was partially blocked using inhibitors of MEK1/2 and p38. Finally, adipocytes from LPS-injected rainbow trout showed higher lipolysis while lipoprotein lipase (LPL) activity in adipose tissue of LPS-injected fish was lower. The second part of this work was focused on the study of the regulation of lipoprotein lipase activity. In rainbow trout, LPL activity in adipose tissue increased in response to feeding, while in both species, fasting produced a down-regulation of LPL activity in adipose tissue, concomitant with low levels of insulin. Insulin administered "in vivo" produced an increase in LPL activity in adipose tissue in both species. In gilthead seabream, this increase in activity was acompanied by an increase in LPL mRNA while in vitro studies in rainbow trout, using fat pads, revealed that insulin stimulated the proportion of LPL in active conformation at extracellular level. Finally, we established the protocol for measuring glucose uptake in isolated adipocytes of rainbow trout. Glucose uptake increased with cell concentration and incubation time. Cytochalasin B inhibited glucose transport suggesting that glucose uptake is carried out by specific facilitative glucose transporters. Insulin and insulin growth factor-I stimulated glucose uptake in isolated adipocytes. This stimulatory effect of insulin was totally blocked by wortmanin suggesting that PI3K/Akt is the main intracellular signalling mechanism involved.

Els transportadors de glucosa de difusió facilitada (GLUTs) són proteïnes essencials per permetre l'entrada de glucosa dins la cèl·lula. Concretament, el GLUT4 s'ha descrit com la isoforma més important per al manteniment de la glucèmia, ja que és el mediador de l'acció de la insulina per incrementar la taxa de captació de glucosa. Fins ara en peixos només s'han identificat quatre isoformes de GLUTs, i entre elles hi destaca el GLUT4, el qual va ser clonat per primera vegada en truita comuna ("Salmo trutta"). A l'inici d'aquesta tesi ja existien algunes evidències sobre la regulació de la insulina sobre l'expressió d'aquest transportador in vivo. No obstant, es desconeixia si l'acció de la insulina era un efecte directe sobre el teixit muscular o bé actuava a través d'altres mediadors. Per altra banda, tampoc es coneixia l'acció de la insulina sobre la proteïna GLUT4 de truita. Per tant, en aquesta tesi hem intentat resoldre aquestes qüestions per poder contribuir a un millor coneixement d'un dels elements importants que intervé en el metabolisme dels carbohidrats en els peixos teleostis.En aquest estudi es va demostrar que els nivells d'insulina circulants són capaços de modular el contingut de proteïna GLUT4 in vivo en el múscul esquelètic de truita i que aquesta regulació és específica del tipus de fibra muscular. També es va demostrar que els efectes de la insulina sobre l'expressió de GLUT4 en el múscul esquelètic de truita són deguts a l'acció directa d'aquesta sobre les cèl·lules musculars. L'expressió basal de GLUT4 augmenta al llarg de la diferenciació de les cèl·lules musculars de truita i, paral·lelament, també augmenta lleugerament l'expressió de GLUT1. La insulina i l'IGF-I estimulen l'expressió de GLUT4 i els seus efectes són més evidents en miotubs. La insulina, en general, promou l'acumulació d'ARN missatger de GLUT1 en les cèl·lules musculars de truita. Per altra banda, l'IGF-I augmenta l'expressió de GLUT1 en mioblasts.En aquesta tesi també es va estudiar la regulació del tràfic del GLUT4 de truita per la insulina en cèl·lules musculars L6. Amb aquest objectiu es va generar una línia estable de cèl·lules L6 que expressaven el GLUT4 de truita amb un epítop myc a la seva porció extracel·lular (btGLUT4myc). La insulina va estimular l'aparició del btGLUT4myc a la membrana plasmàtica, augmentant així la captació de glucosa en aquestes cèl·lules. No obstant, en estat basal un major percentatge de btGLUT4myc estava ja present a la superfície cel·lular comparat amb el GLUT4myc de rata. Els experiments d'internalització de GLUT4myc van demostrar que l'endocitosi del btGLUT4myc és més lenta que la del GLUT4myc de rata. Per tant, aquests resultats suggereixen que les diferències observades entre el tràfic del GLUT4 de truita i el GLUT4 de rata poden ser degudes a diferències en alguns motius aminoacídics dels quals en mamífers s'ha demostrat que participen en la internalització i la retenció intracel·lular del transportador en estat basal. També s'ha vist que la insulina estimula la translocació de btGLUT4 en les cèl·lules musculars de truita i com a conseqüència augmenta el transport de glucosa en aquestes cèl·lules. Per altra banda, els estudis d'immunofluorescència van demostrar que en estat basal el btGLUT4 es troba a l'interior de les cèl·lules de truita i concentrat a la regió perinuclear, tal i com s'ha descrit prèviament en mamífers.En conjunt podem concloure que els mecanismes de regulació de la insulina sobre el GLUT4 en el múscul esquelètic ja existeixen en els vertebrats inferiors, malgrat que presenten algunes diferències respecte als mamífers. Així, podem veure que al llarg de l'evolució s'ha perfeccionat la regulació de la captació de glucosa fins arribar a ser un mecanisme eficient que permet una recuperació ràpida de la glucèmia. / In the present work, we demostrated that insulin plasma levels may modulate GLUT4 protein content in vivo in trout skeletal muscle, but in a fiber-type dependent manner. Furthermore, insulin stimulates GLUT4 gene expression in trout skeletal muscle by acting directly on muscle cells. Basal GLUT4 expression increases throughout differentiation of muscle cells, as well as GLUT1 expression. Insulin and IGF-I increase GLUT4 mRNA levels, but their effects are more pronounced in fully differentiated myotubes. Insulin promotes mRNA accumulation in trout muscle cells. IGF-I increases GLUT1 expression in myoblasts.We also studied the regulation of trout GLUT4 traffic by insulin in L6 muscle cells. To address this issue we generated a stable cell line of L6 cells that express the myc-tagged trout GLUT4 (btGLUT4myc). Insulin stimulates btGLUT4myc translocation to the plasma membrane, resulting in an enhanced glucose uptake in these cells. However, in the basal state a higher percentage of btGLUT4myc is already present at the cell surface compared to rat-GLUT4myc. Internalization experiments of GLUT4myc demonstrated that btGLUT4myc endocytosis is slower than that of rat-GLUT4myc. Therefore, these data suggest that these differences between mammalian and fish GLUT4 in terms of traffic could be related to differences in the sequence of certain protein motifs shown to be important for internalization and intracellular retention of GLUT4. Moreover, insulin also stimulates the translocation of endogenous GLUT4 in trout muscle cells leading to an increased glucose transport activity in these cells. On the other hand, immunofluorescence experiments revealed that under basal conditions btGLUT4 is located in the cytoplasm of trout muscle cells and concentrated in the perinuclear region.Overall, we may conclude that the mechanisms of insulin regulation on GLUT4 in skeletal muscle already exist in lower vertebrates, although they present some differences compared to mammals. Thus, glucose transport regulation has been improved through evolution to become an efficient mechanism that allows a rapid recovery of glycaemia.