La production biologique d'hydrogène (H2) représente une technologie possible pour la production à grande échelle durable de H2 nécessaire pour l'économie future de l'hydrogène. Cependant, l'obstacle majeur à l'élaboration d'un processus pratique a été la faiblesse des rendements qui sont obtenus, généralement autour de 25%, bien en sous des rendements pouvant être atteints pour la production de biocarburants à partir d'autres processus. L'objectif de cette thèse était de tenter d'améliorer la production d'H2 par la manipulation physiologique et le génie métabolique. Une hypothèse qui a été étudiée était que la production d'H2 pourrait être améliorée et rendue plus économique en utilisant un procédé de fermentation microaérobie sombre car cela pourrait fournir la puissance supplémentaire nécessaire pour une conversion plus complète du substrat et donc une production plus grande d'H2 sans l'aide de l'énergie lumineuse. Les concentrations optimales d’O2 pour la production de H2 microaérobie ont été examinées ainsi que l'impact des sources de carbone et d'azote sur le processus. La recherche présentée ici a démontré la capacité de Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (un mutant déficient d’absorption-hydrogénase) de produire de l'H2 sous condition microaérobie sombre avec une limitation dans des quantités d’O2 et d'azote fixé. D'autres travaux devraient être entrepris pour augmenter les rendements d'H2 en utilisant cette technologie. De plus, un processus de photofermentation a été créé pour améliorer le rendement d’H2 à partir du glucose à l'aide de R. capsulatus JP91 hup- soit en mode non renouvelé (batch) et / ou en conditions de culture en continu. Certains défis techniques ont été surmontés en mettant en place des conditions adéquates de fonctionnement pour un rendement accru d'H2. Un rendement maximal de 3,3 mols de H2/ mol de glucose a été trouvé pour les cultures en batch tandis que pour les cultures en continu, il était de 10,3 mols H2/ mol de glucose, beaucoup plus élevé que celui rapporté antérieurement et proche de la valeur maximale théorique de 12 mols H2/ mol de glucose. Dans les cultures en batch l'efficacité maximale de conversion d’énergie lumineuse était de 0,7% alors qu'elle était de 1,34% dans les cultures en continu avec un rendement de conversion maximum de la valeur de chauffage du glucose de 91,14%. Diverses autres approches pour l'augmentation des rendements des processus de photofermentation sont proposées. Les résultats globaux indiquent qu'un processus photofermentatif efficace de production d'H2 à partir du glucose en une seule étape avec des cultures en continu dans des photobioréacteurs pourrait être développé ce qui serait un processus beaucoup plus prometteur que les processus en deux étapes ou avec les co-cultures étudiés antérieurément. En outre, l'expression hétérologue d’hydrogenase a été utilisée comme une stratégie d'ingénierie métabolique afin d'améliorer la production d'H2 par fermentation. La capacité d'exprimer une hydrogénase d'une espèce avec des gènes de maturation d'une autre espèce a été examinée. Une stratégie a démontré que la protéine HydA orpheline de R. rubrum est fonctionnelle et active lorsque co-exprimée chez Escherichia coli avec HydE, HydF et HydG provenant d'organisme différent. La co-expression des gènes [FeFe]-hydrogénase structurels et de maturation dans des micro-organismes qui n'ont pas une [FeFe]-hydrogénase indigène peut entraîner le succès dans l'assemblage et la biosynthèse d'hydrogénase active. Toutefois, d'autres facteurs peuvent être nécessaires pour obtenir des rendements considérablement augmentés en protéines ainsi que l'activité spécifique des hydrogénases recombinantes. Une autre stratégie a consisté à surexprimer une [FeFe]-hydrogénase très active dans une souche hôte de E. coli. L'expression d'une hydrogénase qui peut interagir directement avec le NADPH est souhaitable car cela, plutôt que de la ferrédoxine réduite, est naturellement produit par le métabolisme. Toutefois, la maturation de ce type d'hydrogénase chez E. coli n'a pas été rapportée auparavant. L'opéron hnd (hndA, B, C, D) de Desulfovibrio fructosovorans code pour une [FeFe]-hydrogénase NADP-dépendante, a été exprimé dans différentes souches d’E. coli avec les gènes de maturation hydE, hydF et hydG de Clostridium acetobutylicum. L'activité de l'hydrogénase a été détectée in vitro, donc une NADP-dépendante [FeFe]-hydrogénase multimérique active a été exprimée avec succès chez E. coli pour la première fois. Les recherches futures pourraient conduire à l'expression de cette enzyme chez les souches de E. coli qui produisent plus de NADPH, ouvrant la voie à une augmentation des rendements d'hydrogène via la voie des pentoses phosphates. / Biological hydrogen (H2) production represents a possible technology for the large scale sustainable production of H2 needed for a future hydrogen economy. However, the major obstacle to developing a practical process has been the low yields that are obtained, typically around 25%, well below those achievable for the production of other biofuels from the same feedstock. The goal of this thesis was to improve H2 production through physiological manipulation and metabolic engineering. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economical by using a microaerobic dark fermentation process since this could provide the extra reducing power required for driving substrate conversion to completion and hence more H2 production might be obtained without using light energy. The optimal O2 concentrations for microaerobic H2 production were examined as well as the impact of carbon and nitrogen sources on the process. The research reported here proved the capability of Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (an uptake-hydrogenase deficient mutant) to produce H2 under microaerobic dark conditions with limiting amounts of O2 and fixed nitrogen. Further work should be undertaken to increase H2 yields using this technology. In addition, a photofermentation process was established to improve H2 yield from glucose using R. capsulatus JP91 hup- strain either in batch and/or continuous culture conditions. Some technical challenges in establishing the proper operational conditions for increased H2 yield were overcome. A maximum yield of 3.3 mols of H2/ mol of glucose was found for batch cultures whereas in continous cultures it was 10.3 mols H2/ mol glucose, much higher than previously reported and close to the theoretical maximum value of 12 mols H2/ mol glucose. In batch cultures the maximum light conversion efficiency was 0.7% whereas it was 1.34% in continuous cultures with a maximum conversion efficiency of the heating value of glucose of 91.14%. Various approaches to further increasing yields in photofermentation processes are proposed. The overall results suggest that an efficient single stage photofermentative H2 production process from glucose using continuous cultures in photobioreactors could be developed which would be a much more promising alternative process to the previously studied two stage photofermentation or co-culture approaches. Furthermore, the heterologous expression of hydrogenases was used as a metabolic engineering strategy to improve fermentative H2 production. The capability of expressing a hydrogenase from one species with the maturation genes from another was examined. One strategy demonstrated that the orphan hydA of R. rubrum is functional and active when co-expressed in E. coli with hydE, hydF and hydG from different organisms. Co-expression of the [FeFe]-hydrogenase structural and maturation genes in microorganisms that lack a native [FeFe]-hydrogenase can successfully result in the assembly and biosynthesis of active hydrogenases. However, other factors may be required for significantly increased protein yields and hence the specific activity of the recombinant hydrogenases. Another strategy was to overexpress one of the highly active [FeFe]-hydrogenases in a suitable E. coli host strain. Expression of a hydrogenase that can directly interact with NADPH is desirable as this, rather than reduced ferredoxin, is naturally produced by its metabolism. However, the successful maturation of this type of hydrogenase in E. coli had not been previously reported. The Desulfovibrio fructosovorans hnd operon (hndA, B, C, and D genes), encoding a NADP-dependent [FeFe]-hydrogenase, was expressed in various E. coli strains with the maturation genes hydE, hydF and hydG of Clostridium acetobutylicum. Hydrogenase activities were detected in vitro, thus a multi-subunit NADP-dependent [FeFe]-active hydrogenase was successfully expressed and matured in E. coli for the first time. Future research could lead to the expression of this hydrogenase in E. coli host strains that overproduce NADPH, setting the stage for increased hydrogen yields via the pentose phosphate pathway.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les furocoumarines constituent l'une des classes de métabolites secondaires dérivant de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Elles ont été décrites comme étant des phytoaléxines mais sont également très largement utilisées par l'Homme pour leurs propriétés thérapeutiques. Un certain nombre d'études biochimiques ont été réalisées afin d'en comprendre la biosynthèse mais peu de choses sont connues concernant leur déterminisme moléculaire. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation fonctionnelle de gènes appartenant aux prényltransférases aromatiques potentiellement impliquées dans cette voie de biosynthèse. Les prényltransférases catalysent la première étape de la voie de biosynthèse des furocoumarines linéaires ou angulaires. Elles permettent l'addition d'un groupement dimethylally pyrophosphate (DMAPP) sur l'umbelliférone. En utilisant SfN8DT-1, une prényltransférase aromatique récemment caractérisée, comme sonde, nous avons identifié 7 gènes candidats chez deux familles de plantes (Rutaceae et Apiaceae). Dans la mesure où il a été décrit que ces enzymes étaient des protéines membranaires, nous avons adapté un système d'expression hétérologue basé sur l'utilisation de N. benthamiana. Ce système a été validé par l'expression de deux protéines membranaires : un cytochrome P450 CYP98A22 et une prényltransférase déjà caractérisée SfN8DT-1. Nous avons ensuite utilisé ce système d'expression pour réaliser l'étude des 7 gènes nouvellement isolés. Ces travaux nous ont permis de caractériser la première umbelliferone prenyltransferase de Petroselinum crispum capable de catalyser in vitro et in vivo la prénylation du carbone 6 ou 8 de l'umbelliférone en présence de DMAPP permettant ainsi la synthèse respectivement de demethylsuberosin et d'osthenol. Par ailleurs, une étude réalisée in planta chez le persil a permis de mettre en évidence une relation positive entre le niveau d'expression du gène et la teneur en umbelliférone prénylée. L'étude de la surexpression du gène chez Ruta graveolens a permis de mettre en évidence un lien entre l'expression du gène et la disparition de l'umbelliférone. Enfin nous avons identifié la même activité pour une prényltransférase de Pastinaca sativa, ce qui nous amène à émettre l'hypothèse que l'étape de prénylation n'est pas une étape limitante dans la biosynthèse des furocoumarines angulaires, étant donné que le persil ne produit que des furocoumarines linéaires, tandis que le panais produit des furocoumarines linéaires et angulaires. L'utilisation de ces mêmes systèmes d'expression hétérologue de N. benthamiana et R. graveolens nous a également permis d'identifier une seconde prényltransférase aromatique capable de catalyser l'addition de géranylpyrophosphate (GPP) sur l'umbelliférone et sur l'esculétine / Furanocoumarins constitute one of the classes of secondary metabolites deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These molecules are described as phytoalexins in plants but are also used by humans for their pharmaceutical properties. A large number of biochemical studies were carried out to understand their biosynthetic pathway but little information was available concerning the genes involved in the pathway. In this study, we focused on the characterization of genes encoding for aromatic prenyltransferases which were described to be involved in this pathway. Prenlyltransferases catalyze the entry step to the linear or angular furanocoumarin pathway. Hence they catalyze the addition of a dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) prenyl moiety to umbelliferone. Using a recently characterized aromatic prenyltransferase (SfN8DT-1) as a probe, we isolated 7 different candidate genes from two plant families (Rutaceae and Apiaceae). As these enzymes were described as membrane bound proteins, we adapted a heterologous expression system made up of Nicotiana benthamian aand we validated its efficiency by using two membrane-associated enzymes: a cytochrome P450 (CYP98A22) and the already described prenyltransferase SfN8DT-1. Subsequently, this system was used to perform the functional characterization of the 7 newly identified proteins. This way we succeeded to characterize the first umbelliferone prenyltransferase of Petroselinum crispum that was able to catalyze both the 6-C and 8-C prenylation of umbelliferone with DMAPP producing demethylsuberosin and osthenol respectively. We made evidence that these reactions occurred both in vitro and in vivo. In addition, in planta studies performed in P.crispum showed a positive relationship between the gene expression level and the content of prenylated umbelliferone. The overexpression of this gene was investigated in Ruta graveolens and we could provide evidences of a link between the enzymatic activity and the disappearance of umbelliferone. We also reported a similar activity for a prenyltransferase isolated from Pastinaca sativa, which makes us assume that the prenylation step is not a rate limiting step in the biosynthetic pathway of angular furanocoumarins since parsley is producing only linear furanocoumarins whereas parsnip is producing both linear and angular furanocoumarins. In addition, using the same N. benthamiana and R. graveolens heterologous expression systems, we identified a second aromatic prenyltransferase able to catalyze the addition of geranyl pyrophosphate (GPP) both to umbelliferone and esculetin

Parmi les activités catalytiques les plus intéressantes présentes dans le latex de Carica papaya on trouve l'activité lipolytique (EC 3.1.1.X). En effet les enzymes lipolytiques peuvent catalyser des réactions d’hydrolyse sur divers substrats mais également, dans des conditions thermodynamiques favorables, des réactions de synthèse. De plus, elles sont actives en présence de solvants organiques, ce qui fait de ce type d’enzymes des biocatalyseurs spécialement attractifs pour des applications industrielles. Enfin, cette activité lipolytique est associée à la matrice insoluble du latex, et constitue donc une activité immobilisée. Cependant et pour cette même raison, il n'a pas été possible jusqu'à présent d'élucider la ou les séquences protéiques dans le latex responsables de cette activité lipolytique. En conséquence, cette thèse est dédiée à l'étude de l'activité lipolytique du latex de C. papaya. Pour cela, la purification partielle du latex de C. papaya a été réalisée. Ainsi, les propriétés catalytiques des fractions partiellement purifiées ont pu être déterminées pour l'hydrolyse de triglycérides, la résolution de mélanges racémique d'octyl ester de l'acide 2-bromo-phenylacétique, la synthèse de biopolymères et des lipides structurés. Parallèlement à cela, une recherche dans le génome de C. papaya des séquences codant les motifs conservés dans les protéines lipolytiques, ainsi que des essais d'expression in vivo dans les feuilles de la plante en conditions de stress a été effectuée, ce qui a permis d’isoler pour la première fois une lipase, CpLip2, exprimée in vivo chez C. papaya. Cette protéine, ainsi que 2 autres protéines déjà identifiées dans le latex de C. papaya, CpEst et CpLip1, ont été produites sous forme fonctionnelle en employant respectivement Nicothiana sp., Yarrowia lipolytica et Pichia pastoris comme systèmes d'expression. Finalement, certaines des propriétés biochimiques et catalytiques de ces protéines recombinantes ont pu être déterminées / Lipolytic activity (EC 3.1.1.X) is one of the most interesting catalytic activities from Carica papaya latex. Indeed lipolytic enzymes can catalyze not only hydrolysis but also various synthesis reactions due to their activity in organic solvents, which make them especially attractive for industrial applications. Nevertheless, most of the lipolytic activity present in latex is tightly associated to the insoluble fraction of the latex and up to now it has not been possible to determine which enzymes are responsible for the lipolytic activity of C. papaya latex. This PhD work is dedicated to the study of the lipolytic activity present in Carica papaya. Partial purification of lipolytic activity from C. papaya latex was carried out to evaluate the catalytic properties of the partially purified fractions in the hydrolysis of triglycerides, the resolution of racemic mixtures of 2-bromo-phenylacetic octyl ester, biopolymers and structured lipids synthesis. Bioinformatic analysis was also realized on C. papaya genome by searching conserved motifs for lipolytic proteins. Finally, assays of in vivo transcriptomic in the leaves of stressed C. papaya allowed the isolation of a new lipase produced in vivo (CpLip2, gene 1973.2). This protein, as well as two previously identified lipolytic enzymes from C. papaya, CpEst (gen 25.180) and CpLip1 (gen 55.143) were functionally expressed using Nicotiana sp.,Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris as expression hosts, respectively. Finally, some of the biochemical and catalytic properties of these produced recombinant proteins were evaluated / Una de las actividades catalíticas más interesantes presentes en el látex de Carica papaya es la actividad lipolítica (3.1.1.X).Las enzimas lipolíticas pueden catalizar reacciones de hidrólisis sobre varios sustratos e igualmente, en condiciones termodinámicas favorables, pueden catalizar reacciones de síntesis. Adicionalmente, son activas en presencia de solventes orgánicos, por lo que son biocatalizadores atractivos para aplicaciones industriales. Sin embargo, la mayor parte de la actividad lipolítica del látex se encuentra asociada a la matriz insoluble del látex, formando un biocatalizador auto-inmovilizado.Por esta razón, hasta la fecha no ha sido posible elucidar qué enzima o enzimas son responsables de la actividad lipolítica observada en el látex de C. papaya. En consecuencia, la presente investigación está dedicada al estudio de la actividad lipolítica en Carica papaya. Para ello, se realizaron estudios de purificación parcial del látex de Carica papaya, así como la evaluación de las propiedades catalíticas de las fracciones parcialmente purificadas en la hidrólisis de triglicéridos, resolución de mezclas racémicas de octil éster del ácido 2-bromo-fenilacético y síntesis de biopolímeros y lípidos estructurados. Paralelamente, se realizó un análisis genómico mediante la búsqueda con motivos conservados que codifican para diversas proteínas lipolíticas, así como ensayos de transcriptómica para buscar la expresión in vivo de secuencias seleccionadas en las hojas de la planta, que permitieron encontrar por primera vez una expresión in vivo de una lipasa en C. papaya (CpLip2). Esta proteína y otras dos previamente identificadas en el látex de papaya (CpEst y CpLip1), fueron expresadas de forma funcional empleando respectivamente Nicotiana sp., Yarrowia lipolytica y Pichia pastoris como sistemas de expresión. Finalmente algunas de las propiedades bioquímicas y catalíticas de las proteínas expresadas fueron determinadas

La symbiose mycorhizienne à arbuscule (MA) est une association mutualiste s’établissant entre les racines des plantes et des champignons du sol appartenant à l’embranchement des Gloméromycètes. Dans cette association, le champignon agit comme un fertilisant naturel, fournissant à la plante divers minéraux (phosphore, mais aussi azote et soufre …) en échange de sources de carbone indispensables à son développement. Une caractéristique originale de ces champignons est leur très large spectre d’hôte : de l’ordre de 80% des espèces végétales ont l’aptitude à former cette symbiose, et certains espèces de champignons MA ne semblent pas avoir de limitation de spectre d’hôte. Les champignons MA possèderaient-ils des « clés universelles » de compatibilité cellulaire avec leur hôte, ou de contournement de l’immunité végétale ? Pour aborder cette problématique, nous avons entrepris l’étude du sécrétome du champignon MA Rhizophagus irregularis dont plusieurs données génomiques étaient disponibles. Les microorganismes eucaryotes sécrètent en effet dans leur environnement des protéines agissant sur leurs structures exogènes (paroi cellulaire), leur environnement, et pouvant agir sur l’immunité des cellules hôtes. Ces protéines sécrétées (SPs) sont dans ce dernier cas appelées « effecteurs ». Sur la base de deux assemblages différents, un catalogue de 872 SPs de R. irregularis (RiSPs) a été défini pour lesquelles les profils d’expression dans trois plantes hôtes ont été comparés. Nous avons également comparé ces SPs à celles que nous avons définies sur une autre espèce de champignon MA, Gigaspora rosea. Après enrichissement du catalogue de RiSPs avec des séquences de petite taille identifiées sur un assemblage transcriptomique propre, puis sélection des candidats dont les cadres de lecture sont robustes et présentant un niveau d’expression élevé (FC>10) dans les 3 hôtes testés, un jeu de 33 RiSPs d’intérêt a été défini, dont 18 ont été sélectionnées pour effectuer des analyses fonctionnelles. En absence de protocole de transformation de ces champignons, l’analyse fonctionnelle a porté sur la cytolocalisation de protéines de fusion RiSP:citrine dans les cellules végétales par surexpression dans des feuilles de tabac et des racines de luzerne tronquée. Différents compartiments cellulaires sont ciblés par ces RiSPs, très souvent le compartiment vacuolaire. Des approches par surexpression in planta de plusieurs candidats RiSP ont permis d’identifier une activité stimulatrice de 3 RiSPs sur l’établissement de la symbiose. Parallèlement, des essais de stimulation de la symbiose MA par apport exogène de différents SPs sur plantules en cours de mycorhization en chambre ont été initiés. Ils devront être poursuivis sur les 3 candidats issus du crible de surexpression. En perspective, l’évaluation de la spécificité d’action de ces SPs sur la symbiose MA comparativement à d’autres interactions plante-champignon ouvrira la voie à des essais d’application au champ. / Arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis is a mutualistic association established between plant roots and soil fungi belonging to the phylum Glomeromycota. In this association, the fungus acts as a natural fertilizer, supplying the plant with various minerals (phosphorus, but also nitrogen and sulfur) in exchange to carbon sources essential for its development. An original feature of these fungi is their very broad host spectrum: c.a. 80% of plant species have the ability to form this symbiosis, and some species of AM fungi do not seem to have a restrictive host spectrum. Would MA fungi possess "universal keys" for cell compatibility with their host, or to by-pass plant immunity? To address this problem, we studied the secretome of the AM fungus Rhizophagus irregularis from which several genomic data were available. Eukaryotic microorganisms indeed secrete in their environment proteins acting on their exogenous structures (cell wall), on their environment (nutrient recruitment), and even on host plant cell immunity. These last secreted proteins (SPs) are defined as effectors. Based on two different assemblies, a repertoire of 872 SPs of R. irregularis was defined for which transcriptional expression profiles obtained in three hosts were compared, as well with SPs from another species of AM fungus, Gigaspora rosea. After adding sequences of small size identified from an in-house transcriptomic assembly, screening unambiguous open reading frame, and selecting strongly expressed candidates (FC> 10) in the 3 plant hosts analyzed, a set of 33 RiSPs of interest was defined, of which 18 were selected for functional analysis. As genetic transformation protocol is unavailable for AM fungi, RiSP:citrine fusion proteins were overexpressed in tobacco leaves and barrel medic roots for plant cell localization. Different cell compartments were targeted by these RiSPs, and often localised in the vacuolar compartment. In planta overexpression of several candidates allowed identifying 3 RiSPs that stimulate the establishment of the symbiosis. In the same time, attempts to enhance MA symbiosis by addition of exogenous RiSPs on seedlings during mycorrhizal establishment were initiated. Such assays should be pursued on the 3 active candidates revealed by overexpression assays. Evaluating the specificity of action of these RiSPs on AM symbiosis compared to other plant-fungus interactions will open the way to field trials.

PA1b (Pea Albumin 1 sous-unité b), une knottine toxique de 37 acides aminés, présente un grand intérêt dans la lutte contre les charançons des céréales (Sitophilus spp.), principaux ravageurs des céréales stockées.<br />Afin de mieux connaître la nouvelle famille peptidique de PA1b, sa variabilité tant structurale que d'activité biologique a été étudiée au sein des Légumineuses. Après avoir validé notre approche sur 4 espèces végétales "test", nous avons caractérisé 24 gènes homologues chez 18 espèces de Papilionoideae. De plus, l'activité insecticide d'extraits de graines de 60 espèces des trois sous-familles de Légumineuses a été déterminée sur charançons de souche sensible et résistante à PA1b. Afin de relier variations de structure et d'activité, une approche par mutagenèse dirigée a été envisagée. Un système d'expression bactérienne et de purification de PA1b a été mis au point. Bien que de masse conforme (cystéines oxydées), le peptide recombinant ne présente pas d'activité biologique.

La production biologique d'hydrogène (H2) représente une technologie possible pour la production à grande échelle durable de H2 nécessaire pour l'économie future de l'hydrogène. Cependant, l'obstacle majeur à l'élaboration d'un processus pratique a été la faiblesse des rendements qui sont obtenus, généralement autour de 25%, bien en sous des rendements pouvant être atteints pour la production de biocarburants à partir d'autres processus. L'objectif de cette thèse était de tenter d'améliorer la production d'H2 par la manipulation physiologique et le génie métabolique. Une hypothèse qui a été étudiée était que la production d'H2 pourrait être améliorée et rendue plus économique en utilisant un procédé de fermentation microaérobie sombre car cela pourrait fournir la puissance supplémentaire nécessaire pour une conversion plus complète du substrat et donc une production plus grande d'H2 sans l'aide de l'énergie lumineuse. Les concentrations optimales d’O2 pour la production de H2 microaérobie ont été examinées ainsi que l'impact des sources de carbone et d'azote sur le processus. La recherche présentée ici a démontré la capacité de Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (un mutant déficient d’absorption-hydrogénase) de produire de l'H2 sous condition microaérobie sombre avec une limitation dans des quantités d’O2 et d'azote fixé. D'autres travaux devraient être entrepris pour augmenter les rendements d'H2 en utilisant cette technologie. De plus, un processus de photofermentation a été créé pour améliorer le rendement d’H2 à partir du glucose à l'aide de R. capsulatus JP91 hup- soit en mode non renouvelé (batch) et / ou en conditions de culture en continu. Certains défis techniques ont été surmontés en mettant en place des conditions adéquates de fonctionnement pour un rendement accru d'H2. Un rendement maximal de 3,3 mols de H2/ mol de glucose a été trouvé pour les cultures en batch tandis que pour les cultures en continu, il était de 10,3 mols H2/ mol de glucose, beaucoup plus élevé que celui rapporté antérieurement et proche de la valeur maximale théorique de 12 mols H2/ mol de glucose. Dans les cultures en batch l'efficacité maximale de conversion d’énergie lumineuse était de 0,7% alors qu'elle était de 1,34% dans les cultures en continu avec un rendement de conversion maximum de la valeur de chauffage du glucose de 91,14%. Diverses autres approches pour l'augmentation des rendements des processus de photofermentation sont proposées. Les résultats globaux indiquent qu'un processus photofermentatif efficace de production d'H2 à partir du glucose en une seule étape avec des cultures en continu dans des photobioréacteurs pourrait être développé ce qui serait un processus beaucoup plus prometteur que les processus en deux étapes ou avec les co-cultures étudiés antérieurément. En outre, l'expression hétérologue d’hydrogenase a été utilisée comme une stratégie d'ingénierie métabolique afin d'améliorer la production d'H2 par fermentation. La capacité d'exprimer une hydrogénase d'une espèce avec des gènes de maturation d'une autre espèce a été examinée. Une stratégie a démontré que la protéine HydA orpheline de R. rubrum est fonctionnelle et active lorsque co-exprimée chez Escherichia coli avec HydE, HydF et HydG provenant d'organisme différent. La co-expression des gènes [FeFe]-hydrogénase structurels et de maturation dans des micro-organismes qui n'ont pas une [FeFe]-hydrogénase indigène peut entraîner le succès dans l'assemblage et la biosynthèse d'hydrogénase active. Toutefois, d'autres facteurs peuvent être nécessaires pour obtenir des rendements considérablement augmentés en protéines ainsi que l'activité spécifique des hydrogénases recombinantes. Une autre stratégie a consisté à surexprimer une [FeFe]-hydrogénase très active dans une souche hôte de E. coli. L'expression d'une hydrogénase qui peut interagir directement avec le NADPH est souhaitable car cela, plutôt que de la ferrédoxine réduite, est naturellement produit par le métabolisme. Toutefois, la maturation de ce type d'hydrogénase chez E. coli n'a pas été rapportée auparavant. L'opéron hnd (hndA, B, C, D) de Desulfovibrio fructosovorans code pour une [FeFe]-hydrogénase NADP-dépendante, a été exprimé dans différentes souches d’E. coli avec les gènes de maturation hydE, hydF et hydG de Clostridium acetobutylicum. L'activité de l'hydrogénase a été détectée in vitro, donc une NADP-dépendante [FeFe]-hydrogénase multimérique active a été exprimée avec succès chez E. coli pour la première fois. Les recherches futures pourraient conduire à l'expression de cette enzyme chez les souches de E. coli qui produisent plus de NADPH, ouvrant la voie à une augmentation des rendements d'hydrogène via la voie des pentoses phosphates. / Biological hydrogen (H2) production represents a possible technology for the large scale sustainable production of H2 needed for a future hydrogen economy. However, the major obstacle to developing a practical process has been the low yields that are obtained, typically around 25%, well below those achievable for the production of other biofuels from the same feedstock. The goal of this thesis was to improve H2 production through physiological manipulation and metabolic engineering. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economical by using a microaerobic dark fermentation process since this could provide the extra reducing power required for driving substrate conversion to completion and hence more H2 production might be obtained without using light energy. The optimal O2 concentrations for microaerobic H2 production were examined as well as the impact of carbon and nitrogen sources on the process. The research reported here proved the capability of Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (an uptake-hydrogenase deficient mutant) to produce H2 under microaerobic dark conditions with limiting amounts of O2 and fixed nitrogen. Further work should be undertaken to increase H2 yields using this technology. In addition, a photofermentation process was established to improve H2 yield from glucose using R. capsulatus JP91 hup- strain either in batch and/or continuous culture conditions. Some technical challenges in establishing the proper operational conditions for increased H2 yield were overcome. A maximum yield of 3.3 mols of H2/ mol of glucose was found for batch cultures whereas in continous cultures it was 10.3 mols H2/ mol glucose, much higher than previously reported and close to the theoretical maximum value of 12 mols H2/ mol glucose. In batch cultures the maximum light conversion efficiency was 0.7% whereas it was 1.34% in continuous cultures with a maximum conversion efficiency of the heating value of glucose of 91.14%. Various approaches to further increasing yields in photofermentation processes are proposed. The overall results suggest that an efficient single stage photofermentative H2 production process from glucose using continuous cultures in photobioreactors could be developed which would be a much more promising alternative process to the previously studied two stage photofermentation or co-culture approaches. Furthermore, the heterologous expression of hydrogenases was used as a metabolic engineering strategy to improve fermentative H2 production. The capability of expressing a hydrogenase from one species with the maturation genes from another was examined. One strategy demonstrated that the orphan hydA of R. rubrum is functional and active when co-expressed in E. coli with hydE, hydF and hydG from different organisms. Co-expression of the [FeFe]-hydrogenase structural and maturation genes in microorganisms that lack a native [FeFe]-hydrogenase can successfully result in the assembly and biosynthesis of active hydrogenases. However, other factors may be required for significantly increased protein yields and hence the specific activity of the recombinant hydrogenases. Another strategy was to overexpress one of the highly active [FeFe]-hydrogenases in a suitable E. coli host strain. Expression of a hydrogenase that can directly interact with NADPH is desirable as this, rather than reduced ferredoxin, is naturally produced by its metabolism. However, the successful maturation of this type of hydrogenase in E. coli had not been previously reported. The Desulfovibrio fructosovorans hnd operon (hndA, B, C, and D genes), encoding a NADP-dependent [FeFe]-hydrogenase, was expressed in various E. coli strains with the maturation genes hydE, hydF and hydG of Clostridium acetobutylicum. Hydrogenase activities were detected in vitro, thus a multi-subunit NADP-dependent [FeFe]-active hydrogenase was successfully expressed and matured in E. coli for the first time. Future research could lead to the expression of this hydrogenase in E. coli host strains that overproduce NADPH, setting the stage for increased hydrogen yields via the pentose phosphate pathway.

Les peptides sont des molécules pouvant posséder une activité biologique intéressante (antibiotique, anti-oxydante, antivirale, anti-hypertensive…). Ce sont cependant des molécules difficiles à utiliser car elles possèdent un faible temps de demi-vie in vivo et sont peu bio-disponibles. Le greffage d’un acide gras permet de les protéger et d’accroître leur potentiel d’action. Cette réaction appelée acylation peut être catalysée par des enzymes. A l’heure actuelle, peu de recherches sont faites sur l’acylation de peptides par voie enzymatique et sur la recherche de nouveaux biocatalyseurs adaptés pour cette réaction. Les objectifs de cette thèse ont été, dans un premier temps, de comprendre les mécanismes de la sélectivité d’acylation de peptides de la lipase B de Candida antarctica par une approche de modélisation moléculaire combinant docking et dynamique moléculaire, couplée à une approche expérimentale. Cette étude a permis d’identifier des interactions enzyme-substrats impliquées dans la sélectivité enzymatique et a permis de construire un modèle expliquant la régio- et chimio-sélectivité de l’acylation peptidique catalysée par cette enzyme. Dans un deuxième temps, une étude préliminaire a été menée afin d’identifier de nouvelles enzymes de type acylases présentes dans des surnageants de culture de différentes espèces de Streptomyces. Ces enzymes sont capables de catalyser des réactions d’acylation de peptides en milieux aqueux. Une méthode de semi-purification a été établie et une étude comparative a été menée sur la sélectivité d’acylation de la lipase B de C. antarctica et celle de nouvelles enzymes de type aminoacylases présentes dans un extrait protéique de surnageant de culture de Streptomyces ambofaciens. Ces nouvelles enzymes présentent une spécificité différente de celle de la lipase B de C. antarctica, permettant notamment, une acylation des acides aminés sur leur fonction amine en position α. Une caractérisation partielle des activités amino-acylase du surnageant de culture de S. ambofaciens a été réalisée. Dans une troisième et dernière partie, une comparaison des séquences génétiques a été réalisée entre treptomyces mobaraensis et S. ambofaciens afin d’identifier les gènes codant pour les acylases découvertes chez S. ambofaciens. Des mutants de S. ambofaciens délétés pour ces gènes ont été construits et la fonctionnalité des enzymes codées par ces gènes a été vérifiée ; enfin, une expression hétérologue de l’ε-lysine acylase a été initiée / Peptides exhibit various beneficial effects such as antioxidant, anti-hypertensive, neuroprotective, antiviral or antimicrobial activities. However, their use can be limited by their short half-life and their low biological availability. One solution to overcome these drawbacks is the acylation of peptides with fatty acids. This reaction called acylation can be catalyzed using enzymes. To date, very few studies focus on enzymatic acylation of peptides and on finding new enzymes catalyzing this reaction. The objectives of this work were, in a first time, to understand the selectivity mechanisms of the lipase B of Candida antarctica for peptides acylation combining experimental and molecular modeling approaches. This study highlighted enzyme/substrate interactions involved in the enzymatic selectivity and a modelexplaining the chemo- and regio-selectivity of this enzyme for peptide acylation reactions was built. In a second time, a preliminary study was carried out in order to identify new aminoacylase enzymes produced in the culture supernatant of various species of Streptomyces. These enzymes are able to catalyze acylation of peptides in aqueous media. A partial purification method was set and a comparative study was performed on the selectivity of C. antarctica lipase Band that of the new aminoacylases discovered in the culture supernatant of Streptomyces ambofaciens ATCC 23877. These enzymes presented a selectivity different from C. antarctica lipase B allowing the acylation of the N-terminal amino group of amino acids or peptides. A partial description of the aminoacylase activity of the supernatant crude extract of S. ambofaciens was performed. In a third and final part, a comparison of sequences of aminoacylases from Streptomyces mobaraensis with the genome of S.s ambofaciens ATCC 23877 was performed in order to identify genetic sequences encoding the new discovered aminoacylases from S. ambofaciens ATCC 23877. Each identified gene was deleted to correlate it with the aminoacylase activity observed in the crude extract of S. ambofaciens. Lastly, a heterologous expression of the ε-lysine acylase was initiated

Spécialisée dans la production d’actifs végétaux, l’entreprise PAT développe une activité innovante de recherche qui consiste à produire ou à modifier par voie enzymatique, des molécules présentes naturellement dans les plantes. L’espèce Ipomoea batatas contient de nombreux dérivés d’acide caféoyl-quinique dont majoritairement du 3,5-dicaféoyl-quinique (3,5-DCQ), une molécule antioxydante très recherchée en cosmétique. Cependant, la voie de biosynthèse est assez méconnue pour pouvoir exploiter les gènes d’intérêt par des approches d’ingénierie métabolique en vue d’augmenter la production. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont porté sur l’identification et la caractérisation fonctionnelle d’une hydroxycinnamoyl transférase (HCT) en vue d’augmenter la production de 3,5-DCQ soit en micro-organismes soit dans des plantes recombinantes. Pour réaliser ces travaux, une banque de données RNAseq a été générée permettant ainsi d'accéder à des séquences codantes. Ces séquences ont été analysées par alignement avec des séquences codant pour des hydroxycinnamoyl transférases (HCT, HQT) impliquées dans la synthèse d’un précurseur potentiel, l’acide chlorogénique. Un premier tri a été mené en utilisant des approches d’expression différentielle de gènes. La fonction des gènes a été étudiée par des approches d’expression hétérologue en système bactérien et de transgénèse végétale. La production des métabolites cibles a été analysée dans des plantes transgéniques et dans des cultures cellulaires. Sur ces plantes, nous avons réalisé des tests de résistance à des pathogènes fongiques. Nous avons identifié une HCT qui partage 85% d’identité avec une HCT de café impliquée dans la synthèse de 3,5-DCQ. Cette activité a pu être démontrée in vitro pour l’HCT d’ipomée. De plus, l’expression du gène codant pour l’HCT conduit à une surproduction de 3,5-DCQ dans les cultures cellulaires de tabacs exprimant les HCT. Cette molécule inhibe la croissance de Botrytis cinerea et de Phytophthora parasitica. Compte tenu des teneurs en 3,5-DCQ très faibles par rapport à la plante d’origine, ces résultats suggèrent l’implication d’autres gènes dans cette voie de biosynthèse. L’activité antifongique du 3,5-DCQ pourrait être exploitée pour des applications agrochimiques / Specialized in the production of plant actives, the company PAT develops an innovate research activity that consists of producing or modifying by enzymatic pathway, molecules naturally present in plants. The species Ipomoea batatas contains numerous caffeoylquinic acid derivatives, predominantly 3,5-dicaffeoylquinic acid (3,5-DCQ), an antioxydant molecule arousing interest in cosmetics. However, biosynthesis pathway of this molecule is poorly established in order to exploit the genes of interest by metabolic engineering approaches to increase the production. The work realized in the frame of this PhD concerns the identification and functional characterization of a hydroxycinnamoyl transferase (HCT) in order to increase the production of 3,5-DCQ either in microorganisms or in recombinant plants. To perform this work, an RNAseq databank was generated allowing to access to coding sequences. These sequences were analysed by alignment of sequences encoding for hydroxycinnamoyl transferases (HCT, HQT) involved in the biosynthesis of a potential precursor, chlorogenic acid. A first screening was performed by utilizing an approach of differential expression of genes. The function of genes was studied by heterologous expression in bacterial systems and by plant transgenesis approaches. The production of target metabolites was analyzed in transgenic plants and cell cultures. On these plants, we conducted tests of resistance to fungal pathogens. We identified an HCT that shares 85% of identity with a HCT isolated from coffee previously characterized in 3,5-DCQ biosynthesis. This activity was shown in vitro for HCT of Ipomee. Moreover, the expression of target gene led to an overproduction of 3,5-DCQ in cell cultures of tobacco expressing HCT. This molecule inhibits growth of Botrytis cinerea and Phytophthora parasitica. Giving that amounts of 3,5-DCQ are very low compared to the plant of origin, these results suggest the involvement of other genes in this biosynthesis pathway. Antifungal activity of 3,5-DCQ could be exploited for agrochimic applications