A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, sendo o Brasil o país com maior número de casos. A enfermidade é adquirida por meio da inalação de propágulos de fungos do gênero Paracoccidioides e afeta principalmente os pulmões. Anteriormente, nosso grupo mostrou que o tratamento de camundongos infectados com P. brasiliensis com uma dose da proteína de estresse térmico de 60kDa recombinante de P. brasiliensis (PbHsp60r) induzia um efeito prejudicial na PCM, aumentando carga fúngica e lesão pulmonar, quando comparado a animais infectados e tratados com o veículo. No presente trabalho, buscou-se determinar se outra forma de apresentação da PbHsp60r poderia gerar um efeito benéfico em camundongos infectados com P. brasiliensis. Optou-se pelo plasmídeo pVAX1 subclonado com o gene da PbHsp60 (pVAX1-PB_HSP60). Após subclonagem do gene, foi mostrado, por Western blot, que anticorpos específicos para PbHsp60 eram produzidos por camundongos imunizados com três doses da construção e que a proteína era sintetizada por células HEK293 transfectadas com pVAX1-PB_HSP60. O tratamento dos animais infectados com três doses de pVAX1-PB_HSP60 ou pVAX1 subclonado com Hsp65 de M. leprae (pVAX1-ML_HSP65), que reconhecidamente melhora a PCM experimental, induziu uma diminuição de carga fúngica e da lesão pulmonar quando comparado com animais infectados e tratados com pVAX1 ou PBS. Uma dose de uma dessas construções não induziu melhora significativa na PCM quando comparado aos controles. Como esperado, os animais infectados e tratados com uma dose da PbHsp60r tiveram uma piora dos parâmetros de infecção, o que curiosamente não foi observado com os animais tratados com três doses dessa proteína recombinante, cuja melhora foi muito similar a dos animais infectados e tratados com três doses das construções plasmidiais. Ao pesquisar porque uma dose induz piora da infecção, observouse que PbHsp60r induz morte de linfócitos esplênicos in vitro, em um mecanismo dependente de TLR4, proteína adaptadora TRIF e receptor 1 de TNF. Esses resultados abrem perspectivas de se avaliar a importância da morte de células da resposta imunológica no curso da infecção por P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Latin America and Brazil, which holds most of the PCM cases. PCM is acquired through the inhalation of propagules of fungi from genus Paracoccidioides and mainly affects the lungs. We have previously shown that P. brasiliensis-infected mice treated with single dose of recombinant 60-kDa-heat shock protein from P. brasiliensis (rPbHsp60) had a worsening of infection when compared with animals only infected. In this study, we investigate whether the treatment of infected mice with PbHsp60 gene cloned into a plasmid (pVAX1-PB_HSP60) would render an efficient immune response and improvement of the disease. After cloning of the PbHsp60 gene, we first showed that immunization of mice with three doses of pVAX1-PB_HSP60 induced production of specific anti-PbHsp60 antibody and that pVAX1-PB_HSP60-transfected HEK293 cells synthesized the PbHsp60. Interestingly, mice treated with three doses, but not single dose, of pVAX1-PB_HSP60, and pVAX1 subcloned with Hsp65 from Mycobacterium leprae (pVAX1- ML_HSP65), which induces a beneficial effect in experimental PCM, had an improvement in fungal load and lung injury when compared with infected mice treated with pVAX1 or PBS. Unlike animals infected and treated with single dose of rPbHsp60, which had a worsening of infection parameters, treatment with three doses of rPbHsp60 interestingly induced a beneficial effect in the infected animals, as seen with the plasmid constructs. In investigating the causes of this worsening of PCM triggered by injection of a single dose of protein, we showed that rPbHsp60 induced the death of splenic lymphocytes in vitro in a mechanism dependent on Tolllike receptor 4, TRIF adapter protein and TNF receptor 1. These results open perspectives to evaluate the importance of cell death of the immune response in the course of P. brasiliensis infection.

As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas presentes nas células em condições normais e supra-expressadas em condições de estresse e choque térmico. O laser de diodo tem sido utilizado em diversos tratamentos na odontologia, dentre eles na atenuação de sintomas e na aceleração do reparo de úlceras traumáticas. O objetivo deste estudo foi verificar, através de análise imunoistoquímica da expressão das HSPs (Hsp27 e Hsp 47) e da medição de temperatura por intermédio de câmera termográfica, se o laser de diodo modifica, (e quanto modifica) a temperatura local, bem como se há alteração no padrão de expressão das proteínas citadas em três regiões distintas do fragmento analisado. Para este estudo, foram feitos testes in vitro e in vivo. Para os testes in vivo, foram utilizados 56 ratos, nos quais foi induzida úlcera em ventre lingual. Os animais foram divididos em 4 grupos: GL - grupo ulcerado com posterior irradiação com laser (parâmetros: laser diodo, 0,5 W de potência, pulsado (10 Hz), por 40 segundos (método varredura), 80J/cm2 de energia total (área de 0,25cm2) Má, e a energia por ponto?); GN - grupo ulcerado sem nenhum tratamento posterior; CP - grupo controle sem úlcera e irradiado com laser (mesmos parâmetros de GL); e CN - grupo controle sem úlcera e sem nenhum tratamento posterior. O teste in vitro foi destinado à medição da temperatura durante a irradiação laser, quando utilizaram-se línguas de ratos previamente ulceradas e extirpadas, as quais foram irradiadas com os parâmetros para o teste in vivo. Na superfície irradiada, houve aumento médio de temperatura em torno de 6,7C e, na região mais distante dessa superfície, de 2,7C. Na análise semiquantitativa da expressão imunoistoquímica da Hsp27, observou-se padrão de marcação mais intenso em GL comparando-se a GN e aos demais grupos. Na análise quantitativa da Hsp47, houve maior quantidade de células positivas no GL em relação aos demais grupos, principalmente nas regiões mais próximas da superfície irradiada. Concluiu-se que a irradiação laser provocou aumento de temperatura local, bem como desencadeou padrões de intensidade maiores e diferentes da Hsp27 e da Hsp47 em relação aos demais grupos. Isso indica que o tecido irradiado sofreu maior estresse celular, com resposta tecidual de intensa migração e diferenciação celular, bem como de maior síntese colagênica. / Heat shock proteins (HSPs) are proteins present in cells under normal conditions and over-expressed in terms of stress and thermal shock. The laser diode has been used in various treatments in dentistry, to reduce symptoms and accelerate the repair of traumatic ulcers. The aim of this study was to verify, by means of immunohistochemical expression analysis of HSPs (Hsp27 and Hsp 47) and temperature measurement using a thermographic camera, whether diode laser changes the local temperature (and how much the temperature changes), and whether there is a change in expression pattern of the above-mentioned protein in three distinct regions of the analyzed fragment. For this study, some of the tests were conducted in vitro and others in vivo. For the in vivo tests, 56 rats were used, in which ulcers were induced on the ventral surface of the tongue. The animals were divided into 4 groups: GL-group with ulcer and later laser irradiation (diode laser parameters: 0.5 W power, pulsed (10 Hz), for 40 seconds (defocused), 80J/cm2 total power in area (0.25cm2) GN- group with ulcer and without any further processing; CP- control group without ulcer and with laser irradiation (same parameters as in GL); and GN-control group without ulcer and without any further processing. The in vitro tests were conducted to measure temperature during laser irradiation, using the tongues that had previously been ulcerated in rats, and later removed and irradiated with the same parameters as those used for the in vivo test. In the irradiated surface, there was an increase in mean temperature of around 6.7oC, and in the region more distant from this surface, an increase of 2.7 oC. In the semi-quantitative analysis of immunohistochemical expression of Hsp27, greater expression of Hsp27 was shown in GL in comparison with the other groups in general. In quantitative analysis of Hsp47, there was a larger quantity of positive cells in GL, when compared with the other groups, particularly in the regions closest to irradiated surface. It was concluded that the irradiation laser caused local temperature increase, and also set off greater and different patterns of intensity of Hsp27 and Hsp47, in comparison with those of the other groups. This indicates that the irradiated tissue suffered higher cellular stress, with tissue response of intense migration and cell differentiation, as well as increased collagen synthesis.

A doença de Chagas foi incialmente descrita em 1090 e após mais de 100 anos de investigações sobre essa doença, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos ativados no parasita durante sua adesão e invasão à célula hospedeira. Glicoproteínas de massa molecular de 85kDa localizadas na membrana do parasita foram identificadas como principais elementos responsáveis pela interação com o hospedeiro. Essas proteínas também são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM) da célula hospedeira e esse evento parece ser crucial para modulação da adesão e invasão do parasita e consequente avanço da infecção. Embora diferentes elementos tenham sido identificados no hospedeiro como componentes da via de resposta a adesão ao parasita, as modificações induzidas pela sua ligação ao hospedeiro é ainda pouco conhecida. Modificações pós-traducionais de proteínas, incluindo a fosforilação, têm sido utilizadas por diferentes organismos na transdução de sinais extracelulares. Dessa forma, a identificação de proteínas diferencialmente fosforiladas durante a adesão de tripomastigotas de T. cruzi a ECM, fibronectina e laminina foi o objetivo dessa tese. Tripomastigotas foram incubados com ECM, fibronectina-, laminina- ou BSA- previamente aderidos em placas de cultura de células. Em seguida, os parasitas foram coletados e suas proteínas extraídas e separadas por 2D-PAGE. Os géis de eletroforese foram corados com Pro-Q Diamond (para identifiicação de proteínas fosforiladas) e posteriormente com coomassie colloidal (identificação de proteínas totais). Os spots com diferença significativa na coloração com Pro-Q Diamond (p< 0,05) foram identificados por LC-MS/MS. 54 spots foram diferencialmente fosforilados durante a adesão dos parasitas a ECM, dos quais 39 sofreram um aumento da intensidade de fosforilação e 15 uma redução. Já dos 43 spots diferencialmente fosforilados durante incubação com laminina, 16 aumentaram a fosforilação enquanto 27 sofreram redução da intensidade de fosforilação. Por fim, após incubação com fibronectina, dos 50 spots selecionados, 15 spots sofreram aumento da intensidade de fosforilação e 35 sofreram redução. Após identificação dos spots, as modificações por fosforilação/desfosforilação de proteínas de função desconhecida (hypothetical proteins), proteínas do citoesqueleto, proteínas do choque térmico (HSPs) e proteínas componentes do proteassomo do parasita foram as mais evidentes. A validação por immonoblotting de algumas proteínas identificadas indicou que a desfosforilação de proteínas do citoesqueleto junto com a fosforilação de proteínas do choque térmico são os principais eventos durante a resposta do parasita a adesão a ECM e a seus elementos. Além disso, a desfosforilação de ERK 1/2 observada indicou uma inativação dessa proteína em parasitas aderidos a fibronectina e laminina. Os resultados obtidos nessa tese sugerem uma provável relação entre modificações de proteínas do citoesqueleto e HSPs com a capacidade de internalização dos parasitas na célula hospedeira. / The Chagas disease was firstly described in 1909. After more than 100 years of investigation about this sickness much less is known about the mechanism triggered in the parasite during the adhesion and invasion to the host cell. 85kDa glycoproteins were identified as the major element responsible for the attachment to the host. In addition, these proteins are able to binding to extracellular matrix elements and host cytoskeletal proteins and it event appears to be an essential step in host cell invasion by T. cruzi. Although downstream signal modifications have been studied in host cells upon parasite binding, the molecular changes induced on the parasite by ligand binding are largely unknown. Since post-translational modification of proteins by phosphorylation is one of the most important mechanisms employed by organisms to transduce external signals, identification of proteins modified upon adhesion of T. cruzi trypomastigotes to ECM, laminin and fibronectin of the host cell was pursued. Trypomastigotes (Y strain) were incubated with ECM, laminin-, fibronectin- or BSA-coated surfaces, followed by 2D-PAGE stained with Pro-Q Diamond (phosphorylated protein detection) followed by colloidal coomassie stain (total protein identification). Proteins with significant differences in Pro-Q Diamond stain (p<0.05) were identified by LC-MS/MS. 54 spots were differentially phosphorylated during parasite adhesion to ECM, in which 39 spots have increased their phosphorylation level and 15 have decreased their phosphorylation. From the 43 spots presenting modification to the phosphorylation on incubation with laminin, 16 corresponded to cases of increase of phosphorylation and 27 to cases of dephosphorylation. After incubation with fibronectin: from the 50 spots selected, 15 corresponded to increase of phosphorylation and 35 to dephosphorylation. The results show phosphorylation/dephosphorylation modifications of unknown proteins, parasite cytoskeletal proteins (alpha and beta tubulin and paraflagellar-rod proteins), heat shock proteins and proteasome proteins. The validation by immunoblotting of proteins and their phosphorylation intensities indicates that cytoskeletal protein dephosphorylation in addition to heat shock proteins phosphorylation are the most important event during the trypomastigotes adhesion to the ECM. Looking for downstream signaling, dephosphorylation of ERK1/2 was also shown in trypomastigotes adhered to fibronectin or laminin, suggesting its inactivation. Thereby, those results suggest a possible correlation between cytoskeletal proteins and HSPs modification and the ability of parasite to internalize into host cells

As proteínas de choque térmico (HSP) são expressas em todas as células humanas, sendo superexpressas em condições de estresse celular, tais como hiper ou hipotermia, isquemia, inflamação e reparação. Dentre as várias famílias de HSP, encontram-se a Hsp27 e a Hsp47, cuja superexpressão relaciona-se à inibição da apoptose e à manutenção dos filamentos de actina do citoesqueleto (Hsp27) e à manutenção do sistema de produção de procolágeno e do colágeno (Hsp47). O laser de diodo (LD) tem atualmente amplas aplicações clínicas com vantagens terapêuticas comprovadas, porém os efeitos térmicos que pode acarretar aos tecidos ainda são controversos. Neste trabalho, avaliou-se a influência do LD sobre a expressão imunoistoquímica das Hsp27 e Hsp47 sobre o tecido dentário submetido a gengivoplastia com LD e com bisturi convencional, bem como relacionou-se essa influência com as variações de temperatura provocadas pela irradiação laser. Vinte e quatro ratos adultos foram divididos em dois grupos: grupo 1 12 animais submetidos a gengivoplastia no incisivo central inferior esquerdo utilizando laser de diodo (ZAP soft lase, 810 nm, 0,3 W, densidade de energia de 113,63 J/cm2); grupo 2 12 animais submetidos a gengivoplastia no mesmo local utilizando bisturi convencional. Os animais sofreram eutanásia nos períodos de 0h, 24h, 72h e 120h, sendo os incisivos centrais retirados e descalcificados. Posteriormente foram submetidos a análise imunoistoquímica utilizando anticorpos monoclonais contra Hsp27 e Hsp47. Teste in vitro foi realizado utilizando-se incisivos centrais de ratos extirpados e mantidos resfriados até o momento do teste. Este foi realizado com a instalação de 4 termopares, os quais registraram a variação da temperatura durante gengivoplastia realizada com o LD calibrado com os mesmos parâmetros do teste in vivo. Observou-se haver variação máxima de temperatura entre 1C e 6C, dependendo da região analisada. A expressão da Hsp27 mostrou-se aumentada no grupo irradiado com laser em relação ao bisturi em praticamente todos os períodos experimentais. A Hsp47 também expressou-se mais intensivamente no grupo laser, porém mais tardiamente. A expressão de ambas as proteínas foi mais intensa na região irradiada, porém nas demais regiões medidas não foi possível relacionar as variações imunoistoquímicas com as de temperatura. Concluiu-se que o LD provoca modificações na expressão das Hsp27 e Hsp47, as quais podem estar relacionadas ao aumento da temperatura provocado pelo laser. / Heat shock proteins (HSP) are expressed in all human cells, and are overexpressed under conditions of cellular stress, such as hyper- or hypothermia, ischemia, inflammation and repair. Among the various families of HSP, there are Hsp27 and Hsp47, whose overexpression is related to the inhibition of apoptosis, maintenance of cytoskeletal actin filaments (Hsp27) and maintenance of the procollagen and collagen production system (Hsp47). At present, diode laser (DL) has broad clinical applications with proven therapeutic advantages; however, there is still controversy about the thermal effects it may have on tissues. In this study, the influence of DL on the immunohistochemical expression of Hsp27 and Hsp47 on dental tissue submitted to gingivoplasty with DL and a conventional scalpel was evaluated, as well as how this influence was related to the variations in temperature caused by laser irradiation. Twenty-four adult rats were divided into two groups: Group 1 12 animals submitted to gingivoplasty in the mandibular left central incisor using diode laser (ZAP soft lase, 810 nm, 0.3 W, energy density 113.63 J/cm2); Group 2 12 animals submitted to gingivoplasty in the same site using a conventional scalpel. The animals were euthanized in the periods of 0h, 24h, 72h and 120h, and the central incisors were removed and decalcified. Afterwards they were submitted to immunohistochemical analysis using monoclonal antibodies against Hsp27 and Hsp47. The in vitro test was performed, using the extirpated central incisors of rats, which were kept chilled until the time of the test. This was done by installing 4 thermocouples that recorded the variation in temperature during the gingivoplasty performed with DL calibrated with the same parameters as those of the in vivo test. It was observed that there was a maximum variation in temperature of between 1C and 6C, depending on the region analyzed. Hsp27 expression was shown to be increased in the laser-irradiated group when compared with the group treated by scalpel in practically all the experimental periods. Hsp47 was also more intensely expressed in the laser group, however, much later. The expression of both proteins was more intense in the irradiated region, but in the other regions measured, it was not possible to relate the immunohistochemical variations with those of temperature. It was concluded that DL causes changes in the expression of Hsp27 and Hsp47, which may be related to the temperature increase caused by laser.

A transcrição pela RNA polimerase II (RNA polimerase B) e a sínteses de proteínas são os mais importantes processos metabólicos em células eucarióticas, e estão envolvidas no controle da expressão gênica. Trichoderma reesei foi utilizado como modelo de estudo para o desenvolvimento deste estudo. Este fungo filamentoso é um microrganismo que vem sendo utilizado por vários laboratórios no mundo para o estudo dos diversos processos biológicos básicos devido à sua grande importância biotecnológica. Foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa um banco de dados ESTs (\"Expressed Sequence Tags\") para este microrganismo e, por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs, determinou-se a reposta transcricional de T. reesei em função da disponibilidade de oxigênio e glicose, assim como a alguns estresses ambientais. Com base nesses resultados foram escolhidos alguns transcritos afetados pela limitação de oxigênio, tais como o gene btf3. Este gene codifica para a proteína reguladora BTF3 (Fator Transcricional 3 da RNA polimerase B), muito conservada em eucariotos, envolvida na transcrição de vários promotores da classe II e que faz parte do complexo que se liga aos polipeptídios nascentes (NAC). Com o intuito de estudar a funcionalidade do gene btf3 em condições normais e em choque térmico foi realizada uma análise transcricional comparativa em larga escala da cepa selvagem de T. reesei QM9414 e do mutante nocaute do gene btf3. A expressão de aproximadamente 2.000 genes foi analisada, por meio de \"microarrays\", em células submetidas ao estresse por choque térmico produzido pelo incremento da temperatura de cultura a 40°C. O nocaute do gene btf3 produziu o incremento da expressão dos genes das vias metabólicas primárias (ND4 e FBA), da defesa celular (DnaJ, HSP70 e RCI) e da síntese de proteínas (eIF2); enquanto que reprimiu genes da estrutura celular (HFBII) e da síntese de RNA (ATF21). No choque térmico, genes que codificam para proteínas associadas com a defesa celular, como as chaperonas Hsp70 e DnaJ, tiveram sua expressão induzida enquanto que proteínas associadas à divisão celular, como histonas e septina B, e à síntese de proteínas, como as proteínas ribossomais, foram reprimidas em ambas as cepas como resultado do estresse. Os resultados obtidos na análise por \"microarray\" foram validados através de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estes resultados sugerem que BTF3 possa atuar como repressor de alguns genes transcritos pela RNA polimerase II. / Transcription by RNA polymerase II (RNA polymerase B) and protein synthesis are the most important metabolic processes in eukaryotic cells, and they are involved in the control of gene expression. Trichoderma reesei was used as model of study for the development of this study. This filamentous fungus is a microorganism that has been used by some laboratories around the world for the study of diverse basic biological questions due to its great biotechnological importance. We had established a data base of ESTs (Expressed Sequence Tags) for this microorganism and, through the technique of cDNA microarray, we had determined the transcriptional response of T. reesei to oxygen and glucose availability, as well as some environmental stresses. Based on such studies we chose some transcripts affected by oxygen limitation such as the btf3 gene, for more detailed investigations. This gene codes for the BTF3 regulatory protein (RNA Polymerase B Transcription Factor 3), a conserved transcriptional factor among eukaryotes that is involved in the transcription of several class II promoters and is part of the nascent polypeptide-associated complex (NAC). In order to study the functionality of the btf3 gene in normal and heat shock conditions, a large-scale transcriptional comparative analysis between T. reesei wildtype strain QM9414 and the btf3 knockout mutant was executed. The expression of approximately 2,000 genes was analyzed using microarrays in cells submitted to heat stress produced by culture temperature increment to 40°C. The knockout of btf3 produces the increment of the expression of genes involved with the primary metabolism pathways (ND4 and FBA), cellular defense (DnaJ, HSP70 and RCI) and protein synthesis (eIF2); whereas it repressed genes related to the structure cell (HFBII) and RNA synthesis (ATF21). In heat shock, genes that encode Hsp70 and DnaJ proteins, associated to cellular defense, as chaperones, had their expression induced. On the other hand, genes for proteins associated to cellular division, such as histones and septin B, and those related to protein synthesis, such as ribossomal proteins were transcriptionally repressed in both strains as a result of the stress. The results obtained in the microarray analysis were validated through quantitative real-time PCR (qPCR). These results suggest that BTF3 can act as a repressor for some genes transcribed by RNA polymerase B.

Background: Recent research has demonstrated the presence of heat being an effective stimulus for increasing skeletal muscle and strength. The exposure of increased environmental temperature combined with resistance training has been shown to amplify muscle adaptation for hypertrophy and strength. However, research into the potential effects of using heat stress combined with resistance training to increase performance criteria, such as speed and agility, are minimal. Utilizing a hot environment coupled with an intense exercise regime has been considered as a potential aid for sport preparation given the evidence that heat stress has on promoting hypertrophy and strength. The desired result is to enhance athletic performance. Aim: The aim of this study was to examine if (a) performing resistance training in a hot environment for 10 weeks induces greater increases in muscle mass and (b) whether this combination improves performance in speed, agility and strength compared to resistance training in a standard temperate environment. Methods: 17 healthy male adults, who have undergone a consistent regime of resistance training in the six months leading up to the study, were distributed at random into two groups; (1) Intervention group (Heat n=8) training in 40°C and (2) control group (Con, n=9) training in 23°C. Each group would follow a 10-week resistance exercise protocol. To monitor time-course adaptations, lean body mass, speed, agility and strength were measured at baseline, week 5 and week 10. Results: Over the selected training period, there was no statistically significant difference observed between the two groups or time x group interaction, over the 10-week exercise duration with respect to lean body mass, speed, agility or strength. Conclusion: Compared to the resistance training regime in the standard temperature condition of 23°C (group two), training results suggest heat stress in the hot environment at 40°C (group one) had no effective stimulus in amplifying hypertrophic adaptations in skeletal muscle nor in increasing performance in speed, agility or strength. Certain hypothetical factors were implicated for heat stress being ineffective such as potential counter-productive aspects from heat exposure or flawed methodology. / Heat Effects on Adaptations to Resistance Training, Victoria University

Considerando-se que o papel das proteínas de choque térmico (HSPs) na melhoria da resposta regenerativa da musculatura esquelética de camundongos idosos ainda não é bem conhecido, e que o tratamento com O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl) nicotinic amidoxime (BGP-15), um indutor de HSPs, atenua a fibrose muscular em animais com Distrofia de Duchenne, a hiperexpressão de HSPs no músculo esquelético através do tratamento com BGP-15 e do uso de camundongos transgênicos que hiperexpressam a proteína de choque térmico 70 kDa induzível (HSP70) poderia melhorar o processo regenerativo muscular por meio da atenuação da fibrose do tecido muscular em regeneração de animais idosos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência das HSPs na resposta regenerativa muscular em camundongos idosos através da análise dos efeitos do tratamento com o fármaco BGP-15 e da hiperexpressão da HSP70 induzida por transgenia em aspectos estruturais, celulares, moleculares e funcionais. Em 10 dias após a criolesão de músculos tibialis anterior (TA), o tratamento com BGP-15 (15 mg/kg) atenuou a sarcopenia e a redução do tamanho das fibras musculares em regeneração de camundongos idosos, e induziu a recuperação da densidade de área do tecido conjuntivo em músculos não lesados de camundongos idosos, e da expressão de FGF em músculos lesados de camundongos idosos. Além disso, o BGP-15 proporcionou atenuação da queda da força do músculo extensor digitorum longus em regeneração (EDL) após lesão em camundongos jovens. Além do efeito benéfico do BGP-15 em atenuar a sarcopenia, este fármaco (1&#956;M) também atenuou a perda de miotubos C2C12 expostos às citocinas inflamatórias interferon-&#947; e TNF-&#945; Houve prevenção do déficit na diferenciação inicial e tardia de mioblastos oriundos de animais idosos que hiperexpressam HSP70. Em paralelo, verificamos que o silenciamento de HSP70 em mioblastos C2C12 acarreta na redução da expressão do gene MyoD e do miR-326 no início do processo de diferenciação muscular. Portanto, nossos resultados demonstram que a hiperexpressão de HSPs, induzida por BGP-15, melhora a regeneração muscular em camundongos idosos, pois acelera a recuperação do tamanho da fibra muscular em regeneração. Experimentos in vitro sugerem que esse efeito é mediado pela atenuação do déficit na diferenciação de células precursoras miogênicas. Paralelamente, este trabalho demonstra que a HSP70 participa do início da diferenciação muscular por meio de mecanismo envolvendo MyoD e o miR-326. Além do efeito benéfico do indutor de HSPs, BGP-15, sobre a regeneração muscular de animais idosos, este atenuou a sarcopenia e a perda de miotubos expostos ao modelo de atrofia muscular in vitro induzido por interferon-&#947; e TNF-&#945;. Este último efeito é mediado pela redução na expressão de Atrogin-1. / Considering that the role of heat shock proteins (HSPs) on the skeletal muscle regenerative response of aged mice is still not well known, and that the treatment with O- (3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl ) nicotinic amidoxime (BGP-15), an HSP inducer, attenuates muscle fibrosis in animals with Duchenne Muscular Dystrophy; the overexpression of HSPs in skeletal muscle induced by BGP-15 treatment and the use of inducible 70 kDa heat shock protein (HSP70) overexpressing transgenic mice could improve the muscle regenerative process through attenuation of fibrosis of regenerating muscle tissue in old mice. Therefore, the aim of this study was to investigate the influence of HSPs on muscle regenerative response in aged mice by analyzing the effects of BGP-15 treatment and HSP70 overexpression induced by transgenesis in structural, cellular, molecular and functional aspects of regenerating muscles from aged mice. At 10 days after cryolesion of the tibialis anterior (TA), BGP-15 treatment (15 mg / kg) attenuated sarcopenia, reduced the cross sectional area of regenerating myofiber from aged mice and recovered the connective tissue density and the expression of FGF in injured muscles from aged mice. Moreover, BGP-15 attenuated the force decrease in extensor digitorum longus (EDL) after injury in young mice. In addition to the beneficial effect of BGP-15 on attenuation of sarcopenia, this drug (1&#956;M) also attenuated the loss of C2C12 myotubes exposed to the inflammatory cytokines interferon-&#947; and TNF-&#945;. There was a prevention of the deficit in the initial and late differentiation of myoblasts from aged animals that overexpress HSP70. In parallel, we observed that the silencing of HSP70 in C2C12 myoblasts reduced the gene expression of MyoD and miR-326 at the beginning of the muscle differentiation process. Therefore, our results suggest that the overexpression of HSPs improves muscle regeneration in aged mice, since it accelerates the size recovery of regenerating myofibers. This effect is mediated by the attenuation of the deficit in the differentiation of myogenic precursor cells. In parallel, we demonstrated that HSP70 participates in the beginning of muscle differentiation probably through a mechanism mediated by MyoD and miR-326. In addition to the beneficial effect of the HSP inducer BGP-15 on muscle regeneration of aged animals, it attenuated sarcopenia and loss of myotubes exposed to interferon-&#947; and TNF-&#945;. This latter effect is mediated by the reduction of Atrogin-1 expression.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, sendo o Brasil o país com maior número de casos. A enfermidade é adquirida por meio da inalação de propágulos de fungos do gênero Paracoccidioides e afeta principalmente os pulmões. Anteriormente, nosso grupo mostrou que o tratamento de camundongos infectados com P. brasiliensis com uma dose da proteína de estresse térmico de 60kDa recombinante de P. brasiliensis (PbHsp60r) induzia um efeito prejudicial na PCM, aumentando carga fúngica e lesão pulmonar, quando comparado a animais infectados e tratados com o veículo. No presente trabalho, buscou-se determinar se outra forma de apresentação da PbHsp60r poderia gerar um efeito benéfico em camundongos infectados com P. brasiliensis. Optou-se pelo plasmídeo pVAX1 subclonado com o gene da PbHsp60 (pVAX1-PB_HSP60). Após subclonagem do gene, foi mostrado, por Western blot, que anticorpos específicos para PbHsp60 eram produzidos por camundongos imunizados com três doses da construção e que a proteína era sintetizada por células HEK293 transfectadas com pVAX1-PB_HSP60. O tratamento dos animais infectados com três doses de pVAX1-PB_HSP60 ou pVAX1 subclonado com Hsp65 de M. leprae (pVAX1-ML_HSP65), que reconhecidamente melhora a PCM experimental, induziu uma diminuição de carga fúngica e da lesão pulmonar quando comparado com animais infectados e tratados com pVAX1 ou PBS. Uma dose de uma dessas construções não induziu melhora significativa na PCM quando comparado aos controles. Como esperado, os animais infectados e tratados com uma dose da PbHsp60r tiveram uma piora dos parâmetros de infecção, o que curiosamente não foi observado com os animais tratados com três doses dessa proteína recombinante, cuja melhora foi muito similar a dos animais infectados e tratados com três doses das construções plasmidiais. Ao pesquisar porque uma dose induz piora da infecção, observouse que PbHsp60r induz morte de linfócitos esplênicos in vitro, em um mecanismo dependente de TLR4, proteína adaptadora TRIF e receptor 1 de TNF. Esses resultados abrem perspectivas de se avaliar a importância da morte de células da resposta imunológica no curso da infecção por P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Latin America and Brazil, which holds most of the PCM cases. PCM is acquired through the inhalation of propagules of fungi from genus Paracoccidioides and mainly affects the lungs. We have previously shown that P. brasiliensis-infected mice treated with single dose of recombinant 60-kDa-heat shock protein from P. brasiliensis (rPbHsp60) had a worsening of infection when compared with animals only infected. In this study, we investigate whether the treatment of infected mice with PbHsp60 gene cloned into a plasmid (pVAX1-PB_HSP60) would render an efficient immune response and improvement of the disease. After cloning of the PbHsp60 gene, we first showed that immunization of mice with three doses of pVAX1-PB_HSP60 induced production of specific anti-PbHsp60 antibody and that pVAX1-PB_HSP60-transfected HEK293 cells synthesized the PbHsp60. Interestingly, mice treated with three doses, but not single dose, of pVAX1-PB_HSP60, and pVAX1 subcloned with Hsp65 from Mycobacterium leprae (pVAX1- ML_HSP65), which induces a beneficial effect in experimental PCM, had an improvement in fungal load and lung injury when compared with infected mice treated with pVAX1 or PBS. Unlike animals infected and treated with single dose of rPbHsp60, which had a worsening of infection parameters, treatment with three doses of rPbHsp60 interestingly induced a beneficial effect in the infected animals, as seen with the plasmid constructs. In investigating the causes of this worsening of PCM triggered by injection of a single dose of protein, we showed that rPbHsp60 induced the death of splenic lymphocytes in vitro in a mechanism dependent on Tolllike receptor 4, TRIF adapter protein and TNF receptor 1. These results open perspectives to evaluate the importance of cell death of the immune response in the course of P. brasiliensis infection.

Bacteria have developed specialized responses that involve the expression of particular genes present in a given regulon. Sigma factors provide regulatory mechanisms to respond to stress by acting as transcriptional initiation factors. This work focuses on σ32 during oxidative stress in Escherichia coli. The differential response of key heat shock (HS) genes was investigated during HS and oxidative stress using qPCR techniques. While groEL and dnaJ experienced increases in transcriptional response to H2O2 (10 mM), HS (42°C), and paraquat (50 mM) exposure, the abundance of dnaK over the co-chaperones was apparent. It was hypothesized that DnaK undergoes oxidative modification by reactive carbonyls at its Lys-rich C-terminus, accounting for the differential response during oxidative stress. A σ32-mediated β-galactosidase reporter was devised to detect the activity of wild-type DnaK and DnaKV634X modified to lack the Lys-rich C-terminus. Under unstressed conditions and HS, σ32 was bound at the same rate in both strains. When subjected to H2O2, the WT DnaK strain produced significantly higher β-galactosidase than DnaKV634X (one-tailed Student’s t test p=0.000002, α=0.05) and approached the same level of output as the lacZ positive control. The β-galactosidase assay indicates that DnaK undergoes Lys modification in the WT strain, preventing the protein from binding σ32, increasing the activity of σ32, and resulting in higher β-galactosidase activity than the DnaKV634X strain. In the DnaKV634X strain DnaK continues to bind σ32 so that σ32 could not promote the production of β-galactosidase. These findings demonstrate how DnaK is oxidatively modified, hindering the interaction with σ32 in manner distinct from HS.

Apesar do sucesso do transplante na clínica, os importantes efeitos adversos dos imunossupressores, usados para prevenir e tratar a rejeição, apontam para a necessidade de novas terapias imunorreguladoras. A via oral tem sido efetiva na indução de imunorregulação, em diversos modelos experimentais, principalmente de doenças autoimunes. A Hsp60/65 é uma molécula com grande potencial imunoterapêutico, por sua capacidade de induzir respostas imunes pró-inflamatória e imunorreguladora. Testamos se a terapia oral com o probiótico Lactococcus lactis que expressa a Hsp65, combinada à administração de aloantígenos do doador (AloAg-doador), atua sinergicamente na indução de tolerância ao enxerto de pele semialogeneico murino, ou no aumento de sua sobrevida. Testamos diferentes combinações de terapia oral, assim como a influência da utilização de um anti-inflamatório, inibidor seletivo de COX-2 (celecoxibe). O transplante de pele foi realizado 10 dias após a última administração oral dos probióticos e aloantígenos do doador. Não observamos efeitos benéficos na sobrevida do enxerto no grupo de animais que receberam L.lactis que produz Hsp65, sozinho ou em combinação com AloAg-doador e/ou o anti-inflamatório. Em contraste, a terapia oral combinada com o probiótico L.lactis selvagem e AloAg-doador aumentou significativamente a sobrevida do enxerto (p=0,01), em comparação com o grupo não tratado. Nesse grupo que teve maior sobrevida do aloenxerto (L,lactis selvagem e AloAg-doador), também observamos maior quantidade de epitélio preservado (p=0,02) e maior expressão de TGF-beta (p=0,04), no enxerto, em comparação com o grupo sem tratamento. Não observamos diferenças significativas na expressão, in situ, de FOXP3 e IL-17, que foi baixa em todos os grupos experimentais. Concluímos que a Hsp65 não induziu efeito imunorregulador capaz de prolongar a sobrevida do enxerto. No entanto, a manipulação da microbiota com a terapia combinada com o L.lactis selvagem e a exposição a antígenos do doador, previamente, ao transplante, induz mecanismos imunorreguladores capazes de controlar, mesmo que parcialmente, as respostas inflamatórias dirigidas ao aloenxerto de pele, provavelmente, com a participação de TGF-beta / Despite the success of clinical transplantation, the significant side effects induced by immunosupressants used to prevent and treat rejection, indicate the need for novel immunoregulatory therapies. The oral route has been effective in inducing immunoregulation in several experimental models, mostly in pathological autoimmunity. Heat Shock protein 60/65 (Hsp) displays great immunotherapeutic potential due to its capacity to induce both pro-inflammatory and immunregulatory responses. We tested whether oral therapy with the probiotic Lactococcus lactis that expresses Hsp65, in combination with donor alloantigens (Donor-Allo-Ag), acted synergically, inducing immunotolerance or increasing graft survival, in a murine model of semiallogeneic skin transplantation. We tested different oral therapy combinations, as well as the association with a COX-2 selective nonsteroidal anti-inflammatory drug (celecoxib). Skin transplantation was performed 10 days after the last oral administration of probiotics and Donor-Allo-Ag. We observed no beneficial effect on graft survival in the group that received L.lactis that produce Hsp65, alone or in combination with Donor-Allo-Ag/and/or the anti-inflammatory drug. In contrast, combined oral therapy with wild type L.lactis and Donor-Allo-Ag significantly prolonged graft survival (p=0.01), in comparison to non-treated animals. In this prolonged-survival group (L.lactis and Donor-Allo-Ag), we also found higher extension of preserved epithelium (p=0.02) and higher expression of TGF-beta (p=0.04), within the graft, in comparison to non-treated animals. We found no significant differences in the intragraft expression of FOXP3 and IL-17, which was essentially absent or very low. We conclude that Hsp65 did not induce immunoregulatory effects capable of prolonging graft survival. However, the microbiota manipulation with the combined oral therapy with wild type L.lactis and Donor-Allo-Ag, prior to transplantation, induce immunoregulatory mechanisms capable of partially controlling the inflammatory responses to the graft, most likely involving the participation of TGF-beta