elevação da expectativa de vida e a diminuição no índice de natalidade têm como consequência o envelhecimento da população mundial, com aumento da incidência de doenças neurodegenerativas. Pessoas acometidas por esses males dispõem atualmente de limitados recursos terapêuticos. Estes muitas vezes são só paliativos, com baixa ou nula perspectiva quanto à reversão dos danos instalados. Por isso, o estudo de substâncias possivelmente neuroprotetoras, que apresentam potencial aplicação como novas drogas, tem sido alvo de pesquisas. Estudos realizados a partir das toxinas produzidas por lagartas da mariposa Lonomia obliqua, as quais têm causado inúmeros acidentes na região Sul do Brasil, identificaram uma proteína presente na hemolinfa com atividade antiapoptótica. A mesma demonstrou provável atuação na manutenção do potencial elétrico de membrana mitocondrial elevado, evitando a morte celular por mecanismo apoptótico. Desta forma, este estudo tem como objetivo avaliar o perfil proteico e efeito da hemolinfa bruta e fração cromatográfica sobre a viabilidade celular de cultura primária de neurônios hipocampais de ratos após a indução de apoptose. Para avaliação do perfil proteico em amostras da hemolinfa bruta e frações de 3 lotes de lagartas de origens distintas, foi utilizada a abordagem proteômica shotgun, semi-quantitativa. Foram identificadas 76 proteínas totais, sendo 71 na hemolinfa e 40 nas frações. Na avaliação do extrato bruto da hemolinfa predominaram proteínas do tipo antiviral, serino proteases, hemolinas e inibidores de proteases. Já nas frações avaliadas, foram identificadas proteínas dos grupos hemolinas, serino proteases e inibidores de proteases. Os lotes apresentaram diferenças quali e quantitativas nas proteínas identificadas entre si. Em relação à viabilidade celular, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) nas células tratadas com hemolinfa ou frações e induzidas ao dano oxidativo. Porém o tratamento das células com a fração na concentração de 0,05 e 0,1% (v/v) por 24 h foi capaz de manter a viabilidade celular significativamente maior em relação ao controle positivo (p<0,05 e p<0,01 respectivamente). Estes resultados podem contribuir na identificação de proteínas com potencial aplicação como neuroprotetoras. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Increased life expectancy and the decline in births results in aging population, with increasing of neurodegenerative diseases incidence. The therapeutic is limited, often only palliative, with low or no prospect damage reversal. Study of substances with potentially neuroprotective has been the focus of research. Toxic proteins of Lonomia obliqua caterpillars, which have caused several accidents in southern Brazil, were identified in the hemolymph with anti-apoptotic activity. This protein had demonstrated the maintaining of high electric potential of mitochondrial membrane, preventing cell death by apoptosis mechanism. This study aims the evaluation of the protein profile and effect of hemolymph and fraction on cell viability of rats primary cultured hippocampal neurons after induction of apoptosis. Semi-quantitative shotgun proteomics approach was used to evaluate the protein profile of 3 lots of different origin, 71 in hemolymph and 40 in fractions, in a total of 76 proteins. Antiviral protein predominated in crude extract of hemolymph, following by serine proteases, hemolines and protease inhibitors. In fractions were identified hemolines, serine proteases and protease inhibitors. No statistics differences were found (p<0.05) in the cell viability induced of oxidative damage, which were treated with hemolymph or fractions. However, the treatment with the fraction at concentration of 0.05 and 0.1% (v/v) for 24 hours, was able to maintain cell viability significantly higher than positive control (p<0.05 and p<0.01 respectively). These results may contribute to the identification of proteins with potential use as neuroprotective in degenerative conditions.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A maioria das infecÃÃes bacterianas em camarÃes à causada por bactÃrias do gÃnero Vibrio. Essas infecÃÃes quando instaladas chegam a provocar altos Ãndices de mortalidade com perdas econÃmicas significativas nos paÃses produtores. A ocorrÃncia de bactÃrias na hemolinfa à um indicador de bacteriose generalizada. O presente estudo teve como objetivo relacionar o tempo de coagulaÃÃo com a presenÃa de Vibrio em amostras de hemolinfas de camarÃes Litopenaeus vannamei cultivados em trÃs fazendas localizadas no Estado do CearÃ, entre o perÃodo de outubro de 2005 (seco) e outubro de 2006 (chuva). Foram realizadas 18 coletas, compreendendo uma estaÃÃo chuvosa e outra de estio. Em cada coleta, foram analisados 10 exemplares de camarÃo com o tempo de cultivo variando de 60 a 120 dias. O intervalo do tempo de coagulaÃÃo da hemolinfa nas trÃs fazendas e nos dois perÃodos variou de cinco a 55 segundos, nos 51 camarÃes que portavam Vibrio e para os 129 que nÃo exibiram essa bactÃria, o intervalo foi de quatro a 57 segundos. A Contagem PadrÃo em Placas (CPP) de Vibrio das hemolinfa de 51 indÃviduos, das trÃs fazendas de cultivo e nos dois perÃodos, variou de 10 a 28.000 Unidades Formadoras de ColÃnias (UFC)/mL. Para as fazendas A, B e C os intervalos das CPPs de Vibrio, tanto no perÃodo seco, quanto no chuvoso, foram, respectivamente, 1.000 e 10 a 140; 1.000 a 28.000 e 10 a 2.000; e 110 a 1.000 e 10 a 1.605 UFC/mL na hemolinfa. Das 132 cepas isoladas das hemolinfas dos camarÃes portadores de Vibrio, foram identificadas 13 espÃcies deste gÃnero. A maior diversidade de vÃbrios nas trÃs fazendas foi detectada por ordem decrescente, B, C e A. O perÃodo chuvoso favoreceu a contaminaÃÃo das hemolinfas infectadas com Vibrio. A presenÃa da bactÃria na hemolinfa nÃo teve relaÃÃo com o seu tempo de coagulaÃÃo. / Most of the time, shrimp infection by bacteria is mainly caused by Vibrio. These kinds of infections can bring about high level of mortality with significant economic damages in shrimp-producing countries. When bacteria are located in haemolymph, it indicates a general bacterial infection The purpose of the present study is to relate coagulation time with Vibrio presence in the haemolymph of shrimps reared in three farms located in Cearà State, from October, 2005 (dry period) to October, 2006 (rainy period). In all, 18 samples were withdrawn, in each of which 10 shrimps were analyzed. The cultivation time of the experiment varied from 60 to 120 days. The intervening time of haemolymph coagulation in the farms and in both periods varied in the range of 5 - 55 seconds, in the 51 shrimps infected with Vibrio and, for the remaining ones (129) not infected, the intermission time ranged from 4 to 57 seconds. The Plate Standard Counting (PSC) of Vibrio in haemolymph referring to 51 individuals varied from 10 to 28.000 Colony-Forming Units (CUF/mL). For the farms A, B and C the intervening times of Vibrio PSC in haemolymph in the dry period were, respectively, 1,000, from 10 to 140, and from 1.000 to 28.000; for the rainy period, they varied from 10 to 2,000, from 110 to 1,000 and from 10 to 1,605 CFU/mL. Out of 132 isolated strains of the shrimp haemolymph which contained Vibrio, 13 species were identified. The highest diversity of Vibrio was observed in the following decreasing order of the farms, namely B, C and A, and also that haemolymph contamination was mostly favoured by rainfall. No relationship was found to exist between bacterian presence in the haemolymph and coagulation time.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / As infecÃÃes bacterianas em camarÃes sÃo causadas, freqÃentemente, por bactÃrias do gÃnero Vibrio O presente estudo teve por objetivo quantificar e identificar Vibrio na hemolinfa do camarÃo marinho Litopenaeus vannamei cultivado em fazendas no Estado do CearÃ, Brasil. Relacionou-se tambÃm o tempo de coagulaÃÃo das hemolinfas com as contagens de Vibrio. Foram realizadas 16 coletas em quatro fazendas (A, B, C e D), sendo oito para camarÃes com 4 g, e oito para camarÃes com oito gramas. As coletas foram realizadas nos perÃodos sazonais: chuvoso e estiagem. Perfazendo um total de 480 amostras, sendo 240 para camarÃes com 4 g e 8 g cada, respectivamente. Os valores da Contagem PadrÃo em Placas (CPP) de vÃbrios totais, de vÃbrios Sac+ e Sac-, nas amostras de hemolinfa dos camarÃes com 4g, no perÃodo chuvoso, variaram de: 2,74 x 104 a 28,70 x 106 UFC/mL (est.); de < 6,0 a 14,64 x 106UFC/mL e de < 6,0 a 12,72 x 106 UFC/mL, respectivamente. Para a hemolinfa dos camarÃes com 8 g os valores obtidos foram: 1,68 x 104 a 15,18 x 106 UFC/mL (est.), de < 6,0 a 1,8 x 105 UFC/mL e de < 6,0 a 15,18 x 106UFC/mL (est.), respectivamente. No perÃodo de estiagem esses valores para a hemolinfa dos camarÃes de quatro gramas, foram: 9,0 x 102 (est.) a 5,40 x 104 UFC/mL vÃbrio total; < 6,0 a 1,71 x 10&#8308;UFC/mL (Sacâ) e de < 6,0 a 5,40 x 104 UFC/mL (Sac+). Para os camarÃes com 8 g a contagem de VÃbrio total foi de 9,0 x 102 (est.) a 2,0 x 107, de < 6,0 a 4,02 x 106 UFC/mL (Sac-) e de < 6,0 a 2,0 x 10&#8311; UFC/mL (est.) (Sac +). Os resultados mostram que os Ãndices de colÃnias de Vibrio Sac- e Sac+ foram maiores no perÃodo chuvoso do que no de estiagem. NÃo houve relaÃÃo entre o tempo de coagulaÃÃo e as contagens de Vibrio na hemolinfa dos camarÃes. As espÃcies que predominaram nos perÃodos estudados foram: V. coralliilyticus, V. parahaemolyticus, Vibrio pelagius II, Vibrio alginolyticus, Vibrio mediterranei, Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus B1. / Most of shrimp bacterial infections are caused by Vibrio bacteria genus. This study aims to quantify identify Vibrio in the hemolymph of the marine shrimp Litopenaeus vannamei cultivated in farms in State of Cear, Brazil. Related is also the time of coagulation of hemolymph with counts of Vibrio. Sixteen samples were performed on four farms (A, B, C and D), eight shrimps with 4 g, and eight with eight grams shrimps. The collections were made in seasonal periods: rainy and drought. A total of 480 samples, and 240 to shrimps with 4 g and 8 g each, respectively. The values in the Standard Plate Count (SPC) of total vibrio, Vibrio Suc+ and Suc- in the hemolymph of shrimp samples with 4 g, in the rainy season ranged from: 2. 74 x 10&#8308; to 28.70 x 10&#8310; CFU/mL (est.), <6.0 to 14.64 x 106CFU/mL and <6.0 to 12.72 x 106 CFU/mL, respectively. For hemolymph of shrimp with 8 g of the SPC and the total Vibrio Suc+ and Sucranged from 1.68 x 10&#8308; to 15.18 x 10&#8310; CFU/mL (est.), <6.0 to 1.8 x 105 CFU/mL and <6.0 to 15.18 x 106CFU/mL (est). During the period of drought for these values of shrimp haemolymph of four grams, were: 9.0 x 10Â (est.) to 5.40 x 104 CFU mL total Vibrio, <6.0 to 1.71 x 10&#8308;CFU/mL (Suc-) and <6.0 to 5.40 x 104 CFU/mL (Suc+). For shrimp with 8 g a total Vibrio count was 9.0 x 10Â (est.) CFU/mL to 2.0 x 10&#8311;, <6.0 to 4.02 x 106 CFU/mL (Suc-) and <6.0 to 2.0 x 10&#8311;CFU/mL (est.) (Suc+). The results show that the rates of colonies of Vibrio Suc- and Suc+ were higher in the rainy season than in the drought. There was no relationship between the time of coagulation and the counts of Vibrio in the hemolymph of shrimps. The species that predominated in the period were: V. coralliilyticus, V. parahaemolyticus, Vibrio pelagius II, Vibrio alginolyticus, Vibrio mediterranei, Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus B1

Submitted by Stephany Silva (stephany.silva@cpqam.fiocruz.br) on 2016-09-16T13:23:38Z No. of bitstreams: 1 2016portela-junior-nc.pdf: 1366854 bytes, checksum: b935336bcc69c9cc7ad7b64725f9fb61 (MD5) / Approved for entry into archive by Adagilson Silva (adagilson@cpqam.fiocruz.br) on 2016-09-16T19:29:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016portela-junior-nc.pdf: 1366854 bytes, checksum: b935336bcc69c9cc7ad7b64725f9fb61 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T19:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016portela-junior-nc.pdf: 1366854 bytes, checksum: b935336bcc69c9cc7ad7b64725f9fb61 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O gênero Biomphalaria possui espécies de grande relevância médica uma vez que atuam como hospedeiros intermediários naturais do parasita Schistosoma mansoni, causador da esquistossomose. Dentro desse gênero de moluscos, três espécies são tidas como hospedeiros naturais do parasita, Biomphalaria glabrata, B. straminea e B. tenagophila. O perfil de suscetibilidade à infecção por S. mansoni dentro do gênero é muito variado e muitas pesquisas buscam elucidar a dinâmica da relação parasita-hospedeiro intermediário na finalidade de criar novas medidas de controle da doença. Por isso, esse estudo tem como objetivo determinar o perfil bidimensional de proteínas que podem estar envolvidas na resposta imune contra o S. mansoni comparando duas espécies com diferentes perfis de susceptibilidade B. glabrata, B. straminea além de uma refratária ao S. mansoni, a B. straminea R3. Para isso, os caramujos de cada espécie foram divididos em dois grupos: Infectado, expostos aos miracídios do S. mansoni; e Controle, submetidos ao estresse do processo de infecção livre de miracídios. A hemolinfa foi retirada 24 horas após a exposição. Foi feito o extrato proteico total e determinada a concentração das proteínas totais para cada grupo investigado. As proteínas foram separadas por eletroforese bidimensional onde foi obtido o ponto isoelétrico e peso molecular de todos os spots nos géis. Estes géis foram comparados entre as condições expostos e não expostos ao parasita e os spots que se mostraram diferenciais foram utilizados para uma busca por homologia em bancos de dados de proteínas já descritas. Na dosagem proteica, a espécie B. glabrata se mostrou estável nas duas condições, enquanto que podemos observar aumento na concentração proteica nas duas linhagens de B. straminea. A presença de diversas proteínas homólogas envolvidas em processos metabólicos de adesão e reconhecimento celular, homeostase de ions entre outras relacionadas à resposta imune foram identificadas entre as espécies e na linhagem resistente (AU)

Esse trabalho investigou as principais carboidrases já descritas em Lepidoptera e principalmente as enzimas relacionadas com hidrólise de sacarose presentes na hemolinfa e no intestino do sexto instar larval de Lonomia obliqua. Avaliou também o efeito das diferentes dietas Eriobotrya japonica, Psidium guajava, Mangifera indica e Alchornea ssp sobre as atividades das carboidrases presentes no sistema circulatório e no sistema digestório dessa lagarta. As pectinases e celulases foram identificadas somente no intestino, porém a amilase, a &#945;-glucosidase, a &#946;-glucosidase, a &#945;-fucosidase e a &#946;-fructosidase foram detectadas também na hemolinfa dessa lagarta. Os géis nativos e os pHs ótimos indicam que há distintas carboidrases na hemolinfa e no intestino de Lonomia obliqua. Alterações nas dietas afetam somente as carboidrases intestinais. A sacarose das folhas foi hidrolisada pela ação conjunta da &#945;-glucosidase e da &#946;-frucosidase. A investigação das carboidrases de Lonomia obliqua contribuirão para o desenvolvimento de medidas de controle desse inseto. / This work investigated the main carbohydrases already described in Lepidoptera and especially the enzymes present in the hemolymph and intestine of the 6th instar of Lonomia obliqua related to the hydrolysis of sucrose. It has also evaluated the effect of different diets Alchornea ssp, Eriobotrya japonica, Mangifera indica and Psidium guajava, on the activities of the carbohydrases present in the circulatory and digestive system of this caterpillar. Pectinases and cellulases were identified in the midgut only, but amylase, &#945;-glucosidase, &#946;-glucosidase, &#945;-fucosidase and &#946;-fructosidase were detected in both hemolymph and midgut of this caterpillar. Native gels and effect of pH indicated that there are distinct carboidrases in the hemolymph and the midgut of Lonomia obliqua. Diet change have affected the digestive carbohydrases only. The sucrose in the leaves was hydrolyzed by the combined action of &#945;-glucosidase and &#946;-frucosidase. The investigation of the carboidrases of Lonomia obliqua can contribute to the development of control strategies to this insect.

O sistema de expressão de proteínas que utiliza baculovírus como vetor tem sido intensamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes, pois ele permite a formação de modificações pós-traducionais e conta com um forte promotor, a poliedrina. Porém, em alguns casos, esse sistema não é tão eficaz, pois a infecção das células pelo vírus induz morte por apoptose, limitando a produção industrial de várias proteínas recombinantes de interesse. Reportamos a ocorrência de apoptose em cultivos de células de insetos e de mamíferos com depleção de nutrientes ou induzidos por agentes químicos e virais, e a suplementação dessas culturas com hemolinfa de Lonomia obliqua é capaz de estender a viabilidade da cultura evitando a morte por apoptose. Como objetivo, verificamos previamente o mecanismo de ação antiapoptótica de um isolado protéico da hemolinfa de L. obliqua. A identificação deste mecanismo poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias para controlar a apoptose nos cultivos permitindo a otimização da produtividade viral e de proteínas recombinantes. / The protein expression system using baculovirus as a vector has been intensively used for the production of recombinant proteins because it allows the formation of post-translational modifications and has a strong promoter, polyhedrin. However, in some cases, this expression system is not as effective because the infection of cells by baculovirus induces death by apoptosis, thereby limiting the industrial production of various recombinant proteins of interest. We report the occurrence of apoptosis in cultured insect cells and mammalian depleted of nutrients or induced by chemical and viral agents, and supplementation of these cultures with hemolymph of Lonomia obliqua is able to extend the viability of the culture avoiding death by apoptosis. This study aimed to determine in advance the anti-apoptotic mechanism of action of a protein isolated from hemolymph of L. obliqua. The identification of this mechanism may help develop strategies for controlling apoptosis in cell culture allowing the optimization of productivity of viral and recombinant proteins.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Iara _Fernanda Rocha (1).pdf: 1203704 bytes, checksum: 3b3c626c8325feae1cf11ce8968fd774 (MD5) Previous issue date: 2015-12-03 / Diatraea saccharalis is an important insect pest of sugarcane and other crops, so it has been the focus of research. In general, the insects present innate immune system, which come with a range of immune responses against microorganisms. Many antimicrobial peptides have been isolated and characterized from model insects such as Drosophila melanogaster and Bombyx mori. In the 5th instar larvae of Diatraea saccharalis has already been reported a protein of Gloverin family with antimicrobial activity. Considering these facts, the objectives of this study were to determine the protein profile of hemolymph larvae from Diatraea sacharalis at 5th instar challenged with Escherichia coli (ATCC 11224) and Bacillus subtilis (ATCC 6623), identify differentially expressed proteins and polypeptides by analyzing the proteomic data, and verifying the antimicrobial activity of crude extract on plates by inhibition of microbial growth. Proteins from the hemolymph of larvae of D. sacharalis challenged and unchallenged were extracted. The samples were quantified and subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE) to obtain a proteomic profile of native hemolymph, challenged by E. coli and B. subtilis. Each gel showed an average of 300 protein spots and 92 spots were correspondents in these gels on three conditions. Were taken 41 different protein spots from gels, these spots were digested with trypsin and analyzed by mass spectrometry of the type MALDI-TOF/TOF. In this analysis, it was possible to identify 10 proteins from MS and MS/MS spectra. Among these proteins were expressed by induction with both bacteria such as chitinase and antimicrobial peptides: protein homologous to the turandot (turandot the like-protein), protein homologous to attacin (Attacin like-protein), and protein homologous peptidoglycan recognition. Another antimicrobial peptide was found, the homologous to &#946;-defensin (&#946;-defensin-like protein), induced only in the hemolymph of the larvae challenged by B. subtilis. A homologous protein Cyclophilin (Cyclophilin-like protein) was found in the hemolymph of larvae challenged and non-challenged. In addition, were also found proteins with hatching activity, hydrolytic not characterized and hypothetical protein of unknown function. Additionally, it also tested the antimicrobial activity of crude extracts from the hemolymph, by testing inhibition of microbial growth plate area, and this analysis was observed inhibition of growth of B. subtilis with the hemolymph extract from larvae challenged with B. subtilis. This is the first analysis of proteomic profile of hemolymph of a major agricultural pest, which verified the expression of some proteins with several functions and four related proteins immune response. These results contribute to the understanding of the immune system D. saccharalis under condition of infection. / Diatraea saccharalis é um importante inseto praga da cana-de-açúcar e de outras culturas agrícolas, por isso, tem sido foco de pesquisas. De uma forma geral, os insetos apresentam sistema imunológico inato, que os provêm com uma gama de respostas imunológicas contra microrganismos. Inúmeros peptídeos antimicrobianos têm sido isolados e caracterizados a partir de insetos modelo, como Bombyx mori e Drosophila melanogaster. Em larvas de 5º ínstar de Diatraea saccharalis já foi reportada uma proteína da família Gloverina com atividade antimicrobiana. Considerando estes fatos, os objetivos deste trabalho foram determinar o perfil de proteínas da hemolinfa de larvas de Diatraea sacharalis em 5º ínstar desafiadas com Escherichia coli (ATCC 11224) e Bacillus subtilis (ATCC 6623), identificar proteínas e polipeptídios diferencialmente expressos através da análise dos dados proteômicos, e verificar a atividade antimicrobiana do extrato bruto em placas por meio da inibição do crescimento microbiano. Foram extraídas proteínas da hemolinfa de larvas de D. sacharalis desafiadas e de não desafiadas. As amostras foram quantificadas e submetidas à eletroforese bidimensional (2-DE) para obtenção de um perfil proteômico da hemolinfa nativa, de larvas desafiadas por E. coli e B. subtilis. Cada gel apresentou em média 300 spots protéicos e 92 destes spots eram correspondentes nos géis nas três condições. Foram retirados 41 spots protéicos diferentes dos géis, estes spots foram digeridos com tripsina e analisados por espectrometria de massas do tipo Maldi-ToF/ToF. Nesta análise, foi possível identificar 10 proteínas a partir dos espectros MS e MS/MS. Entre elas, proteínas que foram expressas pela indução com ambas as bactérias, como a quitinase, e os peptídeos antimicrobianos: proteina homóloga à turandot A (turandot A like-protein), proteina homóloga à Atacina (Attacin like-protein), proteína homóloga de reconhecimento de peptideoglicano. Outro peptídeo antimicrobiano encontrado, o homólogo à &#946;-defensina (&#946;-defensin like-protein), foi induzido somente na hemolinfa das larvas desafiadas por B. subtilis. Uma proteína homológa á Ciclofilina (Cyclophilin like-protein) foi encontrada na hemolinfa da larvas desafiadas e não-desafiadas. Além disso, também foram encontradas proteínas com atividade de eclosão, hidrolítica, não caracterizada e proteína hipotética com função desconhecida. Adicionalmente, foi também testada a atividade antimicrobiana dos extratos brutos da hemolinfa, pelo ensaio de zona de inibição do crescimento microbiano em placa, e nesta análise, foi verificada a inibição do crescimento de B. subtilis com o extrato da hemolinfa de larvas desafiadas com B. subtilis. Esta é a primeira análise do perfil proteômico da hemolinfa de uma importante praga agrícola, na qual verificou-se a expressão de algumas proteínas com funções diversas e quatro proteínas relacionadas a resposta imunulógica. Estes resultados contribuem para a compreensão do sistema imunológico da D. saccharalis sob condição de infecção.

Made available in DSpace on 2017-07-10T13:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Iara _Fernanda Rocha (1).pdf: 1203704 bytes, checksum: 3b3c626c8325feae1cf11ce8968fd774 (MD5) Previous issue date: 2015-12-03 / SIM (não especificado) / Diatraea saccharalis is an important insect pest of sugarcane and other crops, so it has been the focus of research. In general, the insects present innate immune system, which come with a range of immune responses against microorganisms. Many antimicrobial peptides have been isolated and characterized from model insects such as Drosophila melanogaster and Bombyx mori. In the 5th instar larvae of Diatraea saccharalis has already been reported a protein of Gloverin family with antimicrobial activity. Considering these facts, the objectives of this study were to determine the protein profile of hemolymph larvae from Diatraea sacharalis at 5th instar challenged with Escherichia coli (ATCC 11224) and Bacillus subtilis (ATCC 6623), identify differentially expressed proteins and polypeptides by analyzing the proteomic data, and verifying the antimicrobial activity of crude extract on plates by inhibition of microbial growth. Proteins from the hemolymph of larvae of D. sacharalis challenged and unchallenged were extracted. The samples were quantified and subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE) to obtain a proteomic profile of native hemolymph, challenged by E. coli and B. subtilis. Each gel showed an average of 300 protein spots and 92 spots were correspondents in these gels on three conditions. Were taken 41 different protein spots from gels, these spots were digested with trypsin and analyzed by mass spectrometry of the type MALDI-TOF/TOF. In this analysis, it was possible to identify 10 proteins from MS and MS/MS spectra. Among these proteins were expressed by induction with both bacteria such as chitinase and antimicrobial peptides: protein homologous to the turandot (turandot the like-protein), protein homologous to attacin (Attacin like-protein), and protein homologous peptidoglycan recognition. Another antimicrobial peptide was found, the homologous to β-defensin (β-defensin-like protein), induced only in the hemolymph of the larvae challenged by B. subtilis. A homologous protein Cyclophilin (Cyclophilin-like protein) was found in the hemolymph of larvae challenged and non-challenged. In addition, were also found proteins with hatching activity, hydrolytic not characterized and hypothetical protein of unknown function. Additionally, it also tested the antimicrobial activity of crude extracts from the hemolymph, by testing inhibition of microbial growth plate area, and this analysis was observed inhibition of growth of B. subtilis with the hemolymph extract from larvae challenged with B. subtilis. This is the first analysis of proteomic profile of hemolymph of a major agricultural pest, which verified the expression of some proteins with several functions and four related proteins immune response. These results contribute to the understanding of the immune system D. saccharalis under condition of infection. / Diatraea saccharalis é um importante inseto praga da cana-de-açúcar e de outras culturas agrícolas, por isso, tem sido foco de pesquisas. De uma forma geral, os insetos apresentam sistema imunológico inato, que os provêm com uma gama de respostas imunológicas contra microrganismos. Inúmeros peptídeos antimicrobianos têm sido isolados e caracterizados a partir de insetos modelo, como Bombyx mori e Drosophila melanogaster. Em larvas de 5º ínstar de Diatraea saccharalis já foi reportada uma proteína da família Gloverina com atividade antimicrobiana. Considerando estes fatos, os objetivos deste trabalho foram determinar o perfil de proteínas da hemolinfa de larvas de Diatraea sacharalis em 5º ínstar desafiadas com Escherichia coli (ATCC 11224) e Bacillus subtilis (ATCC 6623), identificar proteínas e polipeptídios diferencialmente expressos através da análise dos dados proteômicos, e verificar a atividade antimicrobiana do extrato bruto em placas por meio da inibição do crescimento microbiano. Foram extraídas proteínas da hemolinfa de larvas de D. sacharalis desafiadas e de não desafiadas. As amostras foram quantificadas e submetidas à eletroforese bidimensional (2-DE) para obtenção de um perfil proteômico da hemolinfa nativa, de larvas desafiadas por E. coli e B. subtilis. Cada gel apresentou em média 300 spots protéicos e 92 destes spots eram correspondentes nos géis nas três condições. Foram retirados 41 spots protéicos diferentes dos géis, estes spots foram digeridos com tripsina e analisados por espectrometria de massas do tipo Maldi-ToF/ToF. Nesta análise, foi possível identificar 10 proteínas a partir dos espectros MS e MS/MS. Entre elas, proteínas que foram expressas pela indução com ambas as bactérias, como a quitinase, e os peptídeos antimicrobianos: proteina homóloga à turandot A (turandot A like-protein), proteina homóloga à Atacina (Attacin like-protein), proteína homóloga de reconhecimento de peptideoglicano. Outro peptídeo antimicrobiano encontrado, o homólogo à β-defensina (β-defensin like-protein), foi induzido somente na hemolinfa das larvas desafiadas por B. subtilis. Uma proteína homológa á Ciclofilina (Cyclophilin like-protein) foi encontrada na hemolinfa da larvas desafiadas e não-desafiadas. Além disso, também foram encontradas proteínas com atividade de eclosão, hidrolítica, não caracterizada e proteína hipotética com função desconhecida. Adicionalmente, foi também testada a atividade antimicrobiana dos extratos brutos da hemolinfa, pelo ensaio de zona de inibição do crescimento microbiano em placa, e nesta análise, foi verificada a inibição do crescimento de B. subtilis com o extrato da hemolinfa de larvas desafiadas com B. subtilis. Esta é a primeira análise do perfil proteômico da hemolinfa de uma importante praga agrícola, na qual verificou-se a expressão de algumas proteínas com funções diversas e quatro proteínas relacionadas a resposta imunulógica. Estes resultados contribuem para a compreensão do sistema imunológico da D. saccharalis sob condição de infecção.

CARVALHO, Edirsana Maria Ribeiro de. Quantificação e identificação de Vibrio spp. na hemolinfa de camarões Litopenaeus vannamei cultivados em fazendas no Estado do Ceará. 2009. 89 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Engenharia de Pesca, Fortaleza-CE, 2009 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-12T14:11:24Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_emrcarvalho.pdf: 2284309 bytes, checksum: 922a46195a8b0319c114f69b1a9eefd9 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-12T14:11:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_emrcarvalho.pdf: 2284309 bytes, checksum: 922a46195a8b0319c114f69b1a9eefd9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-12T14:11:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_emrcarvalho.pdf: 2284309 bytes, checksum: 922a46195a8b0319c114f69b1a9eefd9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Most of shrimp bacterial infections are caused by Vibrio bacteria genus. This study aims to quantify identify Vibrio in the hemolymph of the marine shrimp Litopenaeus vannamei cultivated in farms in State of Cear, Brazil. Related is also the time of coagulation of hemolymph with counts of Vibrio. Sixteen samples were performed on four farms (A, B, C and D), eight shrimps with 4 g, and eight with eight grams shrimps. The collections were made in seasonal periods: rainy and drought. A total of 480 samples, and 240 to shrimps with 4 g and 8 g each, respectively. The values in the Standard Plate Count (SPC) of total vibrio, Vibrio Suc+ and Suc- in the hemolymph of shrimp samples with 4 g, in the rainy season ranged from: 2. 74 x 10⁴ to 28.70 x 10⁶ CFU/mL (est.), <6.0 to 14.64 x 106CFU/mL and <6.0 to 12.72 x 106 CFU/mL, respectively. For hemolymph of shrimp with 8 g of the SPC and the total Vibrio Suc+ and Sucranged from 1.68 x 10⁴ to 15.18 x 10⁶ CFU/mL (est.), <6.0 to 1.8 x 105 CFU/mL and <6.0 to 15.18 x 106CFU/mL (est). During the period of drought for these values of shrimp haemolymph of four grams, were: 9.0 x 10² (est.) to 5.40 x 104 CFU mL total Vibrio, <6.0 to 1.71 x 10⁴CFU/mL (Suc-) and <6.0 to 5.40 x 104 CFU/mL (Suc+). For shrimp with 8 g a total Vibrio count was 9.0 x 10² (est.) CFU/mL to 2.0 x 10⁷, <6.0 to 4.02 x 106 CFU/mL (Suc-) and <6.0 to 2.0 x 10⁷CFU/mL (est.) (Suc+). The results show that the rates of colonies of Vibrio Suc- and Suc+ were higher in the rainy season than in the drought. There was no relationship between the time of coagulation and the counts of Vibrio in the hemolymph of shrimps. The species that predominated in the period were: V. coralliilyticus, V. parahaemolyticus, Vibrio pelagius II, Vibrio alginolyticus, Vibrio mediterranei, Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus B1 / As infecções bacterianas em camarões são causadas, freqüentemente, por bactérias do gênero Vibrio O presente estudo teve por objetivo quantificar e identificar Vibrio na hemolinfa do camarão marinho Litopenaeus vannamei cultivado em fazendas no Estado do Ceará, Brasil. Relacionou-se também o tempo de coagulação das hemolinfas com as contagens de Vibrio. Foram realizadas 16 coletas em quatro fazendas (A, B, C e D), sendo oito para camarões com 4 g, e oito para camarões com oito gramas. As coletas foram realizadas nos períodos sazonais: chuvoso e estiagem. Perfazendo um total de 480 amostras, sendo 240 para camarões com 4 g e 8 g cada, respectivamente. Os valores da Contagem Padrão em Placas (CPP) de víbrios totais, de víbrios Sac+ e Sac-, nas amostras de hemolinfa dos camarões com 4g, no período chuvoso, variaram de: 2,74 x 104 a 28,70 x 106 UFC/mL (est.); de < 6,0 a 14,64 x 106UFC/mL e de < 6,0 a 12,72 x 106 UFC/mL, respectivamente. Para a hemolinfa dos camarões com 8 g os valores obtidos foram: 1,68 x 104 a 15,18 x 106 UFC/mL (est.), de < 6,0 a 1,8 x 105 UFC/mL e de < 6,0 a 15,18 x 106UFC/mL (est.), respectivamente. No período de estiagem esses valores para a hemolinfa dos camarões de quatro gramas, foram: 9,0 x 102 (est.) a 5,40 x 104 UFC/mL víbrio total; < 6,0 a 1,71 x 10⁴UFC/mL (Sac–) e de < 6,0 a 5,40 x 104 UFC/mL (Sac+). Para os camarões com 8 g a contagem de Víbrio total foi de 9,0 x 102 (est.) a 2,0 x 107, de < 6,0 a 4,02 x 106 UFC/mL (Sac-) e de < 6,0 a 2,0 x 10⁷ UFC/mL (est.) (Sac +). Os resultados mostram que os índices de colônias de Vibrio Sac- e Sac+ foram maiores no período chuvoso do que no de estiagem. Não houve relação entre o tempo de coagulação e as contagens de Vibrio na hemolinfa dos camarões. As espécies que predominaram nos períodos estudados foram: V. coralliilyticus, V. parahaemolyticus, Vibrio pelagius II, Vibrio alginolyticus, Vibrio mediterranei, Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus B1.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-08-01T15:49:41Z No. of bitstreams: 1 Andrea Barretto.pdf: 465481 bytes, checksum: 80d81c9df4236400373841c9117f86d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-01T15:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrea Barretto.pdf: 465481 bytes, checksum: 80d81c9df4236400373841c9117f86d9 (MD5) Previous issue date: 2009-02-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The study of blood cells, also known as hematology, has become for aquaculture a valuable tool in understanding the physiological changes that occur in organisms, however the shrimp, there is still much to discover about if the hemolymph. Considering the above objective of this work: to evaluate the effectiveness of the anticoagulant sodium citrate (10%) in blood tests, to check the influence of cooling on the total count of hemocytes (CTH), haematological data correlate with the presence of Vibrio in the hemolymph, to identify the influence of age and seasonality in the total count of haemocytes in shrimp Litopenaeus vannamei. The species were caught shrimp Litopenaeus vannamei from two nurseries of land (A and B) of mariculture Santa Cruz, located in the city of Goiana-PE. The collections are made weekly, for two cycles of cultivation (dry season and rainy season). It is the examination fresh (macro and microscopic) in all animals sampled. The total counts of hemocytes (cells/mm3) were performed immediately after collection and after five hours of chilling in a Neubauer chamber. Immediately after the counting, the samples intended for bacteriological analysis were transported in temperature to the laboratory of health of aquatic animals (LASAq), Universidade Federal Rural de Pernambuco. The data concerning the influence of cooling on the hemocytes were analyzed using the techniques of mathematical modeling (P <0.05), however the data for the bacteriological analysis,examining changes in the fresh and CTH, the shrimps were divided into four groups: cameroon with injury and with bacteria (CLCB), with injury and without bacteria (CLSB) without injury and with bacteria (SLCB) and without injury and without bacteria (SLSB). The results were submitted to analysis of variance (ANOVA) and when significant, the Tukey test for comparison between means, is adopting a significance level of 5%. At the end of the research concluded that the anticoagulant sodium citrate only adequately preserves the hemolymph of the shrimp Litopenaeus vannamei to CTH performed immediately after collection, and the CTH is not associated with the presence of Vibrio spp and examination with lesions detected in the fresh and therefore not a good tool for immediate recognition of changes in the health of marine shrimp Litopenaeus vannamei. / O estudo das células sanguíneas, também chamado como hematologia, vem se tornando para a aqüicultura um precioso instrumento no conhecimento das alterações fisiológicas que ocorrem nos organismos, no entanto na carcinicultura, ainda há muito que se desvendar a respeito da hemolinfa. Diante do exposto objetivou-se com este trabalho: avaliar a eficácia do anticoagulante citrato de sódio (10%) nas análises hematológicas, verificar a influência da refrigeração sobre a contagem total de hemócitos (CTH), correlacionar os dados hematológicos com a presença de vibrio na hemolinfa, identificar a influencia da idade e da sazonalidade na contagem total de hemócitos em camarões Litopenaeus vannamei. Foram capturados camarões da espécie Litopenaeus vannamei provenientes de dois viveiros de terra (A e B) da Maricultura Santa Cruz, situada no município de Goiana- PE. As coletas se deram semanalmente, durante dois ciclos de cultivo (período seco e período chuvoso). Procedeu-se o exame a fresco (macro e microscópico) em todos os animais amostrados. As contagens totais de hemócitos (células/mm3) foram realizadas imediatamente após a coleta e depois de cinco horas após a refrigeração, em câmara de Neubauer. Imediatamente após a realização das contagens, as amostras destinadas para as análises bacteriológicas foram transportadas, em temperatura ambiente, para o laboratório de Sanidade de Animais Aquáticos (LASAq) da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Os dados referentes a influencia da refrigeração sobre os hemócitos foram analisados utilizando-se as técnicas de modelagens matemáticas (P < 0,05), no entanto os dados referentes àsanalises bacteriológicas, alterações no exame a fresco e CTH, os camarões foram distribuídos em quatro grupos: camarões com lesão e com bactéria (CLCB), com lesão e sem bactéria (CLSB), sem lesão e com bactéria (SLCB) e sem lesão e sem bactéria (SLSB). Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e, quando significativos, ao teste de Tukey, para comparação entre as médias, adotando-se o nível de significância de 5%. Ao término da pesquisa concluímos que o anticoagulante citrato de sódio somente preserva adequadamente a hemolinfa do camarão Litopenaeus vannamei para a CTH realizada imediatamente após a coleta, e que a CTH não está associada com a presença de Vibrio spp e com lesões detectadas no exame a fresco, e portanto, não é uma boa ferramenta para a constatação imediata de alterações na saúde dos camarões marinhos Litopenaeus vannamei.