Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-18T11:49:13Z No. of bitstreams: 1 Lilian Maria Nery de Barros Goes.pdf: 490274 bytes, checksum: f5fc8ea054d8a75de4f16f6764893075 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-18T11:49:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lilian Maria Nery de Barros Goes.pdf: 490274 bytes, checksum: f5fc8ea054d8a75de4f16f6764893075 (MD5) Previous issue date: 2008-07-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The blood cells normal values knowledge is one of the most valuable clinical labs technique which allows the systemic and morphologic anomaly, when identification is not cleary shown in the organism, identification. At the mammals medicine these values are great known, but on the shrimp culture there still be too much to clear up about haemolynph. Several studies have been realized aiming determines the different kinds of cells and their respective functions. However, the important information like the normal values of the hemocytes total counting (HTC) in different development phases to the Litopenaeus vannamei species and the existence of hemocytes behavior variations on males and females, as well as its relation to anatomo-histopatologic alterations, still being unknown. In face of the exposed, it was aimed to verify the hemocytes behavior on the different cultivated L. vannamei shrimp development phases, the sexual quantitative variation existence, the sodium citrate and Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) efficacy as anticoagulant, beyond its relation to the detected alterations at the fresh and histopathology exams. 20 samples of haemolynph were collected weekly, being ten (five males and five females) using the sodium citrate anticoagulant and ten using the EDTA anticoagulant. The collects were realized in two aquariums (A and B), on summer and winter times at a commercial shrimp culture located in Goiana/Pernambuco estate. 0,1mL of haemolynph on a proportion of 1:1 (anticoagulant with 10%concentration:haemolynph) were collected from each shrimp to clinical pathology analyses. The hemocyties/mm3counting was realized immediately after the collect and after a five hours interval. The results were statistically analyzed using multiple linear moulds (P<0,05). The entire sample animals showed themselves healthy doesn’t presenting significant interference of the detected alterations on the fresh and histopathology exams over the HTC. The male shrimps presented bigger HTC than the females, thus the animals age interfered at the HTC, getting bigger counting on elder animals. In relation to the seasonality, the winter cultivated animals presented bigger counting than the summer cultivated. Both the sodium citrate and the ETDA preserved correctly the samples designated to HTC immediately after the collect. It was concluded that the sex, the age and the seasonality interfere directly over the HTC and the sodium citrate at 10% and the EDTA at 10% are indicated to the HTC immediately after the collect. / O conhecimento dos valores normais das células sanguíneas é uma das mais valiosas técnicas de laboratório clínico, que permite a identificação de anormalidades morfológicas e sistêmicas, não aparentes, no organismo. Em mamíferos estes valores são amplamente conhecidos, porém em camarões, ainda há muito que se desvendar a respeito da hemolinfa. Muitos estudos têm sido realizados visando determinar os diferentes tipos celulares e suas respectivas funções. Todavia, informações importantes como os valores normais da contagem total dos hemócitos (CTH) em diferentes fases do desenvolvimento para a espécie Litopenaeus vannamei e a existência de variações no comportamento dos hemócitos de indivíduos machos e fêmeas, bem como sua relação com alterações anatomohistopatológicas, ainda são desconhecidas. Diante do exposto, objetivou-se verificar o comportamento dos hemócitos nas diferentes fases de desenvolvimento de camarões L. vannamei cultivados, a existência de variação quantitativa entre sexos, a eficácia do citrato de sódio e do ácido etilenodiaminotetracético de sódio (EDTA) como anticoagulantes, além de sua relação com alterações detectadas aos exames a fresco e histopatológico. Semanalmente, coletaram-se 20 amostras de hemolinfa, sendo dez (cinco machos e cinco fêmeas) utilizando o anticoagulante citrato de sódio e dez utilizando o anticoagulante EDTA. As coletas foram realizadas em dois viveiros (A e B), nos períodos de inverno e verão numa carcinicultura comercial localizada em Goiana estado de Pernambuco. De cada camarão foi coletado 0,1mL de hemolinfa na proporção de 1:1 (anticoagulante com concentração de 10%:hemolinfa) para as análises de patologia clínica. As contagens de hemócitos/mm3 foram realizadas imediatamente após a coleta e após intervalo de cinco horas. Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando-se modelos lineares múltiplos (P<0,05). Todos os animais amostrados apresentaram-se hígidos, não havendo interferência significativa das alterações detectadas aos exames a fresco e histopatológico sobre a CTH. Os camarões machos apresentaram maiores CTH do que as fêmeas, assim como a idade dos animais interferiu na CTH, obtendo-se maiores contagens em animais mais velhos. Em relação à sazonalidade, os animais cultivados no inverno apresentaram maiores contagens que os cultivados no verão. Tanto o citrato de sódio quanto o EDTA preservaram adequadamente as amostras destinadas CTH imediatamente após a coleta. Conclui-se que o sexo, a idade e a sazonalidade interferem diretamente sobre a CTH e que o citrato de sódio a 10% e o EDTA a 10% são indicados para a CTH imediatamente após a coleta.

Submitted by Natalia de Souza Gonçalves (natalia.goncalves@ufpe.br) on 2016-09-19T13:06:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Mestrado-André-Severino-da-Silva-FINAL-2016 digital ok.pdf: 968681 bytes, checksum: 7aa8797460dde7f9b350d87b19110eee (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-19T13:06:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Mestrado-André-Severino-da-Silva-FINAL-2016 digital ok.pdf: 968681 bytes, checksum: 7aa8797460dde7f9b350d87b19110eee (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / FACEPE / Compostos com núcleo pirimidínico têm grande potencial e importância farmacológica para a saúde humana, pois apresentam várias propriedades biológicas como atividade anti-inflamatória, antitumoral, bioherbicida, entre outras. Este trabalho busca analisar os efeitos genotóxicos dos compostos 4-Amino-2-(fenil)-6-(m-nitrofenil)-5-carbonitrila-pirimidina (5a), 4-Amino-2-(fenil)-6-(p-nitrofenil)-5-carbonitrila- pirimidina (5b) e 4-Amino-2-(fenil)-6-(p-anisil)-5-carbonitrila-pirimidina (5c), obtidos por síntese, por meio do teste SMART (Teste de Mutação e Recombinação Somática) e Ensaio Cometa em Drosophila melanogaster. Para o Ensaio Cometa, larvas de D. melanogaster da linhagem Oregon-R foram expostas por 24 horas aos compostos 5a, 5b e 5c, nas concentrações 0,39, 0,78, 1,56 e 3,12 mg/mL, e ao solvente (grupo controle negativo), além de um grupo controle positivo (Ciclofosfamida 1 mg/mL). Para a análise microscópica dos possíveis danos genéticos causados pelos compostos foram observadas as células da hemolinfa (hemócitos) de larvas. No processo metodológico do SMART, larvas de D. melanogaster foram expostas às concentrações 0,04, 0,09, 0,19, 0,39, 0,78, 1,56 e 3.12 mg/mL dos compostos 5a e 5b, além dos grupos controle negativo (tratado apenas com o solvente) e controle positivo (tratado com mitomicina 1mg/mL). Foi estabelecida uma curva de sobrevivência de acordo com o nascimento dos indivíduos adultos para verificar a citotoxicidade dos compostos. As manchas e pelos mutantes das asas dos indivíduos adultos tratados foram analisadas em microscópio óptico e comparados aos resultados do grupo controle negativo. Os resultados indicaram que não houve diferenças significativas entre os grupos tratados e os controles negativos, tanto para o teste SMART, quanto para o Ensaio Cometa. No teste SMART, as curvas de sobrevivência mostraram que os compostos 5a e 5b, não apresentaram toxicidade para os drosofilídeos testados. Podendo-se concluir, assim, que nas condições experimentais testadas em D. melanogaster os compostos não apresentaram atividade tóxica nem mutagênica, o que contribui para o uso dos compostos pirimidínicos aqui investigados na composição de novos fármacos para o tratamento da saúde humana. / Compounds of the core pyrimidine have great potential and pharmacological importance to human health and the environment and therefore exhibit different biological properties as anti-inflammatory, antitumor, bioherbicide among others. This work intent to analyze the genotoxic effects of the compounds 4-Amino-2-(phenyl)-6-(m-nitrophenyl)-5-carbonitrile-pyrimidine (5a) 4-Amino-2-(phenyl)-6-(p-nitrophenyl)-5-carbonitrile-pyrimidine (5b) and 4-Amino-2-(phenyl)-6-(p-anisyl)-5-carbonitrile-pyrimidine (5c) obtained by chemical synthesis using the SMART (Somatic Mutation and Recombination Test) and Comet Assay in Drosophila melanogaster. For SMART, D. melanogaster larvae were exposed to concentrations of 0.04, 0.09, 0.19, 0.39, 0.78, 1.56 and 3.12 mg/mL of the compounds 5a and 5b, and a negative control group treated only with the solvent. A survival curve was established in accordance with the birth of adults in order to check the cytotoxicity of the compounds. The spots and the mutants were analyzed by light microscopy and the results of the groups treated were compared to the negative control group. During the methodological process of the Comet Assay, larvae of D. melanogaster Oregon-R strain were exposed for 24 hours to the compounds 5a, 5b and 5c, at the concentrations 0.39, 0.78, 1.56 and 3.12 mg/mL, and to the solvent (the negative control group). To microscopic analysis of possible genetic damage caused by the compounds, were observed cells from the hemolymph (hemocytes) of larvae. The results indicated that in both tests there were no significant difference between the treated groups and the negative control. It leads us to conclude that the tested compounds showed neither toxic effect, nor mutagenic activity in D. melanogaster over the experimental conditions in D. melanogaster model.

O sistema de expressão de proteínas que utiliza baculovírus como vetor tem sido intensamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes, pois ele permite a formação de modificações pós-traducionais e conta com um forte promotor, a poliedrina. Porém, em alguns casos, esse sistema não é tão eficaz, pois a infecção das células pelo vírus induz morte por apoptose, limitando a produção industrial de várias proteínas recombinantes de interesse. Reportamos a ocorrência de apoptose em cultivos de células de insetos e de mamíferos com depleção de nutrientes ou induzidos por agentes químicos e virais, e a suplementação dessas culturas com hemolinfa de Lonomia obliqua é capaz de estender a viabilidade da cultura evitando a morte por apoptose. Como objetivo, verificamos previamente o mecanismo de ação antiapoptótica de um isolado protéico da hemolinfa de L. obliqua. A identificação deste mecanismo poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias para controlar a apoptose nos cultivos permitindo a otimização da produtividade viral e de proteínas recombinantes. / The protein expression system using baculovirus as a vector has been intensively used for the production of recombinant proteins because it allows the formation of post-translational modifications and has a strong promoter, polyhedrin. However, in some cases, this expression system is not as effective because the infection of cells by baculovirus induces death by apoptosis, thereby limiting the industrial production of various recombinant proteins of interest. We report the occurrence of apoptosis in cultured insect cells and mammalian depleted of nutrients or induced by chemical and viral agents, and supplementation of these cultures with hemolymph of Lonomia obliqua is able to extend the viability of the culture avoiding death by apoptosis. This study aimed to determine in advance the anti-apoptotic mechanism of action of a protein isolated from hemolymph of L. obliqua. The identification of this mechanism may help develop strategies for controlling apoptosis in cell culture allowing the optimization of productivity of viral and recombinant proteins.

Os resultados obtidos nesta tese podem ser distribuídos em três grupos: composição química da hemolinfa e do casulo coletivo e determinação química de alguns componentes principais do corpo gorduroso e túbulos de Malpighi ao longo do desenvolvimento. Os principais resultados referentes à química da hemolinfa de larvas maduras são: 1) A hemolinfa possui uma densidade 1,043, pH = 7,27, osmolaridade = 216 miliosmoles e corresponde a 37% do pêso-úmido do animal e 26% de seu pêso-sêco. A hemolinfa não se coagula e possui um volume de células correspondente a 0,3% de seu volume total. 2) A análise química realizada deu conta de 88% do peso-sêco total da hemolinfa e revelou que entre os componentes presentes mais importantes em massa estão as proteínas, seguidas dos aminoácidos livres, enquanto que os osmóticamente mais ativos são os aminoácidos livres seguido de Mg++ e Na+. Entre os aminoácidos é notável a presença de ornitina e cistationina em concentrações relativamente elevadas e a ausência, mesmo em traços, de cisteína e/ou cistina e citrulina. 3) Os peptídeos ocorrem em concentrações elevadas, mas em pequeno número, e são compostos de 2 a 3 resíduos de aminoácidos em média; o mais abundante dos quais deve ser um dipeptídeo de histidina e ácido aspártico. 4) Citrato é o ânion mais importante da hemolinfa, seguido dos fosfatos orgânicos, enquanto que trealose é o principal carboidrato presente. 5) Existem pelo menos 6 carotenóides ligados de forma não covalente a proteínas da hemolinfa e uma cromoglicoproteína, de côr amarelo-limão, fluorescente, de natureza desconhecida. Os carotenóides mais importantes quantitativamente são: &#946;-caroteno e um similar ao astaceno. A composição em massa do casulo coletivo na véspera da muda pupal é a seguinte, em números inteiros: 44% de CaCO3; 34% de proteínas e 10% de carboidratos, ambos insolúveis em todos solventes utilizados (SDS 10%, uréia 6M, ácido fórmico 50%, HCl 2N, KOH 1M e Na HCO3 1M); 10% de material hidrossolúvel 4% de cinzas não identificadas. O material hidrossolúvel foi parcialmente identificado como: proteína (4%), carboidratos (2%), enquanto que 4% ainda permanece desconhecido. O correlacionamento da análise química da hemolinfa, casulo, túbulos de Malpighi e corpo gorduroso ao longo do desenvolvimento, possibilitou ainda as seguintes conclusões: 1) A fração insolúvel do casulo (proteínas e carboidratos) corresponde à sêda secretada pelas glândulas salivares da larva, enquanto que o CaCO3 presente provém dos túbulos de Malpighi. 2) As proteínas do casulo devem originar-se, pelo menos em parte, das proteínas da hemolinfa, enquanto que seus carboidratos devem provir do glicogênio do corpo gorduroso. Os resultados são considerados em têrmos de seus possíveis significados metabólicos e eventualmente fisiológicos. Ênfase é dada na discussão do papel metabólico dos componentes orgânicos e inorgânicos da hemolinfa, assim como dos mecanismos de secreção da sêda e CaCO3 e sua possível regulação hormonal. / The results of this thesis are concerned to three main lines of research: the chemical composition of the hemolymph, of the communal cocoon, and the chemical determination of some components in the rat body and Malpighian tubules along larval development. The chief results on the hemolymph chemistry of mature larvae are: 1) The hemolymph has a density = 1.043, pH = 7.27, osmolarity = 2l6 miliosmols and corresponds to 37% of the larva (Wet-Weight) or to 26% of the larva (dry weight). The hemolymph does not clott and the volume of the hemocytes is 0.3% of blood total volume. 2) The chemical analysis dealt with 88% (dry-weight) of the hemolymph and showed that proteins are the most important component in mass, while free amino acids, Mg++ and Na+ are the most osmotically active substances. Among the amino acids is remarkable the titres of ornithine and cystathionine, and the complete absence of cysteine and/or cystine and citrulline. 3) There are few peptides, but present in high titres. They are built of two to three amino acids residues, and the most concentrated of them must be a dipeptide of histidine and aspartic acid. 4) Citrate and organic phosphates are the most important anions in the hemolymph. Trehalose is the chief carbohydrate present. 5) There are at least 6 non-covalentely protein-bound carotenoids and one lemon-yellow, fluorescent chromoglycoprotein of unknown nature. The chemical composition of the communal cocoon of R. americana expressed in percentage of its total dry weigth (numbers rounded to the nearest unity) are: 44% of CaCO3; 34% of proteins and 10% of carbohydrates both insoluble in all solvents used (10% SDS, 6M urea, 50% formic acid, 2N HCl, 1M KOH and 1M NaHCO3 ); 10% of water soluble material and 4% of unknown nature. The water soluble material was identified in part as: protein (4%) and carbohydrates (2%), while 4% remained unknown. The interrelationship among the results of the chemical analysis of the hemolymph, cocoon, Malpighian tubules and fat body during larval development was used to draw the conclusions: 1) The insoluble fraction of the cocoon proteins and carbohydrates) corresponds to the silk produced by the larval salivary glands, while CaCO3 comes from Malpighian tubules. 2) The cocoon proteins must come, at least in part, from the hemolymph proteins, while its carbohydrates must come from the fat body glycogen. The results are discussed in terms of its possible metabolic and eventually physiological meanings. Emphasis is given in the discussion of the metabolic role of the inorganic and organic components of the hemolymph, as yet in the the mechanisms of the silk secretion and CaCO3 deposition and their possible hormonal regulation.

Insetos vetores apresentam diminuição na produção de ovos quando infectadas por plasmódios. Esse fenômeno foi demonstrado em diferentes modelos de laboratório utilizando mosquitos Aedes aegypti, Anopheles gambiae e Anopheles stephensi. Durante o desenvolvimento de Plasmodium gallinaceum ocorrer alterações em diferentes processos fisiológicos de Aedes aegypti, tais como redução nos níveis de ecdisona (precursora do hormônio 20-hidroxiecdisona) na hemolinfa e alterações nos níveis transcricionais em genes envolvidos com vitelogênese, transporte de lipídeos e resposta imune. Os dados obtidos também mostram alterações nas quantidades de proteínas hemolinfáticas minoritárias e majoritárias em fêmeas infectadas. Embora maior parte do desenvolvimento do parasita acontece no trato digestivo, outros tecidos como corpo gorduroso, ovários e hemolinfa são afetados. Além disso, nossos dados sugerem fortemente que o parasita utiliza a lipoforina como fonte nutricional durante a esporogonia. / Insect disease vectors show decreased fecundity when infected with Plasmodium. This phenomenon has already been demonstrated in laboratory models such as Aedes aegypti, Anopheles gambiae and Anopheles stephensi . Some physiological processes of Aedes aegypti suffer changes when the vector is infected with Plasmodium gallinaceum . The ecdysone (20-hidroxyecdysone hormone precursor) level in the hemolymph is reduced and genes involved on vitellogenesis, lipid transport and immune response have their transcriptional pattern changed. The data obtained also show that these modifications also occur with major and minor hemolymph proteins. The fat body, ovaries and hemolymph are affected during infection, even though, the parasite development occurs mainly in the midgut. In addition, our results strongly suggest that parasites use lipophorin as a nutritional source for sporogony.

Peptídeos antimicrobianos são importantes componentes do sistema imune de vertebrados e invertebrados. Neste trabalho purificamos e caracterizamos quatro moléculas presentes na hemolinfa da aranha Acanthoscurria gomesiana: 1) theraphosinina, peptídeo de 4052,5 Da purificado do plasma, apresenta atividade anti-Micrococcus luteus e não apresenta similaridade com outros peptídeos. A partir dos hemócitos foram purificados: 2) mygalomorphina, um peptídeo de 415,9 Da com atividade anti-Escherichia coli. Sua atividade está relacionada à produção de H2O2 pois é inibida por catalase; 3) gomesina, um peptídeo de 2270,4 Da que apresenta alta similaridade com taquiplesinas e protegrinas. Apresenta amplo espectro de atividade contra bactérias, leveduras, fungos e Leishmania; 4) acanthoscurrina, um peptídeo rico em glicina, que apresenta duas isoformas com 10132,4 e 10249,1Da. Este peptídeo tem atividade contra E. coli e Candida albicans e apresenta grande similaridade com proteinas antifúngicas de insetos e também com proteínas relacionadas com a defesa em plantas. / Antimicrobial peptides are important components of the vertebrates and invertebrates immune system. In this work we purified and characterized four molecules from Acanthoscurria gomesiana spider hemolimph: 1) theraphosinin, a 4,052.5 Da peptide purified from plasma with anti-Micrococcus luteus activity. It does not show similarity with any other invertebrate immune peptides. From the hemocytes three peptides have been purified: 2) mygalomorphin, a peptide with 415.9 Da, which shows anti-Escherichia coli activity. This activity is inhibited by catalase, therefore it may be, related to the H2O2 production; 3) gomesin, a peptide with 2,270.4 Da, that shows high similarity with tachyplesins and protegrins. It have large activity spectrum against bacteria, yeast, fungi and Leishmania; 4) acanthoscurrin, a glycine-rich peptide that shows two isoforms of 10,132.4 and 10,249.1 Da. This peptide has activity against E. coli and Candida albicans and shows high similarity with antifungal proteins of insects and plants defense proteins.

Animais hematófagos possuem em sua saliva substâncias que permitem a fluidez do sangue, para o sucesso de sua alimentação. Com isso, têm sido descritos diversos componentes com atividades nos diferentes processos hemostáticos (coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária). O complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudado através de bioquímica clássica e análises transcriptômica e proteômica deste tecido determinaram o perfil dos transcritos e das proteínas produzidas. Dentre os transcritos mais abundantes foram encontrados três clones (H06A09, H06A02 e L02F02) que apresentaram 45%, 87% e 94% de similaridade ao LAPP, um inibidor de agregação plaquetária da sanguessuga Haementeria officinallis, a produção destes componentes pelo tecido foi confirmada pela análise proteômica. O LAPP é um inibidor que age pela via do colágeno e possui cerca de 14 kDa e pI de 4,0 e inibe a ligação da plaqueta ao colágeno tanto pelo epítopo do FvW quanto pelo domínio <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Assim, o objetivo do presente trabalho foi clonar, expressar e caracterizar a proteína recombinante ativa, a partir do clone H06A09 para estudos de atividade desta molécula. Para obter a proteína recombinante de interesse inicialmente a clonagem do transcrito foi realizada com sucesso em vetor pAE, porém, a expressão em sistema procarioto apresentou alguns obstáculos já que a molécula não tinha atividade. Uma nova estratégia foi proposta, sendo realizada clonagem em vetor pPIC9K e expressão em sistema eucariótico (leveduras Pichia pastoris - GS115). Após a utilização de diferentes metodologias para estabelecimento das melhores condições para expressão neste sistema, foi eleito o protocolo onde a proteína recombinante era expressa a 28 °C, sob agitação de 260 rpm, e indução por 0,5% de Metanol a cada 24h, durante 72h de expressão. A molécula recombinante expressa e secretada foi submetida a diferentes metodologias para purificação, assim, determinou-se que a estratégia utilizada que melhor isolou a proteína foi a submissão do sobrenadante da expressão à diálise e concentração em sistema de ultrafiltração (Amicon 5 kDa Millipore) seguida de uma cromatografia de gel filtração em Superdex 75 (GE), sistema FPLC, com coleta fracionada. Ensaios de agregação plaquetária confirmaram a atividade inibitória da proteína recombinante tanto em sangue total como em PRP (plasma rico em plaqueta) e plaqueta lavada, especificamente quando o agonista era o colágeno, apresentando IC50 para PRP e plaqueta lavada de 20 e 712 ng, respectivamente. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a proteína recombinante, diferente do LAPP, age na inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno, pela ligação à subunidade Ib<font face=\"Symbol\">a do complexo GPIb-IX-V, complexo este que usa o FvW como ponte entre a plaqueta e o colágeno, firmando assim a interação da plaqueta ao subendotélio e posterior agregação. Desta forma, o presente trabalho caracteriza o primeiro inibidor recombinante de agregação plaquetária pela via do colágeno proveniente de sanguessugas Haementeria depressa, e comprova que apesar de apresentar 45% de similaridade estrutural ao LAPP é um inibidor com características funcionais diferentes, e com grande potencial a ser estudado. / Hematophagous animals have in their saliva substances that maintain the blood fluidity to the success of their feeding. Therefore, components have been described by their activities in the hemostatic processes (coagulation, fibrinolysis and platelet aggregation).The salivary complex of Haementaria depressa leech has been studied by classical biochemical and transcriptomic and proteomic analysis of this tissue determined the profile of transcripts and proteins produced by it. Among the most abundant transcripts were found three clones (H06A09, H06A02 e L02F02) that showed 45%, 87% e 94% of similarity to LAPP, an inhibitor of platelet aggregation from Haementeria officinallis, the components production was confirmed by proteomic analysis. LAPP is a inhibitor that acts by collagen pathway and has around 14 kDa and pI of 4.0, and inhibits the binding of platelet to collagen by both the epitope domain of vWF as the <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Thereby, the aim of this study was to clone, express and characterize the active recombinant protein from the clone H06A09 for studies of activity of this molecule. To obtain the recombinant protein initially cloning of transcript was successfully performed in pAE vector, however, the protein expressed in prokaryotic system presented some obstacles not presenting activity. A new strategy was proposed, being held in pPIC9K vector and expression in eukaryotic system - yeast Pichia pastoris (GS115). After using different methodologies to establish the best conditions for expression in this system, was elected the protocol where the recombinant protein was expressed in 28 °C, under agitation of 260 rpm, and 0.5% methanol induction every 24 hours during 72 hours of expression. The recombinant molecule was expressed in soluble portion and was subjected to differents methods for purification, so it was determined that the best strategy to isolation of the protein was the concentration and dialysis of the expression supernatant by ultrafiltration system (Amicon 5 kDa Millipore) followed by gel filtration chromatography on Superdex 75 (GE), FPLC system. Tests confirmed the platelet aggregation inhibitory activity of the recombinant protein in whole blood, PRP (platelet rich plasma) and in washed platelets, specifically when the agonist was collagen, with IC50 to PRP and washed platelet of 20 and 712 ng, respectively. Assays by flow cytometry indicated that the recombinant protein, different from LAPP, acts to inhibit platelet aggregation induced by collagen, by the binding to the Ib<font face=\"Symbol\">a subunit of the GPIb-IX-V complex, this complex uses the vWF as a bridge between the platelet and collagen, thus firming the interaction of the subendothelium and subsequent platelet aggregation. Thus, this study characterized the first recombinant inhibitor of platelet aggregation through collagen pathway from Haementeria depressa leeches, and proves that despite having 45% structural similarity to the LAPP is an inhibitor with different functional characteristics, and with great potential to be studied.

Peptídeos antimicrobianos são importantes componentes do sistema imune de vertebrados e invertebrados. Neste trabalho purificamos e caracterizamos quatro moléculas presentes na hemolinfa da aranha Acanthoscurria gomesiana: 1) theraphosinina, peptídeo de 4052,5 Da purificado do plasma, apresenta atividade anti-Micrococcus luteus e não apresenta similaridade com outros peptídeos. A partir dos hemócitos foram purificados: 2) mygalomorphina, um peptídeo de 415,9 Da com atividade anti-Escherichia coli. Sua atividade está relacionada à produção de H2O2 pois é inibida por catalase; 3) gomesina, um peptídeo de 2270,4 Da que apresenta alta similaridade com taquiplesinas e protegrinas. Apresenta amplo espectro de atividade contra bactérias, leveduras, fungos e Leishmania; 4) acanthoscurrina, um peptídeo rico em glicina, que apresenta duas isoformas com 10132,4 e 10249,1Da. Este peptídeo tem atividade contra E. coli e Candida albicans e apresenta grande similaridade com proteinas antifúngicas de insetos e também com proteínas relacionadas com a defesa em plantas. / Antimicrobial peptides are important components of the vertebrates and invertebrates immune system. In this work we purified and characterized four molecules from Acanthoscurria gomesiana spider hemolimph: 1) theraphosinin, a 4,052.5 Da peptide purified from plasma with anti-Micrococcus luteus activity. It does not show similarity with any other invertebrate immune peptides. From the hemocytes three peptides have been purified: 2) mygalomorphin, a peptide with 415.9 Da, which shows anti-Escherichia coli activity. This activity is inhibited by catalase, therefore it may be, related to the H2O2 production; 3) gomesin, a peptide with 2,270.4 Da, that shows high similarity with tachyplesins and protegrins. It have large activity spectrum against bacteria, yeast, fungi and Leishmania; 4) acanthoscurrin, a glycine-rich peptide that shows two isoforms of 10,132.4 and 10,249.1 Da. This peptide has activity against E. coli and Candida albicans and shows high similarity with antifungal proteins of insects and plants defense proteins.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A prospecÃÃo de agentes antibacterianos pode fornecer alternativa terapÃutica para epizootias de etiologia bacteriana que representam risco para o desenvolvimento de atividades aqÃÃcolas. Considerando essa assertiva, o presente estudo teve como objetivo a avaliaÃÃo da bioatividade in vitro de extratos de sementes de Moringa oleifera contra vÃbrios isolados da hemolinfa do camarÃo Litopenaeus vannamei. Como critÃrios de seleÃÃo para os testes de atividade antibacteriana, foram determinados perfis relacionados à resistÃncia a antimicrobianos e à expressÃo de exoenzimas associadas a fatores virulentos. Foram isoladas e identificadas fenotipicamente 100 cepas de Vibrio, verificando-se predominÃncia das espÃcies de V. navarrensis (53%), V. brasiliensis (15%) e V. parahaemolyticus (10%). Todas as cepas testadas (n = 100) foram capazes de expressar pelo menos uma exoenzima. As atividades fosfolipolÃtica e lipolÃtica foram verificadas em 94% e 58% das cepas, respectivamente. Trinta e oito estirpes produziram &#946;âhemÃlise em sangue de ovelha. A habilidade em hidrolisar caseÃna, gelatina e elastina foi observada em 96%, 80% e 35% dos vÃbrios, respectivamente. O perfil fenotÃpico de susceptibilidade a antimicrobianos revelou um elevado Ãndice de resistÃncia (75%). Foram observados perfis de monoresistÃncia (n = 42), resistÃncia cruzada a &#946;-lactÃmicos (n = 20) e multiresistÃncia (n = 13). No que se refere à atividade antibacteriana, os extratos obtidos por extraÃÃo com etanol a frio (MOS-E) e a quente (MOS-ES) mostraram-se bioativos contra 92% e 90% das cepas testadas, respectivamente. A ConcentraÃÃo InibitÃria MÃmima (CIM) de MOS-E e MOS-ES mais eficiente contra o maior percentual de estirpes foi a de 32 Âg mL-1. A triagem bioguiada de compostos bioativos revelou que a fraÃÃo acetato de etila de ambos os extratos foi à Ãnica que apresentou atividade antibacteriana. A partir do fracionamento cromatogrÃfico da fraÃÃo supracitada, isolaram-se as substÃncias vibriocidas niazirina e niazimicina. / The search for antibacterial agents may provide alternative therapy for outbreaks of bacterial etiology that represents a risk to the development of aquaculture activities. Thus, the research aimed to evaluate the in vitro bioactivity of the Moringa oleifera seeds extracts against isolated vibrios from the Litopenaeus vannamei hemolymph. The profiles related to antibiotic resistance and exoenzyme expression associated to virulence factors were determined as criteria for antibacterial activity assays. One hundred strains of Vibrio were isolated and phenotypically identified, with the predominance of V. navarrensis (53%), V. brasiliensis (15%) and V. parahaemolyticus (10%). The expression of at least one exoenzyme was detected in all isolates (n = 100). It was found a percentage of phospholipase and lipase positive strains of 94 and 58%, respectively. Thirty-eight strains produced &#946;-hemolysis on sheep blood. The ability to hydrolyze casein, gelatin and elastin was observed in 96%, 80% and 35% of vibrios, respectively. It was observed a high antibiotic resistance index (75%), with following phenotypic profiles: monoresistance (n = 42), cross-resistance to &#946;-lactams (n = 20) and multiple resistance (n = 13). The antibacterial activity tests indicated bioactivity from the MOS-E and MOS-ES against 92% and 90% of strains tested, respectively. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of MOS and MOS-E-ES able to inhibit the growth of most strains was of 32 Âg mL-1. The screening of bioactive compounds revealed that only a fraction of ethyl acetate from both extracts demonstrated antibacterial effect, which made possible the isolation of the vibriocidal substances niazirine and niazimicine.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A prospecÃÃo de agentes antibacterianos pode fornecer alternativa terapÃutica para epizootias de etiologia bacteriana que representam risco para o desenvolvimento de atividades aqÃÃcolas. Considerando essa assertiva, o presente estudo teve como objetivo a avaliaÃÃo da bioatividade in vitro de extratos de sementes de Moringa oleifera contra vÃbrios isolados da hemolinfa do camarÃo Litopenaeus vannamei. Como critÃrios de seleÃÃo para os testes de atividade antibacteriana, foram determinados perfis relacionados à resistÃncia a antimicrobianos e à expressÃo de exoenzimas associadas a fatores virulentos. Foram isoladas e identificadas fenotipicamente 100 cepas de Vibrio, verificando-se predominÃncia das espÃcies de V. navarrensis (53%), V. brasiliensis (15%) e V. parahaemolyticus (10%). Todas as cepas testadas (n = 100) foram capazes de expressar pelo menos uma exoenzima. As atividades fosfolipolÃtica e lipolÃtica foram verificadas em 94% e 58% das cepas, respectivamente. Trinta e oito estirpes produziram &#946;âhemÃlise em sangue de ovelha. A habilidade em hidrolisar caseÃna, gelatina e elastina foi observada em 96%, 80% e 35% dos vÃbrios, respectivamente. O perfil fenotÃpico de susceptibilidade a antimicrobianos revelou um elevado Ãndice de resistÃncia (75%). Foram observados perfis de monoresistÃncia (n = 42), resistÃncia cruzada a &#946;-lactÃmicos (n = 20) e multiresistÃncia (n = 13). No que se refere à atividade antibacteriana, os extratos obtidos por extraÃÃo com etanol a frio (MOS-E) e a quente (MOS-ES) mostram-se bioativos contra 92% e 90% das cepas testadas, respectivamente. A ConcentraÃÃo InibitÃria MÃmima (CIM) de MOS-E e MOS-ES mais eficiente contra o maior percentual de estirpes foi a de 32 Âg mL-1. A triagem bioguiada de compostos bioativos revelou que a fraÃÃo acetato de etila de ambos os extratos foi à Ãnica que apresentou atividade antibacteriana. A partir do fracionamento cromatogrÃfico da fraÃÃo supracitada, isolaram se as substÃncias vibriocidas niazirina e niazimicina. / The search for antibacterial agents may provide alternative therapy for outbreaks of bacterial etiology that represents a risk to the development of aquaculture activities. Thus, the research aimed to evaluate the in vitro bioactivity of the Moringa oleifera seeds extracts against isolated vibrios from the Litopenaeus vannamei hemolymph. The profiles related to antibiotic resistance and exoenzyme expression associated to virulence factors were determined as criteria for antibacterial activity assays. One hundred strains of Vibrio were isolated and phenotypically identified, with the predominance of V. navarrensis (53%), V. brasiliensis (15%) and V. parahaemolyticus (10%). The expression of at least one exoenzyme was detected in all isolates (n = 100). It was found a percentage of phospholipase and lipase positive strains of 94 and 58%, respectively. Thirty-eight strains produced &#946;-hemolysis on sheep blood. The ability to hydrolyze casein, gelatin and elastin was observed in 96%, 80% and 35% of vibrios, respectively. It was observed a high antibiotic resistance index (75%), with following phenotypic profiles: monoresistance (n = 42), cross-resistance to &#946;-lactams (n = 20) and multiple resistance (n = 13). The antibacterial activity tests indicated bioactivity from the MOS-E and MOS-ES against 92% and 90% of strains tested, respectively. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of MOS and MOS-E-ES able to inhibit the growth of most strains was of 32 &#956;g mL-1. The screening of bioactive compounds revealed that only a fraction of ethyl acetate from both extracts demonstrated antibacterial effect, which made possible the isolation of the vibriocidal substances niazirine and niazimicine.