A baixa sensibilidade dos animais à droga e a função hepática pouco alterada são as principais dificuldades para o desenvolvimento da cirrose hepática experimental. A proposta deste trabalho foi aprimorar o modelo de cirrose por injeção intraperitoneal de tioacetamida (TAA) a fim de reduzir a adaptação dos animais ao fármaco. Foram utilizados 5 grupos de fêmeas de ratos Wistar: A (200 mg TAA/kg); B (aumento de 20% aos 48 dias); C (aumento de 10% a cada 24 dias); D (aumento de 15% a cada 24 dias); E (solução salina). Os animais foram injetados 3 vezes por semana durante 14 semanas. Foram realizadas coletas sanguíneas, por punção cardíaca, no início, no final do experimento e antes dos aumentos de dose, para análise dos marcadores de função hepática. A avaliação comportamental foi efetuada pelo método do labirinto em cruz elevado (LCE). Amostras de fígado foram colhidas e submetidas ao processamento para microscopia de luz. Os animais tratados com TAA apresentaram piloereção, icterícia e cromodacriorréia. Os testes do LCE demonstraram estresse e/ou ansiedade nesses animais. Os fígados cirróticos apresentaram nódulos regenerativos e lesões hemorrágicas na superfície. O ganho de peso foi semelhante entre os grupos tratados, porém, inferior ao do grupo E. Os danos de função hepática foram mais acentuados nos grupos em que houve aumento de dose, entretanto, a mortalidade do grupo D foi elevada (44%). O tratamento com TAA levou ao desenvolvimento de cirrose com formação de nódulos regenerativos circundados por septos fibrosos e desarranjo da arquitetura hepática. A deposição de colágeno foi maior nos grupos B e C. O grupo D apresentou quantidade de colágeno semelhante a do grupo A. O exame histopatológico demonstrou intensa proliferação de células ovais e hiperplasia de ductos biliares com produção de muco ácido. Foi observada presença de hemossiderina, hepatócitos balonizados, lesões nucleares e células inflamatórias. A administração de TAA provocou ainda o desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas, sugerindo possível efeito carcinogênico dessa substância. Os resultados demonstraram que os grupos B e C foram os mais eficazes no desenvolvimento da cirrose experimental. O grupo D, apesar do aumento maior na dose, apresentou resultados similares aos do grupo A (dose constante) e alta mortalidade, selecionando animais resistentes à droga. Assim, recomenda-se o modelo de indução do grupo B por apresentar menor mortalidade (5%), menor influência no aspecto emocional e quadro cirrótico tão grave quanto o dos animais do grupo C. / The low sensitivity of animals to drugs and the lack of changes in liver function are the main difficulties for the development of experimental liver cirrhosis. The aim of this study was improving the model of cirrhosis by intraperitoneal injection of thioacetamide (TAA) to reduce the animal adaptation to the drug. We used 5 groups of female Wistar rats: A (200 mg TAA/kg), B (increase of 20% to 48 days), C (increase of 10% every 24 days), D (increase of 15% every 24 days), E (saline). The animals were injected 3 times a week for 14 weeks. Blood samples were collected by cardiac puncture at the start and at the end of the experiment as well as before each dose increment, for analysis of markers of liver function. The behavioral assessment was done by the method of elevated plus-maze. Samples of liver were collected and processed to light microscopy. The animals treated with TAA showed piloerection, jaundice and chromodacryorrhea. Behavioral test showed stress and/or anxiety in these animals. The liver cirrhosis showed regenerative nodules and hemorrhagic lesions on the surface. Weight gain was similar among the groups treated, however, all of them were smaller than those of group E. The damage of the liver function was more pronounced in groups where the dose was increased over the experimental period, however, the mortality of group D was higher (44%). Treatment with TAA led to the development of cirrhosis with formation of regenerative nodules surrounded by fibrous septa and hepatic architecture disruption. The deposition of collagen was higher in groups B and C, whereas group D was similar to group A. Histopathologic evaluation showed intense proliferation of oval cells and bile duct hyperplasia, with production of acid mucin. It was observed the presence of hemosiderin, hepatocyte ballonization, nuclear lesions and inflammatory cells. The administration of TAA led to the development of neoplastic lesions, suggesting possible carcinogenic effect of this substance. The results showed that the treatment of groups B and C were most effective in the development of experimental cirrhosis. Despite that animals of group D received an increment in their TAA dose, their results seems similar to those of group A but with high mortality, probably because the treatment selected resistant animals to the drug. Therefore, it is recommended the model of induction of group B due to the lower mortality (5%), less influence on the emotional aspect and development of cirrhosis as severe as that the rats of group C.

O fígado é um órgão que apresenta grande capacidade regenerativa após injúria. Contudo, é possível desencadear os processos regenerativos sem injúria, pelo uso de fatores hepatotróficos exógenos (FHE) injetados intraperitonealmente. Ainda há controvérsias em relação a essa via de administração. Neste trabalho foram testados dois protocolos de administração de uma solução de FHE (Parra et al., 1992): em duas doses diárias (2x) e três doses diárias (3x), sendo observado o efeito no crescimento e matriz extracelular (ME) hepática e o efeito do tratamento em outros órgãos viscerais. Os FHE (40 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente em ratas Wistar por dez dias. Um grupo controle (C) recebeu solução salina. Amostras dos fígados foram observadas por microscopia óptica (parafina) e o colágeno foi quantificado por análise morfométrica com a coloração Picrossírius. Os animais do grupo 2x e 3x apresentaram aumento da massa do fígado de 30,1% e 22,5% respectivamente em relação ao grupo C. Ocorreu mortalidade (26,7%) no grupo 3x. Em ambos os grupos (2x e 3x) houve redução do colágeno intersticial em relação ao grupo C. Não houve alteração no quadro histológico dos demais órgãos analisados. Os FHE estimularam o crescimento hepático e a redução da proporção de colágeno tecidual. A administração em três doses diárias pode causar mortalidade, possivelmente pelo excessivo estresse da manipulação, o que não ocorreu no grupo 2x, não sendo recomendada esta abordagem no tratamento com FHE / The liver is an organ that presents great regenerative capacity after injury. However, it is possible to trigger the regenerative processes without previous with, for the use of exogenous hepatotrophics factors (HF) injected intraperitoneally. There are still controversies in relation to that of administration. In this work two protocols of administration of a solution of HF were tested: in two daily doses rates (2x) and three daily doses (3x), being observed the effect in the growth and extracellular liver matrix (ECM) and the effect of this treatment in other visceral organs. EHF (40 mg/kg) were administered intraperitoneally in female rats Wistar for ten days. A control group (C) received saline solution. Samples of the livers were observed by optical microscopy (paraffin) and the collagen was quantified by morfometric analysis with Picrossirius staining. The animals of the group 2x and 3x showed increase of the mass of the liver of 30,1% and 22,5% respectively in relation to the group C. Mortality happened (26,7%) in 3x group. In both groups (2x and 3x) there was reduction of the interstitial collagen in relation to the group C. There was not alteration in the histological picture of the other analyzed organs. HF stimulated the hepatic growth reduced the proportion of tissue collagen. The administration in three daily doses can cause mortality, possibly for the excessive stress of the manipulation, what didn\'t happen in the 2x group, not being recommended this approach in the treatment with HF

Os enxertos hepáticos com esteatose apresentam risco aumentado para a disfunção e o não funcionamento primário. Entretanto, considerando o permanente desequilíbrio entre a oferta e a demanda de enxertos, justifica-se o uso de fígados esteatóticos com um risco aceitável. O padrão ouro para o diagnóstico do grau da esteatose hepática, na prática clínica, é o exame histológico. Entretanto, no cenário dos transplantes, a estimativa do grau de esteatose do enxerto hepático depende do exame macroscópico. Nesse procedimento a leitura da cor é realizada de forma subjetiva e a força da associação cor-esteatose não é conhecida. Considerando esses aspectos, a presente pesquisa teve como objetivo verificar a associação entre a cor do fígado e a intensidade da esteatose hepática, aferindo a cor do fígado, de forma precisa com um colorímetro e quantificando a esteatose com dois exames considerados de referência. Método: Ratos wistar, machos, foram divididos em quatro grupos de quinze animais. Os animais do grupo controle receberam dieta padrão. Os outros três grupos receberam dieta esteatogênica durante, respectivamente, dois, quatro e seis dias. Os ratos foram submetidos à laparotomia, biópsia hepática (pré e pós-perfusão do fígado) para realizar o exame histológico, colorimetria no padrão RGB (pré e pós-perfusão do fígado), conversão da cor, do padrão RGB, para o padrão CINZA, coleta de sangue para realizar exames laboratoriais e hepatectomia (para determinar o peso relativo do fígado e a extração da gordura). A análise estatística foi realizada com o pacote de software estatístico IBM SPSS Statistics 18, e o valor p < 0.05 foi considerado com significado estatístico. Resultados: Foi observada correlação positiva entre os percentuais de gordura e a intensidade das cores pré perfusão (coeficiente de correlação da cor vermelha 0,874, cor verde 0,747 e cor azul 0,763) e pós-perfusão (coeficiente de correlação da cor vermelha 0,900, cor verde 0,886 e cor azul 0,856). As medias dos valores da colorimetria, pré e pós perfusão, apresentaram diferença estatisticamente significativa (p < 0,001). A acurácia da colorimetria pós perfusão, determinada pela curva ROC, foi de100% na determinação da presença de esteatose, 96,2% para o grau moderado ou intenso e 80,4% para o grau intenso da esteatose. Foi verificada diferença significativa dos valores da colorimetria (p < 0,001) entre as medias dos diversos grupos com exceção entre os grupos concentração de gordura moderada X gordura intensa e entre os grupos graus histológicos da esteatose leve X moderada X intensa. Conclusões: a) A cor do fígado, pré e pós perfusão, apresentou correlação forte com a esteatose, de forma positiva e linear; b) A colorimetria, pré e pós perfusão, apresenta a mesma acurácia na identificação da esteatose c) A colorimetria apresentou acurácia perfeita na identificação da presença da esteatose e tendência para classificar, em um mesmo grupo, a esteatose moderada e intensa. / Hepatic grafts with steatosis are at increased risk for dysfunction and primary non-functioning. However, considering the permanent imbalance between supply and demand of grafts, the use of specially selected livers with steatosis is justified. The gold standard for the diagnosis of hepatic steatosis in clinical practice is histological examination. However, in the transplant scenario, the estimation of the grade of hepatic graft steatosis depends on macroscopic examination. In this procedure the color reading is carried out subjectively and the strength of the association of color-steatosis is not known. Considering these aspects, the present study aimed to verify the association between liver color and liver steatosis intensity, accurately assessing the color of the liver with a colorimeter and quantifying steatosis with two exams considered as reference. Method: Male wistar rats were divided into four groups of fifteen animals. The animals in the control group received a standard diet. The other three groups received a steatogenic diet during, respectively, two, four and six days. Rats were submitted to laparotomy, liver biopsy (pre and post-perfusion of the liver) for conventional histological examination, colorimetry in the RGB pattern (pre and post-perfusion of the liver), color conversion from the RGB standard to the GRAY standard, Blood collection for laboratory tests and hepatectomy (to determine relative liver weight and fat extraction). Statistical analysis was performed with the statistical software package SPSS Statistics 18, and p value <0.05 was considered statistically significant. Results: A positive correlation was observed between fat percentages and preperfusion color intensity (red color correlation coefficient 0.874, green color 0.747 and blue color 0.763) and postperfusion (correlation coefficient of red color 0.900, green color 0.866 and blue color 0.856). The mean values of the colorimetry, pre- and post-perfusion, presented a statistically significant difference (p <0.001). The accuracy of the post-perfusion colorimetry, determined by the ROC curve, was 100% in the determination of the presence of steatosis, 96.2% for the moderate or intense degree and 80.4% for the intense degree of steatosis. There was a significant difference (p <0.001) between the means of the different groups except for the groups of moderate fat X intense fat concentration and between the histological grades groups of mild X intense moderate X steatosis. Conclusions: a) The color of the liver, pre and post perfusion, showed a strong correlation with steatosis, in a positive and linear way; B) Colorimetry, pre- and post-perfusion, shows the same accuracy in the identification of steatosis. C) Colorimetry showed perfect accuracy in the presence of steatosis and a tendency to classify moderate and severe steatosis in the same group.

A fibrose hepática é uma característica comum de diversas doenças crônicas do fígado e é caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular no órgão. Em última instância, essa alteração anormal do parênquima hepático acarreta em hipertensão portal, cirrose e insuficiência do fígado, o que pode levar o paciente à morte. As células estreladas hepáticas (HSC) participam ativamente deste processo, modificando seu fenótipo quiescente, rico em gotas lipídicas no citoplasma, para o fenótipo ativado, em resposta a um insulto hepático. A linhagem GRX é um modelo de HSC ativadas. As caveolas são pequenas invaginações de 50-100 nm da membrana plasmática que são ricas em glicoesfingolipídeos, colesterol e proteínas GPI ancoradas. Elas são caracterizadas pela presença de caveolina, uma proteína estrutural específica desta organela. Estas pequenas organelas, consideradas especializações dos “rafts” lipídicos, estão presentes nos mais diversos tipos celulares e podem funcionar como plataformas onde se ancoram várias proteínas de membrana. Estas proteínas reconhecem sinais externos e transmitem sinais moduladores da atividade celular, regulando ou facilitando o transporte de ácidos graxos e de lipídeos, e também são responsáveis pelo transporte de vesículas de membrana. As caveolinas são as principais proteínas estruturais das caveolas, sendo a caveolina-1 (Cav-1) a mais importante. A Cav-1 é encontrada em todos os tipos celulares e está relacionada com a transformação oncogênica e tumorogênese. Estudos já mostraram a interação entre as caveolas e os filamentos de actina, os microtúbulos, e os filamentos intermediários. Em fígados cirróticos foi encontrado um aumento da expressão de Cav-1 nas células endoteliais sinusoidais e nas HSC. Em trabalho anterior, utilizamos o plasmídeo pCav1EGFP para a obtenção de uma linhagem permanente que superexpressa a Cav-1 e a proteína EFGP, a GRXEGFP-Cav. Neste trabalho, nós caracterizamos, bioquímica e morfologicamente, essa linhagem e realizamos outra transfecção com o plasmídeo vazio pCineoEGFP para estabelecer uma linhagem controle, a GRXEGFPpCineo . Através de métodos de análise bioquímica, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo e de microscopia confocal e eletrônica de transmissão, mostramos que a superexpressão de Cav-1, aumentou a proliferação e a adesão celular, alterou a morfologia e a estrutura do citoesqueleto das células, a capacidade de migração e de endocitose da GRXEGFP-Cav. A análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão revelou o aumento do número de caveolas na membrana plasmática. As alterações do citoesqueleto de actina e o aumento da afinidade célula-célula são indicativos de maior mobilidade celular. Esses resultados somados ao aumento do conteúdo de αSMA e Col-I sugerem a modulação da GRXEGFP-Cav para um fenótipo de miofibroblasto ativado característico de situações de dano hepático. Como a distribuição e a significância da expressão de Cav-1 em fígados normais e cirróticos são pouco conhecidas, e considerando o papel das HSC nas doenças hepáticas, entendemos que a linhagem permanente GRXEGFP-Cav pode ser uma ferramenta experimental muito interessante para o estudo destas patologias. / Liver fibrosis is a common feature of several chronic hepatic diseases and is characterized by the excessive deposition of extracellular matrix in the organ. Usually, this abnormal change of the hepatic parenchyma causes portal hypertension, cirrhosis and liver failure, which can lead to the patient death. Hepatic stellate cells (HSC) participate actively in this process through modifying their quiescent phenotype rich in lipid droplets in the cytoplasm to the activated phenotype in response to the liver injury. GRX line is a model of activated HSC. The caveolae are small invaginations of plasma membrane that reaches 50-100nm of size, rich in glycosphingolipids, cholesterol, and GPI-anchored proteins. These organelles are characterized by the presence of caveolin, a structural and specific protein. These small organelles, which are considered specializations of lipid "rafts" and can be present in several cell types, can act as anchoring platforms for several membrane proteins. These proteins recognize external signals and transmit these signals to modulate the cell activity through regulating or facilitating the transport of fatty acids and lipids, being also responsible for the transport of membrane vesicles. Caveolins are the main structural proteins of caveolae and caveolin-1 (Cav-1) is the most important. Cav-1 is found in all cell types and is related to the oncogenic transformation and tumorigenesis. Previous studies have shown the interaction among caveolae, actin filaments, microtubules, and intermediate filaments. Also, it was found an increase of Cav-1 expression in sinusoidal endothelial cells and HSC of cirrhotic livers, which was suggested to be related to the portal hypertension that accompanies the process of fibrosis. In a previous work, we used the pCav1EGFP plasmid to obtain a permanent cell strain that overexpresses Cav-1 protein and EFGP, which was named GRXEGFP-Cav. In this work we biochemical and morphologically characterized this strain. We also did another cell transfection with an empty pCineoEGFP plasmid to establish a permanent control cell line, which was named GRXEGFPpCineo. Through biochemical analysis, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal and electron transmission microscopy, we showed that Cav-1overexpression increased cell proliferation and adhesion, changed cell morphology and cytoskeleton structure, and the cell migration and endocytosis capacity of GRXEGFP-Cav. The actin cytoskeletal changes and the increased cell-cell affinity are indicative of greater cell motility. These results associated to the increase of αSMA and Col-I contents suggest the GRXEGFP-Cav modulation be the activated myofibroblast that characterizes liver damage. As the distribution and the significance of Cav-1 expression in normal and cirrhotic livers are little known and considering the role of HSC in liver diseases, we believe that the permanent GRXEGFP-Cav line can be a very interesting experimental tool for the study of these pathologies.

A ocorrência de lesão hepática induzida por drogas representa um problema de saúde crescente e um desafio para os médicos, órgãos reguladores e a indústria farmacêutica, não só devido à sua potencial gravidade, mas também porque muitas vezes é diagnosticada de forma imprecisa, e outras vezes não são declaradas. Estudos sobre o metabolismo de drogas, juntamente com avaliações patológicas e histológicas, fornecem conjuntos de dados importantes para ajudar a compreender mecanismos subjacentes à hepatotoxicidade da droga. Neste estudo avaliamos a participação das espécies reativas de oxigênio (EROs) e do estresse oxidativo, bem como o envolvimento da sinalização intracelular relacionada ao processo de apoptose, através da ativação de membros da família Bcl-2 (Bcl-2 e Bax) e da família das MAPKs (p-ERK1/2), na hepatotoxicidade induzida por tioacetamida (TAA). Ratos machos Wistar foram divididos em 4 grupos experimentais: CO (controle); CO + Q (controle + quercetina); TAA (tioacetamida) e TAA + Q (tioacetamida + quercetina). Nos grupos que receberam TAA, administrou-se duas doses de 350 mg/Kg de TAA em ratos, em intervalo de 8 horas e, 2 horas após a segunda dose, iniciou-se o tratamento com quercetina (50 mg/Kg). Os grupos tratados com quercetina receberam o flavonóide intraperitonealmente por 4 dias, quando os animais foram mortos para análises de enzimas séricas (AST e ALT) e análises morfológicas, bioquímicas e moleculares de amostras de fígado. Os grupos que receberam TAA mostraram um aumento significativo nas aminotransferases séricas acompanhado de alterações morfológicas, com presença de necrose perivenular em absorção, infiltrado inflamatório com linfócitos e macrófagos e eventuais células gigantes multinucleadas. Além disso, estes animais apresentaram aumento da lipoperoxidação e dos metabólitos de óxido nítrico (nitritos e nitratos) no fígado, com alterações na atividade das enzimas antioxidantes e na expressão das enzimas na apoptose das células hepáticas, Bax, Bcl-2 e pERK1/2. O tratamento com quercetina por 4 dias mostrou níveis séricos significativamente reduzidos de AST e ALT, e as alterações morfológicas foram amplamente prevenidas. A administração de quercetina mostrou também uma redução da lipoperoxidação hepática, bem como dos níveis de metabólitos de óxido nítrico. Também observou-se retorno no equilíbrio das defesas antioxidantes e aumento das enzimas antiapoptóticas em relação às pró-apoptóticas. Os resultados obtidos sugerem efeito protetor da quercetina em ratos com lesão hepática induzida por TAA. / Drug-induced liver injury is an increasing health problem and a challenge for physicians, regulatory bodies and the pharmaceutical industry, not only because of its potential severity and elusive pathogenesis but also because it is often inaccurately diagnosed, commonly missed entirely and more often not reported. Drug metabolism studies, together with pathologic and histologic evaluation, provide critical data sets to help understand mechanisms underlying drug-related hepatotoxicity. We evaluated the involvement of reactive oxygen species (ROS) and oxidative stress, as well as the intracellular apoptosis via activation of the Bcl-2 (Bcl-2 and Bax) and MAPK (p-ERK 1/2) signaling pathway on the thioacetamide (TAA)-induced hepatotoxicity. Male Wistar rats were divided into four groups: CO (control), CO + Q (control + quercetin), TAA (thioacetamide) and TAA + Q (thioacetamide + quercetin). TAA group was administered intraperitoneally (i.p.) two doses of TAA (350 mg / kg) in the range of 8 hours, while TAA + Q group was administered i.p. quercetin (50 mg / kg), 2h after administration of thioacetamide (50 mg / kg). This group received flavonoid quercetin during 4 days, when animals were killed for analysis of serum enzymes (AST and ALT) and morphological, biochemical and molecular study of liver samples. The group receiving TAA showed a significant increase in serum aminotransferases accompanied by morphological changes, with extensive necrosis and inflammatory infiltration, mainly in the centrilobular region and portal tract. Moreover, these animals showed increased lipid peroxidation and nitric oxide metabolites (nitrites and nitrates) in the liver and changes in antioxidant enzyme activity, as wel as expression of apoptotic enzymes in the liver cells (Bax, Bcl-2 and pERK1 / 2). After 4 days treatment with quercetin, rats showed significantly reduced AST and ALT serum levels, with the morphological changes largely prevented. The administration of quercetin also showed a reduction of lipid peroxidation and in the levels of nitric oxide metabolites. It was observed a balance between antioxidant defense systems and production of ROS and increased ratio of anti- versus pro-apoptotic enzymes. The results suggest a protective effect of quercetin in rats with TAA-induced liver disease.

Introdução: A Insuficiência Hepática Aguda Grave (IHAG) é uma síndrome clínica rara, caracterizada por uma disfunção grave e súbita das células do fígado. A tioacetamida (TAA) é uma hepatotoxina, cuja administração em ratos causa a morte de células hepáticas por necrose centro lobular e promove o aumento da formação de espécies reativas de oxigênio (ERO). A glutamina é um aminoácido precursor para a síntese de glutationa. Objetivo: Avaliar o efeito antioxidante da glutamina em modelo experimental IHAG induzida por TAA em ratos. Métodos: Foram utilizados ratos machos Wistar, divididos em 4 grupos por tempo de avaliação: controle, glutamina (25 mg/kg), tioacetamida (400 mg/kg) e animais que receberam tioacetamida e glutamina. Os animais foram avaliados em 24, 36 e 48 horas. Foi coletado sangue para análises de AST, ALT, FA, BT e CRE e amostras de fígado para avaliar a lipoperoxidação (TBARS), a atividade das enzimas antioxidantes (SOD, GPx, CAT e GST), avaliação histológica e análise imuno-histoquímica de NF-kB, TNF-a e iNOS. Resultados: Os níveis de TBARS e a atividade das enzimas antioxidantes SOD e GST mostraram-se significativamente diminuídos nos animais dos grupos tratados com glutamina quando comparados com os animais dos grupos TAA. A atividade da CAT mostrou-se aumentada nos animais que receberam a glutamina em comparação aos animais dos grupos TAA. A atividade da GPx diminuiu significativamente nos grupos tratados com glutamina quando avaliada em 36 e 48 horas quando comparada com os animais dos grupos TAA, nestes tempos. O dano tecidual e a expressão de NF-kB, TNF-a e iNOS foram significativamente menores nos animais tratados com glutamina. Conclusão: A tioacetamida causa alterações em alguns parâmetros bioquímicos, histológicos e no processo inflamatório, por sua vez a glutamina exerce ação protetora ao fígado dos danos gerados pela tioacetamida no modelo de IHAG. / Introduction: Severe acute liver failure (SALF) is a rare clinical syndrome characterized by severe and sudden dysfunction of liver cells. The administration of the hepatotoxin thioacetamide (TAA) in rats causes the death of liver cells by necrosis and lobular center promotes increased formation of reactive oxygen species (ROS). Glutamine is a precursor for the synthesis of glutathione amino acid. Objective: To evaluate the antioxidant effect of glutamine in IHAG experimental model in rats induced by TAA. Methods: Male Wistar rats were divided into 4 groups by evaluation period: control, glutamine (25 mg / kg), thioacetamide (400 mg / kg) and animals that received thioacetamide and glutamine. Animals were evaluated at 24, 36 and 48 hours. Blood was collected for analysis of AST, ALT, ALP, BT and CRE and liver samples to assess lipid peroxidation (TBARS), the activity of antioxidant enzymes (SOD, GPx, CAT and GST), histological and immunohistochemical analysis NF-kB, iNOS and TNF-a. Results: The levels of TBARS and the activity of antioxidant enzymes SOD and GST were significantly decreased in animals in groups treated with glutamine compared with those for groups TAA. CAT activity was shown to be increased in animals receiving glutamine compared to groups TAA. The GPx activity decreased significantly in the groups treated with glutamine when evaluated at 36 and 48 hours compared with those for groups TAA in these times. The tissue damage and the expression of NF-kB, iNOS and TNF-a were significantly lower in animals treated with glutamine. Conclusion: The thioacetamide causes changes in some biochemical, and histological parameters in the inflammatory process, in turn glutamine exerts protective of the liver damage caused by thioacetamide in IHAG model action.

INTRODUÇÃO: Foi recentemente sugerido que a suscetibilidade à fibrose hepática, induzida pelo HCV, está relacionada a genes que regulam a apoptose. OBJETIVOS: Este trabalho visa elucidar a possível interação entre apoptose, inflamação e fibrose em pacientes com hepatite crônica C (HCC). MATERIAL E MÉTODOS: Pacientes com HCC, monoinfectados, com idade entre 18 a 60 anos, foram incluídos e submetidos a exames clínico e histopatológico. Aqueles com insuficiência renal crônica, neoplasias malignas, abuso de álcool, gravidez e/ou uso de imunossupressores foram excluídos. Foram determinados o índice de massa corporal, glicose, insulina, HOMA-IR, perfil lipídico, fibrose (METAVIR), níveis séricos de CK-18 (M30-Apoptosense, ELISA - Lausen, Switzerland), Fas, Fas-L, I-CAM, V-CAM, MIF, PAI (HSEP-63k, Milliplex, Millipore, Copenhagen, Denmark). RESULTADOS: Cinquenta e cinco pacientes foram incluídos, 23 deles eram virgens de tratamento. Dos pacientes que receberam tratamento antiviral, 15 obtiveram resposta virológica sustentada (RVS) e 17 foram não respondedores (NR). A inflamação, avaliada pelo sVCAM foi diretamente associada à fibrose avançada (p = 0,009). Além disso, níveis de apoptose mensurados pelo sFas-L e inflamação mensurados através do sVCAM foram mais elevados no grupo RVS em relação aos virgens de tratamento (p = 0,006 e 0,019, respectivamente). sVCAM correlacionou-se tanto com o sFas-L (rs = 0,778, p < 0,001) quanto com o MIF (rs = 0,621, p < 0,001). MIF e sFas-L também apresentaram correlação positiva (rs = 0,526, p = 0,001). CK-18 não diferiu entre os grupos. CONCLUSÃO: Fibrose avançada teve uma correlação positiva com a inflamação, mensurada pelo sVCAM, mas não foi associada a marcadores de apoptose. Os níveis de apoptose via sFas-L e inflamação via sVCAM evidenciaram-se maiores em pacientes que eliminaram o vírus quando comparados a pacientes não tratados. MIF também revelou tendência a ter níveis mais elevados naqueles com fibrose avançada. / AIMS: HCV-related liver fibrosis was recently suggested to be linked to genes that regulate apoptosis. Our study aims to elucidate the possible crosstalk between apoptosis, inflammation and fibrosis in patients with HCV. METHODS: HCV monoinfected patients, aging from 18 to 60 years old were included and underwent clinical pathological examination. Those with chronic renal failure, malignancies, alcohol abuse, pregnancy and/or taking immunosuppressant agents, were excluded. Body mass index, glucose, insulin, HOMA-IR, lipid profile, and fibrosis (METAVIR) were determined as well as serum levels of CK-18 (M30-Apoptosense, ELISA - Lausen, Switzerland), Fas, Fas-L, I-CAM, V-CAM, MIF, and PAI (HSEP-63k, Milliplex, Millipore, Copenhagen, Denmark). RESULTS: Fifty-five patients were included, 23 of them naïve. From the antiviral-experienced patients, 15 had sustained virological response (SVR) and 17 were non-responders (NR). Inflammation as assessed by sVCAM was directly associated to advanced fibrosis (p=0.009). As well the levels of apoptosis via sFas-L and inflammation via sVCAM both were increased in SVR group in comparison to naïve (p=0.006 and 0.019, respectively). sVCAM correlated both with sFas-L (rs=0.778, p < 0.001) and MIF (rs = 0.621, p < 0.001). MIF and sFas-L also displayed a correlation (rs=0.526, p=0.001). CK-18 did not differ among the groups. CONCLUSION: Advanced fibrosis had a positive correlation with inflammation by sVCAM, but was not associated with apoptosis markers, while levels of apoptosis via sFas-L and inflammation via sVCAM were increased in patients who cleared the virus when compared to naïves. MIF also showed a tendency to have higher levels those with advanced fibrosis.

Introdução: A atresia biliar (AB) inclui obstrução completas das vias biliares extra-hepáticas e uma colangiopatia intra-hepática progressiva, cirrogênica. A natureza da colangiopatia destes processos permanece obscura. Uma arteriopatia levando a colangiopatia isquêmica explicaria a natureza progressiva da lesão biliar. A imunolocalização do fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA) em ramos arteriais e ductos biliares intra-hepáticos e do porta hepatis dos pacientes com AB sugere isquemia nestas estruturas. A ocorrência de hipóxia hepatobiliar na AB necessita ser esclarecida. Objetivo: Determinar a presença de hipóxia nos fígados de pacientes com AB, analisando a expressão gênica dos fatores induzidos por hipóxia (HIF) -1α e -2α. Métodos: Estudo de amostras de biópsias em cunha coletadas na laparotomia exploradora de pacientes com AB isolada sem IgM+ para citomegalovírus (n= 32) comparando com lactentes com colestase intra-hepática (CIH, n= 09), pareados por idade. Uma amostra foi ultracongelada (análise molecular) e outra, parafinizada (análises histológica e imunoistoquímica). Por PCRq, usando sondas TaqMan®, avaliaram-se as expressões gênicas de: HIF1-α, HIF2-α, proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP1) (marcador de fibrose biliar), citoqueratina 19 (CK19) (marcador de colangiócitos). O gene normalizador foi 18S ribossômico. Por morfometria, foram quantificadas as extensões de fibrose e reação ductular. Dados clínico-laboratoriais foram prospectivamente coletados. Resultados: O grupo AB, comparado à CIH, apresentou maior expressão de HIF1-α e HIF2-α. No grupo AB, a expressão do HIF1-α correlacionou-se positivamente com a bilirrubina total (BT) sérica. Dois subgrupos de AB foram detectados quanto à expressão dos HIFs: alta (hiHIF, expressão 3x maior que a mediana da CIH) e baixa (loHIF). Pacientes hiHIF-1α eram mais velhos e com maiores níveis de BT e bilirrubina direta (BD) que loHIF-1α. O subgrupo hiHIF-2α apresentou expressão de CK19 inferior a do loHIF-2α. As demais variáveis foram semelhantes nos subgrupos HIFs. Conclusão: Na AB ocorre hipóxia tecidual hepática. Os dados sugerem a existência de hipóxia tecidual progressiva nos fígados afetados pela AB, associada ao desaparecimento de ductos biliares e à piora do quadro obstrutivo biliar. / Background: Biliary atresia (BA) includes a complete obstruction of the extrahepatic biliary tract and progressive intrahepatic cholangiopathy, and the nature of these processes remains unclear. An arteriopthy, leading to an ischemic cholangiopathy, can be involved. The immunolocalization of vascular endothelial growth factor A (VEGFA) in arterial branches and bile ducts both within the liver and at porta hepatis from patients with BA suggests ischemia in these structures. The occurrence of hypoxia in the hepatobiliary system in BA needs to be elucidated. Aim: To determinate the presence of hypoxia in the livers from patients with BA, by analyzing the gene expression of hypoxia-inducible factor (HIF) -1α and -2α. Methods: Liver biopsy specimens collected at exploratory laparotomy of age-matched patients with isolated, cytomegalovirus IgM-negative BA (n=32) and intrahepatic cholestasis (IHC, n=9) were evaluated. A sample was ultrafrozen (molecular analysis) and the other was paraffin-embedded (for histological and morphometric analyzes). Gene expression of: HIF-1α, HIF-2α, monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1) (biliary fibrosis marker) and cytokeratin 19 (CK19) (cholangiocyte marker) were evaluated by PCRq using TaqMan® probes. The normalizing gene was 18S ribosomal. The extents of fibrosis and ductular reaction were assessed by morphometry. Clinical and laboratory data were prospectively collected. Results: There was higher HIF-1α and HIF-2α expression in BA in comparison with IHC. In BA, the HIF-1α expression was positively correlated with total serum bilirubin (TB). Two groups were observable in BA regarding HIFs: higher (hiHIF, considering as cutoff point a value higher than 3x the median of expression in IHC) and lower (loHIF). Patients with hiHIF-1α were older and presented increased levels of TB and direct-reacting serum bilirubin (DB) than loHIF-1α. Patients with hiHIF-2α presented CK19 expression lower than in loHIF-2α. The other variables were similar in subgroups HIFs. Conclusion: In BA there is hypoxia in the liver tissue, which seems to be progressive and associated with the disappearance of bile ducts and worsening biliary obstruction.

Introdução: Os potenciais evocados auditivos e visuais são propostos como exames úteis no diagnóstico da encefalopatia hepática subclínica. Entretanto não existem estudos demonstrando a sua utilidade na população de pacientes pediátricos. Este estudo foi realizado na tentativa de avaliar diferentes tipos de potenciais na detecção da encefalopatia hepática subclínica na população pediátrica candidata a transplante hepático. Métodos: Realizou-se um estudo de caso controle onde potenciais evocados auditivos e visuais foram realizados em 15 pacientes pediátricos candidatos a transplante hepático que não apresentavam sinais clínicos de encefalopatia hepática. As latências de onda obtidas, nesses exames, foram comparadas com 16 controles saudáveis com faixas etárias similares. Exames laboratoriais de função hepática e eletroencefalograma foram, também, realizados para examinar as suas correlações com os resultados dos potenciais evocados. Resultados: Não foram encontradas diferenças, estatisticamente significativas entre os pacientes e os controles nos potenciais evocados auditivos, porém no potencial evocado visual, os pacientes candidatos a transplante hepático demonstraram latências N1 (N75) significativamente prolongadas quando comparadas com os controles. Não houve atraso significativo nas outras ondas. Por outro lado, latências prolongadas no potencial evocado auditivo tiveram uma correlação positiva com anormalidades no eletroencefalograma, apenas entre crianças com patologia hepática. Tal correlação não foi observada no potencial evocado visual. Conclusões: Os potenciais evocados podem ser usados na detecção de alterações relacionadas à encefalopatia hepática nos pacientes pediátricos, todavia outros estudos são necessários para determinar as suas especificidades e sensibilidades.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-28T12:52:01Z No. of bitstreams: 1 Rodrigo Feliciano do Carmo.pdf: 3731491 bytes, checksum: 86d8eb6b218e10bf0ba32ef83c2d9050 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T12:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigo Feliciano do Carmo.pdf: 3731491 bytes, checksum: 86d8eb6b218e10bf0ba32ef83c2d9050 (MD5) Previous issue date: 2016-05-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The hepatitis C virus (HCV) represents a worldwide health problem, with over 170 million people infected all over the world, corresponding to almost 3% of the world’s population. Approximately 70% of the individuals will develop the chronic form of the disease; 25% will develop cirrhosis and about 5% among the cirrhotic will develop hepatocellular carcinoma (HCC). The reason why some individuals evolve more rapidly to the severe forms is still unknown, however, several studies have pointed the influence of genetic factors of the host which are involved with the disease progression in the liver. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the most common type of genetic variation in humans, and they might alter serum levels or even the function of important proteins. Pentraxin 3 (PTX3) is an acute phase protein that is able to bind the surface of microorganisms and to regulate the complement system. Studies have demonstrated that PTX3 may influence positively the progression of various types of cancer. Additionally, some studies have demonstrated an important influence of a chromosomic region (6q23), associated with the progression of liver fibrosis in schistosomiasis. The IL22RA2 gene is located in this region e may be associated with the severity of fibrosis in HCV, once this gene codifies an inhibitor of an important cytokine correlated with the repair of liver damage, the interleukin-22 (IL-22). Thus, the aim of the present study was to associate the severity of the liver disease caused by HCV with SNPs in the PTX3 and IL22RA2 genes, as well as to identify new SNPs through exome sequencing approach. Patients with chronic hepatitis C were recruited and attended at the service of Gastrohepatology of the Oswaldo Cruz University Hospital/Liver Institute of Pernambuco (Recife, Pernambuco, Brazil) between August 2010 and December 2014. The detection of SNPs was performed by real time PCR using TaqMan probes (Thermo Fisher Scientific). Regarding the exome sequencing, it was used the IonTorrent platform (Thermo Fisher Scientific). A total of three studies were performed, the first study identified two polymorphisms (rs6570136 and rs2064501) on the IL22RA2 gene, associated with the severity of hepatic fibrosis, in a total of 532 patients. It was observed a higher frequency of genotypes GG/GA of rs6570136 and TT/TC of rs2064501 in the group of individuals with severe fibrosis (p=0,007 OR 1,7 and p=0,004 OR 2,4). On the second study, with a total of 524 patients, it was possible to notice a significant association of the genotype AA in the PTX3 gene (rs2305619) with risk of HCC (p=0.024 OR 1,94). Finally, the exome sequencing was carried in 9 HCC cases and 10 cirrhotic controls, where it was possible to identify two genes (PRSS58 and SOCS5), which are possibly associated with the development of HCC. Therefore, through this study we have demonstrated, for the first time, the association of SNPs in IL22RA2, PTX3, PRSS58 and SOCS5 with the progression of the hepatic disease caused by HCV. Other studies are needed in order to evaluate the use of these SNPs as progression markers of hepatitis C; as well as to evaluate the possible use of these molecules as therapeutic targets. / O vírus da hepatite C (HCV) representa um problema de saúde mundial, acometendo mais de 170 milhões de pessoas em todo o mundo, o que corresponde a cerca de 3% da população mundial. Aproximadamente 70% dos indivíduos irão desenvolver a forma crônica da doença, 25% desenvolverão cirrose e cerca de 5% dos cirróticos desenvolverão carcinoma hepatocelular (HCC). O motivo pelo qual alguns indivíduos evoluem mais rapidamente para formas mais graves ainda é desconhecido, entretanto diversos estudos têm apontado a influência de fatores genéticos do hospedeiro envolvidos com a progressão da doença no fígado. Polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) são o tipo de variação genética mais comum em humanos, e podem influenciar os níveis séricos ou até mesmo a função de proteínas importantes. A pentraxina 3 (PTX3) é uma proteína de fase aguda capaz de se ligar a microrganismos e de regular o sistema complemento. Estudos têm demonstrado que a PTX3 pode influenciar positivamente a progressão de vários tipos de câncer. Além disso, alguns estudos têm demonstrado uma grande influência de uma região cromossômica (6q23) associada com a progressão da fibrose hepática na esquistossomose. O gene IL22RA2 está localizado nesta região e poderia estar associado com a gravidade da fibrose no HCV, uma vez que este gene codifica um inibidor de uma importante citocina envolvida com a reparação de danos hepáticos, a interleucina-22 (IL-22). Portanto, o objetivo do presente trabalho foi associar a gravidade da doença hepática causada pelo HCV, com SNPs nos genes PTX3 e IL22RA2, assim como identificar novos SNPs através da técnica de sequenciamento de exoma. Foram recrutados pacientes com hepatite C crônica, atendidos no serviço de Gastrohepatologia do Hospital Universitário Oswaldo Cruz/Instituto do Fígado de Pernambuco (Recife-PE, Brasil) entre agosto de 2010 e dezembro de 2014. A detecção dos SNPs foi realizada por PCR em tempo real através de sondas TaqMan®. Para o sequenciamento do exoma, foi utilizada a plataforma IonTorrent®. Um total de três estudos foram realizados, o primeiro estudo identificou dois polimorfismos (rs6570136 e rs2064501) no gene IL22RA2, associados com a gravidade da fibrose hepática, em um total de 532 pacientes. Foi observada uma maior frequência dos genótipos GG/GA do rs6570136 e TT/TC do rs2064501 no grupo de indivíduos com fibrose grave (p=0,007 OR 1,7 e p=0,004 OR 2,4). No segundo estudo, com um total de 524 pacientes, foi possível observar uma associação significativa do genótipo AA no gene PTX3 (rs2305619) com o risco de HCC (p=0.024 OR 1,94). Por fim, foi realizado o sequenciamento do exoma de 9 casos com HCC e 10 controles cirróticos, onde foi possível identificar dois genes (PRSS58 e SOCS5) possivelmente associados com o desenvolvimento de HCC. Portanto, através do presente estudo, foi demonstrado pela primeira vez a associação de SNPs no IL22RA2, PTX3, PRSS58 e SOCS5 com a progressão da doença hepática causada pelo HCV. Outros estudos são necessários para avaliar o uso desses SNPs como marcadores de progressão da hepatite C, bem como avaliar o possível uso dessas moléculas como alvos terapêuticos.