Die Telomere sind spezialisierte DNA-Protein-Komplexe, die sich an den Enden der Chromosomen der eukaryotischen Zellen befinden. Die Telomerase ist ein Ribonukleoprotein, welches für die vollständige Replikation der Telomere bei den meisten Eukaryoten verantwortlich ist. Die katalytische Untereinheit des Enzyms (hTERT beim Menschen) besitzt Reverse-Transkriptase-Aktivität, und nutzt eine integrierte RNA (hTR beim Menschen) als Template, um Telomer-Wiederholungssequenzen an den Enden der Chromosomen zu synthetisieren. Die Telomerase ist in den meisten normalen humanen somatischen Zellen unterdrückt. In den meisten Krebszellen jedoch, stellt die Reaktivierung der Telomerase zur Beibehaltung der Telomerlänge eine Voraussetzung für deren unbegrenztes Wachstumspotential dar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein neuer, einfacher und selektiver Assay für den Nachweis der humanen Telomerase entwickelt werden. In dem neuen Assay sollten die beiden Kernkomponenten des Enzyms, die Protein-Untereinheit und die RNA, die Targets sein. Der Test ist in seiner Grundstruktur wie folgt aufgebaut : 1. Immobilisierung der Telomerase über die hTERT an eine Festphase, beschichtet mit Phosphorothioat-modifizierten (PS) Oligonukleotiden oder Heparin. Zusammen mit der Telomerase werden bei diesem Schritt die Heparin-bindenden Proteine, die in der Probe enthalten sind, an die Festphase gebunden. 2. Spezifischer Nachweis der hTR. Zur Detektion der hTR wird ein Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) oder eine Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) eingesetzt. In der optimierten Endversion wurde zur Immobilisierung des Enzyms eine Festphase, beschichtet mit PS-Oligonukleotiden, verwendet. Die hTR wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Mit dem neuen Assay wurden erfolgreich 75 Tumorzellen detektiert. / Telomeres are specialized DNA-Protein structures located at the ends of linear eukaryotic chromosomes. Telomerase is a ribonucleoprotein, which is responsible for the complete replication of the telomeres in most eukaryotes. The catalytic reverse transcriptase protein subunit (hTERT in humans) of the nucleoprotein uses an integral RNA (hTR in humans) as a template for the addition of telomeric repeat sequences to the ends of chromosomes. Telomerase is repressed in most normal human somatic cells, while the reactivation of telomerase to maintain telomere length is necessary for the unlimited growth potential of most human cancer cells. The aim of this work was the development of a new, simple and selective assay for the detection of human telomerase. The targets of the new assay were the two core subunits of the enzyme : hTERT and hTR. The test comprises two principal steps : 1. Immobilization of the telomerase via the hTERT subunit on a solid phase, coated with heparin or phosphorothioate-modified (PS) oligonucleotides. In this step telomerase is bound together with the heparin-binding proteins of the analysed sample to the surface. 2. Specific detection of the hTR. For the detection of the hTR an oligonucleotide ligation assay (OLA) or a reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was used. In the optimized final version of the assay a PS-coated solid phase was used for the immobilization of the enzyme. Reverse transcriptase PCR was applied for detection of the hTR. 75 tumor cells were successfully detected with the new assay.

Les lymphocytes constituent un modèle original de cellules somatiques puisqu’ils sont capables de réactiver la télomérase lorsqu’ils sont stimulés. Nous avons montré que les lymphocytes, en culture prolongée et soumis à des stimulations itératives par la PHA, présentent une diminution progressive de l’activité télomérasique interrompue à chaque stimulation par une augmentation transitoire. Ces variations sont corrélées positivement aux variations de hTERT et de la longueur des télomères. Les foyers γ-H2AX et 53BP1 et leur localisation au niveau des télomères augmentent lors du vieillissement cellulaire. Nous montrons un dysfonctionnement des télomères au cours de la sénescence lymphocytaire in vitro résultant d’une érosion accrue des télomères et d’une diminution de l’expression des protéines qui les coiffent. Le mécanisme des variations précoces de l’expression de hTERT lors de l’activation lymphocytaire restaient à comprendre. Les conséquences du traitement des lymphocytes par différents immunosuppresseurs agissant tous de façon directe ou indirecte sur l’activation de NFAT suggéraient le rôle de NFAT dans la régulation transcriptionnelle de hTERT. Nous avons montré i) 5 éléments de réponse potentiels pour NFAT au niveau du promoteur de hTERT, ii) l’activation in vitro du promoteur de hTERT par NFAT essentiellement via un site consensus localisé dans le coeur du promoteur de hTERT en position -40 et une synergie fonctionnelle entre NFAT et SP1, iii) la liaison directe de NFAT sur le promoteur de hTERT via ce site consensus in vivo. Ainsi, NFAT1 régule la transcription de hTERT et est impliqué dans l’activation de la télomérase lors de la stimulation lymphocytaire / Lymphocytes are an example of somatic cells capable to induce telomerase activity when stimulated. We showed that lymphocytes, during long-term culture and repeated PHA stimulations, present a progressive drop in telomerase activity interrupted at each stimulation by a transitory increase. These variations are positively correlated with hTERT and telomere length variations. γ-H2AX and 53BP1 foci and their localization on telomeres increase with cell aging. We show a telomere dysfunction during in vitro lymphocyte senescence resulting from an excessive telomere shortening and a decrease in shelterin content. The mechanism involved in early variations of hTERT expression during lymphocyte activation remained to be understood. Consequences of lymphocyte treatment with different immunosuppressors, all acting directly or indirectly on NFAT activation, suggested a role for NFAT in the regulation of hTERT transcription. Five putative responsive elements for NFAT were identified in the hTERT promoter. We showed that NFAT activates in vitro the hTERT promoter mainly via a consensus site localized in the promoter core at position -40 and a functional synergy between NFAT and SP1. Furthermore, NFAT1 binds directly to the endogenous hTERT promoter via this consensus site in vivo. Thus, NFAT positively regulates the hTERT transcription and we propose its implication in telomerase activation during lymphocyte stimulation

Das Harnblasenkarzinom (BCa) ist die zweithäufigste bösartige urologische Tumorerkrankung sowie die siebthäufigste tumorbedingte Todesursache bei Männern. Zur Senkung des erheblichen Rezidiv- und Progressionsrisikos oberflächlicher BCa kommen lokale Immun- oder Chemotherapeutika zum Einsatz, die jedoch starke Nebenwirkungen verursachen können bzw. ungenügende langfristige Effekte bewirken. Eine neuartige Therapieoption besteht in der gezielten Expressionshemmung von Genen, die den Tumorzellen einen Wachstumsvorteil vermitteln. Hierfür eignen sich besonders synthetische Nukleinsäuren wie Antisense-Oligodesoxynukleotide (AS-ODN) und small interfering RNAs (siRNAs). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expressionshemmung des potenziellen Targetgens hTERT (humane Telomerase Reverse Transkriptase) mit AS-ODN und siRNAs in BCa-Zellen untersucht. Die Tumorspezifität der hTERT-mRNA-Expression konnte zunächst an tumor- und tumorfreien Gewebeproben von BCa-Patienten gezeigt werden. Die verwendeten AS-ODN reduzierten die hTERT-mRNA-Expression auf bis zu 40%, womit eine Verringerung der Telomeraseaktivität einherging. Die AS-ODN-Behandlung bewirkte des Weiteren eine konzentrationsabhängige Viabilitätsreduktion verschiedener BCa-Zelllinien sowie eine verminderte Zellkoloniebildungsrate. Diese antiproliferativen Effekte waren auf eine Apoptoseinduktion zurückzuführen. Durch eine Vorbehandlung von vier BCa-Zelllinien mit hTERT-AS-ODN konnten die zytotoxischen Effekte der für das BCa relevanten Chemotherapeutika Cisplatin, Mitomycin C und Gemcitabin signifikant verstärkt werden. Nach Untersuchung der AS-ODN-Wirkung in vitro erfolgte die Etablierung eines subkutanen Xenotransplantantmodells der Nacktmaus. Die Eignung einer intraperitonealen Applikation wurde mit fluoreszenzmarkierten AS-ODN belegt. In weiteren Zellkulturexperimenten kamen hTERT-siRNAs, als alternative Methode der Geninhibition, zum Einsatz. Die Reduktion der hTERT-mRNA-Expression auf 50% war mit der durch AS-ODN bewirkten Inhibition vergleichbar. Im Gegensatz zur AS-ODN-Behandlung induzierten siRNAs keine unmittelbare Apoptose. Eine Kombination der siRNAs mit Cisplatin und Mitomycin C bewirkte jedoch eine Verdopplung der Apoptoserate. Um die molekularen Mechanismen der Wirkung der nukleinsäurebasierten hTERT-Inhibitoren und den Einfluss targetunabhängiger Effekte zu untersuchen, wurden transkriptomweite Expressionsanalysen mittels Oligonukleotid-Microarrays durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die AS-ODN-Behandlung vorwiegend zu einer gesteigerten Expression von Genen führte, die mit einer zellulären Stressantwort assoziiert sind (u.a. ATF3, EGR1, GADD45). Diese Expressionsmuster stimmten in hohem Maße mit denen überein, die durch Transfektion mit AS-ODN gegen andere Targets erhalten wurden. Diese Ergebnisse deuten auf eine, zumindest teilweise, durch off-Targeteffekte ausgelöste Wachstumshemmung hin. Die siRNA-Behandlungen gegen unterschiedliche Targets zeigten relativ geringe Übereinstimmungen in den Expressionsmustern und somit eine höhere Spezifität. Außerdem wurde erstmalig gezeigt, dass eine hTERT-Inhibition mit siRNAs zur trankriptionellen Hemmung der Onkogene EGFR und FOSL1 führt. Diese Daten sowie die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen deuten auf einen wechselseitigen Zusammenhang zwischen hTERT und EGFR in der Regulation der EGFR-stimulierten Proliferation von BCa-Zellen hin. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass hTERT als tumorspezifisch exprimierter und funktionell relevanter Faktor ein hervorragendes Target für eine nukleinsäurebasierte BCa-Therapieoption darstellt. Im Vergleich zu AS-ODN wirken siRNAs grundsätzlich targetspezifischer. Die therapeutische Wertigkeit der lokal applizierten Inhibitoren, insbesondere in Kombination mit herkömmlichen Chemotherapeutika, sollte in nachfolgenden Experimenten im Rahmen eines orthotopen BCa-Xenotransplantatmodells untersucht werden.

Die Bedeutung geeigneter in vitro Modelle gewinnt im Hinblick auf die Reduktion von Tierversuchen getreu des 3R-Prinzips immer mehr an Bedeutung. Für viele Fragestellungen in Bezug auf den Lebermetabolismus bei Nutztieren bieten primäre bovine und porcine Hepatozyten ein vielversprechendes in vitro Modell. Die Verfügbarkeit von primären Hepatozyten ist aber, aufgrund ihrer besonderen Sensibilität, äußerst begrenzt. Die Kryokonservierung von primären Hepatozyten stellt eine Strategie dar die Verfügbarkeit dieser Zellen maßgeblich zu verbessern. Eine weitere Möglichkeit Hepatozyten haltbar zu machen, ist die Proliferationsinduktion und somit die Immortalisierung der Leberzellen. Ziel dieser Arbeit war es, erstmals ein Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten zu etablieren. Darüber hinaus sollte überprüft werden ob die Proliferationsaktivität von primären bovinen und porcinen Hepatozyten durch eine Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder die Integration von humaner Telomerase reverse Transkriptase (hTERT) mittels Lipofectamine®-Transfektion induziert werden kann. Primäre Hepatozyten vom Rind und vom Schwein wurden von lebergesunden Spendertieren vergleichend mit einer zweischrittigen Kollagenaseperfusion gewonnen. Für die Etablierung des Kryokonservierungsprotokolls wurde zunächst die geeignete DMSO-Endkonzentration von 10 % ermittelt (n=3). Anschließend erfolgte die Kryokonservierung der Hepatozyten mit einer DMSO-Endkonzentration von 10 % und einer Konzentration von 20 % Fetalem Bovinem Serum vergleichend in William’s E Medium (WE) bzw. University of Wisconsin Medium (UW) mit und ohne Zusatz von 0,2 M Trehalose (T). Gleichzeitig wurde der Effekt einer computergesteuerten Einfriertechnik in einem Controlled-Rate-Freezer gegenüber einer manuellen Einfriertechnik mit Hilfe eines Gefrierbehälters evaluiert (n=6). Nach dem Auftauen wurde die Recovery (R, Zellzahl lebend aufgetauter Zellen im Vergleich zur Zahl der lebend eingefrorenen Zellen) und die Viabilität (V) der Hepatozyten mittels Trypanblaufärbung bestimmt, sowie die Kultivierbarkeit der Hepatozyten nach der Kryokonservierung untersucht. Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, wurde im ersten Schritt ein geeignetes Transfektionsreagenz ermittelt, welches keine oder nur geringe zytotoxische Auswirkungen auf die Hepatozyten hat. Hierfür wurden die Hepatozyten in einer Monolayerkultur kultiviert und vergleichend mit Lipofectamine® 3000 und Lipofectamine® 2000 Reagenz behandelt (n=3). Anschließend erfolgte, mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz, eine Ko-Transfektion des eukaryotischen Plasmidvektors pCL-neo-hEST2 (hERT) sowie des fluoreszierenden eukaryotischen Plasmidvektors pmaxGFP™ in primäre bovine und porcine Hepatozyten. Die Überprüfung von Transfektionserfolg und -effizienz erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskopie an Tag 2 nach Ko-Transfektion (n=6). Darüber hinaus wurde überprüft, ob eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren „bovine hepatocyte growth factor“ (bHGF) und „bovine epithelial growth factor“ (bEGF) bei kultivierten primären bovinen Hepatozyten zu einer effektiven Stimulation ihrer Proliferationsaktivität führt. Die Bestimmung der Signifikanzniveaus (P-Wert) erfolgte mittels One-way ANOVA Analyse mit Turkey-Test als Post-Hoc-Test, sowie der Two-Way ANOVA Analyse mit Šidák-Test als Post-Hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Als statistisch signifikant wurde ein Signifikanzniveau von P ≤ 0,05 gewertet. Es konnte gezeigt werden, dass die computergesteuerte Einfriertechnik für die Kryokonservierung von primären bovinen und porcinen Hepatozyten einer manuellen Einfriertechnik deutlich überlegen ist (P < 0.0001). Im Hinblick auf die Wahl des Einfriermediums konnten für bovine Hepatozyten mit WE + T (V: 65,1 ± 8,3 %; R: 36,5 ± 6,0 %) und UW (V: 66,0 ± 11,2 %; R: 34,0 ± 8,9 %) und für porcine Hepatozyten mit UW (V: 76,8 ± 2,7 %; R: 69,7 ± 26,2 %) und UW + T (V: 64,4 ± 7,3 %; R: 67,6 ± 26,1 %) die besten Ergebnisse erzielt werden. Im Gegensatz zu kryokonservierten porcinen Hepatozyten, konnten bovine Hepatozyten ihre Kultivierbarkeit nach der Kryokonservierung nicht beibehalten. Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, konnte gezeigt werden, dass das Transfektionsreagenz Lipofectamine® 3000 für die Transfektion primärer boviner und porciner Hepatozyten aufgrund zytotoxischer Eigenschaften nicht geeignet ist. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz ein erfolgreiches Transfektionsprotokoll für primäre bovine und porcine Hepatozyten etabliert werden. Eine Induktion der Proliferationsaktivität durch die Integration von hTERT konnte allerdings nicht beobachtet werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren bHGF und bEGF allenfalls zu einer geringgradigen Steigerung der Proliferationsaktivität primärer boviner Hepatozyten in einer Kollagen-Monolayer-Kultur führt. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass das Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten weiter angepasst werden muss, um diese nach dem Tiefgefrieren brauchbar zu machen. Darüber hinaus sollte im Prozess der Etablierung einer Hepatozyten-Zelllinie aus primären bovinen bzw. porcinen Hepatozyten die Transfektion viraler Onkogene durchgeführt werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3 2.2 Kryokonservierung 4 2.2.1 Geschichte 4 2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5 2.2.3 Kryoprotektiva 8 2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8 2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11 2.2.4 Einfriermedium 13 2.2.5 Kühlungsrate 14 2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15 2.2.7 Auftauen 15 2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17 2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19 2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19 2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20 2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23 2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24 2.3.3 Gentransfer 26 3 Tiere, Material und Methoden 28 3.1 Material 28 3.2 Spendertiere 28 3.3 Methoden 30 3.3.1 Leberentnahme Rind 30 3.3.2 Leberentnahme Schwein 30 3.3.3 Leberzellisolation 31 3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35 3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36 3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37 3.3.7 Kryokonservierung 38 3.3.7.1 Vorversuch 38 3.3.7.2 Hauptversuch 40 3.3.8 Transfektion 44 3.3.8.1 Vorversuch 44 3.3.8.2 Hauptversuch 47 3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50 3.4 Auswertung 51 3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51 3.4.2 Statistik 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53 4.2 Kryokonservierung 55 4.2.1 Vorversuch 55 4.2.2 Hauptversuch 57 4.3 Transfektion 63 4.3.1 Vorversuch 63 4.3.2 Hauptversuch 67 4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73 5 Diskussion 77 5.1 Ausgangsmaterial 77 5.2 Kryokonservierung 79 5.2.1 DMSO-Konzentration 79 5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81 5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82 5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83 5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84 5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88 5.3 Transfektion 90 5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90 5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91 5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 119 10.1 Geräte 119 10.2 Chemikalien 120 10.3 Plasmide 123 10.4 Gas 123 10.5 Verbrauchsmaterialien 123 10.6 Original Temperatur-Kurven 126 11 Danksagung 129 / The importance of suitable in vitro models is gaining more and more importance with regard to the reduction of animal experiments true to the 3Rs principle. Primary bovine and porcine hepatocytes offer a promising in vitro model to study liver metabolism in farm animals. However, the availability of primary hepatocytes is extremely limited due to their particular sensitivity. Cryopreservation of primary hepatocytes illustrates one strategy to increase their availability. Another approach to preserve hepatocytes in vitro is to induce cell-proliferation resulting in an immortalized hepatocyte cell line. This study aimed to establish for the first time a cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes. Furthermore, it should be verified whether proliferation activity can be induced by treatment with growth factors or integration of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) via Lipofectamine® transfection. Primary bovine and porcine hepatocytes of liver healthy animals were obtained comparatively using a two-step collagenase-perfusion technique. For the establishment of the cryopreservation protocol, the appropriate final DMSO concentration of 10 % was first determined (n=3). Subsequently, cryopreservation of hepatocytes was performed comparatively in William's E medium (WE) and University of Wisconsin medium (UW) respectively, with and without the addition of 0.2 M trehalose (T) with a final DMSO concentration of 10% and a concentration of 20% fetal bovine serum. At the same time, the effect of a computer-controlled freezing technique in a controlled-rate freezer versus a manual freezing technique using a freezing container was evaluated (n=6). Cell-recovery (R, cell number of live thawed cells compared to the number of live frozen cells), as well as cell-viability (V) of cryopreserved hepatocytes was determined by trypan blue staining, after thawing. In addition, it was examined if cryopreserved hepatocytes maintain plateable after thawing. For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, the first step was to determine a suitable transfection reagent that has no or only minor cytotoxic effects on the hepatocytes. For this purpose, hepatocytes were cultured in a monolayer culture and comparatively treated with Lipofectamine® 3000 and Lipofectamine® 2000 reagent (n=3). Subsequently, the eukaryotic plasmid vector pCL-neo-hEST2 (hTERT) plus fluorescent eukaryotic plasmid vector pmaxGFP™ were transfected into primary bovine and porcine hepatocytes using Lipofectamine® 2000 reagent. Transfection success and efficiency was verified by fluorescence microscopy 2 days after co-transfection (n=6). Futhermore, it was examined whether treatment with bovine hepatocyte growth factor' (bHGF) and bovine epithelial growth factor (bEGF) leads to an effective stimulation of proliferation activity in cultured primary bovine hepatocytes Significance levels (P value) were determined by one-way ANOVA analysis with Turkey test as post hoc test, and two-way ANOVA analysis with Šidák-test as post hoc test for multiple comparisons. A significance level of P ≤ 0.05 was considered statistically significant. It was shown that a computer-controlled freezing technique is clearly superior to a manual freezing technique for the cryopreservation of primary bovine and porcine hepatocytes (P < 0.0001). With regard to the choice of the freezing medium, the best results were obtained for bovine hepatocytes with WE + T (V: 65.1 ± 8.3 %; R: 36.5 ± 6.0 %) and UW (V: 66.0 ± 11.2 %; R: 34.0 ± 8.9%) and for porcine hepatocytes with UW (V: 76.8 ± 2.7%; R: 69.7 ± 26.2%) and UW + T (V: 64.4 ± 7.3%; R: 67.6 ± 26.1%). In contrast to cryopreserved porcine hepatocytes, bovine hepatocytes could not maintain their cultivability after cryopreservation. For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, it was shown that the transfection reagent Lipofectamine® 3000 is not suitable for transfection of primary bovine and porcine hepatocytes due to cytotoxic properties. In contrast, a successful transfection protocol for primary bovine and porcine hepatocytes could be established using Lipofectamine® 2000 reagent. However, induction of proliferation activity by integration of hTERT could not be observed. Similarly, treatment with the growth factors bHGF and bEGF was shown to result in at most a modest increase in the proliferation activity of primary bovine hepatocytes in a collagen monolayer culture. In conclusion, the cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes needs to be further adapted to make hepatocytes useful after deep freezing. Furthermore, transfection of viral oncogenes should be considered in the further process of establishing a hepatocyte cell line of primary bovine or porcine hepatocytes.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3 2.2 Kryokonservierung 4 2.2.1 Geschichte 4 2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5 2.2.3 Kryoprotektiva 8 2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8 2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11 2.2.4 Einfriermedium 13 2.2.5 Kühlungsrate 14 2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15 2.2.7 Auftauen 15 2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17 2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19 2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19 2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20 2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23 2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24 2.3.3 Gentransfer 26 3 Tiere, Material und Methoden 28 3.1 Material 28 3.2 Spendertiere 28 3.3 Methoden 30 3.3.1 Leberentnahme Rind 30 3.3.2 Leberentnahme Schwein 30 3.3.3 Leberzellisolation 31 3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35 3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36 3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37 3.3.7 Kryokonservierung 38 3.3.7.1 Vorversuch 38 3.3.7.2 Hauptversuch 40 3.3.8 Transfektion 44 3.3.8.1 Vorversuch 44 3.3.8.2 Hauptversuch 47 3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50 3.4 Auswertung 51 3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51 3.4.2 Statistik 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53 4.2 Kryokonservierung 55 4.2.1 Vorversuch 55 4.2.2 Hauptversuch 57 4.3 Transfektion 63 4.3.1 Vorversuch 63 4.3.2 Hauptversuch 67 4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73 5 Diskussion 77 5.1 Ausgangsmaterial 77 5.2 Kryokonservierung 79 5.2.1 DMSO-Konzentration 79 5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81 5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82 5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83 5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84 5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88 5.3 Transfektion 90 5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90 5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91 5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 119 10.1 Geräte 119 10.2 Chemikalien 120 10.3 Plasmide 123 10.4 Gas 123 10.5 Verbrauchsmaterialien 123 10.6 Original Temperatur-Kurven 126 11 Danksagung 129

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Adult T-cell leukemia (ATL) is an aggressive lymphoproliferative disorder associated with human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) infection. Reactivation of telomerase, a critical event in tumor progression observed in late phases of ATL development, has been shown to be caused by HBZ (HTLV-1 bZIP factor), a regulatory protein encoded by the negative strand of the HTLV-1 genome. The HBZ-mediated up-regulation of the telomerase catalytic subunit is dependent on JunD, which in the cellular context occurs in the complex with menin, the product of the MEN-1 tumor suppressor gene. Interaction with menin represses JunD-dependent transcription and converts JunD into a growth suppressor, whereas it acts as a growth promoter in the absence of menin. My results demonstrate that the viral protein HBZ abrogates tumor suppressor function of menin, resulting in the activation of JunD transcriptional activity and finally in the up-regulation of its target gene, the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). I showed that HBZ, JunD and menin can coexist in the same protein complex and that HBZ and menin exert opposite effects on JunD transcriptional activity. Moreover menin inhibits the JunD-mediated activation of the hTERT proximal promoter and HBZ is able to counteract this effect. Finally, I proposed that HBZ, by recruiting p300 histone acetyltransferase, reverses the histone deacetylation conducted by menin-recruited HDACs and therefore up-regulates the expression of the hTERT gene. Altogether, my work led to the identification of the molecular mechanism leading to the functional impairment of the menin tumor suppressor, which results in the deregulation of AP-1 signaling in HTLV-1 infected cells. Finally this work gave new insights into the mechanism of the transcriptional up-regulation of the hTERT gene upon HTLV-1 infection, being a key event during the development of Adult T-cell leukemia and a necessary step towards the progression into more aggressive courses.

Les télomères sont raccourcis à chaque cycle de réplication de l’ADN à cause du problème de réplication des extrémités. Leur longueur dicte la capacité proliférative des cellules eucaryotes. Des télomères trop courts, aillant atteints la limite de Hayflick, feront entrer les cellules en sénescence réplicative. Pourtant dans les cellules progénitrices ainsi que 90% des cellules cancéreuses la longueur des télomères est maintenue par un complexe ribonucléoprotéique, la télomérase. L’assemblage de ce complexe ainsi que son recrutement aux télomères son des processus dynamiques sous le contrôle d’une régulation fine. Toutefois, comment cette régulation à un impact sur la dynamique de la télomérase dans le noyau n’est toujours pas complétement compris. Dans ce projet nous avons développé une nouvelle méthode se basant sur le système MS2 permettant d’observer pour la première des particules uniques d’ARN de télomérase (hTR) par microscopie à fluorescence sur cellules cancéreuse humaines vivantes. Le suivi en temps réel de ces particules aux télomères a permis de révéler que la télomérase scanne activement les télomères via des interactions courtes avec la protéine télomérique TPP1. Des interactions plus stables nécessaires à l’allongement des télomères peuvent être formées grâce à l’appariement entre hTR et l’ADN simple brin du télomère sous contrôle du domaine OB-fold de la protéine télomérique POT1. Le suivi de ces particules au cours du cycle cellulaire a révélé que ces interactions ne sont pas restreintes à la phase S, la phase d’élongation des télomères. La mesure de la dynamique de hTR dans les corps de Cajal (CBs) couplé à des expériences de photo-activation ont pu montrer que hTERT joue un rôle dans la sortie de hTR des CBs. Enfin des mesures d’intensités de fluorescence de hTR aux télomères montrent qu’une seule particule est recruté sur un télomère en phase S. / Telomeres are shortened at each DNA replication cycle, due to the end replication problem. Their length dictates the proliferative capacity of eukaryotic cells. Too short telomeres, reaching the Hayflick limit, will lead the cells to replicative senescence. However, in stem cells and 90% of cancer cells telomere length is maintained by a ribonucleoproteic complex named telomerase. The assembly of this complex and its recruitment to telomeres are process under a fine regulation. Yet, how this regulation impacts the nuclear dynamics of telomerase is not fully understood. In this project, we developed a new method based on the MS2 system to image for the first time telomerase RNA (hTR) particles in living human cancer cells by fluorescence microscopy. The real time tracking of these particles at telomeres revealed that telomerase actively scan all telomeres by short interactions with the TPP1 shelterin protein. Long stable interaction needed for telomere elongation can be made by the pairing of hTR template and single stranded telomeric DNA under the control of the OB-fold domains of the shelterin protein POT1. By tracking telomerase particle during the cell cycle, we revealed that telomerase recruitment to telomeres is not restricted to S phase, when telomeres are elongated. By measuring the dynamics of hTR in Cajal bodies (CBs) with photo-activation and photo-bleaching technics we showed that hTERT play a role in the hTR exit from CBS. Finally, fluorescence intensity measures of hTR at telomeres showed the recruitment of only one particle on a telomere.

Ce travail de thèse se propose d’étudier le retard de croissance intra-utérin sous l’angle de la cytogénétique placentaire, avec deux approches distinctes et complémentaires. La première approche visera à réévaluer l’influence des anomalies chromosomiques limitées au placenta sur la croissance fœtale, car des études précédentes ont rapporté des résultats contradictoires à ce sujet. La première partie de ce travail permettra en outre d’étudier l’incidence et l’influence de la disomie uniparentale chez les fœtus issus des grossesses compliquées d’une anomalie chromosomique limitée au placenta. La deuxième approche de notre travail s’intéressera à la longueur de structures chromosomiques particulières, les télomères, au niveau placentaire. Il a récemment été décrit que la longueur des télomères des cellules placentaires était réduite au terme des grossesses compliquées d’un retard de croissance intra-utérin. La longueur télomérique placentaire n’a jamais été évaluée au cours de ces grossesses et pourrait potentiellement être utilisée comme biomarqueur placentaire du retard de croissance intra-utérin. La deuxième partie de ce travail nous permettra également d’évaluer le nombre de copies des régions chromosomiques portant les gènes codant pour les principales sous-unités du complexe enzymatique télomérase et de rechercher la présence d’agrégats télomériques au niveau placentaire en cas de retard de croissance intra-utérin. / This thesis proposes to study intrauterine growth restriction in terms of cytogenetics of placenta, with two distinct and complementary approaches. The first approach will be to reassess the influence of confined placental mosaicism on fetal growth, as previous studies have reported conflicting results on this issue. The first part of this work will also study the influence of fetal uniparental disomy in case of confined placental mosaicism. The second approach of our work will focus on the length of terminal chromosomal structures, telomeres, at the placental level. It has recently been reported that telomere length was reduced in placental cells collected at term in pregnancies complicated by intrauterine growth restriction. Placental telomere length has never been evaluated in ongoing pregnancies and it could potentially be used as a placental biomarker of intrauterine growth restriction. The second part of this work will also focus on the copy number of chromosomal regions carrying genes encoding the main subunits of the telomerase enzyme complex and will look for the presence of placental telomeric aggregates in case of intrauterine growth restriction.

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<p>An important step in tumorgenesis is the acquisition of cellular immortality. Tumor cells accomplish this by activating the enzyme telomerase, and thereby avoiding replicative senescence. The aim of this thesis was to study the activity and regulation of telomerase in a panel of malignant cell types.</p><p>We found that TGF-β1 (transforming growth factor-β1) mediated differential effects on telomerase activity in five ATC (anaplastic thyroid carcinoma) cell lines. Cells that harbored a <i>p53</i> mutation responded by up-regulation of telomerase activity after TGF-β1 treatment, whereas cell lines displaying wt <i>p53 </i>responded by down-regulation of telomerase activity. Thus, these results indicate a possible connection between <i>p53</i> genotype and telomerase response to TGF-β1 treatment. Furthermore, the decreased telomerase activity appeared to be due to transcriptional repression of the <i>hTERT</i> promoter and the increased activity possibly involved hTERT activation via phosphorylation. </p><p>We have previously shown that IFNs (interferons) sensitize MM (multiple myeloma) cells to Fas-mediated apoptosis. In the present investigation both IFN-α and IFN-γ down regulated telomerase activity in the MM cell line U-266-1970. The mechanism underlying the reduction of telomerase activity by IFN was shown to be transcriptional repression of the <i>hTERT </i>gene. We suggest that one potential mechanism whereby IFN sensitize MM cells to Fas-mediated apoptosis is by repressing <i>hTERT</i> activity at the transcriptional level. </p><p>In the next study we demonstrated that basal telomerase activity is not a key determinant of sensitivity to cytotoxic drugs in ESCC (esophageal squamous cell carcinoma) cell lines. Furthermore, we observed no correlation between <i>c-Myc</i> amplification, <i>p53</i> mutations and high telomerase activity levels in these cell lines. </p><p>Finally, neuroblastoma cell lines were shown to up-regulate telomerase activity in response to hypoxic exposure and the main regulatory mechanism was not mediated by increased hTERT mRNA expression. This finding might constitute an adaptive stress response of tumor cells exposed to hypoxia. </p>