Les procédés de bioraffinerie, et notamment les agrocarburants, sont aujourd'hui reconnus comme essentiels pour sortir de l'économie actuelle basée sur le pétrole. Dans le cas du bioéthanol produit à partir de biomasse lignocellulosique, l'hydrolyse enzymatique par les enzymes de Trichoderma reesei est le principal point faible du procédé et doit être améliorée. Ces travaux de thèse s'intègrent dans le cadre du projet Futurol, et ont pour objectif d'identifier de nouvelles enzymes capables d'améliorer l'activité de T. reesei sur la lignocellulose. Une analyse post-génomique réalisée sur les secrétomes de vingt souches fongiques s'est révélée particulièrement prometteuse pour l'identification d'enzymes lignocellulolytiques d'intérêt. Une approche de génomique comparative a également abouti à la sélection de deux endo-mannanases de famille GH5 et GH26 chez le champignon Podospora anserina. Ces hémicellulases ont permis d'améliorer significativement la libération de glucose par T. reesei à partir d'épicéa. Une étude fondamentale approfondie a permis de résoudre les structures cristallographiques et de mettre en évidence les relations entre les spécificités enzymatiques de chaque enzyme et leurs caractéristiques structurales. La structure tridimensionnelle de la mannanase GH26 couplée à son CBM35 présente un linker court et rigide et une organisation du site actif atypique. Les deux mannanases ont également fait l'objet d'un travail d'ingénierie aléatoire qui a abouti à des variants des deux enzymes présentant une amélioration de l'efficacité catalytique et/ou une modification de spécificité. / Biorefineries such as biofuels are nowadays considered as essential to reduce our dependence on oil products. In the production process of bioethanol from lignocellulosic biomass, enzymatic hydrolysis performed by Trichoderma reesei enzymes is the main bottleneck of the process and requires improvements.The present work is part of the Futurol project, and aims at identifying new enzymes to improve the activity of T. reesei toward lignocellulose. Post-genomic analyses on twenty fungal strains have revealed the potential of this approach to identify lignocellulolytic enzymes of interest. Comparative genomics also led to the selection of two endo-mannanases from families GH5 and GH26 from the fungus Podospora anserina. These hemicellulases significantly improved glucose release upon T. reesei hydrolysis of spruce. An in-depth fondamental study allowed the solving of cristallographic structures and revealed the relationships between enzymatic specificities and structural characteristics. The structure of GH26 catalytic module appended to CBM35 highlighted a short and rigid linker and an atypical active site organization. The two mannanases were subjected to molecular engineering. Variants displaying improved catalytic efficiency and/or modified specificity were identified for both enzymes.

Antraciclinas estão entre os mais eficazes quimioterápicos contra o cancer. São fármacos glycosídicos compostos pelo carboidrato daunosamina ligado a uma aglicona hidróxi antraquinona, e atuam por intercalação ao DNA, geração de estresse oxidative e envenenamento de topoisomerase II. Apesar de sua utilidade terapêutica, multirresistência e cardiotoxicidade grave são importantes limitações decorrentes do tratamento com antraciclinas, estimulando a descoberta de novos análogos, por exemplo através de glicodiversificação. Este trabalho objetivou explorar azido glicosídeos, a serem combinados com agliconas de antraciclinas para gerar novos glicosídeos. Em uma estratégia semi-sintética, daunorrubicinona e doxorrubicinona protegida foram glicosiladas com doadores 2-azido glucosídicos e -galactosídicos, além de glicais. Uma varredura de metodologias de glicosilação envolveu cloretos, imidatos e tioglicosídeos, sendo os promotores com melhores rendimentos HgO/HgBr2 (4-52%) e TMSOTf (38-41%); para glucais e galactais, catalisadores de Au(I) and Cu(I) forneceram moderados rendimentos (15-46%), mas o sistema mais eficiente foi o organocatalisador de tiouréia e ácido fosfórico (18-95%). A clivagem dos grupos de proteção foi desafiadora, dificultando e atrasando a obtenção dos glicosídeos livres. Mediante desproteção, os glicosídeos obtidos incluíram glucosídeo 49 (13%), 2-azido glucosídeo 51 (34%), 2-desóxi glucosídeo 58 (11%) e 2-desóxi galactosídeo 61 (85%), todos com o esqueleto de daunorrubicina. Em ensaios de proliferação celular, os glicosídeos 61? e 61? foram testados em linhagens de células tumorais humanas HeLa, MDA-MB-231 e MCF-7 e um modelo de células sadias (HDF), com IC50 na faixa de 27.1 a 74.6 ?M para o anômero ?, e superior a 250 ?M para o anômero ?. Estudos preliminares com cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco induzidas foram inconclusivos para estabelecer um modelo experimental de toxicidade cardíaca. / Anthracyclines are ranked among the most effective chemotherapeutics against cancer. They are glycoside drugs comprised by the aminosugar daunosamine linked to a hydroxyanthraquinone aglycone, and act by DNA-intercalation, oxidative stress generation and topoisomerase II poisoning. Regardless of their therapeutic value, multidrug resistance and severe cardiotoxicity are important limitations arising from anthracycline treatment, prompting the discovery of novel analogues, for instance through glycodiversification. This work aimed to exploit azido glycosides, to be combined with anthracycline aglycone and generate novel glycosides. In a semi-synthesis approach, both daunorubicinone and protected doxorubicinone were glycosylated with conveniently functionalised 2-azido glucosyl and galactosyl donors, as well as glycals. A screening of glycosylation protocols involved glycosyl chlorides, imidates and thioglycosides with the most successful promoters being HgO/HgBr2 (4-52% yield) and TMSOTf (38-41%); for glucals and galactals, Au(I) and Cu(I) catalysts gave moderate yields (15-46%), but thiourea-phosphoric acid was the most efficient catalyst system (18-95%). Cleavage of protecting groups proved challenging, hampering and delaying the obtention of free glycosides. Upon deprotection, the glycosides obtained included glucoside 49 (13%), 2-azido glucoside 51 (34%), 2-deoxyglucoside 58 (11%), and 2-deoxygalactoside 61 (85%), all with the daunorubicin scaffold. In cell proliferation assays, glycosides 61? and 61? were tested against human cancer cell lines HeLa, MDA-MB-231 and MCF-7 and a model of healthy cells (HDF), with IC50 in the range of 27.1 to 74.6 ?M for the ? anomer, and higher than 250 ?M for the ? anomer. Preliminary studies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells were inconclusive to establish a cardiac toxicity experimental model.

No tubo digestivo das larvas de Anastrepha fraterculus e Anastrepha pickeli há β-glicosidases capazes de clivar dissacarideos, β-glicosídeos tóxicos produzidos por plantas e substratos sintéticos. As β-glicosidases de A. fraterculus são pouco ativas e as de A. pickeli são bastante ativas sobre alguns compostos, entre eles linamarina, um glicosídeo cianogênico. Esse composto está presente, em altas concentrações, no fruto da mandioca do qual a larva se alimenta. A. fraterculus alimenta-se do fruto da goiaba e aparentemente consegue o carboidrato que necessita por ação de α-glicosidases, que são bem mais ativas do que as β. O fruto da mandioca não é tão nutritivo e A. pickeli deve aproveitar a glicose da linamarina para obter energia e consegue desintoxicar-se do aglicone tóxico. Rhynchosciara americana apresenta quatro β-glicosidases nas membranas microvilares intestinais, sendo três delas β-galactosidases. Dessas, duas são ativadas por Triton X-100 sendo que a glicosidase, de maior mobilidade eletroforética é ativada por este composto, com uma Ka de 4µM, um α de 0,5 e um β de 2. β-tioglicosidases foram demonstradas em afideos. Nós verificamos que ocorre a clivagem do tioglicosídeo sinigrina após separação das β-glicosidases digestivas do Lepidoptera Diatraea saccharalis por cromatografia hidrofóbica. Nesse inseto, a mesma enzima é capaz de clivar O- e S-glicosídeos com atividades semelhantes. Enzimas com essas características nunca foram descritas anteriormente. Esses experimentos ilustram a viabilidade das adaptações dos insetos na utilização de compostos formados for ligações β-glicosídicas, viabilizando a exploração de nutrientes normalmente inacessíveis a outros animais. / Anastrepha fraterculus and Anastrepha pickeli have in their midguts 13-glycosidases able to hydrolase dissaccharides, synthetic substrate and plant toxic β-glucosides. β-glycosidases from A. fraterculus have low activity and the enzymes from A. pickeli may be highly active depending on the substrate used. Linamarin, a cyanogenic β-glucoside present in A. pickeli food (Manihot fruit) is easly hydrolysed by A. pickeli β-glycosidases (A. fraterculus eats on guava fruits and may obtain carbohydrate through the action of α-glycosidases, that are much more active them the β-glycosidases). A. pickeli probably uses glucose derived from linamarinan avoiding the effects of the toxic aglycon. Rhynchosciara americana has 4 β-glycosidases (3 galactosidases and I glucosidase) in their intestinal microvilar membranes. Two of these enzymes are activated by Triton X-100. In β glucosidase the activation has Ka= 4µM, α=0,5 e β=2. β-thioglycosidases occur in Aphids. One digestive β-glucosidase from Diatraea saccharalis resolved by hydrofobic chrornatography hydrolyses sinigrin. The same enzyme may hydrolyse O- and S-glucosides with the same efficienly. Enzymes with this specificity have never been described before. In this study we shown some adaptations of insects to use substrates with β-glycosidic bonds, allowing these organisrns to explore nutrients usualy avoided by other animals.

A busca por substâncias benéficas à saúde humana tem impulsionado o desenvolvimento de pesquisas visando o estudo de enzimas e seus produtos através da otimização de bioprocessos. Um dos principais componentes utilizados como base para a indústria de alimentos funcionais são carboidratos denominados frutooligossacarídeos (FOS) derivados da sacarose. Estes são sintetizados por enzimas denominadas frutosiltransferases que podem ser encontradas em plantas, bactérias e fungos. Os FOS têm atraído grande interesse da indústria, devido às suas características fisiológicas e biomoduladoras. Por serem polissacarídeos prebióticos não-digeríveis, têm a capacidade de estimular seletivamente o crescimento de bifidobactérias e lactobacilos, auxiliando na prevenção da cárie dentária e câncer de cólon em humanos. Podem também contribuir na diminuição do colesterol total e triglicerídeos no sangue, promover a reabsorção de cálcio e magnésio e serem utilizados em dietas com restrições alimentares, por serem açúcares de baixo valor calórico e elevado valor nutricional. Tendo em vista a existência de diferentes formas de FOS sintetizados por diferentes mecanismos, o presente trabalho buscou realizar a caracterização estrutural e funcional de um conjunto de 13 frutosiltransferases de bactérias e fungos. Os genes alvo foram clonados e as enzimas expressas e purificadas. Ensaios estruturais e de atividade enzimática, incluindo de hidrólise e polimerização da sacarose, foram conduzidos para a melhor compreensão das bases moleculares envolvidas no reconhecimento do substrato. Oito enzimas, duas β-frutofuranosidases de B. adolescentis, três sucrose-6-phosphate hydrolase de B. licheniformis e L. gasseri e uma invertase de A.niger foram cristalizadas e as enzimas de B. adolescentis e de L. gasseri tiveram suas estruturas resolvidas e seus sítios catalíticos mapeados. Estas apresentam em sua estrutura uma região β-propeller, local identificado como sítio catalítico, conectada à um módulo β-sanduíche. Ambas as enzimas apresentaram atividade hidrolítica da sacarose e a enzima de L. gasseri apresentou a formação dos FOS nistose e 1-cestose com concentrações de 1 M de sacarose bem como em tempos de 8 e 12 horas de incubação. Estes estudos, somados às análises das outras enzimas, permitirão o melhoramento na produção em larga escala, além da otimização e o controle destes processos de obtenção de FOS. / The search for beneficial substances to human health has driven the development of researches on the study of enzymes and their products through bioprocess optimization. One of the main components used as a basis for functional food industry are carbohydrates called fructooligosaccharides (FOS) derived from sucrose. These are synthesized by enzymes called fructosyltransferases which can be found in plants, bacteria and fungi. The FOS has attracted great interest of the industry due to its physiological and biomodulator properties. Because it is non-digestible polysaccharides prebiotics, have the ability to selectively stimulate the growth of bifidobacteria and lactobacilli, assisting in the prevention of tooth decay and colon cancer in humans. They can also contribute to decrease total cholesterol and triglycerides in the blood, to promote the absorption of calcium and magnesium and can be used in diets with dietary restrictions, because they are low-calorie sugars presenting high nutritional value. Considering there are different forms of FOS synthesized by different mechanisms, the present work attempts to make structural and functional characterization of a set of 13 fructosyltransferases of bacteria and fungi. The target genes were cloned and the enzymes were expressed and purified. Structural testing of X-ray crystallography and enzymatic activity, including sucrose hydrolysis and polymerization were carried out for a better understanding of the molecular basis involved in substrate recognition. Eight enzymes, two β-frutofuranosidases B. adolescentis, three sucrose-6-phosphate hydrolase of B. licheniformis and L. gasseri and A. niger invertase, were crystallized and the enzymes from B. adolescentis and from L. gasseri had their structures determined and their catalytic site mapped. These are similar to each other and present in their structure one β-propeller region which was identified as catalytic site, connected to one β-sandwich module. Both enzymes showed hydrolytic activity of the sucrose and L. gasseri showed the formation of FOS, 1-kestose and nystose with 1 M sucrose concentrations and times of 8 and 12 hours of incubation. These studies together with the analysis of other enzymes will enable the improvement in large-scale production, besides the optimization and control of these processes for the production of FOS.

As hidrolases de glicosídeos (GHs) exercem papéis fundamentais em vários processos biomédicos e aplicações industriais. A maioria destas enzimas possui vários domínios funcionais ligados entre si por peptídeos conhecidos como linkers. Informações sobre organização estrutural destas enzimas e sua mobilidade, posições e orientações mútuas de domínios individuais, bem como mudanças conformacionais introduzidas por ligantes ou por mudanças de condições bioquímicas (pH e T) podem ser muito informativas. Por esse motivo, é muito importante determinar a organização estrutural de GHs em termos de posição e orientação de seus domínios individuais e compreender a interação entre estes domínios em condições próximas às fisiológicas. Entretanto, atualmente, a conformação, dinâmica e função dos GHs com múltiplos domínios ainda não são totalmente compreendidas. Assim, o principal objetivo deste projeto foi conduzir estudos de hidrolases de glicosídeos em solução, usando SAS. Um grande número de GHs foi clonado e expresso em laboratório sob a direção do Prof. Dr. Igor Polikarpov (Grupo de Biotecnologia Molecular, IFSC / USP), seguindo protocolos já estabelecidos na literatura, para sua expressão e purificação. Experimentos SAXS foram realizados em colaboração com o Dr. Evandro Ares de Araújo (USP, São Carlos) e com o Prof. Dr. Mário de Oliveira Neto (UNESP, Botucatu). Para estudar as hidrolases de glicosídeos, foi utilizado o método de espalhamento a baixo ângulo, e em adição ao trabalho experimental, foi desenvolvido um novo pacote de software SAXSMoW2 para processar os dados do SAXS. Este pacote permite obter rapidamente os principais parâmetros estruturais de moléculas de proteínas, calcular o peso molecular e o estado oligomérico. Também foi aperfeiçoado e aplicado o método de acoplamento estatístico (statistical coupling analysis) , para complementar os dados estruturais experimentais, em especial para xiloses isomerases. Este método pode permitir uma melhor compreensão da relação entre as características estruturais evolutivas e sua funcionalidade biológica. Além disso, métodos de bioinformática foram desenvolvidos para complementar e compreender melhor as informações estruturais obtidas nos experimentos de SAXS. O primeiro foi um método para separar sequências de GH7 em duas categorias, exo e endogluconases. É útil analisar cada tipo de proteína dentro da família separadamente e estudar o papel dos loops funcionais - características estruturais que influenciam significativamente a atividade biológica. Outro método foi desenvolvido para encontrar o centro de atividade na nova enzima Xilose Isomerase obtida, usando uma estrutura relacionada, bem conhecida, da mesma família. Este método foi aplicado a enzimas cujas estruturas foram estudadas pela técnica de cristalografia em nosso laboratório no IFSC / USP. Inspirado pelo SCA, um método de detecção de comunidades difusas de aminoácidos em proteínas foi desenvolvido. Essa informação também pode complementar os resultados do SCA, indicando conjuntos fortemente correlacionados de aminoácidos na enzima. Outro novo método desenvolvido é uma estimativa de afinidade nas famílias de enzimas ativas em carboidratos utilizando similaridade dos modelos escondidos de Markov e bancos de dados open access de sequências de proteínas. / The Glycoside Hydrolases (GHs) play a key role in a number of biomedical processes and industrial applications. Most of these enzymes are multidomain proteins composed of different functional domains connected by linker peptides. Thus, it is very important to determine structural organization of glycoside hydrolases in terms of positions and orientations of their individual domains and comprehend the interplay between their multiple domains under close-to physiological conditions. To study the glycoside hydrolases, in this work a small-angle scattering method has been used. Currently, the conformation, dynamics and function of GHs with multiple domains are not fully understood. This is why the information on their structural organization and mobility; mutual position and orientation of the individual domains and conformational changes induced by interaction with the substrates or difference in biochemical conditions might be very informative. A large number of GHs have been cloned and expressed in the lab under direction of Prof. Dr. Igor Polikarpov (Molecular Biotechnology group, IFSC/USP) and we follow already established protocols for their expression and purification. SAXS experiments have been carried out in collaboration with Dr. Evandro Ares de Araujo (USP, São Carlos) and Prof. Dr. Mario de Oliveira Neto (UNESP, Botucatu). Additionally to experimental work, a new software package SAXSMoW2 for SAXS data processing has been developed. The software allows to obtain rapidly main structural parameters of the protein molecule, calculate molecular weight and oligomeric state. To supplement an structural data, the method of statistical coupling analysis (SCA) has been significantly improved and applied. The method allows a better understanding of interconnection between evolutionary caused structural features and their biological functionality. Also, various bioinformatic methods were developed to complete and understand better structural information obtained in SAXS experiments. The first one is a method for separating sequences from GH7 into the two bins of exo- and endogluconases. It is helpful to analyze each type of proteins inside the family separately and study the role of functional loops -- structural features that significantly influence on biological activity. Other developed method is for finding of activity center in the new obtained Xylose Isomerase enzyme using related well-known structure from the same family. This method was applied to the enzyme whose structure was studied using crystallography technique in our laboratory at IFSC/USP. Inspired by SCA, a method of aminoacid fuzzy communities detection in proteins has been developed as well. This information also can complete SCA results showing strong correlated sets of aminoacids in the enzyme. Another one new developed method is an estimation of carbohydrate-active family affiliation of unknown proteins using Markov hidden model similarities and open access databanks of protein sequences.

A importância do estudo das celulases não se limita à aquisição de conhecimento científico, mas também ao grande potencial biotecnológico que elas representam. Isso se deve ao fato da celulose ser a molécula mais abundante presente na natureza e prover uma vasta gama de produtos e processos sustentáveis. Muitas famílias de celulases já foram bem caracterizadas, enquanto outras permanecem ainda desconhecidas. Dentre estas últimas, a família 45 das hidrolases de glicosídeos é a família de celulases fúngicas menos caracterizada tanto estruturalmente quanto funcionalmente. Recentemente foi proposta a divisão dessa família em três subfamílias e, até agora, apenas membros da subfamília A tiveram enzimas estruturalmente elucidadas. Nesse trabalho reportamos a estrutura cristalográfica da proteína recombinante endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), a primeira das hidrolases de glicosídeos da subfamília C, e seu complexo com celobiose a 1,4 Å e 1,7 Å de resolução, respectivamente. A PcCel45A é uma enzima de domínio único, com uma estrutura em β-barril e seu empacotamento geral remete ao formato de âncora. O sítio ativo da enzima forma um longo sulco na superfície da estrutura, sendo que o seu centro catalítico é diferente das outras enzimas publicadas dessa família e o aspartato catalítico, que atua como aceptor de próton na reação de inversão, (Asp10) não é conservado. Adicionalmente, a estrutura cristalográfica dessa enzima apresenta mais similaridades com as β-expansinas (proteínas de plantas) e transglicosilases líticas (proteínas que clivam o peptidoglicano de bactérias) do que com as outras representantes da família 45, o que a torna ainda mais singular. Para entendermos melhor seu funcionamento foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos principais resíduos do sítio ativo. O Asp121, conhecido por participar da reação de inversão das outras enzimas da família como doador de próton, mostrou-se essencial para a atividade da enzima, enquanto que outros resíduos conservados como a Tyr25, o Trp161 e o Asp92 afetaram, mas não aniquilaram a atividade da enzima, apresentando aproximadamente 20%, 50% e 10% da atividade da enzima nativa, respectivamente. / The importance of the study of the cellulases is not limited to generating significant scientific knowledge, since these enzymes represents an enormous potential in biotechnology. This is partly because cellulose is the most abundant molecule in nature and provides a wide range of products and sustainable process. Many cellulases families have been well characterized, while others still remain unknown. Among them, the glycoside hydrolase family 45 is the least well characterized both structurally and functionally, between fungal cellulases. It was recently proposed the subdivision of this family into three subfamilies, with structural information available only for subfamily A. In this work, we report the chrystallographic structure of the recombinant endoglucanase from Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), the first GH45 subfamily C and its complex with cellobiose at 1.4 Å and 1.7 Å respectively. The PcCel45A is a single domain enzyme, which has a β-barrel structure with the overall shape resembling an anchor. The active site of the enzyme has a long cleft on the surface, being remarkably different from those members of subfamily A, and the catalytic aspartate responsible for acting as proton acceptor (Asp10) is not present. Additionally, the chrystallographic structure of this enzyme has shown more similarity with β -expansins (plant proteins) and lytic transglycosylase (proteins that cleave the peptidoglycan of bacteria) than others representants of family 45, which makes it more singular. For a better understanding of its function, we perform pontual mutations in the main residues from active site. The Asp121, known for acting as proton acceptor in the inversion reaction of others enzymes, proved to be essential for the enzyme activity, while others conserved residues as Tyr25, Trp161 and Asp92 affected but not annihilated the enzyme activity, leaving approximately 20%, 50% and 10% of the native enzyme activity.

Os carboidratos são componentes essenciais de muitos produtos naturais de grande importância medicinal. As porções carboidrato podem aumentar a solubilidade em água de drogas, diminuir a toxicidade e/ou contribuir para a bioatividade dos produtos naturais. A síntese de C-glicosídeos, a partir de D-glicose, é de grande interesse porque estes são úteis como blocos de construção para a síntese de vários tipos de moléculas com grande potencial de utilização em princípios ativos para tratamento de câncer, diabetes, HIV, como antivirais, entre outros. Os C-glicosídeos são essencialmente inertes à degradação porque o centro anomérico natural (um O- ou N-acetal instável) foi transformado hidroliticamente em ligação éter. Como resultado, uma atenção significativa tem sido dedicada para o desenvolvimento de novas vias sintéticas. A reação de Knoevenagel, descrita há mais de um século, consiste na condensação de aldeídos com moléculas contendo metileno ativo, tais como o ácido malônico ou o seu éster e dicetonas. Embora consista de uma desidratação, surpreendentemente, a reação é favorecida em meio aquoso, em alguns casos. A condensação de carboidratos desprotegidos com dicetonas tem atraído crescente interesse com a crescente cobrança da sociedade por tecnologias mais limpas (verdes). Nesse sentido, baseando-se no conceito de Química Verde e seus Doze princípios, buscou-se a redução ou troca de solventes orgânicos por outros mais verdes, adaptação dos sistemas de reação para operação em temperaturas mais brandas e substituição de matérias-primas por outras mais verdes. O objetivo principal consistiu na preparação da cetona-?-C-glicosídeo (CG) e seus derivados, a partir da D-glicose, com potencial aplicação como intermediários de fármacos. Nesse trabalho, foram preparados derivados do CG e da D-glicose: CG peracetilado, D-glicose peracetilada, CG perbenzoilado, D-glicose perbenzoilada, CG peracetilado clorado, CGAr1 ((E)-4-(4-metoxifenil)-1-(3,4,5-trihidroxi-6- (hidroximetil)-tetrahidro-2H-piran-2-il)but-3-en-2-ona), CGAr1 peracetilado e CGAr1 peracetilado bromado. O CG foi preparado em meio aquoso ou em EtOH-água 4:1, pH alcalino (35-80%). O CG peracetilado (2,3,4,6-tetracetil-1-C-(?-D-glicopiranosil)propan-2-ona) e a Dglicose peracetilada (1,2,3,4,6-pentacetil-1-C-(?-D-glicopiranosil)) foram preparados (71 e 77,5%) usando quatro metodologias: duas usando AcONa/Ac2O a 50-90 °C, uma com AcONa/py/DMAP a t.a. e uma com I2/Ac2O a 28 °C. O CG perbenzoilado (2,3,4,6-tetrabenzoil- 1-C-(?-D-glicopiranosil)propan-2-ona) e a D-glicose perbenzoilada (1,2,3,4,6-pentabenzoil-1-C- (?-D-glicopiranosil) foram preparados (31 e 83%), respectivamente, usando sete metodologias: duas em solução de NaOH a t.a., quatro com py e DCM e/ou tolueno como solvente a 65 °C, uma com py/DCM a 5 °C. O CG peracetilado clorado (2-(acetoximetil)-6-(3-cloro-2- oxopropil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetato) foi preparado (19,6%) usando NH4Cl/oxone em MeOH sob refluxo. O CGAr1 foi preparado a partir do CG bruto com p-anisaldeído, L-prolina e TEA em MeOH a t.a (33,5%). O CGAr1 peracetilado ((E)-2-(acetoximetil)-6-(4-(4-metoxifenil)- 2-oxobut-3-en-1-il)-tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triil triacetato) foi preparado (54%) usando três metodologias: Ac2O/AcONa a 50 °C, I2/Ac2O a 28 e a 50°C. O CGAr1 peracetilado bromado foi preparado (78%) usando Br2/CCl4 a t.a. / Carbohydrates are essential components of many natural products of great medicinal importance. The carbohydrate portions may increase the water solubility of drugs, decrease toxicity and/or contribute to the bioactivity of the natural products. The synthesis of Cglycosides, from D-glucose, is of great interest because they are useful as building blocks for the synthesis of various types of molecules with great potential as active principles for the treatment of cancer, diabetes, HIV, as antivirals, among others. C-glycosides are essentially inert to degradation because their natural anomeric center (an unstable O- or N-acetal) has been hydrolytically transformed into an ether linkage. Thus, significant attention has been devoted to the development of new synthetic routes. The Knoevenagel reaction, described over a century ago, consists of the condensation of aldehydes with molecules containing active methylene, such as malonic acid or its ester and diketones. Although it consists of a dehydration, surprisingly, the reaction is favored in aqueous medium in some cases. The condensation of unprotected carbohydrates with diketones has attracted increasing interest with the growing society\'s demand for cleaner (green) technologies. Based on the concept of Green Chemistry and its Twelve Principles, the aim was to reduce or substitute organic solventes for greener ones, adapt reaction systems to operate at milder temperatures and substitute raw materials for greener ones. The main goal was to prepare ketone-?-C-glucoside (CG) and its derivatives, from D-glucose, with potential application as drug intermediates. In this work, CG and D-glucose derivatives were prepared: peracetylated CG, peracetylated D-glucose, perbenzoylated CG, perbenzoylated D-glucose, chlorinated peracetylated CG, CGAr1 ((E)-4-(4- methoxyphenyl)-1-(3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-tetrahydro-2H-pyran-2-yl)but-3-en-2- one), peracetylated CGAr1 and brominated peracetylated CGAr1. CG was prepared (35-80%) in water or EtOH-water (4:1), alkaline pH. Peracetylated CG (2,3,4,6-tetraacetyl-1-C-(?-Dglucopyranosyl) propan-2-one) and peracetylated D-glucose (1,2,3,4,6-pentacetyl-1-C-(?-Dglucopyranosyl)) were prepared (71 and 77,5%), using four methodologies: two using AcONa/ Ac2O at 50-90 °C, one with AcONa/py/DMAP at rt and one with I2/Ac2O at 28 °C. The perbenzoylated CG (2,3,4,6-tetrabenzoyl-1-C-(?-D-glucopyranosyl)propan-2-one) and perbenzoylated D-glucose (1,2,3,4,6-pentabenzoyl-1-C-(?-D-glucopyranosyl) were prepared (31 and 83%) using seven methodologies: two in NaOH aqueous solution, four with py and DCM and/or toluene as solvent at 65 °C. Chlorinated peracetylated CG (2-(acetoxymethyl)-6-(3- chloro-2-oxopropyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triyl triacetate) was prepared (19,6%) using NH4Cl/oxone in MeOH under reflux. CGAr1 was prepared from crude CG with p-anisaldehyde, L-proline and TEA in MeOH at rt (33,5%). The peracetylated CGAr1 ((E)-2-(acetoxymethyl)-6- (4-(4-methoxyphenyl)-2-oxobut-3-en-1-yl)-tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triyl triacetate) was prepared (54%) using three methodologies: Ac2O/AcONa at 50 °C, I2/Ac2O at 28 and at 50 °C. Brominated peracetylated CGAr1 was prepared (78%) using Br2/CCl4 at rt.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Claudia Comandolli.pdf: 4289017 bytes, checksum: 2bef35ae167e04ceccfedeedc54fbb31 (MD5) Previous issue date: 2010-12-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of the present study was to evaluate the antimicrobial, antioxidant and cytotoxicity potentials of extracts of leaves and branches of Casearia javitensis, and to purify and identify their secondary metabolites. Leaves and branches were collected in Reserva Adolpho Ducke, Manaus, AM. The plant material was dried, grinded and the extracts were prepared with DCM, MeOH and water using ultrasound for 20 minutes each. The extracts were concentrated and tested for antibacterial, cytotoxicity and antioxidant activity. Antibacterial activity assays were done using the agar diffusion method by well technique, against Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) were measured for the most active extracts. The cytotoxicity assay employed brine shrimp Artemia salina and the evaluation of antioxidant activity used a method with DPPH and ascorbic acid. DCM branches extract was fractioned in chromatographic column (CC), and recrystallization. Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analyses afforded steroids, as β-sitosterol. DCM extracts of leaves and branches were analyzed by GC-MS in appropriated conditions to steroids and triterpenes analyses, and triterpene friedelin was detected in branches extracts. Antimicrobial assay showed high activity for branches MeOH extract and leaves MeOH extract against A. hydrophila, MIC value < 2 mg/mL and showed no cytotoxicity in Artemia salina. These MeOH extracts were dissolved in water and partitioned between dichloromethane (DCM), ethyl acetate (AcOEt) and n-buthanol (n-BuOH), and these phases were tested for antibacterial activity. The AcOEt phases were the most active, and showed high antimicrobial activity. The DCM phase from branches MeOH extract was fractioned by CC and afforded β-friedelanol. The AcOEt fraction of branches MeOH extract was fractioned by CC and some fractions were purified by HPLC, and afforded five phenolic glycosides, which structures are not yet determined. 1D and 2D-NMR and mass spectrometry analyses are still on progress. The n BuOH phase from branches MeOH extract was fractioned by exclusion chromatography (Sephadex LH-20) and subjected to CC over a Poliamide-6 column, and NMR analyses of one fraction suggest the presence of a phenolic glycoside. / O presente trabalho teve por objetivo isolar e identificar os metabólitos secundários presentes nos extratos de Casearia javitensis, assim como avaliar o potencial antimicrobiano, citotóxico e antioxidante destes extratos. Para o trabalho, foram realizadas quatro coletas na Reserva Adolpho Ducke, Manaus-AM. Os materiais coletados foram secos, moídos e extraídos em ultrassom com diclorometano (DCM), metanol (MeOH) e H2O. Para os testes antimicrobianos, utilizou-se o método de difusão em ágar, pela técnica de poço, contra Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Mínima Bactericida (CMB) foram determinadas para os extratos mais ativos. O ensaio citotóxico utilizou Artemia salina como organismo-teste e o ensaio de atividade antioxidante empregou o método quantitativo utilizando o radical DPPH e equivalência com o ácido ascórbico. O extrato DCM dos galhos foi fracionado por coluna cromatográfica (CC) e uma fração foi purificada através de recristalização. Frações analisadas por Cromatográfo à Gas acoplado à Espectrometria de Massas (CG-EM) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) mostraram presença de esteroides, possuindo o β-sitosterol como majoritário nas frações. Os demais extratos DCM foram analisados por CG-EM em uma condição para análise de esteroides e triterpenos, e o triterpeno friedelina foi detectado nos extratos dos galhos. O extrato metanólico dos galhos da primeira coleta e o extrato metanólico das folhas da terceira coleta apresentaram halos de inibição superiores a 10 mm no teste contra Aeromonas hydrophila, CIM abaixo de 2 mg/mL e ausência de atividade citotóxica em Artemia salina. Estes extratos foram submetido à partição com diclorometano (DCM), acetato de etila (AcOEt) e n-butanol (n-BuOH), e as fases obtidas foram avaliadas para atividade antimicrobiana. As fases AcOEt destes extratos mostraram-se como as mais ativas, concentrando a atividade antimicrobiana. A fase DCM do extrato MeOH dos galhos foi fracionada por sucessivas CCs e uma fração mostrou a presença de β-friedelanol por análise em CG-EM. A fase AcOEt foi fracionada por CC e algumas frações foram purificadas por CLAE, fornecendo cinco fenólicos glicosilados, os quais a determinação estrutural ainda não está concluída, pois espectros de RMN mono e bidimensionais são necessários para a conclusão desta etapa. A fase n -BuOH foi fracionada em CC utilizando Sephadex LH-20 e CC de Poliamida-6, e o espectro de RMN de uma fração semipurificada sugere a presença também de fenólicos glicosilados.

Having access to mild and operationally simple techniques for attaining carbohydrate targets will be necessary to facilitate advancement in biological, medicinal, and pharmacological research. Even with the abundance of elegant reports for generating glycosidic linkages, the stereoselective construction of alpha- and beta-oligosaccharides and glycoconjugates is by no means trivial. In an era when expanded awareness of the impact we are having on the environment drives the state-of-the-art, synthetic chemists are tasked with developing cleaner and more efficient reactions for achieving their transformations. This movement imparts the value that prevention of waste is always superior to its treatment or cleanup. Chapter 1 of this thesis will highlight recent advancement, in this regard, by examining strategies that employ transition metal catalysis in the synthesis of oligosaccharides and glycoconjugates. These methods are mild and effective for constructing glycosidic bonds with reduced levels of waste through utilization of sub-stoichiometric amounts of transition metals to promote the glycosylation. The development of a general and practical method for the stereoselective synthesis of beta-O-aryl-glycosides that exploits the nature of a cationic palladium(II) catalyst, instead of a C(2)-ester directing group, to control the beta-selectivity is described in chapter 2. The beta-glycosylation protocol is highly diastereoselective and requires 2-3 mol % of Pd(CH3CN)4(BF4)2 to activate glycosyl trichloroacetimidate donors at room temperature. The method has been applied to D-glucose, D-galactose, and D-xylose donors with a non-directing group incorporated at the C(2)-position to provide the O-aryl glycosides with good to excellent beta-selectivity. In addition, its application is widespread to electron-donating, electron-withdrawing, and hindered phenols. The glycosylation is likely to proceed through a seven-member ring intermediate, wherein the palladium catalyst coordinates both the C(1)-trichloroacetimidate nitrogen and C(2)-ether oxygen, blocking the alpha-face. As a result, the phenol nucleophile preferentially approaches from the top face of the activated donor, leading to the formation of the beta-O-aryl glycoside. The area of sugar urea derivatives has received considerable attention in recent years because of the unique structural properties and activities that these compounds display. The urea-linkage at the anomeric center is a robust alternative to the naturally occurring O- and N-glycosidic linkages of oligosaccharides and glycoconjugates, and the natural products that have been identified to contain these structures show remarkable biological activity. While methods for installing the beta-urea-linkage at the anomeric center have been around for decades, the first synthesis of alpha-urea glycosides has been much more recent. In either case, the selective synthesis of glycosyl ureas can be quite challenging, and a mixture of alph- and beta-isomers will often result. Chapter 3 provides a comprehensive review of the synthetic approaches to alpha- and beta-urea glycosides and examines the structure and activity of the natural products, and their analogues, that have been identified to contain them. There are only a handful of reports for the construction of beta-urea glycosides, and even fewer that are able to attain the alpha-urea structures. Chapter 4 will cover two of these methods, where a transition metal catalyst is employed to facilitate the alpha-selective transformation. The 1st-generation process, covered in section 4.1, involves the cationic palladium(II)-catalyzed rearrangement of glycal trichloroacetimidate to alpha-glycal trichloroacetamide in its key step. The transformation is carried out with only 0.5 mol% Pd(CH3CN)4(BF4)2 catalyst and is both highly alpha-selective and tolerant to a diverse array of protecting groups. The glycal product of the rearrangement is functionalized to pyranoside, protected, and then converted to glycosyl urea in 3-steps. A diverse array of primary and hindered secondary nitrogen nucleophiles have been coupled with the alpha-acetamide products, generating alpha-urea glycosides with retention of stereochemical integrity at the anomeric center. This is the first synthesis of alpha-glycosyl urea to rely on the nature of the catalyst/ligand complex, rather than substrate, to control selectivity. This method, however, suffers from limitations in scope and a dependence on toxic osmium tetroxide to functionalize the glycal. In section 4.2, the development and mechanistic investigation of a 2nd-generation process, able to overcome the limitations of the glycal methodology to provide an efficient and highly stereoselective access to alpha-urea glycosides, is decribed. This two-step procedure begins with a highly selective nickel-catalyzed conversion of alpha-glycosyl trichloroacetimidate to alpha-trichloroacetamide. The alpha-selectivity in the reaction is controlled with a cationic nickel(II) catalyst, Ni(dppe)(OTf)2. Mechanistic studies have identified a coordination of the nickel catalyst with equatorial C2-ether group of the glycosyl trichloroacetimidate to be paramount for achieving an á-selective transformation. A cross-over experiment has indicated that the reaction does not proceed in an exclusively-intramolecular fashion. The alpha-trichloroacetamide products are directly converted into alpha-urea glycosides by reacting them with a variety of nucleophilic amines in presence of cesium carbonate. Only alpha-urea products are observed, as the reaction retains stereochemical integrity at the anomeric center during the urea-forming step.

Les glycophanes sont des molécules cycliques, chirales contenant des sucres séparés par des segments hydrocarbonés. Ils sont considérés comme des hybrides de cyclophanes et de cyclodextrines. Ce travail concerne la synthèse de glycophanes symétriques à partir du D-glucal. Après la synthèse de O-glycosides insaturés et de bis-O-glycosides d'alkyle 2,3 insaturés par réarrangement de Ferrier, nous avons préparé des précurseurs bifonctionnels pour différentes réactions de macrocyclisation pour l'obtention de ces macrocycles à savoir les bis-ethers de propargyle pour la réaction de Glaser ; les azido-alcynes pour la réaction de Huisgen et les amino-acides de sucres pour le couplage peptidique. Les conditions de dilution ont permis d'obtenir des molécules-cages de symétrie C2 que nous avons déprotégées pour des essais de complexation.