We assessed influence of three acclimation regimes and influence of recovery after cold shock (exposure to 0°C for a period of time corresponding to Lt25) on the relative mRNA levels of selected stress proteins using qRT-PCR method. Larvae acclimated at 25°C showed relatively weak upregulation responses to cold shock. Much stronger responses were observed in the larvae that were cold-acclimated at 15°C or 15°C ? 6°C prior to cold shock. Two different general trends were distinguished in the response to cold acclimation and cold shock: (a) proteins from families SP70 and SP90 and splice variants c and d of the transcription factor HSF were upregulated in response to cold acclimation and the levels of their mRNA transcripts further increased after cold shock (for instance, the abundance of hsp70Aa mRNA increased up to 300-fold after cold shock (acclimation variant 15°C ? 6°C)); (b) four members of the small Hsp family (22, 23, 26 and 27 kDa) and splice variants a and b of the transcription factor HSF were down-regulated during cold acclimation (for instance, 10-fold in the case of hsp22) and the levels of their mRNA transcripts were either unchanged or increased only moderately after the cold shock. A third group of proteins, namely Hsc70, Hsp40 showed no or relatively small changes.

Os fogachos são a queixa mais comum das mulheres peri- e pós-menopausa e estão fortemente relacionados com a diminuição dos níveis de estrogênio. No entanto, a fisiopatologia deste sintoma vasomotor muito desagradável é ainda desconhecido. Por outro lado, o estradiol (E2) apresenta a capacidade de induzir a expressão de HSP72, um membro da família de 70 kDa das proteínas de choque térmico (HSP70), que são citoprotetoras e cardioprotetoras. Sabe-se que a expressão HSP70 é comprometida em doenças inflamatórias relacionadas com o envelhecimento. Por isso, questionamos se a capacidade do organismo de desencadear uma resposta ao choque térmico (Heat Shock Response) robusta, estaria ainda presente após a retirada, via castração, do E2. Para tanto, foram estudados os efeitos do choque térmico (Heat Shock - HS), através de uma sessão de banho de imersão, em ratas Wistar submetidas a ovariectomia bilateral (OVX), após um período de washout hormonal de 7 dias. Doze horas após o HS, os animais foram mortos e o arco aórtico foi excisado cirurgicamente para análises moleculares. Os resultados foram comparados com os marcadores de estresse oxidativo no plasma (superóxido dismutase, catalase e lipoperoxidação), pois é bem estabelecido que a expressão de HSP70 é sensível a regulação redox. A relação entre a iHSP70 (intracelular) e a eHSP70 (extracelular/plasma), proposto como um índice do estado inflamatório sistêmico, também foi investigada. Os resultados mostraram que a Heat Shock Response continua preservada em animais OVX, como inferido a partir da expressão de HSP70 (até 40% de aumento, p <0,01) nas aortas, o que não foi acompanhado por nenhuma outra alteração em marcadores de estresse oxidativo, parâmetros hematológicos e no controle glicêmico. Desta forma, sugerimos que a avaliação periódica do status de HSP70 (iHSP70 vs eHSP70) pode ser de extrema relevância clínica, pois a diminuição da capacidade de defesa do organismo via Heat Shock Response está no centro do aparecimento de disfunções relacionadas com a menopausa. / Hot flashes, the most common complaint of peri- and postmenopausal women, are tightly related to decrease in estrogen levels. However, the pathophysiology of this very unpleasant vasomotor symptom is greatly unknown. On the other hand, estradiol (E2) has been found to induce the expression of HSP72, a member of the 70 kDa family of heat shock proteins (HSP70), which are cytoprotective and cardioprotective. Since it has been noticed that HSP70 expression is compromised in age-related inflammatory diseases, we argued whether the capacity of triggering a robust heat shock (HS) response would be still present after E2 withdrawal. Hence, we studied the effects of HS treatment (hot tub) in female Wistar rats subjected to bilateral oophorectomy (OVX) after a 7 day washout period. Twelve hours after HS, the animals were killed and aortic arches were surgically excised for molecular analyses. The results were compared with oxidative stress markers in the plasma (superoxide dismutase, catalase and lipoperoxidation) because HSP70 expression is sensitive to redox regulation. Extracellular (plasma) to intracellular HSP70 ratio, an index of systemic inflammatory status, was also investigated. The results showed that HS response was preserved in OVX animals, as inferred from HSP70 expression (up to 40% rise, p<0.01) in the aortas, which was accompanied by no further alterations in oxidative stress, hematological parameters and glycemic control either. As a consequence, periodic evaluation of HSP70 status (iHSP70 vs eHSP70) may be of clinical relevance because decreased HS response capacity is at the center of the onset of menopause-related dysfunctions.

Apesar do sucesso do transplante na clínica, os importantes efeitos adversos dos imunossupressores, usados para prevenir e tratar a rejeição, apontam para a necessidade de novas terapias imunorreguladoras. A via oral tem sido efetiva na indução de imunorregulação, em diversos modelos experimentais, principalmente de doenças autoimunes. A Hsp60/65 é uma molécula com grande potencial imunoterapêutico, por sua capacidade de induzir respostas imunes pró-inflamatória e imunorreguladora. Testamos se a terapia oral com o probiótico Lactococcus lactis que expressa a Hsp65, combinada à administração de aloantígenos do doador (AloAg-doador), atua sinergicamente na indução de tolerância ao enxerto de pele semialogeneico murino, ou no aumento de sua sobrevida. Testamos diferentes combinações de terapia oral, assim como a influência da utilização de um anti-inflamatório, inibidor seletivo de COX-2 (celecoxibe). O transplante de pele foi realizado 10 dias após a última administração oral dos probióticos e aloantígenos do doador. Não observamos efeitos benéficos na sobrevida do enxerto no grupo de animais que receberam L.lactis que produz Hsp65, sozinho ou em combinação com AloAg-doador e/ou o anti-inflamatório. Em contraste, a terapia oral combinada com o probiótico L.lactis selvagem e AloAg-doador aumentou significativamente a sobrevida do enxerto (p=0,01), em comparação com o grupo não tratado. Nesse grupo que teve maior sobrevida do aloenxerto (L,lactis selvagem e AloAg-doador), também observamos maior quantidade de epitélio preservado (p=0,02) e maior expressão de TGF-beta (p=0,04), no enxerto, em comparação com o grupo sem tratamento. Não observamos diferenças significativas na expressão, in situ, de FOXP3 e IL-17, que foi baixa em todos os grupos experimentais. Concluímos que a Hsp65 não induziu efeito imunorregulador capaz de prolongar a sobrevida do enxerto. No entanto, a manipulação da microbiota com a terapia combinada com o L.lactis selvagem e a exposição a antígenos do doador, previamente, ao transplante, induz mecanismos imunorreguladores capazes de controlar, mesmo que parcialmente, as respostas inflamatórias dirigidas ao aloenxerto de pele, provavelmente, com a participação de TGF-beta / Despite the success of clinical transplantation, the significant side effects induced by immunosupressants used to prevent and treat rejection, indicate the need for novel immunoregulatory therapies. The oral route has been effective in inducing immunoregulation in several experimental models, mostly in pathological autoimmunity. Heat Shock protein 60/65 (Hsp) displays great immunotherapeutic potential due to its capacity to induce both pro-inflammatory and immunregulatory responses. We tested whether oral therapy with the probiotic Lactococcus lactis that expresses Hsp65, in combination with donor alloantigens (Donor-Allo-Ag), acted synergically, inducing immunotolerance or increasing graft survival, in a murine model of semiallogeneic skin transplantation. We tested different oral therapy combinations, as well as the association with a COX-2 selective nonsteroidal anti-inflammatory drug (celecoxib). Skin transplantation was performed 10 days after the last oral administration of probiotics and Donor-Allo-Ag. We observed no beneficial effect on graft survival in the group that received L.lactis that produce Hsp65, alone or in combination with Donor-Allo-Ag/and/or the anti-inflammatory drug. In contrast, combined oral therapy with wild type L.lactis and Donor-Allo-Ag significantly prolonged graft survival (p=0.01), in comparison to non-treated animals. In this prolonged-survival group (L.lactis and Donor-Allo-Ag), we also found higher extension of preserved epithelium (p=0.02) and higher expression of TGF-beta (p=0.04), within the graft, in comparison to non-treated animals. We found no significant differences in the intragraft expression of FOXP3 and IL-17, which was essentially absent or very low. We conclude that Hsp65 did not induce immunoregulatory effects capable of prolonging graft survival. However, the microbiota manipulation with the combined oral therapy with wild type L.lactis and Donor-Allo-Ag, prior to transplantation, induce immunoregulatory mechanisms capable of partially controlling the inflammatory responses to the graft, most likely involving the participation of TGF-beta

A doença de Chagas foi incialmente descrita em 1090 e após mais de 100 anos de investigações sobre essa doença, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos ativados no parasita durante sua adesão e invasão à célula hospedeira. Glicoproteínas de massa molecular de 85kDa localizadas na membrana do parasita foram identificadas como principais elementos responsáveis pela interação com o hospedeiro. Essas proteínas também são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM) da célula hospedeira e esse evento parece ser crucial para modulação da adesão e invasão do parasita e consequente avanço da infecção. Embora diferentes elementos tenham sido identificados no hospedeiro como componentes da via de resposta a adesão ao parasita, as modificações induzidas pela sua ligação ao hospedeiro é ainda pouco conhecida. Modificações pós-traducionais de proteínas, incluindo a fosforilação, têm sido utilizadas por diferentes organismos na transdução de sinais extracelulares. Dessa forma, a identificação de proteínas diferencialmente fosforiladas durante a adesão de tripomastigotas de T. cruzi a ECM, fibronectina e laminina foi o objetivo dessa tese. Tripomastigotas foram incubados com ECM, fibronectina-, laminina- ou BSA- previamente aderidos em placas de cultura de células. Em seguida, os parasitas foram coletados e suas proteínas extraídas e separadas por 2D-PAGE. Os géis de eletroforese foram corados com Pro-Q Diamond (para identifiicação de proteínas fosforiladas) e posteriormente com coomassie colloidal (identificação de proteínas totais). Os spots com diferença significativa na coloração com Pro-Q Diamond (p< 0,05) foram identificados por LC-MS/MS. 54 spots foram diferencialmente fosforilados durante a adesão dos parasitas a ECM, dos quais 39 sofreram um aumento da intensidade de fosforilação e 15 uma redução. Já dos 43 spots diferencialmente fosforilados durante incubação com laminina, 16 aumentaram a fosforilação enquanto 27 sofreram redução da intensidade de fosforilação. Por fim, após incubação com fibronectina, dos 50 spots selecionados, 15 spots sofreram aumento da intensidade de fosforilação e 35 sofreram redução. Após identificação dos spots, as modificações por fosforilação/desfosforilação de proteínas de função desconhecida (hypothetical proteins), proteínas do citoesqueleto, proteínas do choque térmico (HSPs) e proteínas componentes do proteassomo do parasita foram as mais evidentes. A validação por immonoblotting de algumas proteínas identificadas indicou que a desfosforilação de proteínas do citoesqueleto junto com a fosforilação de proteínas do choque térmico são os principais eventos durante a resposta do parasita a adesão a ECM e a seus elementos. Além disso, a desfosforilação de ERK 1/2 observada indicou uma inativação dessa proteína em parasitas aderidos a fibronectina e laminina. Os resultados obtidos nessa tese sugerem uma provável relação entre modificações de proteínas do citoesqueleto e HSPs com a capacidade de internalização dos parasitas na célula hospedeira. / The Chagas disease was firstly described in 1909. After more than 100 years of investigation about this sickness much less is known about the mechanism triggered in the parasite during the adhesion and invasion to the host cell. 85kDa glycoproteins were identified as the major element responsible for the attachment to the host. In addition, these proteins are able to binding to extracellular matrix elements and host cytoskeletal proteins and it event appears to be an essential step in host cell invasion by T. cruzi. Although downstream signal modifications have been studied in host cells upon parasite binding, the molecular changes induced on the parasite by ligand binding are largely unknown. Since post-translational modification of proteins by phosphorylation is one of the most important mechanisms employed by organisms to transduce external signals, identification of proteins modified upon adhesion of T. cruzi trypomastigotes to ECM, laminin and fibronectin of the host cell was pursued. Trypomastigotes (Y strain) were incubated with ECM, laminin-, fibronectin- or BSA-coated surfaces, followed by 2D-PAGE stained with Pro-Q Diamond (phosphorylated protein detection) followed by colloidal coomassie stain (total protein identification). Proteins with significant differences in Pro-Q Diamond stain (p<0.05) were identified by LC-MS/MS. 54 spots were differentially phosphorylated during parasite adhesion to ECM, in which 39 spots have increased their phosphorylation level and 15 have decreased their phosphorylation. From the 43 spots presenting modification to the phosphorylation on incubation with laminin, 16 corresponded to cases of increase of phosphorylation and 27 to cases of dephosphorylation. After incubation with fibronectin: from the 50 spots selected, 15 corresponded to increase of phosphorylation and 35 to dephosphorylation. The results show phosphorylation/dephosphorylation modifications of unknown proteins, parasite cytoskeletal proteins (alpha and beta tubulin and paraflagellar-rod proteins), heat shock proteins and proteasome proteins. The validation by immunoblotting of proteins and their phosphorylation intensities indicates that cytoskeletal protein dephosphorylation in addition to heat shock proteins phosphorylation are the most important event during the trypomastigotes adhesion to the ECM. Looking for downstream signaling, dephosphorylation of ERK1/2 was also shown in trypomastigotes adhered to fibronectin or laminin, suggesting its inactivation. Thereby, those results suggest a possible correlation between cytoskeletal proteins and HSPs modification and the ability of parasite to internalize into host cells

Os fogachos são a queixa mais comum das mulheres peri- e pós-menopausa e estão fortemente relacionados com a diminuição dos níveis de estrogênio. No entanto, a fisiopatologia deste sintoma vasomotor muito desagradável é ainda desconhecido. Por outro lado, o estradiol (E2) apresenta a capacidade de induzir a expressão de HSP72, um membro da família de 70 kDa das proteínas de choque térmico (HSP70), que são citoprotetoras e cardioprotetoras. Sabe-se que a expressão HSP70 é comprometida em doenças inflamatórias relacionadas com o envelhecimento. Por isso, questionamos se a capacidade do organismo de desencadear uma resposta ao choque térmico (Heat Shock Response) robusta, estaria ainda presente após a retirada, via castração, do E2. Para tanto, foram estudados os efeitos do choque térmico (Heat Shock - HS), através de uma sessão de banho de imersão, em ratas Wistar submetidas a ovariectomia bilateral (OVX), após um período de washout hormonal de 7 dias. Doze horas após o HS, os animais foram mortos e o arco aórtico foi excisado cirurgicamente para análises moleculares. Os resultados foram comparados com os marcadores de estresse oxidativo no plasma (superóxido dismutase, catalase e lipoperoxidação), pois é bem estabelecido que a expressão de HSP70 é sensível a regulação redox. A relação entre a iHSP70 (intracelular) e a eHSP70 (extracelular/plasma), proposto como um índice do estado inflamatório sistêmico, também foi investigada. Os resultados mostraram que a Heat Shock Response continua preservada em animais OVX, como inferido a partir da expressão de HSP70 (até 40% de aumento, p <0,01) nas aortas, o que não foi acompanhado por nenhuma outra alteração em marcadores de estresse oxidativo, parâmetros hematológicos e no controle glicêmico. Desta forma, sugerimos que a avaliação periódica do status de HSP70 (iHSP70 vs eHSP70) pode ser de extrema relevância clínica, pois a diminuição da capacidade de defesa do organismo via Heat Shock Response está no centro do aparecimento de disfunções relacionadas com a menopausa. / Hot flashes, the most common complaint of peri- and postmenopausal women, are tightly related to decrease in estrogen levels. However, the pathophysiology of this very unpleasant vasomotor symptom is greatly unknown. On the other hand, estradiol (E2) has been found to induce the expression of HSP72, a member of the 70 kDa family of heat shock proteins (HSP70), which are cytoprotective and cardioprotective. Since it has been noticed that HSP70 expression is compromised in age-related inflammatory diseases, we argued whether the capacity of triggering a robust heat shock (HS) response would be still present after E2 withdrawal. Hence, we studied the effects of HS treatment (hot tub) in female Wistar rats subjected to bilateral oophorectomy (OVX) after a 7 day washout period. Twelve hours after HS, the animals were killed and aortic arches were surgically excised for molecular analyses. The results were compared with oxidative stress markers in the plasma (superoxide dismutase, catalase and lipoperoxidation) because HSP70 expression is sensitive to redox regulation. Extracellular (plasma) to intracellular HSP70 ratio, an index of systemic inflammatory status, was also investigated. The results showed that HS response was preserved in OVX animals, as inferred from HSP70 expression (up to 40% rise, p<0.01) in the aortas, which was accompanied by no further alterations in oxidative stress, hematological parameters and glycemic control either. As a consequence, periodic evaluation of HSP70 status (iHSP70 vs eHSP70) may be of clinical relevance because decreased HS response capacity is at the center of the onset of menopause-related dysfunctions.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-25T12:11:00Z No. of bitstreams: 2 Waleska Yana Lazaretti.pdf: 953419 bytes, checksum: 36f62c7ad6ece04a0ae6842c9d0df45c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-25T12:11:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Waleska Yana Lazaretti.pdf: 953419 bytes, checksum: 36f62c7ad6ece04a0ae6842c9d0df45c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-08 / Acinetobacter baumannii (A. baumannii) is an important opportunistic, Gram-negative pathogen responsible for severe nosocomial infections such as pneumonia, septicemia, urinary tract infections and meningitis. Strains of A. baumannii have been identified in an endemic and epidemic manner in hospitals, being verified the occurrence of multiresistant strains in these environments, with important ability to adapt to selective changes and environmental pressures. Furthermore, multidrug resistance to antibiotics has been continuously studied because it is a global public health problem, resulting in failure of therapy, prolongation of hospitalization, increase of mortality and morbidity rates, and increase in the financial costs of treatment. This pathogen has varied strategies involved with antimicrobial resistance, but it is known that the bacteria are able to respond to unfavorable conditions in the medium through the rapid expression of heat shock proteins (HSP) and also appear to be involved with the stress response caused by the presence of antibiotics. Among the HSPs is ClpB, an ATP-dependent molecular chaperone belonging to the HSP100 family that is associated with several cellular activities, with the remarkable ability to rescue proteins damaged by stress. The objective of this work was to investigate the role of the clpB gene responsible for the coding of a heat shock protein through qPCR in response to stress generated by thermal shock and antibiotics in cells of a multidrug resistant strain of A. baumannii (RS4). Tests performed included analysis of the structure of the clpB gene with bioinformatics tools and analysis of the expression of the same gene by qRT-PCR in response to exposure to heat shock and subinhibitory concentrations of the following antibiotics: ampicillin (30 g mL-1 ), amoxicillin + sulbactam (12 g mL-1), cefepime (30 g mL-1), sulfamethoxazole + trimethoprim (120/8 g mL-1) and meropenem (18 g mL-1).The analysis of the qPCR results showed a transient increase in the induction of the clpB gene in the different treatments used in this study and repression of mRNA-clpB in the presence of cefepime. In addition, in the presence of ampicillin and amoxicillin associated with sulbactam the increase in mRNA-clpB synthesis was around 1.4 times higher after 20 min of incubation with the antibiotics than in the complete absence of the antibiotics. Surprisingly, in the presence of meropenen the induction of mRNA-clpB expression was more than 30-fold higher after 10 minutes of incubation with the antibiotic and more than 8-fold higher in the presence of sulfamethoxazole associated with trimetropin. These data suggest that A. baumannii through thermal stress and antibiotic exposure, adjusts transcription levels of gene clpB allowing the bacterium to survive unfavorable conditions of the medium. Consequently, it can be stated that the protein encoded by the clpB gene is an important virulence factor in response to antibiotics in this pathogen. / Acinetobacter baumannii (A. baumannii) é um importante patógeno oportunista, Gram-negativo e responsável por infecções nosocomiais severas como pneumonias, septicemias, infecções urinárias e meningites. Cepas de A. baumannii têm sido identificadas de maneira endêmica e epidêmica nos hospitais, sendo verificada a ocorrência de cepas multirresistentes nesses ambientes, com importante habilidade de adaptação a mudanças seletivas e pressões ambientais. Ainda, a multirresistência a antibióticos vem sendo estudada continuamente, por se tratar de um problema de saúde pública global, resultando em falha na terapia, no prolongamento da internação hospitalar, no aumento das taxas de mortalidade e morbidade e na elevação dos custos financeiros do tratamento. Esse patógeno possui estratégias variadas envolvidas com a resistência aos antimicrobianos, porém, sabe-se que as bactérias apresentam habilidade de responder a condições desfavoráveis do meio em que se encontram por meio da rápida expressão de proteínas de choque térmico (HSP) e parecem também estar envolvidas com a resposta a estresse causado pela presença de antibióticos. Dentre as HSPs, está a ClpB, chaperone molecular dependente de ATP, pertencente à família HSP100 que está associada a diversas atividades celulares, com a capacidade notável para resgatar proteínas danificadas pelo estresse. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel do gene clpB em resposta a estresse gerado por choque térmico e antibióticos em células de uma cepa multirresistente de A. baumannii (RS4). Os testes realizados englobaram análise da estrutura do gene clpB com ferramentas de bioinformática e análise da expressão do mesmo gene por qRT-PCR em resposta à exposição a choque térmico e a concentrações subinibitórias dos seguintes antibióticos: ampicilina (30 g mL-1), amoxacilina+ sulbactam (12 g mL-1), cefepime (30 g mL-1), sulfametoxazol + trimetoprima (120/8 g/mL-1) e meropenem (18 g mL-1). Os resultados apontados por análise de bioinformática sugerem uma conservação da estrutura global de ClpB dentro do gênero Acinetobacter sp. A análise dos resultados de qPCR evidenciou aumento transitório na indução do gene clpB nos diferentes tratamentos utilizados neste estudo e repressão do mRNA-clpB na presença de cefepime. Em adição, tanto na presença de ampicilina como de amoxicilina associada à sulbactam o aumento na síntese de mRNA-clpB foi em torno de 1,4 vezes superior após 20 min de incubação com os antibióticos do que na completa ausência dos antibióticos. Surpreendentemente, na presença de meropenen, a indução da expressão do mRNA-clpB foi mais que 30 vezes superior após 10 minutos de incubação com o antibiótico e mais que 8 vezes superior na presença de sulfametoxaxol associado à trimetropina. Esses dados sugerem que A. baumannii, mediante estresse térmico e exposição a antibióticos, ajusta os níveis de transcrição do gene clpB, permitindo que a bactéria sobreviva a condições desfavoráveis do meio. Consequentemente, pode-se afirmar que a proteína codificada pelo gene clpB figura como importante fator de virulência em resposta a antibióticos neste patógeno.

As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas presentes nas células em condições normais e supra-expressadas em condições de estresse e choque térmico. O laser de diodo tem sido utilizado em diversos tratamentos na odontologia, dentre eles na atenuação de sintomas e na aceleração do reparo de úlceras traumáticas. O objetivo deste estudo foi verificar, através de análise imunoistoquímica da expressão das HSPs (Hsp27 e Hsp 47) e da medição de temperatura por intermédio de câmera termográfica, se o laser de diodo modifica, (e quanto modifica) a temperatura local, bem como se há alteração no padrão de expressão das proteínas citadas em três regiões distintas do fragmento analisado. Para este estudo, foram feitos testes in vitro e in vivo. Para os testes in vivo, foram utilizados 56 ratos, nos quais foi induzida úlcera em ventre lingual. Os animais foram divididos em 4 grupos: GL - grupo ulcerado com posterior irradiação com laser (parâmetros: laser diodo, 0,5 W de potência, pulsado (10 Hz), por 40 segundos (método varredura), 80J/cm2 de energia total (área de 0,25cm2) Má, e a energia por ponto?); GN - grupo ulcerado sem nenhum tratamento posterior; CP - grupo controle sem úlcera e irradiado com laser (mesmos parâmetros de GL); e CN - grupo controle sem úlcera e sem nenhum tratamento posterior. O teste in vitro foi destinado à medição da temperatura durante a irradiação laser, quando utilizaram-se línguas de ratos previamente ulceradas e extirpadas, as quais foram irradiadas com os parâmetros para o teste in vivo. Na superfície irradiada, houve aumento médio de temperatura em torno de 6,7C e, na região mais distante dessa superfície, de 2,7C. Na análise semiquantitativa da expressão imunoistoquímica da Hsp27, observou-se padrão de marcação mais intenso em GL comparando-se a GN e aos demais grupos. Na análise quantitativa da Hsp47, houve maior quantidade de células positivas no GL em relação aos demais grupos, principalmente nas regiões mais próximas da superfície irradiada. Concluiu-se que a irradiação laser provocou aumento de temperatura local, bem como desencadeou padrões de intensidade maiores e diferentes da Hsp27 e da Hsp47 em relação aos demais grupos. Isso indica que o tecido irradiado sofreu maior estresse celular, com resposta tecidual de intensa migração e diferenciação celular, bem como de maior síntese colagênica. / Heat shock proteins (HSPs) are proteins present in cells under normal conditions and over-expressed in terms of stress and thermal shock. The laser diode has been used in various treatments in dentistry, to reduce symptoms and accelerate the repair of traumatic ulcers. The aim of this study was to verify, by means of immunohistochemical expression analysis of HSPs (Hsp27 and Hsp 47) and temperature measurement using a thermographic camera, whether diode laser changes the local temperature (and how much the temperature changes), and whether there is a change in expression pattern of the above-mentioned protein in three distinct regions of the analyzed fragment. For this study, some of the tests were conducted in vitro and others in vivo. For the in vivo tests, 56 rats were used, in which ulcers were induced on the ventral surface of the tongue. The animals were divided into 4 groups: GL-group with ulcer and later laser irradiation (diode laser parameters: 0.5 W power, pulsed (10 Hz), for 40 seconds (defocused), 80J/cm2 total power in area (0.25cm2) GN- group with ulcer and without any further processing; CP- control group without ulcer and with laser irradiation (same parameters as in GL); and GN-control group without ulcer and without any further processing. The in vitro tests were conducted to measure temperature during laser irradiation, using the tongues that had previously been ulcerated in rats, and later removed and irradiated with the same parameters as those used for the in vivo test. In the irradiated surface, there was an increase in mean temperature of around 6.7oC, and in the region more distant from this surface, an increase of 2.7 oC. In the semi-quantitative analysis of immunohistochemical expression of Hsp27, greater expression of Hsp27 was shown in GL in comparison with the other groups in general. In quantitative analysis of Hsp47, there was a larger quantity of positive cells in GL, when compared with the other groups, particularly in the regions closest to irradiated surface. It was concluded that the irradiation laser caused local temperature increase, and also set off greater and different patterns of intensity of Hsp27 and Hsp47, in comparison with those of the other groups. This indicates that the irradiated tissue suffered higher cellular stress, with tissue response of intense migration and cell differentiation, as well as increased collagen synthesis.

Orientadores: Carlos Henrique Inácio Ramos, Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_YurideAbreu_D.pdf: 5998927 bytes, checksum: dad9a44995521aa0e68ad9507bd61765 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As bactérias patogênicas gram-negativas desenvolveram estratégias sofisticadas para infectar seus hospedeiros, utilizando sistemas de secreção especializados para translocar proteínas de virulência através da membrana das células eucarióticas para o citoplasma. Para que este processo seja eficiente, estas proteínas de virulência devem estar parcialmente enoveladas ou mesmo desenoveladas para que possam ser transportadas para o interior das células hospedeiras através desses sistemas de secreção. Uma vez dentro das células alvo, as proteínas de virulência são encaminhadas ao seu estado nativo e ativadas pela própria maquinaria de enovelamento da célula hospedeira. As proteínas responsáveis em auxiliar o enovelamento protéico nas células são as chaperonas, denominadas classicamente de proteínas de choque térmico (Hsps). Plantas, por serem organismos sésseis, são muito mais vulneráveis a fatores de estresse biótico e abiótico, tornando o papel das Hsps ainda mais relevante para a homeostase protéica e viabilidade celular. O estudo das proteínas da família Hsp90 é muito difundido devido ao seu papel fundamental desempenhado nas situações de infecção e em diferentes tipos de estresse. Neste trabalho, a proteína recombinante Hsp90 de laranja doce (Citrus sinesis) foi clonada e purificada com o objetivo de estudar o mecanismo geral de infecção do fitopatógeno bacteriano de espécies de citros Xanthomonas citri (Xac). Investigou-se a interação, combinando técnicas de western blot e ensaios de pull-down, entre a Hsp90 e todas as quatro variantes da PthA, principal fator de virulência de Xac, e as co-chaperonas da Hsp90 de laranja ciclofilina (Cyp) e uma proteína tiorredoxina-"like? (TDX). Estas proteínas já foram descritas por se apresentarem reguladas positivamente na laranja doce durante a infecção com Xac, apontando para um possível papel da Hsp90 na formação de um complexo de enovelamento capaz de ativar as proteínas de virulência de Xac no interior das células infectadas. Além disso, investigamos a estrutura e função da Hsp90 de laranja doce que apresentou-se enovelada e solúvel, como medido por dicroísmo circular (CD), espectroscopia de fluorescência intrínseca e espalhamento de luz dinâmico (DLS). A Hsp90 se apresentou como um dímero em solução com um raio de Stokes de 62 Å, e altamente resistente á desnaturação por temperatura, como medido por CD. A proteína mostrou-se funcional, como medido pela sua capacidade de proteger a agregação da citrato sintase in vitro em um ensaio de espalhamento de luz. O estudo do efeito de nucleotídeos na conformação e função da Hsp90 através de CD, fluorescência intrínseca e de espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) mostram alterações na conformação da proteína na presença destes ligantes / Abstract: Gram-negative bacterial pathogens, which have developed sophisticated strategies to infect hosts, use specialized secretion systems to secrete and translocate virulence proteins across the eukaryotic cell membrane into the cytoplasm. The translocation process depends on unfolded or partially folded virulence proteins to be transportated through the secretion system into the target inner cell where they are folded by the host chaperone machinery. Auxiliary proteins are responsible to help folding in cells and are known as molecular chaperones, or heat shock proteins (HSPs). Plants, being sessile organisms, are much more vulnerable to biotic and abiotic stress factors, making the role of HSPs even more important for protein homeostasis and cell viability. The study of the Hsp90 family is widespread due to the key role played in situations of infection and under various types of stress. In this work, an Hsp90 sweet orange (Citrus sinesis) was cloned and purified in order to study the general mechanism of infection of the bacterial pathogen of citrus species, Xanthomonas citri (Xac). First, we investigated the interaction, by combining immunostaining and pull-down assays, between Hsp90 and all four variants of PthA, the major virulence factor of Xac, and the orange Hsp90 cochaperonas cyclophilin (Cyp) and a thioredoxin-like protein (TDX). These proteins have been described to be upregulated in sweet orange during infection with Xac, pointing to a possible role of Hsp90 in the formation of a folding complex able to activate the virulence proteins of Xac inside the infected cells. Furthermore, we took to investigate the structure and function of the Hsp90 from sweet orange, which was folded and soluble as measured by circular dichroism (CD), intrinsic fluorescence spectroscopy and dynamic light scattering (DLS). Hsp90 was a dimer in solution with a Stokes radius of about 62 Å, tolerating up to 90 °C without denaturation, as measured by CD. The protein was functional, as measured by its ability to protect the aggregation of citrate synthase in an light scattering assay. The study of the effect of nucleotides on the conformation and function of Hsp90 by CD, intrinsic fluorescence and small-angle X-ray scattering (SAXS) show evidence of conformation modulation by ATP and ADP / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Avec plus de 3,5 millions de nouveaux cas diagnostiqués chaque année, l’insuffisance cardiaque (IC) touche actuellement plus de 15 millions d’européens et représente ainsi la première cause de mortalité cardiovasculaire en Europe. Malgré les avancées de la recherche cardiovasculaire, l’IC reste une maladie grave et de mauvais pronostic. En effet, plus de 50% des patients meurent dans les 5 années suivant le diagnostic. La compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents, encore largement inconnus, permettrait de développer des thérapeutiques visant à soigner les causes de l’IC plutôt que les conséquences et ainsi d’améliorer la prise en charge des patients. La contribution majeure des modifications post-traductionnelles (MPTs) dans la régulation de l’expression génique, de l’activité enzymatique ainsi que dans la régulation fonctionnelle des protéines font des MPTs les intégrateurs de l'adaptation dynamique du phénotype. C’est pourquoi l’équipe a réalisé des analyses phosphoprotéomiques dans un modèle expérimental d’IC chez le rat à 2 mois post-infarctus du myocarde (IDM). Ces analyses ont permis de mettre en évidence d’une augmentation du niveau de phosphorylation en sérine de la Desmine dans les ventricules gauches (VG) de rats IC par rapport aux témoins.Notre étude vise à identifier d’une part les kinases impliquées dans la phosphorylation de la Desmine et d’autre part à déterminer l’impact de l’augmentation de la forme phosphorylée de la Desmine sur son devenir dans le modèle in vivo.Par analyse bioinformatique, nous avons sélectionné les kinases potentiellement impliquées dans la phosphorylation de la Desmine. L’étude de la régulation de ces kinases dans le modèle d’IC chez le rat a permis de mettre en évidence la présence d’une plus grande quantité d’unités actives de PKC zeta et de GSK3 beta dans les VG de rats IC à 2 mois post-IDM. In vitro, l’inhibition de PKC zeta entraîne à la fois une diminution de l’activité GSK3 beta ainsi qu’une modulation du profil de phosphorylation de la Desmine. L’ensemble de ces données suggère l’implication de PKC zeta et de GSK3 beta dans l’augmentation du niveau de phosphorylation de la Desmine dans le modèle d’IC chez le rat. Néanmoins, leur action directe sur la Desmine, en cascade ou encore indirecte via d’autres partenaires reste encore à définir.Par immunofluorescence, nous avons mis en évidence la présence d'agrégats de Desmine dans les VG de rats IC à 2 mois post-IDM possiblement formés suite à son hyperphosphorylation. Nous avons émis l’hypothèse que ces agrégats de Desmine, comme toute protéine agrégée, seraient toxiques pour le cardiomyocyte et nécessiteraient l'intervention des systèmes protéolytiques pour être éliminés afin d'assurer la survie cellulaire. L’étude du système ubiquitine protéasome, de la macroautophagie et de l’autophagie médiée par le chaperonnes (CMA) dans le modèle d’IC chez le rat à 7 jours, 1 et 2 mois post-IDM suggère que l’inefficacité de la macroautophagie à 7 jours post-IDM et la diminution de son activité au cours du temps entraînerait une accumulation cytosolique de Desmine phosphorylée mais également l’induction de la CMA afin d’assurer la clairance de cette dernière. In vitro, nous avons montré que l’induction pharmacologique de la CMA entraîne une diminution du niveau de Desmine ainsi qu’une modulation de son profil de phosphorylation.L’augmentation de phosphorylation en sérine de la Desmine dans les VG de rats IC à 2 mois, dépendante de la PKC zeta et/ou GSK3 beta, semble entraîner l’accumulation cytosolique de Desmine ainsi que la formation d’agrégats dans les VG de rat IC qui pourraient participer à la dysfonction contractile observée au cours de l’IC. En réponse à l'inefficacité de la macroautophagie, la CMA serait activée afin d’assurer l’élimination de la Desmine phosphorylée et ainsi la survie du cardiomyocyte au cours de l’IC. / With over 3,5 million new cases each year, heart failure (HF) currently affects more than 15 million of European individuals and thus represents the leading cause of cardiovascular mortality in Europe. Despite advances in cardiovascular research, HF remains a serious disease with poor prognosis. Indeed, more than 50 per cent of patients die within 5 years after diagnosis. Understanding the underlying physiopathological mechanisms would allow the development of therapeutics to treat the causes of HF rather than the consequences of the disease, thereby improving the medical care of patients. The major contribution of post-translational modifications (PTMs) in the regulation of gene expression, enzyme activity as well as in the functional regulation of proteins, turns PTMs into integrators of the dynamic adaptation of the phenotype. For this reason, the team performed phosphoproteomic analyses in an experimental rat model of HF at 2 monhs following myocardial infarction (MI). These analyses revealed an increase of the phosphorylation levels of Desmin at serine residues in left ventricles (LV) of HF rats compared to sham rats.The aim of our study is to identify the kinases which are implicated in Desmin phosphorylation on one hand, and the impact and behavior of increased phosphorylated Desmin in cardiomyocyte on the other hand.By bioinformatic analysis, we first selected the kinases which are potentially implicated in Desmin phosphorylation. Then, we studied the enzymatic regulation of selected kinases in an experimental rat model of HF, which allowed the identification of active PKC zeta and GSK3 beta in the LV of HF rats at 2 months. In vitro, pharmacological inhibition of PKC zeta leads to a decreased of GSK3 beta activity as well as a modulation of the phosphorylated Desmin profiles. Taken together, these data suggest an implication of PKC zeta and GSK3 beta in the increase of Desmin phosphorylation levels in the LV of HF rats. However, their direct, consecutive or indirect implication on Desmin phosphorylation remains to be evaluated.By immunofluorescence, we observed the presence of aggregated Desmin in LV of HF rats at 2 months post-MI that suggest that these could be the result of Desmin hyperphosphorylation. We hypothesized that these Desmin aggregates, like other aggregated proteins, could be toxic for cardiomyocytes and need to be cleared by proteolytic systems to ensure cell survival.The study of proteolytic systems in the in vivo model showed that while the UPS is not modulated all along LV remodeling, macroautophagy decreases with time and could thus drive cytosolic accumulation of phosphorylated Desmin in LV of HF rats. At the same time, CMA seems to be activated thereby ensure phosphorylated Desmin clearance. In vitro, we have shown that pharmacological induction of CMA results in lower phosphorylated Desmin levels.In conclusion, increased Desmin phosphorylation levels seems to be dependent of PKC zeta and/or GSK3 beta activation in LV of HF rats at 2 months after MI. This elevation could drive the cytosolic accumulation and aggregation of Desmin, which could be involved in the contractile dysfunction observed during HF. Finally, as a result of decreased macroautophagy, CMA could be activated in LV of HF rats to ensure phosphorylated Desmin clearance and thus cardiomyocyte survival.

Heat Shock 40 kDa proteins (Hsp40s) partner with heat shock 70 kDa proteins (Hsp70s) in facilitating, among other chaperone activities; correct protein transport, productive protein folding and assembly within the cells; under both normal and stressful conditions. Hsp40 proteins regulate the ATPase activity of Hsp70 through interaction with the J-domain. Plasmodium falciparum Hsp70s (PfHsp70s) do not contain a Plasmodium export element (PEXEL) sequence although PfHsp70-1 and PfHsp70-3 have been located outside of the parasitophorous vacuole. Studies reveal that a type I P. falciparum (PfHsp40) chaperone (PF14_0359) stimulates the rate of ATP hydrolysis of the cytosolic PfHsp70 (PfHsp70-1) and that of human Hsp70A1A. PFE0055c is a PEXEL-bearing type II Hsp40 that is exported into the cytosol of P. falciparum-infected erythrocytes; where it potentially interacts with human Hsp70. Studies reveal that PFE0055c associates with structures found in the erythrocyte cytosol termed “J-dots” which are believed to be involved in trafficking parasite-encoded proteins through the erythrocyte cytosol. If P. falciparum exports PFE0055c into the host cytosol, it may be proposed that it interacts with human Hsp70, making it a possible drug target. The effect of PFE0055c on the ATPase activity of human Hsp70A1A has not been previously characterised. Central to this study was bioinformatic analysis and biochemical characterisation PFE0055c using an in vitro (ATPase assay) approach. Structural domains that classify PFE0055c as a type II Hsp40 were identified with similarity to two other exported type II PfHsp40s. Plasmids encoding the hexahistidine-tagged versions of PFE0055c and human Hsp70A1A were used for the expression and purification of these proteins from Escherichia coli. Purification was achieved using nickel affinity chromatography. The urea-denaturing method was used to obtain the purified PFE0055c whilst human Hsp70A1A was purified using the native method. PFE0055c could stimulate the ATPase activity of alfalfa Hsp70, although such was not the case for human Hsp70A1A in vitro.