INTRODUÇÃO: O objetivo do estudo foi avaliar o perfil de marcadores imuno-histoquímicos relacionados às células NK em biópsias de aloenxertos renais com diagnóstico anatomopatológico de rejeição aguda (mediadas por células T ou anticorpos) e estabelecer relações desses marcadores com parâmetros morfológicos de lesão à microcirculação e sobrevida do enxerto. MÉTODOS: Estudo retrospectivo histórico que revisou 74 biópsias realizadas entre janeiro de 2009 e dezembro de 2012, de pacientes com rejeição aguda mediada por células T (n=36), rejeição aguda mediada por anticorpos com expressão positiva (n=19) ou negativa (n=19) para o marcador C4d, juntamente com levantamento de dados clínicos e laboratoriais pertinentes ao estudo. Foram realizadas reações imuno-histoquímicas, para os marcadores CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 e CD4 com ênfase para os marcadores CD56 e CD16. Foi feita análise das células positivas em toda a cortical da biópsia nos compartimento intersticial, glomerular e vascular. Testes estatísticos foram aplicados conforme os pressupostos definidos no objetivo da pesquisa. RESULTADOS: No compartimento intersticial, células CD56+ (P = 0,004) e CD57+ (P < 0,001) foram expressas em maior quantidade em biópsias negativas para dosagem sérica de anticorpos específicos anti-doador (DSA) com diagnóstico de rejeição aguda mediada por células T. CD56 intersticial foi associado estatisticamente com presença de glomerulite (g >= 1) (P = 0,02) e ausência / leve capilarite peritubular (ptc <= 1) (P = 0,003). Células intersticiais positivas para o marcador CD56 com média superior a 0,56 céls/mm2 tiveram uma pior sobrevida do enxerto renal (P = 0,028). Biópsias com contagem inferior ou igual a 0,56 cél/mm2 tiveram associação estatisticamente significante para ausência ou leve capilarite peritubular (P = 0,012) e com contagem superior a 0,56 céls/mm2, foram associadas à presença de glomerulite (P = 0,002). Foi observado maior número de células positivas para o marcador CD16 no compartimento glomerular em biópsias positivas para dosagem sérica de DSA com diagnóstico de rejeição aguda mediada por anticorpos (P = 0,03) e em biópsias com presença de glomerulite (P = 0,009). Presença de maior número de células CD16+ no compartimento intersticial associou-se com capilarite peritubular (P = 0,0001). CONCLUSÕES: Maior expressão de células CD56 positivas no compartimento intersticial das biópsias foi significantemente associada com escores relacionados à lesão na microcirculação, especialmente glomerulite, com rejeição aguda mediada por células T e pior sobrevida do enxerto renal. Células CD16 positivas, no compartimento glomerular foram associadas com rejeição aguda mediada por anticorpos e glomerulite. As variações na expressão dos marcadores de células NK nos diferentes compartimentos da biópsia renal podem sugerir presença de envolvimento das células NK em diferentes vias do sistema imune nas rejeições agudas de aloenxertos renais / INTRODUCTION: The aim of this study was to investigate the immunohistochemical profile of markers related to NK cells from renal allograft biopsies with morphological diagnosis of acute rejection (T-cells or antibodies mediated rejection) and to study associations of those markers with types of rejection, microcirculation injury morphological parameters and graft survival. METHODOLOGY: Historical retrospective study that reviewed 74 biopsies performed between January 2009 and December 2012 in patients with acute T-cell-mediated rejection (n=36) and acute antibody-mediated rejection with (n=19) or without evident C4d deposition (n=19). The study was performed with relevant clinical and laboratory data. Immunohistochemical reactions were performed for CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 and CD4 markers with highlights for CD56 and CD16. Counting of positive cells throughout cortical biopsy was performed in glomerular, interstitial and vascular compartments. Statistical tests were applied according to assumptions set out the goal of the study.RESULTS: DSA-negative biopsies-from patients with acute T-cell mediated rejection (aTCMR) had an increased expression of CD56+ and CD57+ cells (P = 0.004 and P < 0.001) in the interstitial compartment in comparison with donor-specific antibodies ( DSA)-positive biopsies from patients acute antibody-mediated rejection with and without C4d deposition. Interstitial CD56+ cells had an increased expression for presence of glomerulitis (g >= 1) (P = 0.02) and peritubular capillaritis (ptc >= 2) (P = 0.003). Interstitial CD56 + cells with mean superior to 0.56cells/mm2 had worse allograft survival (P = 0.028). CD56+ cells in the interstitial compartment with mean inferior or equal to 0.56cells/mm2 associated with absence or mild peritubular capillaritis (P = 0.012) and mean superior to 0.56cells/mm2 was associated with presence of glomerulitis (P = 0.002). CD16+ cells was increased in the glomerular compartment in DSA-positive biopsies (P = 0.03) and in the presence of glomerulitis (P = 0.009). Interstitial CD16+ cells associated with peritubular capillaritis (P = 0.0001).CONCLUSION: CD56+ cell infiltrates in the interstitial compartment were significantly associated with microcirculation injury scores, especially glomerulitis, acute T-cell mediated rejection and clinical outcomes. CD16+ cell infiltrates in glomerular compartment was associated with acute antibody-mediated rejection and glomerulitis. Our findings showed variations in expression of NK cells markers in renal biopsy different compartments which might suggest the involvement of NK cells in different immune system pathways in acute renal allograft rejection

Regulatory T cells (Tregs), lymphocytes that suppress immunological reactions, are of great interest for our comprehension of basic immunology and as a therapeutic agent to treat immune-mediated pathologies. Understanding the physiology of these cells will help to inform clinical strategies targeting Tregs. In order to study the homing of human Tregs, we utilised genetic engineering to drive expression of fluorescent protein in human Tregs, permitting in vivo cell tracking. We optimised a protocol for lentivirus-mediated transduction of human Tregs during in vitro expansion, to generate high yields of stably-engineered cells. After infusing labelled cells into a humanised mouse model of skin allotransplantation, we detected human Tregs within a human skin graft by PCR and visualised Tregs moving in the graft, in a live mouse, by two-photon microscopy. Through reverse genetic analyses, we explored molecular mechanisms that allow Tregs to respond adaptively to environmental cues. Neuropilin-1 (NRP1), a transmembrane co-receptor, has been implicated in the function of mouse Tregs. Tregs transduced with shRNA to knock down NRP1 were severely impaired in their capacity to suppress cell proliferation in vitro and to prolong allograft survival in a humanised mouse model. qRT-PCR analysis revealed that transcription the gene encoding the anti-inflammatory cytokine IL-10, and the autophagy-associated genes BECN1, COPS4 and MAP1LC3B, was significantly diminished in NRP1-deficient Tregs. We concluded that in human Tregs, NRP1 is necessary for suppressive function, most likely via regulation of NRP1-dependent regulation of cytokine production and metabolism. Having identified a molecular target via which Treg function might be potentiated, we explored methods to target such molecules for cell therapy applications. Tregs engineered to over-express IL-10, but not NRP1, exerted significantly enhanced suppression of cell proliferation in vitro. Thus, relatively straightforward genetic engineering, compatible with generation of therapeutic cell yields, could be exploited to improve the efficacy of Treg cellular therapy.

A tolerância operacional (TO) é um raro fenômeno que ocorre em indivíduos transplantados, que permanecem com função estável do aloenxerto, sem rejeição, após a suspensão de drogas imunossupressoras, por pelo menos um ano. A compreensão de mecanismos envolvidos na tolerância operacional poderá contribuir para a elaboração de novas terapias imunorreguladoras, na clínica do transplante. Investigamos se, no estado de tolerância operacional, há um perfil funcional diferencial de resposta imune celular antígeno-específica, dirigida a três grupos de antígenos relevantes no alotransplante: aloantígenos do doador (peptídeos HLA-DR), antígenos de patógenos (peptídeos do CMV - citomegalovírus) e autoantígenos (peptídeos da Hsp60 - Proteína de choque térmico 60, com funções imunológicas, imunorreguladora (REGULA) e pró-inflamatória (INFLAMA). Analisamos a produção de citocinas (por Luminex) e a proliferação de diferentes subpopulações de células T CD4+ (por FACS), com funções, predominantemente, REGULA ou INFLAMA, frente aos três tipos de antígenos, comparativamente entre TO (n=6) e Rejeição Crônica (RC: n=8), indivíduos com função estável do enxerto, usando imunossupressores (EST: n=8) e indivíduos saudáveis (SAU: n=7). Em concordância com nossa hipótese, a resposta celular é modulada, de forma diferencial, na tolerância operacional, ocorrendo um desvio funcional da resposta a peptídeos HLA-DR do doador para um perfil REGULA, enquanto é preservado o perfil INFLAMA na resposta a peptídeos do patógeno (CMV). Apesar das diferenças nas respostas aos peptídeos do CMV entre TO e RC (p=0,02 e p=0,02 para citocinas e subpopulações regula e p=0,008 e p=0,003 para citocinas e subpopulações inflama), houve preservação do perfil INFLAMA na TO, em relação ao estado fisiológico, com indução/aumento das citocinas inflamatórias IL-1B, IL-17, IFNy, MCP-1 e MIP-1B, com algum grau de inibição de citocinas imunorreguladoras, e inibição da proliferação de células Tregs, sugerindo serem importantes mecanismos na preservação da imunocompetência, na tolerância operacional. Na resposta celular a autoantígenos, destacamos o peptídeo N6 que induziu um perfil significativamente diferente na TO (mais REGULA), em relação à RC (mais INFLAMA) (p=0,001 para citocinas regula; p=0,04 para citocinas inflama), principalmente pelo aumento/indução da produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, na TO, sugerindo que o peptídeo N6 possa ter uma contribuição nos mecanismos na TO, favorecendo a produção dessas citocinas com atividade imunorreguladora. Considerando a diferença significativa do perfil funcional de resposta aos aloantígenos do doador entre TO (REGULA) e RC (INFLAMA) (p=0,0007 para citocinas regula e p < 0,0001 para citocinas inflama), principalmente pela inibição das citocinas próinflamatórias, como IL-1B, IL-8, IL-12, IL-17, G-CSF, IFN-y e MCP-1, na TO, concluímos que o desvio REGULA da via indireta de alorreconhecimento dirigida a peptídeos HLA-DR do doador, com inibição dessas citocinas, tenha um papel importante nos mecanismos envolvidos na tolerância operacional. Em conclusão os mecanismos em curso na tolerância operacional, modulam a resposta celular antígeno-específica dirigida a desafios antigênicos no transplante, envolvendo o desvio REGULA da resposta a peptídeos HLA-DR do doador, a participação da autoimunidade imunorreguladora à Hsp60, ao mesmo tempo em que há preservação da resposta inflamatória a patógenos / Operational tolerance (OT) is a rare phenomenon, taking place in transplanted individual who do not reject, following the complete withdrawal of immunosuppressive drugs for at least one year. Understanding the mechanisms involved in operational tolerance will contribute to opening new pathways for the development of novel immunoregulatory therapies, in transplantation. We investigated whether the state of operational tolerance displays a functionally differential profile of the antigen-specific cellular response, directed to three groups of antigens, relevant in the context of allotransplantation: donor alloantigens (HLA-DR peptides), pathogen-derived antigens (cytomegalovirus peptides - CMV) and autoantigens (peptides derived from the Hsp60 - selfantigen displaying immunoregularory (REG) and proinflammatory (INFLAMMA) properties). We determined cytokine production (by Luminex) and the proliferative response of different CD4+ T cell subsets (by FACS), displaying predominantly REG or INFLAMMA activities, in response to the three types of antigens, comparing OT (n=6) with Chronic Rejection (CR: n=8), individual with stable graft function, taking conventional immunosuppression (Sta: n=8), and healthy individuals (HI: n=7). In concordance with our hypothesis, the cellular immune response is differentially modulated in operational tolerance, giving rise to an immunoregulatory deviation in the response to HLA-DR donor peptides, preserving the proinflammatory response to pathogen peptides (CMV). Despite significant differences in the responses to CMV peptides, between OT and CR (p=0.02 and p=0.02 for REG cytokines and CD4+ subsets; p=0.008 and p=0.003 for INFLAMMA cytokines and CD4+ subsets), OT is able to preserve the INFLAMMA response in relation to the physiologic state (HI). This INFLAMMA profile of the response to CMV peptides is maintained by the induction/increase of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-17, IFN-y, MCP-1 and MIP-1B, some inhibition of REG cytokines and inhibition of Treg proliferation, suggesting that these are important mechanisms in the preservation of immunocompetence to deal with pathogens, in OT. In the cellular response to autoantigens, we highlight the N6 peptide that induced a differential profile in OT (REG profile) compared to CR (INFLAMMA profile) (p=0.001 for REG cytokines; p=0.04 for INFLAMMA cytokines), due to the induction/increase of IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, in OT, suggesting that N6 may contribute to the underlying mechanisms in OT, favoring the production of these immunoregulatory cytokines. Taken the marked differences in the response to donor alloantigens, between OT (predominantly REG) and CR (predominantly INFLAMMA) (p=0.0007 for REG cytokines and p < 0.0001 for INFLAMMA cytokines), due to the inhibition of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-8, IL- 12, IL-17, G-CSF, IFN-y and MCP-1, in OT, we conclude that the immunoregulatory deviation in the indirect pathway of allorecognition, directed to donor HLA-DR peptides, leading to the inhibition of these cytokines, has an important role in the mechanisms of tolerance. In conclusion, the ongoing immunoregulatory mechanisms in operational tolerance, modulate the antigenspecific cellular response to relevant antigenic challenges in allotransplantation, involving a REG deviation in the response to donor HLA-DR peptides, together with the participation of immunoregulatory autoimmunity to Hsp60, while preserving the proinflmammatory response to pathogens

NOD mice model human type 1 diabetes and have been used to investigate tolerance induction protocols for islet transplantation in a setting of autoimmunity. Costimulation blockade-based tolerance protocols that induce prolonged skin and permanent islet allograft survival in non-autoimmune mice have failed in NOD mice. To investigate the underlying mechanisms, we generated NOD hematopoietic chimeras. We were able to show that dendritic cell maturation defects seen in NOD mice are partially corrected in mixed hematopoietic chimeras. Furthermore, skin allograft survival was dependent upon the phenotype of the bone marrow donor, demonstrating that in the NOD the resistance to tolerance induction resides in the hematopoietic compartment. In addition, we studied congenic NOD mice bearing insulin dependent diabetes (Idd) loci that reduce diabetes incidence. The incidence of diabetes is reduced in NOD.B6 Idd3 mice, and virtually absent in NOD.B6 Idd3Idd5 mice. Islet allograft survival in NOD.B6 Idd3 mice is prolonged as compared to NOD mice, and in NOD.B6 Idd3Idd5 mice islet allograft survival is similar to that achieved in C57BL/6 mice. Alloreactive CD8 T cell depletion in NOD mice treated with costimulation blockade is impaired, but is partially restored in NOD.B6 Idd3 mice, and completely restored in NOD.B6 Idd3Idd5 mice. Idd3 results from variations in Il2 gene transcription. We hypothesized insufficient levels of IL-2 in NOD mice contributes to impaired deletion of alloreactive CD8 T cells and shortened islet allograft survival. We observed using synchimeric mice that co-administration of exogenous IL-2 to NOD mice treated with costimulation blockade led to deletion of alloreactive CD8 T cells comparable to that in C57BL/6 mice and prolonged islet allograft survival. However, some Idd loci impaired the induction of transplantation tolerance. These data suggest that Idd loci can facilitate or impair induction of transplantation tolerance by costimulation blockade, and that Idd3 (IL-2) is critical component in this process.

A partir da década de 60, com a utilização do transplante renal em larga escala como terapia substitutiva para pacientes com falência do órgão, surgiu a preocupação quanto ao desenvolvimento do processo de rejeição do enxerto. Tal intercorrência, em geral, cursa com sinais e sintomas clínicos apenas quando o evento está bem estabelecido, ou mesmo quando lesões irreversíveis já se instalaram. Assim, é fundamental um acompanhamento rigoroso, visando detectar os casos subclínicos. O presente trabalho, a fim de fornecer novas ferramentas que auxiliem o diagnóstico precoce de rejeição do enxerto, avaliou a expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD3, CD5, CD20, CD68, CD25, FoxP3 e C4d em biópsias renais realizadas entre os anos de 2007 e 2009 em pacientes transplantados acompanhados pelo Serviço de Nefrologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto, UERJ - RJ, correlacionando os resultados obtidos com o diagnóstico histológico. Para tal, as biópsias foram reavaliadas por três médicos patologistas que as classificaram, segundo Critérios de Banff 2007, quanto à presença ou não de rejeição do enxerto e seu tipo, aguda ou crônica. A partir de então, os blocos de parafina foram processados pela técnica Tissue Microarray for all (Pires, ARC. e cols.) e submetidos à imuno-histoquímica. A positividade dos marcadores foi avaliada e graduada e os resultados encontrados foram correlacionados, em um primeiro momento, com a presença ou ausência de rejeição. Posteriormente, os casos com diagnóstico histológico de rejeição tiveram seu perfil imuno-histoquímico analisado em função da positividade para C4d, marcador definidor de rejeição humoral. Neste momento, buscou-se averiguar se os anticorpos estudados seriam úteis em detectar, neste grupo, rejeição humoral e celular. Após a análise estatística, realizada pelo Teste Exato de Fisher, pode-se, então, concluir que o comportamento do marcador CD3 é capaz de inferir a presença de rejeição e que os anticorpos CD5 e CD25 permitem sugerir rejeição celular e humoral, respectivamente. Foi observado também que casos sem diagnóstico histológico de rejeição podem apresentar marcação para C4d em mais de 10% de seus capilares peritubulares. / From the 60's, with the use of renal transplantation on a large scale as replacement therapy for patients with organ failure, came out the concern about the development process of graft rejection. This intercurrence, generally, evolves with clinical signs and symptoms only when the event is well established, or even when irreversible damage has already been installed. So, is essential a close monitoring, looking forward to detect subclinical cases. The present work, in order to provide new tools that help in the early diagnosis of rejection of the graft, evaluated the immunohistochemical expression of CD3, CD5, CD20, CD68, CD25, FoxP3 and C4d in renal biopsies performed between the years 2007 and 2009 in transplanted patients accompanied by the Department of Nephrology of Pedro Ernesto University Hospital, UERJ - RJ, correlating the results with the histological diagnosis. To this, the biopsies were evaluated by three pathologists who classified them, according to Banff 2007 Criteria, for the presence or absence of graft rejection and its type, acute or chronic. Thereafter, the paraffin blocks were processed by Tissue Microarray for all technique (Pires, ARC. & cols.) and submitted to immunohistochemistry. The positivity of the markers was evaluated and graded and the results were correlated, at first, with the presence or absence of rejection. Later, cases with histological diagnosis of rejection had their immunohistochemical profile considered according to the positivity for C4d, a defining marker of humoral rejection. At this point, we sought to determine whether the antibodies would be useful in detecting, in this studied group, humoral and cellular rejection. After statistical analysis, performed by Fisher's Exact Test, it could be, therefore, concluded that the behavior of the CD3 marker is able to infer the presence of rejection and that CD5 and CD25 antibodies may suggest cellular and humoral rejection, respectively. It was also observed that cases without histological diagnosis of rejection may have markings for C4d in more than 10% of their peritubular capillaries.

A partir da década de 60, com a utilização do transplante renal em larga escala como terapia substitutiva para pacientes com falência do órgão, surgiu a preocupação quanto ao desenvolvimento do processo de rejeição do enxerto. Tal intercorrência, em geral, cursa com sinais e sintomas clínicos apenas quando o evento está bem estabelecido, ou mesmo quando lesões irreversíveis já se instalaram. Assim, é fundamental um acompanhamento rigoroso, visando detectar os casos subclínicos. O presente trabalho, a fim de fornecer novas ferramentas que auxiliem o diagnóstico precoce de rejeição do enxerto, avaliou a expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD3, CD5, CD20, CD68, CD25, FoxP3 e C4d em biópsias renais realizadas entre os anos de 2007 e 2009 em pacientes transplantados acompanhados pelo Serviço de Nefrologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto, UERJ - RJ, correlacionando os resultados obtidos com o diagnóstico histológico. Para tal, as biópsias foram reavaliadas por três médicos patologistas que as classificaram, segundo Critérios de Banff 2007, quanto à presença ou não de rejeição do enxerto e seu tipo, aguda ou crônica. A partir de então, os blocos de parafina foram processados pela técnica Tissue Microarray for all (Pires, ARC. e cols.) e submetidos à imuno-histoquímica. A positividade dos marcadores foi avaliada e graduada e os resultados encontrados foram correlacionados, em um primeiro momento, com a presença ou ausência de rejeição. Posteriormente, os casos com diagnóstico histológico de rejeição tiveram seu perfil imuno-histoquímico analisado em função da positividade para C4d, marcador definidor de rejeição humoral. Neste momento, buscou-se averiguar se os anticorpos estudados seriam úteis em detectar, neste grupo, rejeição humoral e celular. Após a análise estatística, realizada pelo Teste Exato de Fisher, pode-se, então, concluir que o comportamento do marcador CD3 é capaz de inferir a presença de rejeição e que os anticorpos CD5 e CD25 permitem sugerir rejeição celular e humoral, respectivamente. Foi observado também que casos sem diagnóstico histológico de rejeição podem apresentar marcação para C4d em mais de 10% de seus capilares peritubulares. / From the 60's, with the use of renal transplantation on a large scale as replacement therapy for patients with organ failure, came out the concern about the development process of graft rejection. This intercurrence, generally, evolves with clinical signs and symptoms only when the event is well established, or even when irreversible damage has already been installed. So, is essential a close monitoring, looking forward to detect subclinical cases. The present work, in order to provide new tools that help in the early diagnosis of rejection of the graft, evaluated the immunohistochemical expression of CD3, CD5, CD20, CD68, CD25, FoxP3 and C4d in renal biopsies performed between the years 2007 and 2009 in transplanted patients accompanied by the Department of Nephrology of Pedro Ernesto University Hospital, UERJ - RJ, correlating the results with the histological diagnosis. To this, the biopsies were evaluated by three pathologists who classified them, according to Banff 2007 Criteria, for the presence or absence of graft rejection and its type, acute or chronic. Thereafter, the paraffin blocks were processed by Tissue Microarray for all technique (Pires, ARC. & cols.) and submitted to immunohistochemistry. The positivity of the markers was evaluated and graded and the results were correlated, at first, with the presence or absence of rejection. Later, cases with histological diagnosis of rejection had their immunohistochemical profile considered according to the positivity for C4d, a defining marker of humoral rejection. At this point, we sought to determine whether the antibodies would be useful in detecting, in this studied group, humoral and cellular rejection. After statistical analysis, performed by Fisher's Exact Test, it could be, therefore, concluded that the behavior of the CD3 marker is able to infer the presence of rejection and that CD5 and CD25 antibodies may suggest cellular and humoral rejection, respectively. It was also observed that cases without histological diagnosis of rejection may have markings for C4d in more than 10% of their peritubular capillaries.

Orientador: Newton Kara-Jose / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T21:12:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_DacioCarvalho_D.pdf: 11382661 bytes, checksum: a5c3e2c591c002085753bfe5397e34f3 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Objetivo: Comparar a eficácia da injeção subconjuntival de 20 mg de triancinolona associada a prednisolona 1% tópica com a injeção intravenosa de 500 mg de metilprednisolona associada a prednisolona 1% tópica no tratamento da rejeição endotelial de transplante de córnea. Métodos: Estudo caso-controle realizado no Hospital das Clínicas da UNICAMP. Os pacientes submetidos a transplante penetrante de córnea que apresentaram primeiro episódio de rejeição endotelial com até 15 dias do início dos sintomas durante o período de novembro de 2005 a outubro de 2006 foram tratados com injeção subconjuntival de 20 mg de acetonido de triancinolona associado a acetato de prednisolona 1% tópico. Estes pacientes foram pareados por idade e diagnóstico com pacientes submetidos a tratamento com injeção intravenosa de 500 mg de succinato sódico de metilprednisolona associado a acetato de prednisolona 1% tópico e analisados quanto à capacidade de reversão do episódio de rejeição, pressão intraocular aos 30 dias e acuidade visual ao final de 1 ano. Resultados: 16 pacientes foram tratados com 20 mg de triancinolona subconjuntival e prednisolona 1% tópica durante o período de recrutamento e foram pareados com 16 pacientes tratados com 500 mg de metilprednisolona intravenosa e prednisolona 1% tópica. Ao final de 1 ano, o grupo tratado com triancinolona obteve melhores resultados do que o grupo tratado com metilprednisolona (p=0,025), obtendo 15 pacientes com córnea transparente enquanto o grupo tratado com metilprednisolona obteve 10 pacientes. 3 pacientes do grupo tratado com triancinolona apresentaram segundo episódio de rejeição durante o seguimento e foram retratados com sucesso enquanto no grupo da metilprednisolona, 4 pacientes apresentaram segunda rejeição, com 2 pacientes apresentando falência com o retratamento e 2 obtendo sucesso. A pressão intraocular subiu nos dois grupos (p=0,002) após 30 dias, porém não houve diferença entre os grupos (p=0,433). A acuidade visual melhorou após 1 ano em ambos os grupos (p=0,049) e o grupo tratado com triancinolona obteve melhor acuidade visual (p=0,002). Conclusão: A injeção subconjuntival de 20 mg de triancinolona combinada com prednisolona 1% tópica mostrou-se mais eficaz em reverter episódios de rejeição de transplante de córnea neste estudo caso-controle do que a aplicação intravenosa de 500 mg de metilprednisolona. Estudos adicionais necessitam ser realizados para verificar a segurança e eficácia deste tratamento em grandes populações / Abstract: Purpose: To compare the efficacy of 20 mg subconjunctival triamcinolone in association with topical prednisolone 1% to 500 mg intravenous methylprednisolone in association with topical prednisolone 1% in the treatment of cornea endothelial graft rejection. Methods: Case-control study carried out at State University of Campinas Hospital. Patients submitted to penetrating keratoplasty that presented first episode of corneal endothelial rejection within 15 days of symptoms onset between November 2005 and October 2006 were treated with 20 mg subconjunctival injection of triamcinolone acetate in association with topical prednisolone acetate 1%. These patients were matched for age and diagnosis to patients that were submitted to a single 500 mg intravenous injection of methylprednisolone sodium succinate in association with topical prednisolone acetate 1% and analyzed regarding the reversion of the rejection episode, intraocular pressure at day 30 and visual acuity at the end of 1 year. Results: 16 patients were treated with 20 mg subconjunctival triamcinolone and topical prednisolone 1% during the period of recruitment and were matched to 16 patients treated with 500 mg intravenous methylprednisolone and topical prednisolone 1%. At the end of 1 year, the group treated with triamcinolone had a better outcome than the group treated with methylprednisolone (p=0.025), having 15 patients with clear grafts as the group treated with methylprednisolone had 10 patients. 3 patients from the group treated with triamcinolone had new rejection episodes during follow-up and were retreated successfully as in the group treated with methylprednisolone 4 patients had a new rejection episode, with 2 progressing to failure and 2 to success with retreatment. Intraocular pressure rose in both groups (p=0.002) at day 30 but there were no statistically significant differences between the groups (p=0.433). Visual acuity improved after 1 year in both groups (p=0.049) and the group treated with triamcinolone had better visual acuities (p=0.002). Conclusions: 20 mg subconjunctival injection of triamcinolone acetonide associated with topical prednisolone acetate 1% showed to be more effective than 500 mg intravenous methylprednisolone associated with prednisolone acetate 1% in this case-control study. Further studies need to be accomplished to verify its safety and effectiveness in larger populations / Doutorado / Oftalmologia / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Carmino Antonio de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:20:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TiconaPerez_FanyVeronica_M.pdf: 4562191 bytes, checksum: dfed269ba3213d41785041f56823dd90 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Este estudo prospectivo avalia os níveis séricos e as especificidades dos anticorpos anti-HLA em receptores de rim de doador cadáver, além de estimar sua influência na etiologia e gravidade das crises de rejeição. Entre os meses de junho de 2004 a agosto de 2006 foram analisados 40 receptores de transplante renal com prova cruzada pré-transplante negativa e acompanhados, clinicamente, no mínimo por 90 dias após o transplante. Os pacientes foram estratificados por sintomatologia clínica de rejeição bem sucedido e mau sucedido, sendo o grupo A composto de 26 casos com rejeição e o grupo B com 14 casos sem complicações. As amostras de soro para a pesquisa de anticorpos anti-HLA, aplicando os testes imunoenzimáticos (One Lambda Inc.), foram obtidas antes e até 60 dias depois do transplante, pois coincide com o aumento dos níveis de creatinina sérica, nos pacientes com má evolução do enxerto. O resultado dos anticorpos anti-HLA antes do transplante foi negativo. Enquanto o número médio de incompatibilidade HLA (mismatched) entre receptor e doador, considerando os loci HLA-A, B e DR, foi 4/6 em ambos os grupos, sendo que no grupo A as mais freqüentes foram 4/6 e 3/6 e do grupo B somente 4/6. Dentre os 26 pacientes do grupo A, 3 (11,5%) desenvolveram anticorpos anti-HLA detectados nos dias 16, 28 e 46 após o transplante. Os anticorpos desenvolvidos foram específicos aos antígenos do doador, sendo apenas um caso pertencente ao grupo de reação cruzada, no qual se incluía também o antígeno do doador. Estes pacientes desenvolveram rejeição aguda do tipo vascular. Os demais pacientes deste grupo apresentaram crises de rejeição reversíveis com a administração da terapia imunossupressora (ciclosporina, micofenolato e tacrolimus) estabelecida pelos protocolos do Centro Integrado de Nefrologia. Enquanto o grupo B não desenvolveu anticorpos anti-HLA. Embora a casuística seja pequena, os resultados sugerem a importância de desenvolver anticorpos que combatam os antígenos HLA do doador perante a gravidade da crise de rejeição e por conseguinte, na perda do enxerto / Abstract: This prospective study evaluates the seric levels and anti-HLA antibodies¿ specificities of kidney receptor from dead donor, besides to esteem its influence in the etiology and its severity in the rejection crises. From June 2004 to August 2006, 40 transplanted kidney receptors had been analyzed with negative crossed test before of transplant and followed, clinically, at least 90 days after transplant. Patients were grouped by positive and negative rejection of clinical symptoms, being the group A made up of 26 positive cases and group B 14 negative cases. The serum samples for researching anti-HLA antibodies, applying the immunoenzimatic tests (One Lambda Incorporation), had been gotten just before and up to 60 days after the transplant, so that it coincides with increasing creatinine serum levels in the patients with bad evolution of engraftment. The anti-HLA antibodies results before transplant were negative. While the average number of HLA incompatibility (mismatched) between receptor and donor, considering HLA-A, B and DR loci, was 4/6 in both groups. Being in the group A the most frequent had been 4/6 and 3/6 and in the group B only 4/6. Among 26 patients of group A, 3 (11.5%) had developed detected anti-HLA antibodies in days: 16, 28 and 46 after transplant. The developed antibodies had been specific to donor¿s antigens, being only one case belongs to the crossed reaction group, which it had also the donor¿s antigens. These patients had an acute rejection of the vascular type. The others of this group presented reversible crises of rejection using immunosuppressive therapy (cyclosporine, mycophenolate and tacrolimus) determined by the Institution protocols. Group B did not develop anti-HLA antibodies. Although this sample is small, the results suggest the importance of creating antibodies that battle with donor¿s HLA antigen due to severity of rejection crisis and therefore, its loss / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

A rejeição ao aloenxerto mediada por mecanismos celulares ou humorais representa uma importante complicação no pós-transplante renal. Estudos anteriores demonstraram que o depósito de C4d peritubular é um marcador de rejeição mediada por anticorpos. A técnica padrão ouro para a pesquisa de C4d é a imunofluorescência em criostato. No entanto, o manuseio do material congelado implica em algumas limitações custo-operacionais, particularmente em nosso meio. Nos casos de rejeição mediada por anticorpos é de relevância patogenética a análise da participação de linfócitos B e plasmócitos, pois são as células responsáveis pela produção de anticorpos. Considerando que até o momento o envolvimento de linfócitos B e plasmócitos no processo de rejeição foi pouco investigado, no presente estudo também será analisada a expressão de CD20 e CD138 em biópsias renais, para caracterização destes componentes celulares. Portanto, o objetivo do presente estudo foi analisar a detecção do fragmento C4d por meio de 4 diferentes técnicas, além de analisar o infiltrado de linfócitos B e plasmócitos em biópsias de enxerto renal, correlacionando estes achados com o C4d peritubular. Foram analisadas 107 biópsias de 82 pacientes submetidos a transplante renal. A pesquisa do C4d foi realizada utilizando-se as técnicas de imunofluorescência [IF] (em cortes de criostato e de parafina) e imuno-histoquímica [IH] (em cortes de criostato e de parafina), enquanto que as pesquisas dos linfócitos B e plasmócitos foram realizadas pela técnica de IH em cortes de parafina utilizando-se os anticorpos anti-CD20 e anti-CD138, específicos para linfócitos B e plasmócitos, respectivamente. Com relação à detecção de C4d, as técnicas com maior índice de concordância com a IF-criostato, considerada padrão-ouro, foram IH-criostato (75,6% dos casos apresentaram resultados coincidentes, r=0,72; p<0,0001) e IF-parafina (73%, r=0,59; p=0,0001), enquanto a taxa de concordância na técnica de IH-parafina foi de apenas 51,4% (r=0,35; p=0,03). Analisando a evolução clínica, a sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia foi menor no grupo C4d positivo comparado ao grupo C4d negativo (67% vs 96%, respectivamente, p=0,01). A prevalência de linfócitos B (CD20+) foi de 54% das biópsias de enxerto renal. A análise histológica do infiltrado de linfócitos B revelou 2 padrões distintos de infiltrado: padrão de células isoladas (74%) e padrão nodular (26%). O padrão nodular esteve associado a uma menor sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia (61% vs 89% no grupo CD20 negativo; p=0,03; e 61% vs 87% no grupo padrão de células isoladas; p=0,03). A prevalência de plasmócitos (CD138+) em biópsias de enxerto renal foi de 59%. O infiltrado plasmocitário não esteve associado a uma pior evolução clínica do transplante. A análise da correlação entre C4d peritubular, linfócitos B e plasmócitos demonstrou que o número de células CD20+ e CD138+ foi significativamente maior nos casos C4d positivos comparados aos casos C4d negativos (CD20+: 155±53 vs 26±7 cels/mm2, respectivamente; p=0,001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cels/mm2, respectivamente; p=0,002). O presente estudo concluiu que o depósito peritubular de C4d e o infiltrado de linfócitos B, em especial o padrão nodular, estão associados a uma evolução clínica desfavorável do transplante renal. Outra conclusão importante é que há uma associação positiva entre os infiltrados de linfócitos B e de plasmócitos com o C4d peritubular, sugerindo um possível papel destas células responsáveis pela produção de anticorpos na ativação do sistema complemento in situ. Finalmente, as técnicas de IH-criostato e IF-parafina podem ser consideradas técnicas alternativas à técnica de IF-criostato para a detecção do C4d / Allograft rejection mediated by cellular or humoral mechanisms represents an important complication after kidney transplantation. Capillary C4d deposition was recognized as a specific and independent prognostic marker of antibody mediated rejection. The gold standard technique for C4d detection is the immunofluorescence in cryostat sections. However, this technique involves some operating and costs limitations, particularly in Brazil. In antibody mediated rejection, the analysis of B lymphocytes and plasma cells is of pathogenetic relevance since these cells are responsible for antibody production. Considering that the involvement of B lymphocytes and plasma cells in the rejection process is not clear, in this study the CD20 and CD138 expression in kidney biopsies will be also analyzed. Therefore, the aim of the present study was to analyze the C4d detection by 4 different techniques and the infiltration of B lymphocytes and plasma cells in renal allograft biopsies, correlating these findings with the capillary C4d deposition. One hundred and seven biopsies of 82 renal transplant patients were analyzed. C4d was evaluated by immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHC) techniques in frozen and paraffin sections (obtained from the same patients), whereas B-lymphocytes and plasma cells were evaluated by immunohistochemistry in paraffin sections using specific antibodies anti-B Lymphocytes (CD20) and anti-plasma cells (CD138). Regarding the C4d detection, the techniques with higher concordance rate with frozen-IF, considered the gold standard, were the frozen-IHC technique (85.4% of cases showed coincident results, r=0.72; p<0.0001) and the paraffin-IF technique (73%, r=0.59; p=0.0001), whereas the concordance rate in the paraffin-IHC technique was only 51.4% (r=0.35; p=0.03). The clinical follow up analysis demonstrate that C4d positive group was associated with a poor graft survival at 3 years post-diagnosis (67% vs 96% in C4d negative group; p=0.01). The histological analysis of mature B cells (CD20+) infiltrate showed 2 distinct patterns: scattered cells and clusters. The cluster pattern was associated with poor graft survival at 3 years (61% vs 89% in the CD20 negative group; p=0.03; and 61% vs 87% in the CD20+ scattered pattern group; p=0.03). The plasma cells infiltrate was not associated with a worse clinical transplant outcome. The analysis of the capillary C4d and B lymphocytes correlation demonstrate that the number of CD20+ and CD138+ cells was significantly higher in C4d positive cases (CD20+: 155±53 vs 26±7 cells/mm2, respectively; p=0.001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cells/mm2, respectively; p=0.002). This study concluded that C4d capillary and mature B cells (clusters pattern) are associated with worse graft survival. Another important conclusion is a positive association between B lymphocytes (mature B cells and plasma cells) and capillary C4d, suggesting a possible role of these cells, responsible for antibodies production, in the in situ complement system activation. Finally, the frozen-IHC and paraffin-IF techniques may be considered alternative to frozen-IF technique for C4d detection

INTRODUÇÃO: O objetivo do estudo foi avaliar o perfil de marcadores imuno-histoquímicos relacionados às células NK em biópsias de aloenxertos renais com diagnóstico anatomopatológico de rejeição aguda (mediadas por células T ou anticorpos) e estabelecer relações desses marcadores com parâmetros morfológicos de lesão à microcirculação e sobrevida do enxerto. MÉTODOS: Estudo retrospectivo histórico que revisou 74 biópsias realizadas entre janeiro de 2009 e dezembro de 2012, de pacientes com rejeição aguda mediada por células T (n=36), rejeição aguda mediada por anticorpos com expressão positiva (n=19) ou negativa (n=19) para o marcador C4d, juntamente com levantamento de dados clínicos e laboratoriais pertinentes ao estudo. Foram realizadas reações imuno-histoquímicas, para os marcadores CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 e CD4 com ênfase para os marcadores CD56 e CD16. Foi feita análise das células positivas em toda a cortical da biópsia nos compartimento intersticial, glomerular e vascular. Testes estatísticos foram aplicados conforme os pressupostos definidos no objetivo da pesquisa. RESULTADOS: No compartimento intersticial, células CD56+ (P = 0,004) e CD57+ (P < 0,001) foram expressas em maior quantidade em biópsias negativas para dosagem sérica de anticorpos específicos anti-doador (DSA) com diagnóstico de rejeição aguda mediada por células T. CD56 intersticial foi associado estatisticamente com presença de glomerulite (g >= 1) (P = 0,02) e ausência / leve capilarite peritubular (ptc <= 1) (P = 0,003). Células intersticiais positivas para o marcador CD56 com média superior a 0,56 céls/mm2 tiveram uma pior sobrevida do enxerto renal (P = 0,028). Biópsias com contagem inferior ou igual a 0,56 cél/mm2 tiveram associação estatisticamente significante para ausência ou leve capilarite peritubular (P = 0,012) e com contagem superior a 0,56 céls/mm2, foram associadas à presença de glomerulite (P = 0,002). Foi observado maior número de células positivas para o marcador CD16 no compartimento glomerular em biópsias positivas para dosagem sérica de DSA com diagnóstico de rejeição aguda mediada por anticorpos (P = 0,03) e em biópsias com presença de glomerulite (P = 0,009). Presença de maior número de células CD16+ no compartimento intersticial associou-se com capilarite peritubular (P = 0,0001). CONCLUSÕES: Maior expressão de células CD56 positivas no compartimento intersticial das biópsias foi significantemente associada com escores relacionados à lesão na microcirculação, especialmente glomerulite, com rejeição aguda mediada por células T e pior sobrevida do enxerto renal. Células CD16 positivas, no compartimento glomerular foram associadas com rejeição aguda mediada por anticorpos e glomerulite. As variações na expressão dos marcadores de células NK nos diferentes compartimentos da biópsia renal podem sugerir presença de envolvimento das células NK em diferentes vias do sistema imune nas rejeições agudas de aloenxertos renais / INTRODUCTION: The aim of this study was to investigate the immunohistochemical profile of markers related to NK cells from renal allograft biopsies with morphological diagnosis of acute rejection (T-cells or antibodies mediated rejection) and to study associations of those markers with types of rejection, microcirculation injury morphological parameters and graft survival. METHODOLOGY: Historical retrospective study that reviewed 74 biopsies performed between January 2009 and December 2012 in patients with acute T-cell-mediated rejection (n=36) and acute antibody-mediated rejection with (n=19) or without evident C4d deposition (n=19). The study was performed with relevant clinical and laboratory data. Immunohistochemical reactions were performed for CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 and CD4 markers with highlights for CD56 and CD16. Counting of positive cells throughout cortical biopsy was performed in glomerular, interstitial and vascular compartments. Statistical tests were applied according to assumptions set out the goal of the study.RESULTS: DSA-negative biopsies-from patients with acute T-cell mediated rejection (aTCMR) had an increased expression of CD56+ and CD57+ cells (P = 0.004 and P < 0.001) in the interstitial compartment in comparison with donor-specific antibodies ( DSA)-positive biopsies from patients acute antibody-mediated rejection with and without C4d deposition. Interstitial CD56+ cells had an increased expression for presence of glomerulitis (g >= 1) (P = 0.02) and peritubular capillaritis (ptc >= 2) (P = 0.003). Interstitial CD56 + cells with mean superior to 0.56cells/mm2 had worse allograft survival (P = 0.028). CD56+ cells in the interstitial compartment with mean inferior or equal to 0.56cells/mm2 associated with absence or mild peritubular capillaritis (P = 0.012) and mean superior to 0.56cells/mm2 was associated with presence of glomerulitis (P = 0.002). CD16+ cells was increased in the glomerular compartment in DSA-positive biopsies (P = 0.03) and in the presence of glomerulitis (P = 0.009). Interstitial CD16+ cells associated with peritubular capillaritis (P = 0.0001).CONCLUSION: CD56+ cell infiltrates in the interstitial compartment were significantly associated with microcirculation injury scores, especially glomerulitis, acute T-cell mediated rejection and clinical outcomes. CD16+ cell infiltrates in glomerular compartment was associated with acute antibody-mediated rejection and glomerulitis. Our findings showed variations in expression of NK cells markers in renal biopsy different compartments which might suggest the involvement of NK cells in different immune system pathways in acute renal allograft rejection