COSTA, R. A. Bioatividade in vitro de extratos etanólicos de sementes de Moringa oleifera frente a estirpes de Vibrio portadoras de fatores de virulência e resistentes a antimicrobianos, isoladas da hemolinfa do camarão Litopenaeus vannamei. 2011. 102 f. Tese (Doutorado em Engenharia de Pesca) - Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-20T20:23:11Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_racosta.pdf: 1305999 bytes, checksum: 11762dc7bce1ed50c5a3cf3dfbb995ef (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-11-24T23:21:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_racosta.pdf: 1305999 bytes, checksum: 11762dc7bce1ed50c5a3cf3dfbb995ef (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-24T23:21:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_racosta.pdf: 1305999 bytes, checksum: 11762dc7bce1ed50c5a3cf3dfbb995ef (MD5) Previous issue date: 2011 / The search for antibacterial agents may provide alternative therapy for outbreaks of bacterial etiology that represents a risk to the development of aquaculture activities. Thus, the research aimed to evaluate the in vitro bioactivity of the Moringa oleifera seeds extracts against isolated vibrios from the Litopenaeus vannamei hemolymph. The profiles related to antibiotic resistance and exoenzyme expression associated to virulence factors were determined as criteria for antibacterial activity assays. One hundred strains of Vibrio were isolated and phenotypically identified, with the predominance of V. navarrensis (53%), V. brasiliensis (15%) and V. parahaemolyticus (10%). The expression of at least one exoenzyme was detected in all isolates (n = 100). It was found a percentage of phospholipase and lipase positive strains of 94 and 58%, respectively. Thirty-eight strains produced β-hemolysis on sheep blood. The ability to hydrolyze casein, gelatin and elastin was observed in 96%, 80% and 35% of vibrios, respectively. It was observed a high antibiotic resistance index (75%), with following phenotypic profiles: monoresistance (n = 42), cross-resistance to β-lactams (n = 20) and multiple resistance (n = 13). The antibacterial activity tests indicated bioactivity from the MOS-E and MOS-ES against 92% and 90% of strains tested, respectively. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of MOS and MOS-E-ES able to inhibit the growth of most strains was of 32 μg mL-1. The screening of bioactive compounds revealed that only a fraction of ethyl acetate from both extracts demonstrated antibacterial effect, which made possible the isolation of the vibriocidal substances niazirine and niazimicine. / A prospecção de agentes antibacterianos pode fornecer alternativa terapêutica para epizootias de etiologia bacteriana que representam risco para o desenvolvimento de atividades aqüícolas. Considerando essa assertiva, o presente estudo teve como objetivo a avaliação da bioatividade in vitro de extratos de sementes de Moringa oleifera contra víbrios isolados da hemolinfa do camarão Litopenaeus vannamei. Como critérios de seleção para os testes de atividade antibacteriana, foram determinados perfis relacionados à resistência a antimicrobianos e à expressão de exoenzimas associadas a fatores virulentos. Foram isoladas e identificadas fenotipicamente 100 cepas de Vibrio, verificando-se predominância das espécies de V. navarrensis (53%), V. brasiliensis (15%) e V. parahaemolyticus (10%). Todas as cepas testadas (n = 100) foram capazes de expressar pelo menos uma exoenzima. As atividades fosfolipolítica e lipolítica foram verificadas em 94% e 58% das cepas, respectivamente. Trinta e oito estirpes produziram β–hemólise em sangue de ovelha. A habilidade em hidrolisar caseína, gelatina e elastina foi observada em 96%, 80% e 35% dos víbrios, respectivamente. O perfil fenotípico de susceptibilidade a antimicrobianos revelou um elevado índice de resistência (75%). Foram observados perfis de monoresistência (n = 42), resistência cruzada a β-lactâmicos (n = 20) e multiresistência (n = 13). No que se refere à atividade antibacteriana, os extratos obtidos por extração com etanol a frio (MOS-E) e a quente (MOS-ES) mostram-se bioativos contra 92% e 90% das cepas testadas, respectivamente. A Concentração Inibitória Mímima (CIM) de MOS-E e MOS-ES mais eficiente contra o maior percentual de estirpes foi a de 32 µg mL-1. A triagem bioguiada de compostos bioativos revelou que a fração acetato de etila de ambos os extratos foi à única que apresentou atividade antibacteriana. A partir do fracionamento cromatográfico da fração supracitada, isolaram se as substâncias vibriocidas niazirina e niazimicina.

Resumo: No Paraná, ocorrem apenas quatro espécies de aranhas do gênero Loxosceles: L. gaucho, L. laeta, L. hirsuta e L. intermedia, sendo essa ultima espécie a mais abundante em Curitiba-PR e região metropolitana. Essas aranhas também são conhecidas como aranhas-marrons devido a sua coloração que varia de marrom claro a marrom escuro. Atualmente, acidentes com aranha-marrom é um problema de saúde publica devido aos inúmeros casos de envenenamento. O veneno dessas aranhas já foi caracterizado e diversas toxinas foram estudadas. Contudo, a hemolinfa de Loxosceles nunca foi pesquisada e de forma geral a hemolinfa de artrópodes é pouco investigada. Hemolinfa de diferentes animais tem sido alvo de estudos que envolvem diversas aplicações biotecnológicas, tais inibição de proteases e aplicação dos peptídeos antimicrobianos nas áreas médicas. Portanto, esse trabalho teve como objetivo determinar as características bioquímicas e biológicas da hemolinfa da aranha-marrom L. intermedia. A hemolinfa de L. intermedia apresentou um perfil proteico com amplo espectro de proteínas. O componente proteico mais representativo foi identificado na região de 66 kDa. Alguns autores mostraram que essa região refere-se às subunidades de hemocianina, que é a proteína mais abundante na hemolinfa dos artrópodes. Além disso, o perfil proteico apresentou outras duas bandas bem características da hemolinfa de outros artrópodes em 116 e 97 kDa. O perfil em gel 2D revelou que as proteínas totais da hemolinfa de L. intermedia estão distribuídas principalmente na faixa de pH ácido e neutro. A análise lipídica da hemolinfa foi realizada através de HPTLC e foram identificados fosfolipídios como fosfatidilcolina, fosfatidil-inositol e fostatidiletanolamina. Os esteróis identificados nesse trabalho foram colesterol, ergosterol e triacilglicerol; e não foram identificados glicolipídios. O perfil de glicosilação proteica foi avaliado através de Lectin Blot e as proteínas totais da hemolinfa de L. intermedia apresentaram resíduos de alta manose e N-acetilglucosamina. Não foram identificados resíduos de ácido siálico, corroborando com dados de glicosilação de toxinas do veneno dessa mesma aranha. Através de microscopia de luz foram identificados pró-hemócitos, que são células precursoras dos outros tipos celulares. Também foi constatada a presença de plasmatócitos e granulócitos, que são células envolvidas na imunidade inata, realizando fagocitose, nodulação, encapsulação e melanização. Esse trabalho foi o primeiro a estudar a hemolinfa da aranha-marrom caracterizando o perfil proteico, lipídico e de glicosilação de seus componentes. Além disso, a fração celular também foi investigada e diferentes hemócitos identificados. Dessa forma esse estudo inicia uma nova linha de pesquisa no estudo de Loxosceles, ampliando o conhecimento e as fontes naturais de moléculas bioativas com potenciais biotecnológicos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:41:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 251554.pdf: 746920 bytes, checksum: 54e0a681ee69d3d314a965422c51f830 (MD5)

NASCIMENTO, Carine Belarmino do. Variações de temperatura e salinidade do meio e seus efeitos no processo de osmorregulação da lagosta Panulirus argus (Latreille, 1804). 2015. 82 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Agrícola)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-19T19:05:54Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_cbnascimento.pdf: 1815598 bytes, checksum: ed67ab3c622d0f089ca438dcff73d0b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-23T20:22:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_cbnascimento.pdf: 1815598 bytes, checksum: ed67ab3c622d0f089ca438dcff73d0b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T20:22:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_cbnascimento.pdf: 1815598 bytes, checksum: ed67ab3c622d0f089ca438dcff73d0b5 (MD5) Previous issue date: 2015 / The lobster Panulirus Argus, for decades, is the most important fishing resource in the Northeast. However, due to the sharp fishing effort, the stocks are currently over-exploited.One solution would be the development of technological packages which make easy the growth of this species in captivity. The place where the lobsters live appears to be the definition of comfort based on the environmental context, when we analyze the environmental characteristics due to the comfort zone of cultivated species. The objective of this work was to evaluate the mixed effect of differents temperature and salinity in controlled laboratory environments by determining and interpreting the osmolality of the hemolymph of Panulirus argus lobster. The study was developed at the Center for Studies in Aquaculture Coast Sea Institute of Sciences of the Federal University in Ceará between April 2014 to January 2015. Lobsters were evaluated (both sexes) when they were abruptly submited to varying conditions of temperature and salinity for a continuous period about three hours. The experiment was achieved in two steps, based on each of the set temperatures, respectively 22°C and 28°C.Combined effects of temperature with different salinities (15‰, 20‰, 25‰, 30‰, 35‰,40‰) were checked with a total of four repetitions for each tested salinity. The temperature were monitored, dissolved oxygen, pH, salinity and animal behavior as mobility and acceptance of food. It was observed there were significant differences (p <0.05) in Osmoregulatory behavior of Argus Panulirus lobsters that live in environments in terms of different salinities and the animals submited seawater around osmolality 1127 mOsm (40 %) to 22 ° C and 1081 mOsm (40 %) to 28 ° C were possibly in comfort situation. Despite the significant absence (p> 0.05) of the variation of osmolality of the hemolymph following the two temperatures tested in selected animals to the same salinity, it is clear that individuals kept at a temperature of 22 ° C results showed 100% survival when exposed to salinity of 20 ‰ considered lethal for lobsters. When these animals are submited bruptly to salinity of 15 % in these two temperatures tested showed 100 % mortality in the first three hours of exposure.The physical and chemical parameters , oxygen and pH of the water remained normal standards regarding lobster Panulirus Argus maintained in the laboratory. / A lagosta Panulirus argus, há décadas, é o recurso pesqueiro mais importante da região Nordeste. No entanto, devido ao acentuado esforço de pesca, os estoques atualmente se encontram sobre-explorados. Uma solução seria o desenvolvimento de pacotes tecnológicos que viabilizassem o crescimento dessa espécie em cativeiro. A ambiência surge como sendo a definição de conforto baseada no contexto ambiental, quando se analisa as características de meio ambiente em função da zona de conforto das espécies cultivadas. Objetivou-se nesse trabalho avaliar o efeito combinado de diferentes temperaturas e salinidades em ambientes controlados de laboratório através da determinação e interpretação da osmolalidade da hemolinfa da lagosta Panulirus argus. O estudo foi realizado no Centro de Estudos emAquicultura Costeira do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará entre os períodos de abril de 2014 a janeiro de 2015. Foram avaliadas lagostas de ambos os sexos quando as mesmas foram submetidas abruptamente a condições variadas de temperatura e salinidade por um período contínuo de três horas. O experimento foi realizado em duas etapas, tendo como base cada uma das temperaturas estabelecidas, respectivamente 22°C e 28°C. Efeitos combinados das temperaturas com diferentes salinidades (15‰, 20‰, 25‰, 30‰, 35‰, 40‰) foram testados, com um total de quatro repetições para cada salinidade testada. Foram monitorados oxigênio dissolvido, temperatura, pH, e salinidade. Observou-se que existiram diferenças significativas (p<0,05), no comportamento osmorregulatório das lagostas Panulirus argus que habitam ambientes distintos em termos de salinidades e que os animais submetidos à osmolalidade de água do mar em torno de 1127 mOsm (40‰) para a temperatura de 22°C e 1081 mOsm (40‰) para a temperatura de 28°C estavam possivelmente em situação de maior conforto. Apesar da ausência significativa (p>0,05) da variação da osmolalidade da hemolinfa em função das duas temperaturas testadas em animais selecionados a uma mesma salinidade, percebe-se que indivíduos mantidos na temperatura de 22°C apresentaram resultados de 100% de sobrevivência quando expostos a salinidades de 20‰ consideradas letais para as lagostas. Animais submetidos abruptamente à salinidade de 15‰ nas duas temperaturas testadas apresentaram 100% de mortalidade nas três primeiras horas de exposição. Os parâmetros físico-químicos, oxigênio e pH da água mantiveram-se dentro dos padrões da normalidade em relação à lagosta P. argus mantida em laboratório.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-13T13:16:28Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Camila Daniela dos Santos Lima.pdf: 845528 bytes, checksum: bc275312cb51faff1db8ee976c3b9d47 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-13T13:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Camila Daniela dos Santos Lima.pdf: 845528 bytes, checksum: bc275312cb51faff1db8ee976c3b9d47 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / CNPq; FACEPE; PROPESQ-UFPE; CAPES / A prodigiosina é um metabólico secundário de Serratia marcescens com diversas aplicações farmacêuticas, agrotóxicas e antitumorais. Este trabalho teve como objetivo avaliar a ação genotóxica da prodigiosina em células somáticas do organismo-modelo Drosophila melanogaster. Esta espécie se destaca por oferecer características semelhantes ao genótipo humano e por ser capaz de proporcionar um ambiente genético seguro e muito bem conhecido para a observação do possível efeito danoso (potencial genotóxico) da Prodigiosina. Foram analisados hemócitos obtidos das larvas de D. melanogaster, em terceiro estágio de desenvolvimento, expostas ao metabólito adicionado ao meio de cultivo, nas concentrações de 2, 5 e 10μM/mL. O Ensaio Cometa foi empregado para a avaliação dos danos genômicos nas células da hemolinfa, que ocorreu em todas as concentrações testadas. Duas abordagens diferentes foram empregadas para a avaliação dos resultados: a suposta ação seletiva da prodigiosina, sobre células normais; e a ação inseticida da mesma. Com relação à ação genotóxica em ambas as abordagens, a prodigiosina se mostrou um potente agente de danos genômicos.

Orientador: Eliana Maria Zanotti-Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T06:14:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Allegretti_SilmaraMarques_D.pdf: 7173440 bytes, checksum: a0d4e606aad825810e374339d5ed7dce (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Este trabalho teve por objetivo verificar a ação da inoculação de hemolinfa total, hemolinfa livre de células e suspensão dc amebócitos no desenvolvimento do /..__. mansoni da linhagem BH em B. g/abrata melânica. Os parâmetros avaliados foram: taxa de infecção, taxa de mortalidade, período pré-patente, reação tecidual em tomo das larvas de S. mansoni, atividade fagocitária dos amebócitos e nÚmero de amebócitos na hemolintà. Para a determinação da taxa de infecção, taxa de mortalidade, período pré-patente, atividade fagocitária e número de amebócitos circulantes os moluscos foram infectados com 10 miracídios do tremalódeo. A reação tecidual foi observada em moluscos expostos a 100 miracídios. Os resultados indicaram que, a inoculação de hemolintà total provocou a facilitação da infecção observando-se diminuição do período pré-patente, aumento da taxa de mortalidade, pequena atividade fagocitária dos amebócitos e discreta reação amebocitária em tomo do esporocisto de ,)_. mansoni. A inoculação de hemolintà livre de células provocou um retardamento do desenvolvimento do parasita com o aumento do período pré-patente, e reação tecidual mais intensa em tomo do esporocisto de S. mansoni. A inoculação de suspensão de amebócitos produziu uma reação mais efetiva contra o parasita com aumento do período pré-patente, diminuição da mortalidade dos moluscos, aumento da atividade fagocitária, aumento das células estreladas na hemolinfa circulante e aumento das reações amebocitárias no tecido em tomo dos csporocistos. A inoculação de suspensão de células produziu maior resistência ao desenvolvimento do S. mansoni. / Abstract: The main purpose of this work was to verify the effects from the inoculation of diftercnt kinds of hemolymph on the development of SdÚS/OSOlIIll IIIlf/l lli in pigmcnted Biomphalaria glahrata. The S. mansoni belongs to the BH strain. The types of hemolymph were: complete hemolymph, cells-fTee hemolymph and amoebocyte suspenslOn. In order to achieve our purpose the following variables vere considered: intection rate, death rate, pre-patent period, tissue reactions arollnd S mansoJli larval, phagocytosis activity and number of amoebocytes in the circlIlation hemolymph R. [;/ahrala snail were infected with 10 miracidia trom the trematodes. The tissue reaction was observed on the snails that were exposed to 100 miracidia. The results have indicated that the inoculation of the complete hemolymph facilitated the infection with decrease on the pre-patent period as well as the increase on the death rate little phagocytosis activity on the amoebocytes and slight reaction around sporocyst of the S. mansoni. The inoculation of cells-tl'ee hemolymph postponed the parasite development with the increase of the pre-patent period and more intense tissue reaction arollnd sporocyst of S. mansoni. The inoculation of the amoebocytes slIspcnsion caused a more ctrcctive reaction against the parasite with the increase the pre-patent period, the decrease snails mortality, the increase phagocytosis activity the increase 01' granulocytes in the circulating hemolymph and the increase of amoebocytes reactions around sporocysts of S mansoni. The inoculation of the amoebocytes suspension produccd greater resistance to the S. mansoni development. / Doutorado / Parasitologia / Mestre em Ciências Biológicas

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T04:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 282466.pdf: 9853650 bytes, checksum: bbea26b8767078edc352a095e4d16200 (MD5) / Crustinas são peptídeos antimicrobianos que integram o sistema imune inato dos crustáceos e atuam na defesa destes animais contra infecções, juntamente com outras moléculas imunoefetoras presentes na hemolinfa. O objetivo do presente trabalho foi clonar e expressar, em sistema heterólogo, uma crustina do camarão nativo Farfantepenaeus paulensis para avaliar sua atividade antimicrobiana e produzir anticorpos policlonais para imunolocalizar este peptídeo nas diferentes populações de hemócitos deste peneídeo, assim como em diferentes grupos de crustáceos. Por abordagem molecular, foi possível clonar uma sequência gênica correspondente a uma crustina, com características do subgrupo da crustina I, que denominamos de crusFpau2. A crusFpau2 apresentou 94% de homologia com a única isoforma já descrita em F. paulensis (crusFpau). Esta nova isoforma caracteriza-se por apresentar uma região N-terminal rica em resíduos de glicina, além da região C-terminal com doze resíduos conservados de cisteína, onde se encontra um domínio WAP (whey acidic protein). A crusFpau2 foi expressa em E. coli BL21(DE3)pLysS com peso molecular de 17,3 kDa e foi utilizada para avaliar sua atividade antimicrobiana e produzir anticorpos policlonais em camundongo. A crustina recombinante mostrou-se ativa contra a bactéria Micrococcus luteus. Através de imunomarcação foi possível determinar que as crustinas são produzidas de forma constitutiva apenas nos hemócitos granulares (HGs) de F. paulensis, sendo armazenadas em seus grânulos. Aparentemente, estas proteínas não são processadas no interior dos grânulos e não são secretadas para a hemolinfa. Os anticorpos produzidos contra a crusFpau2 recombinante foram ainda capazes de reconhecer especificamente crustinas nos hemócitos granulares de outros grupos de crustáceos (Litopenaeus vannamei, Macrobrachium potiuna e Callinectes sapidus), mas não no mexilhão marinho Perna perna. Estes resultados sugerem que as crustinas são peptídeos de ocorrência geral em crustáceos. Este é o primeiro trabalho que produziu um peptídeo antimicrobiano a partir de uma espécie nativa brasileira de crustáceos marinhos, além de produzir os primeiros anticorpos contra crustinas até o momento. Estes anticorpos constituem uma ferramenta importante para imunomarcar especificamente populações de hemócitos granulares de crustáceos, além de auxiliar a uma melhor compreensão do sistema imune deste grupo zoológico, que inclui muitas espécies de interesse econômico. Por fim, uma avaliação futura mais detalhada do seu real espectro antimicrobiano poderá revelar o seu potencial promissor como agente terapêutico para aquicultura e saúde humana.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:01:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 223442.pdf: 486908 bytes, checksum: 416277d8611ae8789a29052571a0b516 (MD5) / Os produtos naturais constituem uma fonte inesgotável de compostos com atividades farmacológicas promissoras, incluindo ação antiviral. Os materiais protéicos são encontrados em abundância na natureza e têm atividades biológicas como antibacteriana, antifúngica, antitumoral e antiviral comprovadas. Neste trabalho, a citotoxicidade (CC50) e a atividade antiviral (CE50) de peptídeos antimicrobianos (PAM) e hemolinfa de ostras (Crassostrea gigas e C. rhizophorae), foram avaliadas, em células VERO, HEp-2 e MA104 e contra os vírus herpes simplex tipo 1(HSV-1/KOS), adenovírus sorotipo 5 (AdV-5), rotavírus símio SA-11 (RV-SA11), pelo ensaio colorimétrico do MTT, utilizando diferentes estratégias. Para a hemolinfa das ostras também foi realizado o estudo da ação virucida. Dentre os PAM testados, a peneidina apresentou o maior índice de seletividade (IS= CC50/ CE50) para o HSV-1/KOS (IS = 64). A hemolinfa de ostras apresentou ação virucida contra os três vírus avaliados neste estudo, também apresentando atividade anti-herpértica (IS = 19,76/C. rhizophorae) e antiadenovírus (IS = 5,33/C. gigas), sem, no entanto, exibir ação antiviral contra o rotavírus. Foram observados, em alguns casos, baixos IS, associados a altas porcentagens de inibição da replicação viral, mais evidente no grupo dos PAM. Estudos adicionais devem ser realizados a fim de se confirmar a atividade antiviral e prováveis mecanismos ação.

Orientador : Profª. Drª. Andrea Senff-Ribeiro / Coorientador : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 17/02/2017 / Inclui referências : f. 102-115 / Área de concentração / Resumo: As aranhas do gênero Loxosceles (aranhas-marrons) são responsáveis pela maioria dos acidentes envolvendo animais peçonhentos em Curitiba e região metropolitana, sendo consideradas um problema de saúde pública. O veneno dessas aranhas tem sido amplamente estudado e diversos grupos de pesquisa têm investido na caracterização de suas toxinas. Entretanto, a literatura referente à hemolinfa dessas aranhas é bastante restrita: o único artigo existente foi publicado pelo nosso grupo em 2015. Baseado na premissa de que o conhecimento dos conteúdos celular, lipídico e protéico podem fornecer informações importantes sobre a toxinologia e sobre moléculas bioativas, o objetivo deste trabalho foi a caracterização bioquímica e celular da hemolinfa de L. intermedia, bem como analisar potenciais atividades biológicas da hemolinfa e suas moléculas. O perfil proteico da hemolinfa de L. intermedia em eletroforese (SDS-PAGE) uni e bidimensional revelou a presença de proteínas e peptídeos com massas variando de 20 a 200 kDa. As proteínas da hemolinfa apresentaram os resíduos de glicosilação: galactose ? (1,4) N-acetilglucosamina e alta manose. Por meio de espectrometria de massas foi verificado que os lipídios predominantes na hemolinfa são a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina. Quanto à fração celular da hemolinfa, quatro tipos de hemócitos foram identificados: os pró-hemócitos, os plasmatócitos, os adipohemócitos e os granulócitos. A atividade esfingomielinásica da toxina recombinante fosfolipase-D de L. intermedia (LiRecDT1) foi reduzida em 70% na presença da hemolinfa, contudo não foi encontrado um inibidor específico para essa enzima, sugerindo que essa redução tenha sido decorrente da dificuldade da toxina em encontrar seu substrato preferencial. O ensaio de imunodetecção indicou na hemolinfa a presença de uma proteína de aproximadamente 36 kDA com epítopo similar ao da toxina LiRecDT1, mas a hemolinfa não apresentou toxicidade para camundongos nas concentrações testadas. O cultivo primário dos hemócitos foi realizado em meio Sf-900-III SFM contendo 250 ?g/ml de gentamicina e 10% de soro (SFB). Verificou-se que a incubação dos hemócitos com veneno de L. intermedia e com a toxina loxoscélica recombinante LiRecDT1 não alterou as características morfológicas das células em microscopia optica, sugerindo ausência de processos de apoptose ou necrose. Dificuldades metodológicas não permitiram a caraterização dos hemócitos por microscopia eletrônica de transmissão. O estudo de proteômica (shotgun) não identificou inibidores de proteases ou de outras enzimas presentes no veneno; e grande parte das identificações foram relacionadas a proteínas estruturais e à hemocianina. Os experimentos de citometria de fluxo utilizando a sonda fluorescente Mitotracker permitiram a separação eficiente das populações de pró-hemócitos e plasmatócitos, contudo havia granulócitos nas duas amostras isoladas. Os ensaios de atividade antimicrobiana de peptídeos presentes na hemolinfa isolados por HPLC não evidenciou a inibição do crescimento dos microrganismos Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A hemolinfa é uma amostra biológica muito rica que deve continuar a ser investigada, contudo as dificuldades de estudá-la estão relacionadas com o baixo rendimento da coleta da amostra e a grande complexidade bioquímica do seu conteúdo (celular e proteica). Palavras-chaves: hemolinfa, L. intermedia, hemócitos, antimicrobiano, cultivo primário, inibidores, citometria. / Abstract: Loxosceles genus spiders (Brown spiders) are responsible for most of the accidents involving venomous animals in Curitiba and metropolitan region and for this reason they are considered a public health problem. The venom from these spiders has been widely studied and several research groups have been focused in the characterization of the toxins. However, the literature on the hemolymph from these spiders is rather restricted: the only article was published by our group in 2015. Based on the premise that knowledge of the cellular, lipidic and proteic contents can provide important information about toxinology and bioactive molecules, the aim of this work was biochemical and cellular characterization from L. intermedia hemolymph as well as to analyze potential biological activities present in this hemolymphand yours molecules. The protein from hemolpymph of L. intermedia hemolymph in one and two-dimensional SDS-PAGE revealed the presence of proteins and peptides with molecular mass varying from 20 to 200 kDa. The protein from hemolymph presented glycosylation: galactose ? (1,4) N-acetylglucosamine and high mannose. By means of mass spectrometry analysis was verified the lipidic predominance in the hemolymph are phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. In relation to the hemolymph cellular fraction four types of hemocytes were identified: pro-hemocytes, plasmatocytes, adipohemocytes and granulocytes. The sphingomyelinase activity of L. intermedia recombinase phospholipase-D (LiRecDT1) was decreased 70% In the presence of hemolymph, however, no specific inhibitor to this enzyme was found, suggesting that this reduction was related to difficulty of the toxin to find your preferential substrate. The immunodetection assay indicated there are in the hemolymph a protein with nearly 36 kDa with epitope resembling LiRecDT1, but this protein showed no toxicity to mice at the concentrations tested. The primary culture of hemocytes was done in Sf-900-III SFM medium plus 250 ?g /ml gentamycin and 10% FBS. It was found that the incubation venom from L. intermedia and toxin LiRecDT1with hemocytes did not present morphological alterations in these cells analyzed by optical microscopy, indicated no apoptosis or necrosis. Methodological difficulties did not allow the hemocytes to be characterization by transmission electron microscopy. In proteomic (shotgun) analysis no protease inhibitors or other enzymes present in the venom; and the most of identification were related to structural proteins and hemocyanin. The experiments of flow citometry with MitoTracker probe labeling resulted in the efficient isolation of prohemocytes and plasmatocytes, however there was granulocytes in both of samples isolated. The antimicrobial activity assays of peptides present in hemolymph isolated by HPLC did no show isolated activity against Candida albicans, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Hemolymph is a very rich biological sample that needs to be investigated more thoroughly, but the difficulties of studying it are related to the low amount of sample (cellular and protein). Key-words: Hemolymph, L. intermedia, hemocytes, antimicrobial, primary culture, inhibitors, cytometry.

elevação da expectativa de vida e a diminuição no índice de natalidade têm como consequência o envelhecimento da população mundial, com aumento da incidência de doenças neurodegenerativas. Pessoas acometidas por esses males dispõem atualmente de limitados recursos terapêuticos. Estes muitas vezes são só paliativos, com baixa ou nula perspectiva quanto à reversão dos danos instalados. Por isso, o estudo de substâncias possivelmente neuroprotetoras, que apresentam potencial aplicação como novas drogas, tem sido alvo de pesquisas. Estudos realizados a partir das toxinas produzidas por lagartas da mariposa Lonomia obliqua, as quais têm causado inúmeros acidentes na região Sul do Brasil, identificaram uma proteína presente na hemolinfa com atividade antiapoptótica. A mesma demonstrou provável atuação na manutenção do potencial elétrico de membrana mitocondrial elevado, evitando a morte celular por mecanismo apoptótico. Desta forma, este estudo tem como objetivo avaliar o perfil proteico e efeito da hemolinfa bruta e fração cromatográfica sobre a viabilidade celular de cultura primária de neurônios hipocampais de ratos após a indução de apoptose. Para avaliação do perfil proteico em amostras da hemolinfa bruta e frações de 3 lotes de lagartas de origens distintas, foi utilizada a abordagem proteômica shotgun, semi-quantitativa. Foram identificadas 76 proteínas totais, sendo 71 na hemolinfa e 40 nas frações. Na avaliação do extrato bruto da hemolinfa predominaram proteínas do tipo antiviral, serino proteases, hemolinas e inibidores de proteases. Já nas frações avaliadas, foram identificadas proteínas dos grupos hemolinas, serino proteases e inibidores de proteases. Os lotes apresentaram diferenças quali e quantitativas nas proteínas identificadas entre si. Em relação à viabilidade celular, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) nas células tratadas com hemolinfa ou frações e induzidas ao dano oxidativo. Porém o tratamento das células com a fração na concentração de 0,05 e 0,1% (v/v) por 24 h foi capaz de manter a viabilidade celular significativamente maior em relação ao controle positivo (p<0,05 e p<0,01 respectivamente). Estes resultados podem contribuir na identificação de proteínas com potencial aplicação como neuroprotetoras. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2016-08-09T18:20:58Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao Silviane Maggi.pdf: 179220 bytes, checksum: e4fa7fa341a705b1bc92316316dcda37 (MD5) Dissertacao Silviane Maggi.pdf: 3436577 bytes, checksum: 8560e84ef586763d3a72494cdbda34da (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T18:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao Silviane Maggi.pdf: 179220 bytes, checksum: e4fa7fa341a705b1bc92316316dcda37 (MD5) Dissertacao Silviane Maggi.pdf: 3436577 bytes, checksum: 8560e84ef586763d3a72494cdbda34da (MD5) Previous issue date: 2016-08-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Increased life expectancy and the decline in births results in aging population, with increasing of neurodegenerative diseases incidence. The therapeutic is limited, often only palliative, with low or no prospect damage reversal. Study of substances with potentially neuroprotective has been the focus of research. Toxic proteins of Lonomia obliqua caterpillars, which have caused several accidents in southern Brazil, were identified in the hemolymph with anti-apoptotic activity. This protein had demonstrated the maintaining of high electric potential of mitochondrial membrane, preventing cell death by apoptosis mechanism. This study aims the evaluation of the protein profile and effect of hemolymph and fraction on cell viability of rats primary cultured hippocampal neurons after induction of apoptosis. Semi-quantitative shotgun proteomics approach was used to evaluate the protein profile of 3 lots of different origin, 71 in hemolymph and 40 in fractions, in a total of 76 proteins. Antiviral protein predominated in crude extract of hemolymph, following by serine proteases, hemolines and protease inhibitors. In fractions were identified hemolines, serine proteases and protease inhibitors. No statistics differences were found (p<0.05) in the cell viability induced of oxidative damage, which were treated with hemolymph or fractions. However, the treatment with the fraction at concentration of 0.05 and 0.1% (v/v) for 24 hours, was able to maintain cell viability significantly higher than positive control (p<0.05 and p<0.01 respectively). These results may contribute to the identification of proteins with potential use as neuroprotective in degenerative conditions.