Made available in DSpace on 2016-03-08T14:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 amanda_silva_ioc_dout_2015.pdf: 5657411 bytes, checksum: dd6832f72c07e39e96a4939a73d96d25 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A família Herpesviridae abriga um grande número de vírus que infectam animais e o homem. Nove herpesvirus foram identificados que possuem o homem como hospedeiro primário e descritos através da análise filogenética foram classificados em três subfamília: Alfaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gamaherpesvirinae. A família Herpesviridae agrupa vírus de genoma DNA e que estão associados a infecções latentes e a manifestações clínicas recorrentes. As infecções por herpesvírus podem se manifestar de forma assintomática ou sintomática, podendo causar diferentes síndromes clínicas. Estes vírus normalmente são benigno, sendo o aparecimento de lesões nas mucosas a forma mais comum da doença, podendo causar doenças neurológicas severas principalmente em pacientes imunocomprometidos. A incidência e severidade podem ser exacerbadas entre indivíduos imunocomprometidos. A presente tese é composta por três manuscritos, sendo dois trabalhos publicados e um submetido. Estes estudos se propuseram a padronizar métodos de silenciamento gênico, otimizar e comparar métodos para o diagnóstico e realizar a caracterização genotípica do herpes simples tipo 1 (HSV-1) e herpesvírus humano tipo 6 (HHV-6). Os estudos foram realizados em paciente imunocomprometidos do estado do Rio de Janeiro No primeiro artigo \201CRNA interference inhibits herpes simplex vírus type 1 isolated from saliva samples and mucocutaneos lesions\201D, foi possível realizar a comparação da sensibilidade para detecção do HSV-1 por isolamento viral e pela metodologia da reação de PCR em tempo real em amostras de lesão, saliva e cultura celular . Além disso, neste estudo foi possível obter-se a inibição de mais 99% da replicação viral do HSV-1 in vitro utilizando a técnica de RNA de interferência. No segundo estudo \201CGenotypic characterization of herpes simplex vírus type 1 isolates in immucompromised patients from Rio de Janeiro, Brazil\201D realizamos a primeira caracterização genotípica do HSV-1 no Rio de Janeiro. Os resultados demonstraram a existência de um único genótipo viral circulando nas amostras de pacientes imunocomprometidos. Além disso, as amostras brasileiras apresentam um alto grau de identidade estamos agrupadas no mesmo clado. No terceiro artigo \201CAcute liver failure in an immunocompetent patient\201D, foi possível a detecção do HHV-6B no soro e no fígado de paciente com hepatite fulminante. Neste estudo, foi possível mostrar a contribuição do HHV-6B na hepatite aguda fulminante sem etiologia definida. Esses estudos contribuem para o conhecimento das características clínicas e genéticas do HSV-1 e do HHV-6 circulantes em pacientes imunocomprometidos do Rio de Janeiro, Brasil / The Herpesviridae family has a la rge number of virus widespread in animal s and human . Nine herpesvirus a re identified that have hum a ns as their primary host and described by phylogenetic analysis were classified into three subfamily : Alfaherpesvirinae, Betaherpesvirinae and Gammaherpesvirinae. The family Herpesviridae is family of DNA virus and that are associated with latent infections and recurrent clinical manifestations. Herpesvirus infections can manifest themselves in asymptomatic or symptomatic form, may cause different clinical syndromes. These viruses are usually benign and the appearance of mucosal lesions are more common, but severe neur ological diseases can occurred especially in immunocompromised patients. The incidence and severity may be exacerbated among immunoc ompromised individuals. This thesis consists o f three manuscripts, two published papers and submitted. These studies set out to standardize methods of gene silencing, optimize and compare methods for the diagnosis and the genotypic characterization of herpes simplex type 1 (HSV - 1) and human herpesviru s type 6 (HHV - 6). The studies were conducted in immunocompromised patient Rio de Janeiro. In the first article "RNA interference inhibits herpes simplex virus type 1 isolated from saliva samples and mucocutaneous lesions", the comparison of sensitivity for detection of HSV - 1 for viral isolation and PCR methodology in real time is possible for different types of samples. Furthermore, in this study it was possible to obtain the most 99% inhibition of viral replication of HSV - 1 in vitro using RNA interference technique. In the second study "Genotypic characterization of herpes simplex virus type 1 isola tes in immucompromised patients from Rio de Janeiro, Brazil" held the first genotypic characterization of HSV - 1 in Rio de Janeiro. The results demons trated the existence of a unique viral genotype circulating in the samples of immunocompromised patients. Furthermore, viruses of the isolates show a high degree of identity and form a single clade. In the third article "Acute liver failure in an immunocompetent pati ent," HHV - 6B detection in serum and liver of patients with fulminant hepatitis was possible. In this study, we show the HHV - 6B contribution to acute fulminant hepatitis of unknown etiology. These studies contribute to the kn owledge of clinical and genetic HSV - 1 and HHV - 6 circulating in immunocompromised patients in Rio de Janeiro, Brazil.

O herpesvírus bovino tipo 4 (BoHV-4) é um herpesvírus membro da subfamília Gammaherpesvirinae, gênero Rhadinovirus que tem sido detectado em bovinos sadios e com diferentes sinais clínicos em todos os continentes. Sugere-se que este vírus está relacionado com diversas doenças do trato reprodutivo de bovinos. Dessa forma, faz-se necessária a pesquisa desse vírus em amostras biológicas com potencial utilização em biotécnicas de reprodução de bovinos, com o objetivo de reduzir sua transmissão e possíveis prejuízos econômicos advindos de sua infecção. Cento e dezenove amostras de líquido folicular de fêmeas abatidas em frigorífico e 164 amostras de sêmen de centros de inseminação artificial foram submetidas a uma reação de nested PCR para detecção do genoma do BoHV-4. Foi detectado o DNA de BoHV-4 em 2 amostras (1,68%) de liquido folicular e em 14 amostras (8,54%) de sêmen. Sete produtos foram submetidos ao sequenciamento, que revelou a semelhança dessas amostras com amostras europeias. É o primeiro relato de detecção do DNA de BoHV-4 em amostras de líquido folicular de bovinos, o que pode sugerir uma nova via de transmissão desse agente. Dessa forma, as alíquotas de sêmen destinadas à inseminação artificial e os ovários destinados a produção de embriões in vitro necessitam de um controle maior para evitar a disseminação do BoHV-4 entre os rebanhos bovinos e possíveis prejuízos econômicos associados ao vírus. / Bovine herpesvirus type 4 (BoHV-4), a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, genus Rhadinovirus has been detected in healthy as well as diseased cattle in all continents. It is suggested that this virus is associated to several disorders of the reproductive tract of bovines, and the virus or its genome has been found in clinical and biological samples like fetuses, semen and cells of the granulosa. Given the lack of evidences on the circulation of BoHV-4 in bovines of Brazil, specifically from samples from the reproductive tract, this study aimed the detection of BoHV-4 DNA from semen and follicular fluids of bovines. One hundred and nineteen follicular fluid samples obtained from a slaughterhouse and 164 semen samples obtained in artificial insemination centers were subjected to a nested PCR for the detection of BoHV-4 DNA. BoHV-4 DNA was detected in 2 samples (1.68%) from follicular fluid and 14 (8.54%) of semen samples. Seven products were subjected to sequencing, which confirmed the identity of the PCR products and revealed the similarity of these viruses with European virus isolates. It is the first report on the detection of BoHV-4 DNA in bovine follicular fluid samples and semen in Brazil, which may suggest that the virus may be disseminating in Brazilian cattle through reproductive practices. In addition, the results found here point to the a requirement for the testing of such samples, in search for BoHV-4 DNA, in order to prevent the spread of BoHV-4 between the cattle herds and the potential economic losses associated.

O herpesvírus bovino tipo 4 (BoHV-4) é um herpesvírus membro da subfamília Gammaherpesvirinae, gênero Rhadinovirus que tem sido detectado em bovinos sadios e com diferentes sinais clínicos em todos os continentes. Sugere-se que este vírus está relacionado com diversas doenças do trato reprodutivo de bovinos. Dessa forma, faz-se necessária a pesquisa desse vírus em amostras biológicas com potencial utilização em biotécnicas de reprodução de bovinos, com o objetivo de reduzir sua transmissão e possíveis prejuízos econômicos advindos de sua infecção. Cento e dezenove amostras de líquido folicular de fêmeas abatidas em frigorífico e 164 amostras de sêmen de centros de inseminação artificial foram submetidas a uma reação de nested PCR para detecção do genoma do BoHV-4. Foi detectado o DNA de BoHV-4 em 2 amostras (1,68%) de liquido folicular e em 14 amostras (8,54%) de sêmen. Sete produtos foram submetidos ao sequenciamento, que revelou a semelhança dessas amostras com amostras europeias. É o primeiro relato de detecção do DNA de BoHV-4 em amostras de líquido folicular de bovinos, o que pode sugerir uma nova via de transmissão desse agente. Dessa forma, as alíquotas de sêmen destinadas à inseminação artificial e os ovários destinados a produção de embriões in vitro necessitam de um controle maior para evitar a disseminação do BoHV-4 entre os rebanhos bovinos e possíveis prejuízos econômicos associados ao vírus. / Bovine herpesvirus type 4 (BoHV-4), a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, genus Rhadinovirus has been detected in healthy as well as diseased cattle in all continents. It is suggested that this virus is associated to several disorders of the reproductive tract of bovines, and the virus or its genome has been found in clinical and biological samples like fetuses, semen and cells of the granulosa. Given the lack of evidences on the circulation of BoHV-4 in bovines of Brazil, specifically from samples from the reproductive tract, this study aimed the detection of BoHV-4 DNA from semen and follicular fluids of bovines. One hundred and nineteen follicular fluid samples obtained from a slaughterhouse and 164 semen samples obtained in artificial insemination centers were subjected to a nested PCR for the detection of BoHV-4 DNA. BoHV-4 DNA was detected in 2 samples (1.68%) from follicular fluid and 14 (8.54%) of semen samples. Seven products were subjected to sequencing, which confirmed the identity of the PCR products and revealed the similarity of these viruses with European virus isolates. It is the first report on the detection of BoHV-4 DNA in bovine follicular fluid samples and semen in Brazil, which may suggest that the virus may be disseminating in Brazilian cattle through reproductive practices. In addition, the results found here point to the a requirement for the testing of such samples, in search for BoHV-4 DNA, in order to prevent the spread of BoHV-4 between the cattle herds and the potential economic losses associated.

Orientadores: Maria de Lourdes Rios Barjas Castro, Oslei Paes de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-04T10:28:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_ClaudioMaranhao_D.pdf: 182124 bytes, checksum: 0fd842544041d32727c8890ccaaf8cdc (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Doença do enxerto contra o hospedeiro crônica (DECHc) é a mais freqüente complicação tardia do transplante de medula ósseo (TMO) alogênico. Em sua forma crônica, acomete cerca de 50% dos indivíduos submetidos ao TMO alogênico, sendo que mais de 80% dos pacientes apresentam envolvimento bucal. O vírus herpes humano tipo 6 (HHV-6) é o agente etiológico do exantema súbito. Após a infecção primária geralmente o vírus fica em latência nas glândulas salivares e a saliva torna-se seu principal modo de transmissão. HHV-6 em latência pode ser reativado em pacientes imunocomprometidos podendo causar graves complicações. O objetivo deste estudo foi padronizar uma técnica para coleta e extração de DNA viral de fluidos bucais (saliva total, saliva de glândula parótida e fluido gengival); Assim como avaliar o quadro clínico e investigar a presença do vírus HHV-6 nas manifestações bucais da DECHc. O vírus foi pesquisado no sangue periférico, saliva total, saliva de glândula parótida, fluido gengival e amostras de tecido de mucosa labial. Os fluidos bucais e sangue periférico foram coletados de 19 pacientes portadores de manifestações bucais da DECHc e de 28 indivíduos saudáveis doadores de sangue. Fluido gengival e saliva da glândula parótida foram coletados utilizando cones endodônticos de papel para evitar a contaminação destes fluidos com a saliva total. Amostras de tecido bucal foram obtidas de 12 pacientes portadores de manifestações bucais da DECHc e de 12 indivíduos saudáveis. Reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada com o objetivo de identificar a presença do HHV-6. Seis (31.6%) pacientes apresentaram a forma liquenóide clássica da DECHc em cavidade bucal, 6 (31.6%) a forma atrófica-ulcerativa, 2 (10.5%) hiperqueratótica e 3 (15.8%) lesão bucal mista. Dois pacientes não apresentaram lesões bucais no momento do exame clínico. O vírus foi identificado na saliva total de 13 (68%) pacientes portadores da DECHc e de 19 (67.8%) doadores de sangue. HHV-6 não foi identificado em nenhuma amostra de fluido gengival e de saliva de glândula parótida de pacientes portadores da DECHc. No grupo controle, 4 amostras de fluido gengival e 4 amostras de saliva de glândula parótida (14.3%) apresentaram resultados positivos. Duas amostras de tecido bucal foram positivas para o HHV-6 nos pacientes portadores da DECHc. Os resultados demonstraram predominância e similar incidência das formas clínicas liquenóide e ulcerativa-atrófica. Os dados sugerem que os pacientes portadores de DECHc e indivíduos saudáveis apresentam alta e similar incidência do HHV-6 nos fluidos bucais e não mostram influência do vírus na severidade das lesões bucais da DECHc / Abstract: Chronic graft versus host disease (cGVHD) is the most late complication of allogeneic bone marrow transplantation. Chronic GVHD affects approximately 50% of the surviving adults and oral manifestations can be found in around 80% or more, of patients. Human herpesvirus 6 (HHV-6) is the etiologic agent of exanthem subitum. The virus is latent in salivary glands and saliva is the main form of viral transmission. Latent HHV-6 may be reactivated in immunocompromised patients causing severe complications. The aims of this study were to standardize a technique for collecting and extracting viral DNA from oral fluids (gingival crevicular fluid, whole saliva, and parotid gland saliva), evaluate the oral manifestation and clinical features of the cGVHD and investigate the HHV6 in patients with oral manifestation of cGVHD. Peripheral blood and oral fluids (whole saliva, gingival crevicular fluid and parotid gland saliva) from 19 cGVHD patients and 28 blood donors were searched for viruses. Gingival crevicular fluid and parotid gland saliva were collected using endodontic paper cones in order to not contaminate these fluids with whole saliva. Buccal¿s mucosa samples were obtained from 12 cGVHD patients and 12 healthy individuals. Nested-polymerase chain reaction was employed to identify the HHV6. The results showed that six (31.6%) patients presented the lichenoid form of cGVHD in buccal mucosa, 6 (31.6%) atrophic-ulcerative, 2 (10.5%) hyperceratotic and 3 (15.8%) the mixing form. Two patients did not present oral lesions at the moment of the clinic exams. The virus was detected in whole saliva in thirteen (68%) cGVHD patients and in ninetheen (67.8%) blood donors. HHV6 was not identified in any samples of gingival crevicular fluid and parotid gland saliva in the cGVHD patients. In the control group, four gingival crevicular fluid and four (14.3%) parotid gland saliva samples were positive. Two buccal¿s mucosa samples of cGVHD patients presented positives results. The results demonstrated predominance of lichenoid and ulcerative-atrophic forms with similar incidence of these lesions in patients with GVHDc. The data also showed that, cGVHD patients and healthy individuals present high and similar incidence of HHV-6 in oral fluids and did not support the virus influence in the severity of the cGVHD oral lesions / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia

Dez cavalos adultos clinicamente saudáveis foram inoculados por via intranasal com a estirpe A4/72 do herpesvírus eqüino tipo 1 (HVE-1). Com o intuito de estudar o efeito da dose infectante na severidade da rinopneumonite, os animais foram distribuídos em dois grupos experimentais: (a) grupo I (106,6 DICT50) e (b) grupo II (5×106,6 DICT50). Nos primeiros dez dias após a inoculação viral, todos os cavalos apresentaram manifestações de infecção respiratória leve e restrita às vias aéreas anteriores. Poucos animais desenvolveram leucopenia sangüínea envolvendo linfócitos (n=4) e neutrófilos (n=2). Somente em um houve aumento na contagem dos neutrófilos no lavado broncoalveolar (LBA). Apesar de possuírem elevados títulos de anticorpos neutralizantes antes da inoculação, alguns cavalos apresentaram soroconversão após o desafio viral. Esse padrão de resposta humoral foi determinado pelo aumento da dose infectante. O HVE-1 não foi isolado a partir das secreções nasais de nenhum animal. Entretanto, o DNA viral foi detectado pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) nas células mononucleares sangüíneas entre o terceiro e o oitavo dias pós-inoculação (d.p.i.) em todos os animais, indicando a ocorrência de viremia. Além disso, a prova de PCR detectou o vírus nas amostras de LBA a partir do nono d.p.i. no grupo II, demonstrando que a disseminação do HVE-1 pelo trato respiratório após o desafio viral foi dose-dependente. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que a PCR é uma técnica com alta sensibilidade para o diagnóstico do HVE-1, capaz de detectar a presença do DNA viral mesmo quando não ocorre a constatação do agente pelos métodos tradicionais / Ten clinically healthy adult horses were inoculated intranasally with the A4/72 strain of equine herpesvirus 1 (EHV-1). The animals were divided into two experimental groups in order to study the influence of the infective dose in the severity of rhinopneumonitis: (a) group I (106,6 TCID50) and (b) group II (5×106,6 DICT50). In the first ten days after the inoculation, they showed signs of a mild, self-limiting upper respiratory tract infection. Very few animals developed transient blood leukopenia, involving lymphocytes (n=4) as well as neutrophils (n=2). Only one horse had an increase in the neutrophils count of the bronchoalveolar lavage (BAL) samples. In spite of the presence of neutralizing antibodies before the trial, seroconversion was observed in some horses. The pattern of antibody response was determined by the increase of the challenge exposure. The virus was not isolated from nasal swabs of any horse. However, the EHV-1 was detected through the polymerase chain reaction (PCR) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of all horses in the experiment within the third to the eighth day after the inoculation that illustrated the viremia. In addition, the PCR assay also detected the virus in BAL samples starting on the ninth day after the experimental infection of group II. For that reason, the dissemination of the EHV-1 throughout the respiratory tract after virus exposure was dose-dependent. Based on the results obtained from this study, it can be affirmed that the PCR is a highly effective technique in detecting the EHV-1. It may be used in circumstances where traditional methods are not efficient due to the fact that it provides an enhanced diagnostic procedure for underdiagnosed diseases

As proteínas E7 (HPV), p24 (HIV) e gD (HSV) são exclusivamente expressas por células infectadas ou tumorais e, por isso, são utilizadas como alvos para vacinas com características terapêuticas. Foram desenvolvidas duas vacinas de DNA capazes de expressar as três proteínas virais por meio de um vetor de expressão bicistrônico baseado na sequência IRES. As vacinas, denominadas pIRES I e pIRES II, diferem entre si por transportarem os genes que codificam as proteínas E7 do HPV-16 e p24 do HIV fusionadas à proteína gD do HSV-1 em ordem inversa. Células COS-7 transfectadas com os plasmídeos vacinais expressaram as proteínas alvo, como determinado por imunofluorecência com anticorpos específicos para as proteínas gD, p24 e E7. As vacinas foram testadas em modelo murino quanto à capacidade de gerar anticorpos e células T CD8+ específicas. Observamos que animais vacinados desenvolveram baixas taxas de anticorpos contra gD, p24 e E7. Em contrapartida, demonstramos a indução de células T CD8+ específicas para os três antígenos testados. Os plasmídeos vacinais foram capazes de proteger camundongos inoculados com células tumorais TC-1 (que expressam a proteína E7 do HPV-16), embora apresentando diferentes níveis de proteção em ensaios profiláticos e terapêuticos. As formulações foram testadas em relação à capacidade de proteger animais frente a desafio com o HSV-1 sendo que apenas um deles gerou efeito protetor. Em conclusão, os resultados demonstram que vacinas voltadas para o controle terapêutico de infecções ou processos tumorais associados aos vírus HPV, HIV e HSV representam uma meta viável e promissora. / The proteins E7 (HPV), p24 (HIV) and gD (HSV) are exclusively expressed by infected cells or tumors and therefore are used as targets for vaccines with therapeutic characteristics. We developed two DNA vaccines capable of expressing these three viral proteins using a bicistronic expression vector based on IRES sequence. The plasmid vaccines, named pIRES I and pIRES II, differ by carrying the genes that encode proteins of HPV-16 E7 and p24 fused to the HIV protein gD of HSV-1 in reverse order. Transfected COS-7 cells expressed the target proteins, as determined by immunofluorescence with specific antibodies for gD, p24 and E7. The vaccines were tested in mice for their ability to generate antibodies and specific CD8+ T cells. We observed that vaccinated animals developed low levels of antibodies against gD, E7 and p24. In contrast, we demonstrate the induction of specific CD8+ T cells for the three antigens. The plasmid vaccines were able to protect mice inoculated with TC-1 tumor cells (which express the E7 protein of HPV-16), although with different levels of protection in prophylactic and therapeutic trials. The formulations were tested for ability to protect animals against challenge with HSV-1 and only one of them generated a protective effect. In conclusion, the results show that vaccines directed to therapeutic control of infections or tumor process associated with HPV, HSV or HIV represents a promising and viable goal.

Thesis (Ph.D. in Microbiology & Immunology) -- University of Colorado Denver, 2007. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 200-212).

Dez cavalos adultos clinicamente saudáveis foram inoculados por via intranasal com a estirpe A4/72 do herpesvírus eqüino tipo 1 (HVE-1). Com o intuito de estudar o efeito da dose infectante na severidade da rinopneumonite, os animais foram distribuídos em dois grupos experimentais: (a) grupo I (106,6 DICT50) e (b) grupo II (5×106,6 DICT50). Nos primeiros dez dias após a inoculação viral, todos os cavalos apresentaram manifestações de infecção respiratória leve e restrita às vias aéreas anteriores. Poucos animais desenvolveram leucopenia sangüínea envolvendo linfócitos (n=4) e neutrófilos (n=2). Somente em um houve aumento na contagem dos neutrófilos no lavado broncoalveolar (LBA). Apesar de possuírem elevados títulos de anticorpos neutralizantes antes da inoculação, alguns cavalos apresentaram soroconversão após o desafio viral. Esse padrão de resposta humoral foi determinado pelo aumento da dose infectante. O HVE-1 não foi isolado a partir das secreções nasais de nenhum animal. Entretanto, o DNA viral foi detectado pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) nas células mononucleares sangüíneas entre o terceiro e o oitavo dias pós-inoculação (d.p.i.) em todos os animais, indicando a ocorrência de viremia. Além disso, a prova de PCR detectou o vírus nas amostras de LBA a partir do nono d.p.i. no grupo II, demonstrando que a disseminação do HVE-1 pelo trato respiratório após o desafio viral foi dose-dependente. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que a PCR é uma técnica com alta sensibilidade para o diagnóstico do HVE-1, capaz de detectar a presença do DNA viral mesmo quando não ocorre a constatação do agente pelos métodos tradicionais / Ten clinically healthy adult horses were inoculated intranasally with the A4/72 strain of equine herpesvirus 1 (EHV-1). The animals were divided into two experimental groups in order to study the influence of the infective dose in the severity of rhinopneumonitis: (a) group I (106,6 TCID50) and (b) group II (5×106,6 DICT50). In the first ten days after the inoculation, they showed signs of a mild, self-limiting upper respiratory tract infection. Very few animals developed transient blood leukopenia, involving lymphocytes (n=4) as well as neutrophils (n=2). Only one horse had an increase in the neutrophils count of the bronchoalveolar lavage (BAL) samples. In spite of the presence of neutralizing antibodies before the trial, seroconversion was observed in some horses. The pattern of antibody response was determined by the increase of the challenge exposure. The virus was not isolated from nasal swabs of any horse. However, the EHV-1 was detected through the polymerase chain reaction (PCR) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of all horses in the experiment within the third to the eighth day after the inoculation that illustrated the viremia. In addition, the PCR assay also detected the virus in BAL samples starting on the ninth day after the experimental infection of group II. For that reason, the dissemination of the EHV-1 throughout the respiratory tract after virus exposure was dose-dependent. Based on the results obtained from this study, it can be affirmed that the PCR is a highly effective technique in detecting the EHV-1. It may be used in circumstances where traditional methods are not efficient due to the fact that it provides an enhanced diagnostic procedure for underdiagnosed diseases

Orientadores: Sandra Helena Alves Bonon, Anamarli Nucci, Sandra Cecilia Botelho Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-28T03:54:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rimerio_CarlaAparecidaTavares_D.pdf: 6984397 bytes, checksum: e5297c2f56a94baa8a9eb6aed8b782ee (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Atualmente, pacientes imunocompetentes e idosos estão recebendo maior atenção em relação às infecções virais. A reativação dos herpesvírus pode ocorrer eventualmente no sistema nervoso e a ausência de tratamento adequado pode causar sequelas. O teste padrão para a confirmação laboratorial da presença do DNA dos herpesvírus no sistema nervoso é a PCR no líquor e, neste trabalho utilizamos também o plasma como amostra-teste. Nosso objetivo foi determinar a incidência dos herpesvírus em pacientes com suspeita de infecções no sistema nervoso utilizando a nested PCR no líquor e comparar os resultados obtidos com a nested PCR realizada em DNA extraído de plasma, verificando a concordância entre eles. Foram incluídos no estudo 52 amostras de líquor e 52 amostras de plasma de pacientes imunocompetentes com sintomas clínicos de distúrbios no sistema nervoso. Os dados clínicos foram obtidos a partir das informações constantes dos prontuários médicos. Como resultados, em 27/52 (52%) pacientes, o DNA dos herpesvírus foi detectado pelo menos uma vez nas amostras de líquor pela nested PCR. Destas amostras 15/27 (55%) tinham hipótese diagnóstica inicial de encefalite. A ocorrência de monoinfecção foi de 10/27 (37%) dos pacientes. Coinfecção ocorreu em 17/27 (63%) dos pacientes positivos. Os vírus mais encontrados foram o Epstein-Barr e o citomegalovírus humano, com 12/27 (44%) e 15/27 (55%), respectivamente. Um paciente com hipótese inicial de encefalite que apresentou positividade para estes dois vírus foi a óbito por insuficiência aguda respiratória, epilepsia e encefalite. O Herpesvírus 1 foi observado em 5/27 (18%); herpesvírus 2 em 2/27(7%); varicela-zoster, 3/27 (11%); herpesvírus 6, 10/27 (37%) e herpesvírus 7, 9/27 (33%). O Herpesvírus 8 não foi detectado. Nas amostras de DNA extraído de plasma, a positividade para os herpesvírus foi de 32/52 (61%). Monoinfecção ocorreu em 13/32 (41%) e coinfecção ocorreu em 19/32 (59%). Herpesvírus tipo 1 ocorreu em 1/32 (3%); herpesvírus 2 em 2/32 (6%); Epstein-Barr em 5/32 (16%); citomegalovírus humano em 11/32 (34%); herpesvírus tipo 6 em 7/32 (22%); herpesvírus 7 em 5/32 (16%) e herpesvírus 8 em 1/32 (3%). Utilizando o teste de McNemar para análise de concordância entre os exames realizados com amostras de DNA extraídas de líquor com as de plasma, observamos que para os herpesvírus 1, 2, Epstein-Barr, citomegalovírus, herpesvírus tipos 6 e 7 positivos estudados, não houve diferença estatisticamente significativa entre os testes. Para os herpesvírus VZV e HHV-8, não foi possível avaliar, devido ao baixo número de casos positivos. A detecção qualitativa do DNA dos herpesvírus no plasma por nested PCR pode ser tão útil quanto a detecção do líquor ao longo do tempo para identificar os pacientes que apresentam distúrbios neurológicos causados por esses vírus, tanto imunocompetentes quanto imunodeprimidos. Sendo assim, neste estudo verificamos o papel que os herpesvírus humanos desempenham nas infecções do sistema nervoso em pacientes imunocompetentes, com foco nas hipóteses diagnósticas de infecção viral no sistema nervoso central e periférico. Com a detecção do DNA viral, o tratamento antiviral precoce poderá ser instituído para os vírus ao qual existem antivirais disponíveis. Avaliando a eficiência dos métodos de diagnóstico laboratorial baseado na detecção do DNA dos herpesvírus no plasma, os valores obtidos podem ser considerados em relação à especificidade, assim como os valores verdadeiros negativos podem ser detectados e o tratamento empírico pode ser evitado. Esses achados sugerem que mesmo ocorrendo resultados falso negativos, este teste poderá ser utilizado nos pacientes que enfrentam problemas relacionados à coleta do líquor / Abstract: Currently, immunocompetent and elderly patients are receiving more attention in relation to viral infections. Reactivation of herpesviruses may eventually occur in the nervous system and the absence of adequate treatment can cause sequels. The standard for laboratorial confirmation of the presence of herpesvirus DNA in the nervous system is PCR in the cerebrospinal fluid (CSF). In this study, it was also used plasma as a sample test. The aim was to determine the incidence of herpesviruses in patients with suspect of virus infections of the nervous system using nested PCR in cerebrospinal fluid and compare the results with nested PCR performed on DNA extracted from plasma, by checking the correlation between them. The study included 52 samples of CSF and plasma from 52 immunocompetent patients with clinical symptoms of disorders in the nervous system. Clinical data were obtained from the information contained in the medical records. As a result, in 27/52 (52%) patients, herpesvirus DNA was detected at least once in CSF samples by nested PCR. These samples, 15/27 (55%) had initial diagnosis of encephalitis. The occurrence of monoinfection was 10/27 (37%) patients. Coinfection occurred in 17/27 (63%) positive patients. The most prevalent viruses found were Epstein-Barr virus and human cytomegalovirus, with 12/27 (44%) and 15/27 (55%), respectively. A patient with initial hypothesis of encephalitis that was positive for these two viruses died due to acute respiratory failure, epilepsy and encephalitis. Herpesvirus simplex 1 was observed in 5/27 (18%); herpesvirus simplex 2 in 2/27 (7%); varicella-zoster, 3/27 (11%); herpesvirus 6, 10/27 (37%) and herpesvirus 7, 9/27 (33%). Herpesvirus 8 was not detected. In DNA samples extracted from plasma, herpesviruses were positive in 32/52 (61%). Monoinfection occurred in 13/32 (41%) and coinfection occurred in 19/32 (59%). Herpesvirus simplex 1 occurred in 1/32 (3%); herpesvirus simplex 2 in 2/32 (6%); Epstein-Barr 5/32 (16%); human cytomegalovirus in 11/32 (34%); herpesvirus 6 in 7/32 (22%); herpesvirus 7 in 5/32 (16%) and herpesvirus 8 in 1/32 (3%). Using McNemar's test for analysis of agreement between the tests performed with DNA samples extracted from CSF with the plasma were observed that for herpesvirus 1, 2, Epstein-Barr, cytomegalovirus, herpesvirus type 6 and 7 positive studied, there was no statistically significant difference between the tests. For VZV and HHV-8 herpesvirus, could not be assessed due to the low number of positive cases. The qualitative detection of herpesvirus DNA in plasma by nested PCR can be as useful as the detection of CSF over time to identify patients with neurological disorders caused by these viruses, both immunocompetent as immunocompromised. Therefore, in this study it was seem the role human herpesvirus infections play in the nervous system in immunocompetent patients, focusing on diagnoses of viral infection in the central and peripheral nervous system. With the detection of viral DNA, early antiviral therapy may be institute for the virus that are antivirals available. Evaluating the efficiency of laboratorial diagnostic methods based on detection of DNA of the herpesvirus in the plasma, values obtained can be considered in relation to specificity, as well as the true negative values can be detected and empiric treatment can be avoided. These findings suggest that even occurring false negative results, this test can be used in patients who have problems related to the collection of CSF / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

As proteínas E7 (HPV), p24 (HIV) e gD (HSV) são exclusivamente expressas por células infectadas ou tumorais e, por isso, são utilizadas como alvos para vacinas com características terapêuticas. Foram desenvolvidas duas vacinas de DNA capazes de expressar as três proteínas virais por meio de um vetor de expressão bicistrônico baseado na sequência IRES. As vacinas, denominadas pIRES I e pIRES II, diferem entre si por transportarem os genes que codificam as proteínas E7 do HPV-16 e p24 do HIV fusionadas à proteína gD do HSV-1 em ordem inversa. Células COS-7 transfectadas com os plasmídeos vacinais expressaram as proteínas alvo, como determinado por imunofluorecência com anticorpos específicos para as proteínas gD, p24 e E7. As vacinas foram testadas em modelo murino quanto à capacidade de gerar anticorpos e células T CD8+ específicas. Observamos que animais vacinados desenvolveram baixas taxas de anticorpos contra gD, p24 e E7. Em contrapartida, demonstramos a indução de células T CD8+ específicas para os três antígenos testados. Os plasmídeos vacinais foram capazes de proteger camundongos inoculados com células tumorais TC-1 (que expressam a proteína E7 do HPV-16), embora apresentando diferentes níveis de proteção em ensaios profiláticos e terapêuticos. As formulações foram testadas em relação à capacidade de proteger animais frente a desafio com o HSV-1 sendo que apenas um deles gerou efeito protetor. Em conclusão, os resultados demonstram que vacinas voltadas para o controle terapêutico de infecções ou processos tumorais associados aos vírus HPV, HIV e HSV representam uma meta viável e promissora. / The proteins E7 (HPV), p24 (HIV) and gD (HSV) are exclusively expressed by infected cells or tumors and therefore are used as targets for vaccines with therapeutic characteristics. We developed two DNA vaccines capable of expressing these three viral proteins using a bicistronic expression vector based on IRES sequence. The plasmid vaccines, named pIRES I and pIRES II, differ by carrying the genes that encode proteins of HPV-16 E7 and p24 fused to the HIV protein gD of HSV-1 in reverse order. Transfected COS-7 cells expressed the target proteins, as determined by immunofluorescence with specific antibodies for gD, p24 and E7. The vaccines were tested in mice for their ability to generate antibodies and specific CD8+ T cells. We observed that vaccinated animals developed low levels of antibodies against gD, E7 and p24. In contrast, we demonstrate the induction of specific CD8+ T cells for the three antigens. The plasmid vaccines were able to protect mice inoculated with TC-1 tumor cells (which express the E7 protein of HPV-16), although with different levels of protection in prophylactic and therapeutic trials. The formulations were tested for ability to protect animals against challenge with HSV-1 and only one of them generated a protective effect. In conclusion, the results show that vaccines directed to therapeutic control of infections or tumor process associated with HPV, HSV or HIV represents a promising and viable goal.