Introdução: A doença vascular do coração transplantado, consiste em um processo inflamatório proliferativo que compromete o sucesso a longo prazo do transplante cardíaco e não há prevenção ou tratamentos efetivos. Uma nanoemulsão lipídica (LDE) pode carregar agentes quimioterápicos na circulação e concentrá-los nos enxertos cardíacos dos coelhos. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do paclitaxel combinado a LDE;do metotrexate combinado ao LDE e a associação de ambos quimioterápicos ao LDE nos corações transplantados. Método: 28 coelhos alimentados com dieta com teor de 0,5% de colesterol e submetidos a transplante cardíaco herotópico foram tratados com ciclosporina (dose 10 mg/kg/ dia por via oral) e alocados em 4 grupos de 7 animais.Um grupo recebeu a associação de Metotrexate e LDE endovenosa (4 mg/kg/semana); segundo grupo recebeu por via endovenosa a combinação de Paclitaxel e LDE; o terceiro grupo recebeu a associação de LDE com metotrexate e paclitaxel; grupo controle que recebeu somente solução salina intravenosa. Os animais foram sacrificados 6 semanas após o procedimento. Foram realizadas análises da morfologia,histologia,imunohistoquímica e análise da expressão gênica do enxerto e dos corações nativos. Resultado: Em comparação com o grupo controle,coelhos transplantados e tratados com paclitaxel associado ao LDE apresentaram redução em 50% de estenose em artérias coronárias. Já nos grupos que usaram metotrexate associado a LDE ou paclitaxel combinado com metotrexate e associado a LDE, houve redução em 18% da estenose coronariana em relação ao grupo controle,mas a diferença não apresentou significância estatística.Nos três grupos tratados, houve redução do infiltrado macrofágico. No grupo que recebeu metotrexate associado a LDE,a expressão gênica de fatores pró-inflamatórios( TNF-alfa; MCP1; IL 18; VCAM-1 e MMP-12) foi reduzida drasticamente; enquanto a expressão de agentes anti-inflamatórios(IL 10 por exemplo) aumentou. Nos outros dois grupos (LDE+paclitaxel e LDE+paclitaxel e metotrexate) não houve influência consistente na expressão de genes pró e anti-inflamatórios. Conclusão: A associação paclitaxel e LDE promoveu melhora importante na vasculopatia dos enxertos.A associação metotrexate e LDE e a metotrexate mais palcitaxel e LDE reduziram a estenose de coronárias porém sem significância estatística. O infiltrado macrofagocítico foi reduzido nos três grupos tratados. Tais resultados podem servir de ponte para novos ensaios clínicos / Background: Coronary allograft vasculopathy is an inflammatory-proliferative process that compromises the long-term success of heart transplantation and currently has no effective prevention and treatment. A lipid nanoemulsion (LDE) can carry chemotherapeutic agentsin the circulation and concentrates them in the heart graft in rabbits. The aim of this study was to investigate the effects of paclitaxel (PACLI) binded tire parentesis to LDE, methotrexate (MTX) binded to LDE and the association of both particles in transplanted heart. Methods: Twenty eight rabbits fed 0,5% cholesterol diet and submitted to heterotopic heart transplantation were treated with cyclosporine A (10mg/kg/daily orally) and allocated to four groups of 7 animals. One group was treated with intravenous LDE-MTX (4mg/kg B.W., weekly); a second with LDE-paclitaxel, the third one with association of LDE-PACLI with LDE-MTX and the control group received only weekly intravenous saline solution. Animals were sacrificed 6 weeks later for morphometric, histological, immunohistochemical and gene expression analysis of the graft and native hearts. Results: Compared to controls, grafts of LDE-PACLI treated rabbits showed 50%reduction of coronary stenosis and in the LDE-MTX and LDE-MTX/PACLIstenosiswas around 18% less than control but this difference was not statistically significant. In the 3 treatment groups macrophage infiltration was decreased. In LDE-MTX group, gene expression of pro-inflammatory factors TNF-?, MCP-1, IL-18 and VCAM-1, and MMP-12 was strongly diminished whereas expression of anti-inflammatory IL-10 increased. In the other two treatment, groups (LDE-PACLI and LDE-PACLI/MTX) there was not a consistent influence in pro and anti-inflammatory gene expression. Conclusions: LDE-PACLI promoted strong improvement of the cardiac allograft vasculopathy. LDE- MTX and LDE -MTX/PACLI decreased coronary stenosis but without statistic significance. Macrophage infiltration was decrease in the three treatment groups. This new preparation maybe candidate for future clinical trials

Introdução: A Doença Vascular do Enxerto (DVE), um processo envolvendo fatores de natureza inflamatória e proliferativa, é a principal causa de morte após o Transplante Cardíaco (TxC), com incidência acima de 50 % ao fim do quinto ano. É possível que a intervenção farmacológica nesses fatores possa resultar na inibição da proliferação de células musculares lisas vasculares e melhora da DVE. Neste sentido, em trabalho anterior desta Instituição, o paclitaxel, agente antiproliferativo usado no tratamento do câncer, foi capaz de regredir as lesões ateromatosas em coelhos com aterosclerose induzida por dieta rica em colesterol. Naquele trabalho, o paclitaxel foi concentrado nas lesões utilizando-se uma nanopartícula lipídica, parecida com a lipoproteína de baixa densidade (LDL), mas sem a parte protéica, denominada LDE. Tendo em vista as dificuldades do tratamento da DVE em pacientes e da grande importância dessa doença para o êxito do procedimento, novas alternativas terapêuticas devem ser procuradas, e o uso do paclitaxel associado à LDE pode ser uma rota interessante, tendo em vista que as bases inflamatórias e proliferativas da DVE são semelhantes às da doença cardiovascular aterosclerótica, onde a LDE-paclitaxel mostrou-se eficiente. Objetivos: Verificar se o tratamento com LDE-Paclitaxel reduz a incidência e o grau de DVE de coelhos submetidos a transplante cardíaco heterotópico. Analisar a biodistribuição da LDE em coelhos submetidos a transplante cardíaco heterotópico. Método: TxC heterotópico em posição cervical foi realizado utilizando-se 21 coelhos da raça New Zealand vermelhos como doadores e 21 coelhos brancos como receptores (peso ± 3 kg). Os coelhos receptores receberam dieta com acréscimo de 0,5 % de colesterol e ciclosporina A na dose de 10 mg/kg/dia via oral como imunossupressor. Foram divididos em 2 grupos: um grupo, constituído de 11 animais, foi tratado com LDE-Paclitaxel na dose de 4 mg/kg/semana, durante 6 semanas, por via endovenosa. O outro grupo (controle) compôs-se de 10 animais tratados com 3 mL de solução fisiológica por via endovenosa, semanalmente, durante 6 semanas. A biodistribuição da LDE foi determinada em 4 animais do grupo controle, injetando-se a LDE marcada com éter de colesterol radioativo 24 h antes do sacrifício, seguindose a contagem de radioatividade nos corações e outros tecidos após extração lipídica. Após o sacrifício dos animais, retiraram-se os corações nativo e transplantado para análise histológica com coloração H/E e Verhoeff-van Gieson. A área transversal das artérias coronárias foi estimada pela medida da lamina elástica interna e da área do lúmen. A porcentagem de estenose foi calculada da diferença entre área do lúmen do vaso e a área da lamina elástica interna. Análise estatística com ANOVA e o teste T, com valor p <= 0,05 considerado significante. Resultados: A captação da LDE pelo coração transplantado foi quase 4 vezes maior do que no coração nativo (p<=0,0001). Nos animais tratados com LDE-paclitaxel, houve uma dramática melhora no status das artérias coronárias dos corações transplantados, ocorrendo um acentuado aumento de 3 vezes na área da luz dos vasos (p<=0,031) e de redução da estenose em 45% (p<=0,0008). Conclusões: A LDE é capaz de concentrar-se no coração transplantado, o que possibilita o direcionamento do paclitaxel para o enxerto. O tratamento com LDE-paclitaxel reduziu acentuadamente a DVE, o que pode abrir uma nova perspectiva para o controle da doença vascular do enxerto. / Introduction: Cardiac Allograft Vasculopathy (CAV), a process involving factors of inflammatory and proliferative nature, is the leading cause of death after heart transplantation (HT), with incidence above 50% after the fifth year. It is possible that pharmacological intervention on these factors may result in inhibiting the proliferation of vascular smooth muscle cells and improves the CAV. Thus, in previous studies of this institution, paclitaxel, an antiproliferative agent used in cancer treatment, was able to recede the atheromatous lesions in rabbits with atherosclerosis induced by high cholesterol diet. In that study, paclitaxel was concentrated in the lesions using a lipid nanoparticle, similar to low density lipoprotein (LDL) but without the protein part, called LDE. Given the difficulties of the treatment of CAV in HT patients and the great importance of this disease to the success of the procedure, new therapeutic alternatives must be sought, and the use of paclitaxel associated to LDE can be an interesting route, given that the bases inflammatory and proliferation of CAV are similar to those of atherosclerotic cardiovascular disease, where the LDE-paclitaxel was efficient. Objectives: To determine whether treatment with LDE-paclitaxel reduces the incidence and degree of CAV in rabbits undergoing heterotopic heart transplantation. To analyze the biodistribution of LDE in rabbits undergoing heterotopic heart transplantation. Methods: Heterotopic HT in cervical position was performed using 21 New Zealand red rabbits as donors and 21 white rabbits as recipients (weight ± 3 kg). The receptors rabbits were fed regular chow with added 0.5% cholesterol and with cyclosporine A, 10 mg / kg / day orally as immunosuppressants. They were divided into two groups: one consisting of 11 animals was treated with LDE-paclitaxel at a dose of 4 mg / kg / week for 6 weeks intravenously. The other group (control) was composed of 10 animals treated with 3 ml of saline intravenously weekly for six weeks. The biodistribution of LDE was determined in four control animals, by injecting the LDE labeled with radioactive cholesteryl ether 24 h before sacrifice, followed by radioactivity count in the hearts and other tissues after lipid extraction. After sacrificing the animals, we excised the native and transplanted hearts for histological staining with H / E and Verhoeff-van Gieson. The cross-sectional area of the coronary arteries was estimated by measuring the internal elastic lamina and the lumen area. The percentage of stenosis was calculated from the difference between the area of the vessel lumen and the area of internal elastic lamina. Statistical analysis with ANOVA and T test with p value <= 0.05 was considered significant. Results: The uptake of LDE for the transplanted heart was almost fourfold higher than in the native heart (p<=0.0001). In animals treated with LDE-paclitaxel, there was a dramatic improvement in the status of the coronary arteries of the transplanted hearts, indicating by a marked increase of three times of the vascular lumen area (p<=0.031) and reduction of stenosis in 45% (p<=0.0008). Conclusions: The LDE is able to concentrate on the transplanted heart, which enables the targeting of paclitaxel to the graft. Treatment with LDE-paclitaxel markedly reduced CAV in the transplanted heart, which may open a new perspective for control of Cardiac Allograft Vasculopathy.

O transplante cardíaco é a última opção terapêutica para pacientes portadores de insuficiência cardíaca grave. Apesar dos avanços na terapia imunossupressora, a rejeição continua sendo o principal obstáculo para o sucesso do transplante. No presente estudo, propõe-se avaliar o perfil de expressão gênica no tecido cardíaco. Com isso, espera-se contribuir para o melhor entendimento do processo de rejeição a nível molecular. Foram analisadas as amostras sequenciais (1, 3 e 6 meses, 1 e 2 anos pós-transplante) de biópsias endomiocárdicas em parafina de 63 indivíduos transplantados cardíacos. O diagnóstico de rejeição humoral foi realizado pela detecção de C3d e C4d do complemento na reação de imuno-histoquímica, e as expressões dos genes protetores (ADIPOR1, ADIPOR2, HMOXO-1, BCL2L1 e VEGF) e genes associados à inflamação (IL-6, TNF?, IFN?, TGF-?, AIF-1, NOS2, ICAM, VCAM e MCP-1); foram avaliadas pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR). As frequências de indivíduos positivos para C4d (28,6%) e vasculite (20,0%) foram significantemente maiores em relação ao teste de reatividade de anticorpos realizado nos receptores antes do transplante (6,3%). Houve mudança no perfil de expressão gênica no tecido cardíaco após o transplante, com aumento da expressão dos genes inflamatórios (AIF-1, TNF?, IL-6, NOS2 e VCAM) e diminuição da expressão dos genes protetores (ADIPOR1, ADIPOR2, BCL2L1 e VEGF). Além disso, as expressões dos genes ADIPOR1 e ADIPOR2 foram significantemente menores nos indivíduos positivos para C4d (p<0,001) e gene VEGF (p<0,001) no grupo com vasculite. Houve também uma correlação positiva entre a expressão do gene VEGF e ADIPOR1 (r=0,5688) e ADIPOR2 (r=0,5191). Por outro lado, a expressão aumentada do gene VCAM (p<0,001) foi detectada em todos os tipos de rejeição. Conclui-se que, depois do transplante, o sistema imune do receptor passou a reconhecer os antígenos do órgão transplantado. Com isso, ocorreu uma mudança no perfil de expressão gênica no enxerto cardíaco, caracterizada pela expressão aumentada dos genes inflamatórios e diminuição dos genes protetores. A expressão aumentada do gene VCAM associada à baixa expressão dos genes protetores: ADIPOR1, ADIPOR2, BCL2L1 e VEGF resultaram em maior gravidade da rejeição celular, humoral e vasculopatia do aloenxerto cardíaco. / Heart transplantation is the ultimate treatment for patients with severe heart failure. Despite advances in immunosuppressive therapy, rejection still remains the main obstacle to successful transplant. The purpose of this study is to evaluate the gene expression profile in cardiac tissue. With this we hope to contribute to a better understanding of the rejection process at the molecular level. Sequential samples (1, 3, and 6 months, 1 to 2 years post-transplant) endomyocardial biopsies paraffin of 63 heart transplant subjects were analyzed. The diagnosis of humoral rejection was performed by detection of C3d and C4d complement in immunohistochemistry and the expression of protective genes (ADIPOR1, ADIPOR2, HMOXO-1, and VEGF BCL2L1) and genes associated with inflammation (IL-6,TNF?, IFN?, TGF-?, AIF-1, NOS2, ICAM, VCAM and MCP-1); were evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). The frequency of individuals positive for C4d (28.6%) and vasculitis (20.0%) were significantly higher compared to antibodies reactivity test conducted in the recipients before transplantation (6.3%). There was a change in the gene expression profile in cardiac tissue after transplantation, with increased expression of inflammatory genes (AIF-1,TNF?, IL-6, NOS2, and VCAM) and a decreased expression of protective genes (ADIPOR1, ADIPOR2, BCL2L1, and VEGF). Furthermore, the expressions of ADIPOR1 and ADIPOR2 genes were significantly lower in C4d positive individuals (p<0,001), and VEGF (p<0,001) in the group with vasculitis. There was also a positive correlation between VEGF expression and ADIPOR1 (r=0.5688) and DIPOR2 (r=0.5191). Moreover, increased expression of VCAM (p<0,001) was detected in all types of rejection. We conclude that, after transplantation, the recipient\'s immune system began to recognize the antigens of the transplanted organ. Thus, a change in gene expression profile in cardiac graft is characterized by increased inflammatory genes and decreased expression of protective genes. Increased VCAM gene associated with lower expression of protective genes expression: ADIPOR1, ADIPOR2, BCL2L1 and VEGF resulted in increased severity of cellular and humoral rejection and cardiac allograft vasculopathy.

A rejeição é uma das principais complicações após transplante cardíaco (TC). A biópsia endomiocárdica do ventrículo direito (BEVD) continua a ser o padrão-ouro para seu diagnóstico. Há uma necessidade de alternativas não invasivas que permitam um diagnóstico seguro e precoce de rejeição cardíaca, antes do início dos sintomas clínicos. A ecocardiografia com speckle tracking (EST) permite a análise da dinâmica de contração ventricular, possibilitando a detecção precoce de disfunção miocárdica. Os objetivos deste estudo foram comparar os parâmetros da dinâmica ventricular obtidos com a EST em pacientes transplantados e indivíduos não transplantados cardíacos e avaliar o valor da EST e da dosagem sérica de troponina I e peptídeo cerebral natriurético (BNP), como ferramentas não invasivas para a detecção precoce de rejeição celular aguda significativa (RCA) após o TC. Entre janeiro de 2014 e novembro de 2017, foram estudados, prospectivamente, 49 pacientes transplantados cardíacos com função sistólica normal, tanto do ventrículo esquerdo (VE) como do direito (VD) submetidos à BEVD para vigilância ou por suspeita clínica de rejeição. A RCA foi definida como >= 2R pelos critérios da Sociedade Internacional para Transplante de Coração e Pulmão. Quarenta e nove indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo constituíram o grupo controle. Todos os pacientes foram submetidos à ecocardiografia convencional e à EST. Os pacientes transplantados foram submetidos, horas antes da BEVD, à dosagem de troponina I e BNP séricos. Parâmetros ecocardiográficos clássicos, strain e strain rate longitudinal global, radial e circunferencial do VE, além de strain longitudinal da parede livre do VD (SLPL-VD) foram analisados. Os 49 pacientes transplantados cardíacos (média etária 45,2 ± 11,5 anos, 28 homens) foram submetidos a 66 biópsias entre 6-12 meses após o TC. A RCA foi detectada em 17 (26%) e ausência de RCA em 49 (74%) biópsias. Strain e strain rate longitudinal, circunferencial e radial globais do VE e SL-PLVD foram significantemente menores, em valores absolutos, nos grupos dos transplantados cardíacos do que no grupo controle. O SL-PLVD apresentou valor absoluto menor no grupo com RCA do que no sem RCA (-18,28 ± 4,8% versus -22,11 ± 2,9%; p < 0,001). Um valor de SL-PLVD < 17,57% (valor absoluto) teve sensibilidade de 71%, especificidade de 90%, valor preditivo positivo de 75%, acurácia de 84% e valor preditivo negativo de 88% para detecção de RCA. A dosagem da troponina I foi significantemente mais alta em pacientes com RCA (p < 0,01). A mediana para este grupo foi 0,19 [intervalo interquartil 0,09-1,31 ng/mL], versus 0,05 [intervalo interquartil, 0,01-0,18ng/mL] para o grupo sem RCA. Na análise multivariada, o SL-PLVD foi o único preditor independente de RCA com razão de chance de 1,70 (intervalo de confiança de 95% = 1,17- 2,48); p = 0,006. Concluiu-se que o SL-PLVD derivado da EST foi marcador sensível e específico de RCA. Estes dados sugerem que esta técnica é adequada para detectar alterações na deformação ventricular direita durante um episódio de RCA / Rejection is a major complication after heart transplantation (HT). Right ventricular endomyocardial biopsy (EMB) remains the gold standard for diagnosis of rejection. There is a need for non-invasive alternatives that allow for a safe and early diagnosis of cardiac rejection prior to the onset of clinical symptoms. Speckle tracking echocardiography (STE) enables the analysis of left and right ventricular contraction dynamics, thus allowing for the early detection of myocardial dysfunction. The aims of the present study were to compare ventricular dynamics parameters obtained by STE in heart transplanted patients and control individuals. We also aimed to assess the value of STE, troponin I, and brain natriuretic peptide (BNP) serum levels as noninvasive tools for the early detection of significant acute cellular rejection (ACR) after HT. From January 2014 to November 2017, we prospectively studied 49 transplanted patients with normal left and right ventricular systolic function, who had undergone EMB for either surveillance or clinical suspicion of rejection. ACR was defined as >= 2R graded according to the revised International Society for Heart and Lung Transplantation by EMB. A total of 49 age- and sex-matched healthy individuals formed the control group. All studied patients underwent conventional echocardiography with the analysis of STE. The transplanted group also had their serum troponin I and BNP levels measured hours before undergoing EMB. Classic echocardiographic parameters left ventricular global longitudinal strain (LV-GLS), radial and circumferential strain and strain rate, and right ventricular free wall longitudinal strain (RV-FWLS) were analyzed. The 49 heart transplanted patients (mean age 45.2 ± 11.5 years, 28 men) underwent 66 biopsies, 6-12 months after HT. ACR was detected in 17 (26%) and no ACR in 49 (74%) of biopsies. LV-GLS, circumferential and radial strain and strain rate and RVFWLS values were significantly lower in heart transplant group than in control group. RV-FWLS was lower (absolute value) in the group with ACR than in the group without ACR (-18.28 ± 4.8% versus -22.11 ± 2.9%; p < 0.001). A RVFWLS < 17.57% had 71% sensitivity, 90% specificity, 75% positive predictive value, 84% accuracy, and 88% negative predictive value for detection of ACR. The troponin I level was significantly higher in patients with ACR (p < 0.01). The median value for this group was 0.19 [interquartile interval 0.09-1.31 ng/mL] vs. 0.05 [interquartile interval 0.01-0.18 ng/mL] for the group without ACR. In the multivariate analysis, RV-FWLS was the only independent predictor of ACR, with odds ratio of 1.70 (CI 95% = 1.17-2.48); p=0.006. We concluded that STE-derived RV-FWLS was a sensitive and specific marker of ACR. Our data suggest that this is a suitable technique for noninvasive detection of changes in the right ventricular deformation during an episode of ACR

Estudos com células tronco mesenquimais (CTm) têm despertado grande interesse devido a seu promissor potencial terapêutico e representam uma alternativa para o tratamento de diversas patologias em diferentes órgãos, inclusive em transplante renal. A rejeição crônica é um dos maiores desafios no transplante tardio e se caracteriza por perda progressiva da função renal causado pela intensa fibrogênese no aloenxerto. Os tratamentos convencionais com imunossupressores, apesar de reduzirem significativamente as crises de rejeição aguda, não interferem na sobrevida do enxerto a longo prazo. A compreensão dos processos fisiopatológicos da doença depende de seu estudo em modelos experimentais, que são de grande importância pois também propiciam uma melhor compreensão dos possíveis tratamentos. O presente estudo teve como objetivo analisar a terapia com células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (CTmTA) no modelo experimental de transplante renal em ratos, para estudar seu efeito na rejeição crônica e avaliar seu potencial efeito imunomodulador. O modelo foi estabelecido com ratos das linhagens isogênicas Fisher (doador) e Lewis (receptor) e os animais transplantados foram divididos em três grupos: ISO (transplante isogênico de Lewis para Lewis, n=6), ALO (transplante alogênico de Fisher para Lewis, n=6) e ALO+CTmTA (transplante alogênico, tratado com CTmTA, n=6). As CTmTA foram caracterizadas por aderência ao plástico, diferenciação nas linhagens adipogênica, condrogênicas e osteogênicas e por citometria de fluxo. Foram inoculadas 1 x 106 células na região subcapsular renal no dia da realização da nefrectomia unilateral direita (10 dias pós-transplante). Após 6 meses foram realizadas análises dos parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica e PCR em tempo real. As CTmTA foram eficientes em prevenir significativamente a elevação da ureia e da creatinina séricas, manter clearence de creatinina em níveis normais, e prevenir a elevação da fração de excreção de Na+ e K+. Além disso, impediram o desenvolvimento de proteinúria e da hipertensão arterial. A análise histológica mostrou uma redução significativa do infiltrado inflamatório de macrófagos e linfócitos T, além de uma diminuição da fibrose intersticial no grupo ALO+CTmTA. O tratamento com CTmTA reduziu significativamente a expressão relativa dos fatores e citocinas pró-inflamatórios tais como INF-y, TNF-alfa, IL1beta e IL-6, além de aumento importante na expressão de IL-4 e IL-10, conhecidas por seu potencial antiinflamatório. Em conclusão, o tratamento com ADMSC em um modelo experimental de transplante renal pode trazer uma nova abordagem terapêutica para controle da rejeição crônica do enxerto. A aparente modulação da resposta imune observada neste trabalho, pode estar associada a uma possível polarização de macrófagos e células T. Outros estudos pré-clínicos e clínicos são necessários para confirmar nossos resultados / Studies involving mesenchymal stem cells (MSCs) have aroused great interest due to their promising therapeutic potential representing an alternative for the treatment of several pathologies in different organs, including renal transplantation. Chronic rejection is one of the major challenges in late transplantation and is characterized by progressive loss of renal function caused by intense fibrogenesis in the allograft. Conventional immunosuppressive treatments, while significantly reducing acute rejection crises, do not interfere with long-term graft survival. Animal model of kidney transplantation can provide a better understanding of the pathophysiological processes and bring a new path to treat chronic rejection. The aim of this project was to analyze the therapy with mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ADMSCs) in the experimental model of kidney transplantation in rats, focus on chronic rejection and evaluate its potential immunomodulatory effect. The model was established with rats of isogenic strains Fisher (donor) and Lewis (recipient), and the transplanted animals were divided into three groups: ISO (isogenic transplantation from Lewis to Lewis, n = 6), ALO (allogenic transplant from Fisher to Lewis, n = 6) and ALO + ADMSCs (allogenic transplantation, treated with ADMSCs, n = 6). ADMSCs were characterized by adhesion to plastic, differentiation in adipogenic, condrogenic and osteogenic lines and by flow cytometry. One million of cells were inoculated under the renal capsule on the day of the right unilateral nephrectomy (10 days after transplantation). After 6 months, clinical and laboratory parameters were analyzed, as well as histological analysis, immunohistochemistry and real-time PCR. ADMSCs were effective in preventing elevation of serum urea and creatinine, elevation of the Na + and K + excretion fraction as well as maintained creatinine clearence at normal levels. Furthermore, the treatment also prevented the development of proteinuria and preserved blood pressure. Histological analysis showed a significant reduction of macrophages and T cells infiltrate, associated to a decreased of interstitial fibrosis in the ALO + ADMSCs group. In the presence of ADMSCs, there was a significant decrease in the relative expression of INF-y, TNF-alpha, IL1beta and IL-6 factors and pro-inflammatory cytokines, as well as a significant increase in the relative expression of anti-inflammatory cytokines as IL-4 and IL-10. In conclusion, treatment with ADMSC in a transplantation model could open a new approach to control chronic rejection. This apparent modulation of the immune response may be associated with a possible polarization of macrophages and T cells. Further pre-clinical and clinical studies are needed to confirm our findings

The transplantation of allogeneic cells and tissues for the treatment of human disease has been a life-saving procedure for many thousands of patients worldwide. However, to date, neither solid organ transplantation nor bone marrow transplantation have reached their full clinical potential. Significant limitations to the advancement of clinical transplantation stem from our current inability to prevent the rejection of allogeneic tissues by the immune system of the host. Similarly, in patients that receive allogeneic bone marrow transplants, we cannot permanently prevent the engrafted immune system from mounting a response against the patient. This problem, termed graft versus host disease is the most prevalent cause of morbidity and mortality in recipients of allogeneic bone marrow transplants. Clinically, we rely on lifelong immunosuppression to prolong survival of allogeneic tissues within the host. Our currently available therapeutics burden patients with side-effects that range from being unpleasant to life-threatening, while in most cases offering only a temporary solution to the problem of alloimmunity. Efforts are underway to develop protocols and therapeutics that more effectively prevent the pathology associated with alloimmunity. To minimize patient risk, extensive pre-clinical studies in laboratory animals are conducted to predict clinical responses. In the case of immunologic studies, many of these pre-clinical studies are carried out in murine models. Unfortunately, studies of murine immunity often do not predict outcomes in the clinic. One approach to overcome this limitation is the development of a small animal model of the human immune system. In this dissertation, we hypothesized that NOD-scid IL2rγnull mice engrafted with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), termed the hu-PBMC-NOD-scid IL2rγnull model, would provide a model that more accurately reflects human immunity in vivo than other models currently available. To investigate this possibility, we first investigated whether NOD-scid IL2rγnull mice were able to support the engraftment of human PBMC. We found that NOD-scid IL2rγnull mice engraft with human PBMC at much higher levels then the previous gold standard model, the NOD-scid mouse. We then investigated the kinetics of human cell engraftment, determined the optimal cell dose, and defined the influence of injection route on engraftment levels. Even at low PBMC input, NOD-scid IL2rγnullmice reproducibly support high levels of human PBMC engraftment. In contrast to previous stocks of immunodeficient mice, we observed low intra- and interdonor variability of engraftment. We next hypothesized that the human PBMC engrafted in NOD-scid IL2rγnull mice were functional and would reject transplanted allogeneic human tissues. To test this, human islets were transplanted into the spleen of chemically diabetic NOD-scid IL2rγnull mice with or without intravenous injection of HLA-mismatched human PBMC. In the absence of allogeneic PBMC, the human islets were able to restore and maintain normoglycemia. In contrast, human islet grafts were completely rejected following injection of HLA-mismatched human PBMC as evidenced by return to hyperglycemia and loss of human C-peptide in the circulation. Thus, PBMC engrafted NOD-scid IL2rγnull mice are able to provide an in vivomodel of a functional human immune system and of human islet allograft rejection. The enhanced ability of NOD-scid IL2rγnull mice to support human cell engraftment gave rise to the possibility of creating a model of graft versus host disease mediated by a human immune system. To investigate this possibility, human PBMC were injected via the tail vein into lightly irradiated NOD-scid IL2rγnull mice. We found that in contrast to previous models of GVHD using human PBMC-injected immunodeficient mice, these mice consistently (100%) developed GVHD following injection of as few as 5x106PBMC, regardless of the PBMC donor used. We then tested the contribution of host MHC in the development of GVHD in this model. As in the human disease, the development of GVHD was highly dependent on host expression of MHC class I and class II molecules. To begin to evaluate the extent to which the PBMC-engrafted NOD-scid IL2rγnull humanized mouse model of GVHD represents the clinical disease, we tested the ability of a therapeutic in clinical trials to modulate GVHD in these mice. In agreement with the clinical experience, we found that interrupting the TNFα signaling cascade with etanercept delayed the onset and severity of disease in this model. In summary, we conclude that humanized NOD-scid IL2rγnull mice represent an important surrogate for investigating in vivo mechanisms of both human islet allograft rejection and graft versus host disease.

The NOD mouse is a widely studied model of type 1 diabetes. The loss of self-tolerance leading to autoimmune diabetes in NOD mice involves at least 27 genetic loci. Curing type I diabetes in mice and humans by islet transplantation requires overcoming both allorejection and recurrent autoimmunity. This has been achieved with systemic immunosuppression, but tolerance induction would be preferable. In addition to their genetic defects in self-tolerance, NOD mice resist peripheral transplantation tolerance induced by costimulation blockade using donor-specific transfusion and anti-CDl54 antibody. Failure has been attributed to the underlying autoimmunity, assuming that autoimmunity and resistance to transplantation tolerance have a common basis. Hypothesizing that these two abnormalities might be related, we investigated whether they had a common genetic basis. Diabetes-resistant NOD and C57BL/6 stocks congenic for various reciprocally introduced Idd loci were assessed for their ability to be tolerized. Surprisingly, in NOD congenic mice that are almost completely protected from diabetes, costimulation blockade failed to prolong skin allograft survival. In reciprocal C57BL/6 congenic mice with NOD-derived Idd loci, skin allograft survival was readily prolonged by costimulation blockade. Unexpectedly, we observed that (NOD x C57BL/6)F1 mice, which have no diabetes, nonetheless resist induction of tolerance to skin allografts. Further analyses revealed that the F1 mice shared the dendritic cell maturation defects and abnormal CD4+ T cell responses of the NOD but had lost its defects in macrophage maturation and NK cell activity. Finally, using a genome wide scan approach, we have identified four suggestive markers in the mouse genome that control the survival of skin allografts following DST and anti-CD154 mAb therapy. We suggest that mechanisms controlling autoimmunity and transplantation tolerance in NOD mice are not completely overlapping and are potentially distinct, or that the genetic threshold for normalizing the transplantation tolerance defect is higher than that for preventing autoimmune diabetes. We conclude that resistance to allograft tolerance induction in the NOD mouse is not a direct consequence of overt autoimmunity and that autoimmunity and resistance to costimulation blockade-induced transplantation tolerance phenotypes in NOD mice are not under identical genetic control.

O CD30 solúvel (CD30s) é uma glicoproteína transmembrana da família do fator de necrose tumoral expressa na superfície das células T. Quando este marcador é clivado ele torna-se solúvel, sendo detectado na circulação. Atualmente, o valor de CD30s pré-transplante vem sido demonstrado como um bom preditor de rejeição aguda (RA) e perda do enxerto. Poucos estudos foram realizados para sua avaliação no pós-transplante e sua correlação com sobrevida e TFG. Avaliar a eficácia da determinação dos marcadores laboratoriais CD30 solúvel (CD30s) e anticorpos reativos contra painel HLA (PRA) em seis meses, um ano e seis anos pós-transplante renal em receptores de doadores vivos, correlacionando estes marcadores com episódios de rejeição aguda, eventos infecciosos no pós-transplante, perda do enxerto e óbito do paciente transplantado. E, avaliar a correlação destes marcadores com a sobrevida do enxerto renal nestes períodos. Os pacientes estudados foram transplantados renais com doadores vivos no Hospital Federal de Bonsucesso (HFB) do Rio de Janeiro no ano de 2006 e do período de agosto de 2010 a maio de 2011, sendo uma extensão de um trabalho realizado previamente. CD30s e PRA foram analisados nas amostras coletadas no pré-transplante e com 7, 14, 21 dias, 1, 3, 6, 12 meses após o transplante e nos pacientes transplantados em 2006 amostras após 6 anos de transplante. A taxa de filtração glomerular (TFG) foi estimada utilizando MDRD e CKD-epi e 6 meses, 1 ano e 6 anos após o transplante. Os pacientes foram agrupados em 5 grupos: sem eventos, com perda do enxerto, óbito, rejeição aguda e pacientes com quadros infecciosos. Estes grupos foram avaliados com relação ao CD30s, PRA I e II e comparados dois a dois. O teste qui quadrado foi utilizado. Quando necessário aplicou-se a correção de Yates, o teste de Fisher, o teste de Kruskal-wallis. Foi considerado estatisticamente significante p<0,05. As análises foram feitas pelo programa EPI-Info (versão 3.5.3). Setenta e seis pacientes com doadores vivos foram incluídos no estudo 47 pacientes não tiveram nenhum evento (grupo 1), 7 pacientes perderam o enxerto (grupo 2), 3 pacientes faleceram (grupo 3), 11 pacientes ficaram no grupo de rejeição aguda (grupo 4) e oito pacientes tiveram infecção por CMV e herpes (grupo 5). Os pacientes do grupo de RA tiveram correlação positiva com os valores tanto de CD30s Pré-transplante (p=0,01), quanto do CD30s pós-transplante (p=0,002) e PRA I e II (p<0,001), respectivamente, quando comparados com pacientes sem eventos. A TFG tanto com MDRD e CKD-Epi não mostrou correlação com CD30s pré e pós-transplante e nem PRA I e II. A TFG com as duas fórmulas foi menor no grupo com RA comparado com o grupo sem evento após 6 anos de transplante (p=0,006). CD30s é um bom preditor de RA, assim como PRAI e II. E, também mais uma ferramenta que pode ser utilizada no acompanhamento pós-transplante Renal. A RA é um preditor isolado para diminuição de TFG no transplante.

Tolerance-based stem cell transplantation using sub-lethal conditioning is being considered for the treatment of human disease, but safety and efficacy remain to be established. In order to study these two issues, we first established that mouse bone marrow recipients treated with sub-lethal irradiation plus transient blockade of the CD40-CD154 costimulatory pathway develop permanent hematopoietic chimerism across allogeneic barriers. Our conditioning regimen of 6 Gy irradiation, a short course of anti-CD154 mAb and 25 million fully allogeneic BALB/c bone marrow cells consistently produced long-term, stable, and multilineage chimerism in C57BL/6 recipients. Furthermore, chimeric mice displayed donor-specific transplantation tolerance, as BALB/c skin allografts were permanently accepted while third-party CBA/JCr skin allografts were promptly rejected. We next determined both the safety and efficacy of this protocol by infecting chimeric mice with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) either at the time of transplantation or at several time points afterwards. Infection with LCMV at the time of transplantation prevented engraftment of allogeneic, but not syngeneic, bone marrow in similarly treated mice. Surprisingly, infected allograft recipients also failed to clear the virus and died. Post-mortem study revealed hypoplastic bone marrow and spleens. Hypoplasia and death in these mice required the combination of 6 Gy irradiation, LCMV infection on the day of transplantation, and an allogeneic bone marrow transplant but did not require the presence of anti-CDl54 mAb. Allochimeric mice infected with LCMV 15 days after transplantation were able to survive and maintain their bone marrow graft, indicating that the deleterious effects of LCMV infection on host and graft survival are confined to a narrow window of time during the tolerization and transplantation process. The final section of this thesis studied the mechanisms of graft rejection and death in sublethally irradiated recipients of allogeneic bone marrow and infection with LCMV at the time of bone marrow transplantation. Infection of interferon-α/β receptor knockout mice at the time of transplantation prevented the engraftment of allogeneic bone marrow, but the mice survived. Therefore, IFN-αβ is involved in the development of marrow hypoplasia and death, whereas a second mechanism is involved in blocking the development of chimerism in these mice. Through the use of depleting mAb's and knockout mice we demonstrate that three types of recipients survived and became chimeric after being given sublethal irradiation, anti-CD154 mAb, an allogeneic bone marrow transplant and a day 0 LCMV infection: mice depleted of CD8+ T cells, CD8 knockout mice, and TCR-αβ knockout mice. Our data indicate that the mediator of bone marrow allograft destruction in LCMV-infected mice treated with costimulatory blockade is a radioresistant CD8+ NK1.1- TCRαβ+ T cell. We conclude that a non-cytopathic viral infection at the time of transplantation can prevent engraftment of allogeneic bone marrow and result in the death of sub-lethally irradiated mice treated with costimulation blockade. The abrogation of allogeneic bone marrow engraftment is mediated by a population of CD8+ NK1.1- TCRαβ+ T cells and the mediator of hypoplasia and death is viral induction of IFN-αβ.

O CD30 solúvel (CD30s) é uma glicoproteína transmembrana da família do fator de necrose tumoral expressa na superfície das células T. Quando este marcador é clivado ele torna-se solúvel, sendo detectado na circulação. Atualmente, o valor de CD30s pré-transplante vem sido demonstrado como um bom preditor de rejeição aguda (RA) e perda do enxerto. Poucos estudos foram realizados para sua avaliação no pós-transplante e sua correlação com sobrevida e TFG. Avaliar a eficácia da determinação dos marcadores laboratoriais CD30 solúvel (CD30s) e anticorpos reativos contra painel HLA (PRA) em seis meses, um ano e seis anos pós-transplante renal em receptores de doadores vivos, correlacionando estes marcadores com episódios de rejeição aguda, eventos infecciosos no pós-transplante, perda do enxerto e óbito do paciente transplantado. E, avaliar a correlação destes marcadores com a sobrevida do enxerto renal nestes períodos. Os pacientes estudados foram transplantados renais com doadores vivos no Hospital Federal de Bonsucesso (HFB) do Rio de Janeiro no ano de 2006 e do período de agosto de 2010 a maio de 2011, sendo uma extensão de um trabalho realizado previamente. CD30s e PRA foram analisados nas amostras coletadas no pré-transplante e com 7, 14, 21 dias, 1, 3, 6, 12 meses após o transplante e nos pacientes transplantados em 2006 amostras após 6 anos de transplante. A taxa de filtração glomerular (TFG) foi estimada utilizando MDRD e CKD-epi e 6 meses, 1 ano e 6 anos após o transplante. Os pacientes foram agrupados em 5 grupos: sem eventos, com perda do enxerto, óbito, rejeição aguda e pacientes com quadros infecciosos. Estes grupos foram avaliados com relação ao CD30s, PRA I e II e comparados dois a dois. O teste qui quadrado foi utilizado. Quando necessário aplicou-se a correção de Yates, o teste de Fisher, o teste de Kruskal-wallis. Foi considerado estatisticamente significante p<0,05. As análises foram feitas pelo programa EPI-Info (versão 3.5.3). Setenta e seis pacientes com doadores vivos foram incluídos no estudo 47 pacientes não tiveram nenhum evento (grupo 1), 7 pacientes perderam o enxerto (grupo 2), 3 pacientes faleceram (grupo 3), 11 pacientes ficaram no grupo de rejeição aguda (grupo 4) e oito pacientes tiveram infecção por CMV e herpes (grupo 5). Os pacientes do grupo de RA tiveram correlação positiva com os valores tanto de CD30s Pré-transplante (p=0,01), quanto do CD30s pós-transplante (p=0,002) e PRA I e II (p<0,001), respectivamente, quando comparados com pacientes sem eventos. A TFG tanto com MDRD e CKD-Epi não mostrou correlação com CD30s pré e pós-transplante e nem PRA I e II. A TFG com as duas fórmulas foi menor no grupo com RA comparado com o grupo sem evento após 6 anos de transplante (p=0,006). CD30s é um bom preditor de RA, assim como PRAI e II. E, também mais uma ferramenta que pode ser utilizada no acompanhamento pós-transplante Renal. A RA é um preditor isolado para diminuição de TFG no transplante.