Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-05-18T19:09:17Z No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-19T10:43:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T10:43:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The genus Trichoderma includes species that have the ability to antagonize plant pathogens in a complex process ranging from antibiosis, competition for nutrients, mycoparasitism and induction of defense mechanisms in plants or a combination of these. Trichoderma species are known for their ability to produce lytic enzymes such as exoglucanases, endoglucanases, chitinases, and proteases that is essential for phytopathogen cell wall degradation. In the development and differentiation processes of Trichoderma, β-glucanases contributes significantly to the morphogenetic-morphological process that lead to the presence of β-glucans as the main component of fungi wall. In this work, we studied the functional role of the gluc31 gene that encodes an endo β-1,3-glucanase of the GH16 family of Trichoderma harzianum ALL42 through the deletion of this gene. This study demonstrated that the absence of Δgluc31 gene did not affect the in vivo mycoparasitism ability of the mutant T. harzianum ALL42, however the involvement of this gene in cell wall remodeling and synthesis were demonstrated. In the absence of the gluc31 gene, a higher deposition of chitin polymers on the cell wall of the mutant hyphae was observed. The absence of the gluc31 gene in T. harzianum also demonstrated an effect on the expression of other genes belonging to the family 16 of glycosyl hydrolases, due to the function redundancy found among the glucanases. / O gênero Trichoderma inclui espécies que possuem habilidade de antagonizar patógenos de plantas em um processo complexo que vão desde antibiose, competição por nutrientes, micoparasitismo, indução de mecanismos de defesa em plantas ou ainda uma combinação desses. Espécies de Trichoderma são conhecidas por sua capacidade de produzir enzimas líticas tais como exoglucanases, endoglucanases, quitinases e proteases que desempenham papéis importantes na degradação da parede de fitopatógenos. Nos processos de desenvolvimento e diferenciação de Trichoderma, as β-glucanases contribuem de forma significativa no processo morfogenéticomorfolítico uma vez que a β-glucanas é o componente principal da sua parede. Nesse trabalho, realizou-se o estudo do papel funcional do gene gluc31 que codifica uma endo β-1,3-glucanase da família GH16 de Trichoderma harzianum ALL42, através da deleção deste gene. Observamos que a ausência do gene gluc31 não afetou a capacidade de micoparasitismo, in vitro, da espécie mutante de T. harzianum ALL42, entretanto, o envolvimento deste gene na síntese e remodelamento da parede celular foi demonstrado. Na ausência do gene gluc31, uma maior quantidade de polímero de quitina na parede celular das hifas da linhagem mutante Δgluc31 foi observado. A ausência do gene gluc31 em T. harzianum demonstrou ainda um efeito sobre a expressão dos outros genes pertencentes à família 16 de glicosil hidrolases em ensaios de RT-qPCR, devido a redundância de função entre as glucanases.

Orientadores: Everson Alves Miranda, Sindélia Freitas Azzoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarinoBohorquez_MayraAlejandra_M.pdf: 2274078 bytes, checksum: b43b1a849020cc996eb872607460441e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O crescente interesse pelo aproveitamento da matéria-prima renovável vem demandando novas tecnologias eficientes na produção de etanol de segunda geração a fim de reduzir os altos custos associados com as enzimas envolvidas na sacarificação. Este estudo teve como objetivo principal concentrar, através de precipitação com etanol, glicosil hidrolases responsáveis pelas atividades de endoglucanase, ?-glicosidase, FPase e xilanase produzidas por Trichoderma harzianum P49P11. As variáveis de precipitação testadas foram temperatura, concentração de etanol e pH do fermentado. O etanol demonstrou potencial para recuperar ao redor de 98% da atividade de xilanase correspondente a 17,6 U/mL através de precipitações com 90% de etanol (v/v) em todas as temperaturas testadas (5,0, 15 e 25°C) e pH 5,0. Sob estas mesmas condições de precipitação, 90% de etanol (v/v) e pH 5,0, porém a 5°C, foi obtida a máxima recuperação da atividade de celulase (FPase) sendo 77% correspondente a 0,08 U/mg. Esta última formulação causou precipitação instantânea. Desta forma, a precipitação com etanol pode ser considerada uma técnica eficiente para concentrar xilanase e, em certa medida, para o complexo de celulase / Abstract: Growing interest in the use of renewable raw materials for the production of second generation ethanol has led to the need of new efficient technologies to reduce the high costs associated with saccharification enzymes. This study aimed to concentrate by ethanol precipitation glycosil hydrolases responsible for FPase, ?-glicosidase, endoglucanase and xylanase activities produced by Trichoderma harzianum P49P11. The precipitation variables tested were temperature, ethanol concentration and pH of the fermentation broth. The results showed that the precipitation by ethanol recovered more than 98% of the total xylanase activity using ethanol at concentration of 90% (v/v) at all temperatures tested (5.0, 15 e 25°C) and pH 5.0. The maximum recovery of cellulose activity as FPase was 77% by precipitation carried out at this same ethanol concentration and pH (90% v/v and pH 5.0) but at 5.0°C. This last set of conditions caused almost instantaneous precipitation. Therefore, ethanol precipitation can be considered an efficient technique for xylanase concentration and, to a certain extent, for the cellulase complex / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

Orientador: Munir Salomão Skaf / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:29:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_RodrigoLeandro_D.pdf: 21325666 bytes, checksum: e2332474509730ff297050a513a97a70 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção de bioetanol a partir da biomassa lignocelulósica integra processos físico-químicos e enzimáticos que comprometem sua viabilidade econômica. A biomassa possui uma estrutura recalcitrante composta de celulose, hemicelulose e lignina. Tal estrutura, bem como os mecanismos das enzimas, não são bem compreendidos. Nesta tese, simulações de dinâmica molecular e a teoria mecânico-estatística 3D-RISM foram utilizada para investigar aspectos moleculares da degradação de biomassa, incluindo: (1) dinâmica estrutural de celulases; (2) base molecular da termofilicidade de laminarinaes; (3) disrupção não-hidrolítica de biomassa por expansinas; (4) nanoarquitetura da parede ceular primária; e (5) forças termodinâmicas da parede celular secundária. No tópico (1), observou-se que a acessibilidade ao substrato em celulases pode ser modulada por alterações na estrutura primária, com consequências para a atividade enzimática. Observou-se também que a inibição por produto está relacionada a alterações conformacionais de resíduos próximos ao sítio de ligação. Adicionalmente, alterações na dinâmica intrínseca das enzimas ocorrem conforme a etapa do processo de hidrólise. No tópico (2), os resultados mostraram que a conformação do sítio de ligação ao substrato de laminarinases é sensível a variações de temperatura. No tópico (3), observou-se que a expansina pode transladar sobre a superfície da celulose e induzir torções em cadeias de glucano, sugerindo a possibilidade de romper ligações de hidrogênio celulose-celulose e/ou celulose/xiloglucano como um zíper. No tópico (4), observou-se que a agregação de nanofibrilas de celulose se dá através de suas faces hidrofílicas e que a presença de hemicelulose estabiliza tal agregação. No tópico (5), os resultados mostraram que as forças de coesão da parede celular secundária são de natureza entrópica e que a composição química da lignina modula as interações lignina-lignina e lignina-hemicelulose / Abstract: Biofuel production from lignocellulosic biomass involves physico-chemical and enzymatic processes that challenge its economic viability. The lignocellulosic biomass is recalcitrant against degradation and is made up of cellulose, hemicellulose and lignin. This structure and the enzyme mechanisms are not fully understood. In this thesis, molecular dynamics simulations and the statistical mechanical theory 3D-RISM were employed to assess molecular aspects of the biomass degradation, including: (1) structural dynamics of cellulases; (2) molecular basis of the thermophilicity of laminarinases; (3) non-hydrolytic disruption of biomass by expansins; (4) primary cell wall nanoarchitecture; and (5) thermodynamic forces of the secondary cell wall. In the topic (1), we observed that cellulase substrate accessibility can be modulated through changes in its primary structure, with consequences to the enzymatic activity. Moreover, the product inhibition is related to conformational changes of residues located close to the substrate binding site. In addition, changes of the intrinsic dynamics allow cellulases change their function according to the hydrolysis step. In the topic (2), we show that the substrate binding site conformation of laminarinases is sensitive to temperature variations. In the topic (3), we observed that the expansin can translade over the cellulose surface and induce torsions in free glucan chains, suggesting the possibility of disruption of cellulose-cellulose and cellulose-xyloglucan hydrogen bonds as a ziper. In the topic (4), the results showed that the aggregation of cellulose nanofibrils takes place through their hydrophilic face and that hemicellulose plays roles in stabilizing such aggregation. In the topic (5), we observed that the cohesion forces within the secondary cell wall are of entropic origin and that the lignin chemical composition modulates the lignin-lignin and lignin-hemicellulose interactions / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Orientador: Mário Tyago Murakami / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:09:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_JoiceHelena_D.pdf: 28922115 bytes, checksum: be729b855c60f1b34aac3a0b43e0aeac (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

A resistência das paredes celulares vegetais à hidrólise enzimática é um dos grandes gargalos tecnológicos para a obtenção do etanol celulósico. Acredita-se que as modificações nas paredes celulares em processos como a mobilização de reservas, formação de aerênquima, amadurecimento de frutos e senescência, por exemplo, envolvam a ativação de módulos funcionais que culminam em alterações nas paredes celulares. Estes módulos são: 1) recepção de um sinal para início do processo; 2) Morte Celular Programada (PCD); 3) separação celular; 4) expansão celular; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. No caso da formação de aerênquimas lisígenos o processo que se inicia com a PCD e é seguido pela liberação de glicosil hidrolases que atuam a na degradação e/ou modificação da parede celular, formando espaços de ar no córtex radicular. A formação de aerênquima nas raízes de cana de açúcar é constitutiva e pouco se sabe sobre os mecanismos de modificação que ocorrem na parede celular durante este processo. Este estudo buscou compreender os padrões de variação expressão gênica, proteínas e de atividades enzimáticas associados à formação do aerênquima em raízes de cana de açúcar, com ênfase no papel das hidrolases de parede celular e em algumas proteínas relacionadas à PCD. Foram utilizados 5 segmentos de raízes de 1 cm cada, a partir do ápice radicular. No material coletado observou-se a formação gradual de aerênquima. Foram realizadas análises transcricional, proteômica e atividade enzimática das glicosil hidrolases e outras proteínas que atuam na modificação da parede celular, os quais foram identificados e quantificados ao longo da formação do aerênquima. As glicosil hidrolases pertencentes às famílias Cazy GH1, GH3, GH17, GH18 bem como expansinas, celulose sintase, lacase, calreticulina, calmodulina e proteínas relacionadas a degradação de pectinas, foram encontradas ao longo dos segmentos, principalmente após o segmento 2. De acordo com a atividade transcricional e dados da proteômica, sugere-se que os polissacarídeos seriam atacados por enzimas nos estágios iniciais da formação do aerênquima (seg 2 e 3). O ataque ocorre principalmente sobre as pectinas e o β-glucano. Contudo, os dados apontam para a deposição de xiloglucano, xilanos e celulose (após seg 3), que formam um compósito ao redor dos espaços de ar. Isto sugere que parte dos polissacarídeos das paredes não sejam degradados ao longo do processo, embora enzimas específicas detectadas possam atuar na modificação dos mesmos, como verificado para algumas pectinases e membros de GH17. Além disso, nos pré-tratamentos com água foi possível observar que há maior sacarificação da parede nos seg. 1 e 2. Contudo quando retira-se a maior parte das pectinas e hemiceluloses após pré-tratamento com NaOH, a sacarificação é maior nos segmentos 2, 3 e 4, devido ao maior acesso e a maior quantidade de celulose. As glicosil hidrolases encontradas neste trabalho sugerem que estas atacam a parede de um específico conjunto de células do córtex que dá origem ao aerênquima. Já no fim do processo, quando há lise celular, algumas paredes de células remanescentes são recalcitrante à hidrólise, provavelmente devido a sua arquitetura e composição. Este trabalho traz informações para o desenvolvimento de futuras tecnologias para a produção do etanol do etanol celulósico de cana-de-açúcar / The resistance of plant cell walls to enzymatic hydrolysis is one of the main bottlenecks of the development of technology of production of cellulosic ethanol. It is believed that the modifications in cell walls related to processes of storage mobilization, aerenchyma formation, fruit ripening and senescence, for instance, involve the activation of functional moduli that culminate in alterations of cell walls. These moduli are: 1) signal perception to start the process; 2) Programmed Cell Death (PCD); 3) cell separation; 4) cell expansion; 5) hydrolysis of hemicelluloses and 6) hydrolysis of cellulose. In the case of the formation of lysigenous aerenchyma, the process starts with PCD and is followed by the release of glycosil hydrolases that act on the degradation and/or cell wall modifications, forming air spaces in the cortex of the root. The formation of aerenchyma in the roots of sugarcane is a constitutive phenomenon and little is known about the mechanisms of modification that occur in cell walls during its development. Thus, the present study focused on the visualization of the patterns of variation of gene expression, proteins and enzyme activities associated to the formation of aerenchyma in roots of sugarcane in order to understand the role of the cell wall hydrolases and some proteins related to PCD in cell wall modifications along the process. Five root segments of 1cm each, starting from root apex, were used. A gradual centripetal formation of aerenchyma was recorded in the cortex of developing roots. Analyses of the transcriptional, proteomic and enzyme activity profiles during the process revealed that several enzymes act on cell wall modifications. The glycosil hydrolases belonging to the Cazy families GH1. GH3, GH17, GH18, as well as expansins, cellulose synthase, laccase, calreticulin, calmodulin and other proteins related to pectin degradation have been found along the segments, mainly after segment 2. According to the data on transcriptomics and proteomics, it is suggested that enzymes attack polysaccharides during the initial stages of aerenchyma formation (seg. 2 and 3). The attack of the enzymes occurs mainly on pectins and β-glucan. Conversely, the data point out to the deposition (or maintenance) of xyloglucan, xylan and cellulose (after seg. 3), which form a composite that surrounds the air spaces. This suggests that part of the polysaccharides present in cell walls are not degraded during the process, although specific enzymes have been detected that could act on polysaccharide mobilization, such as the GH17 family. Further, under pretreatment with water, it has been observed that cell wall saccharification was higher at segments 1 and 2. On the other hand, when most of the pectins and hemicelluloses are retrieved by pretreatment with NaOH, saccharification is higher of segments 2, 3 and 4, probably due to the higher access to the wall and also to the higher proportion of cellulose. The profiles related to the glycosil hydrolases found in this work, suggest that these enzymes attack the cell wall. Initially, they are probably kept within a group of cells that will originate the aerenchyma. At the end of the process, when there is cell lysis, the remaining walls of some cells are recalcitrant to hydrolysis probably due to changes in their architecture and composition. Our findings bring promising information that could be used in the future to improve efficiency of hydrolysis for cellulosic ethanol production from sugarcane

Os dispositivos biossensores foram primeiramente pesquisados por Clark e Lyons, em 1962, visando medir o nível de glicemia. Atualmente, há uma popularização dos medidores de glicemia e diversas tecnologias foram desenvolvidas, principalmente, para aplicações em diagnósticos médicos e monitoramento ambiental. No entanto, há uma ampla quantidade de aplicações para biossensores ainda não disponível no mercado. A imobilização de espécies bioativas que interagem diretamente com o analito, chamada de superfície bioativa, é frequentemente considerada a etapa mais difícil no desenvolvimento de biossensores para novas aplicações. O objetivo deste trabalho é demonstrar a caracterização da camada bioativa desenvolvida pela técnica de construção de camadas auto-organizadas usando o princípio da adsorção eletrostática. Para isto, foram utilizadas três diferentes concentrações de soluções compostas por ligações covalentes entre nanotubos de carbono de paredes múltiplas e três diferentes biomateriais, Polietilenoimina, Ácido Desoxirribonucléico e enzimas do tipo Hidrolase de Organofosforados. As diferentes soluções polieletrolíticas foram caracterizadas pela técnica de ressonância de plasmons de superfície e simultaneamente formaram camadas auto-organizadas na superfície de um eletrodo de carbono vítreo. A atividade das enzimas foi analisada por voltametria cíclica para as diferentes concentrações das soluções utilizadas. Os resultados mostraram que a caracterização por ressonância de plasmons de superfície promove o controle da adsorção eletrostática. A variação do ângulo de ressonância de plasmons de superfície corresponde à intensidade e à saturação das interações eletrostáticas entre as camadas. Biossensores desenvolvidos com soluções de maior concentração, consequentemente, ampliaram os limites de detecção e elevaram a resolução do sinal elétrico. Em aplicações para medir baixas concentrações do analito, o adequado controle das concentrações das soluções poli eletrolíticas reduz os custos no desenvolvimento de biossensores especialmente, com relação ao custo de enzimas isoladas. / The biosensor devices were first researched by Clark and Lyons in 1962, aiming to measure the blood glucose level. Currently, there is a popularization of blood glucose meters and several technologies have been developed mainly for applications in medical diagnostics and environmental monitoring. However, there is a wide range of applications for biosensors not yet available. The immobilization of bioactive species that interact directly with the analyte, called bioactive surface, is often considered the most difficult step in the biosensors development for new applications. The objective of this work is to demonstrate the characterization of the bioactive surface developed by self-assembled monolayers technique using the electrostatic adsorption principle. For this, we used three different concentrations of solutions composed of covalent bonds between multi-walled carbon nanotubes and three different biomaterials, Polyethyleneimine, Deoxyribonucleic Acid and Organophosphorous Hydrolase enzymes. These enzymes catalyze the hydrolysis of phosphorus compounds such as organophosphorous neurotoxins. The different polyelectrolyte solutions were characterized by the technique of surface plasmon resonance, and simultaneously, self-assembled monolayers were formed on the surface of a glassy carbon electrode. The enzymes activity was analyzed by cyclic voltammetry for the different concentrations of the solutions used. The results showed that the surface plasmon resonance characterization promote the control of electrostatic adsorption. The variation of the surface plasmon resonance angle corresponds the intensity and saturation of electrostatic interactions between the layers. Biosensors developed with solutions of higher concentration, consequently, widened the detection limits, and increased the resolution of the electrical signal. In applications to measure low concentrations of analyte, adequate control of the concentrations of polyelectrolytes solutions reduces costs in the development of biosensors especially, the cost of isolated enzymes.

Os dispositivos biossensores foram primeiramente pesquisados por Clark e Lyons, em 1962, visando medir o nível de glicemia. Atualmente, há uma popularização dos medidores de glicemia e diversas tecnologias foram desenvolvidas, principalmente, para aplicações em diagnósticos médicos e monitoramento ambiental. No entanto, há uma ampla quantidade de aplicações para biossensores ainda não disponível no mercado. A imobilização de espécies bioativas que interagem diretamente com o analito, chamada de superfície bioativa, é frequentemente considerada a etapa mais difícil no desenvolvimento de biossensores para novas aplicações. O objetivo deste trabalho é demonstrar a caracterização da camada bioativa desenvolvida pela técnica de construção de camadas auto-organizadas usando o princípio da adsorção eletrostática. Para isto, foram utilizadas três diferentes concentrações de soluções compostas por ligações covalentes entre nanotubos de carbono de paredes múltiplas e três diferentes biomateriais, Polietilenoimina, Ácido Desoxirribonucléico e enzimas do tipo Hidrolase de Organofosforados. As diferentes soluções polieletrolíticas foram caracterizadas pela técnica de ressonância de plasmons de superfície e simultaneamente formaram camadas auto-organizadas na superfície de um eletrodo de carbono vítreo. A atividade das enzimas foi analisada por voltametria cíclica para as diferentes concentrações das soluções utilizadas. Os resultados mostraram que a caracterização por ressonância de plasmons de superfície promove o controle da adsorção eletrostática. A variação do ângulo de ressonância de plasmons de superfície corresponde à intensidade e à saturação das interações eletrostáticas entre as camadas. Biossensores desenvolvidos com soluções de maior concentração, consequentemente, ampliaram os limites de detecção e elevaram a resolução do sinal elétrico. Em aplicações para medir baixas concentrações do analito, o adequado controle das concentrações das soluções poli eletrolíticas reduz os custos no desenvolvimento de biossensores especialmente, com relação ao custo de enzimas isoladas. / The biosensor devices were first researched by Clark and Lyons in 1962, aiming to measure the blood glucose level. Currently, there is a popularization of blood glucose meters and several technologies have been developed mainly for applications in medical diagnostics and environmental monitoring. However, there is a wide range of applications for biosensors not yet available. The immobilization of bioactive species that interact directly with the analyte, called bioactive surface, is often considered the most difficult step in the biosensors development for new applications. The objective of this work is to demonstrate the characterization of the bioactive surface developed by self-assembled monolayers technique using the electrostatic adsorption principle. For this, we used three different concentrations of solutions composed of covalent bonds between multi-walled carbon nanotubes and three different biomaterials, Polyethyleneimine, Deoxyribonucleic Acid and Organophosphorous Hydrolase enzymes. These enzymes catalyze the hydrolysis of phosphorus compounds such as organophosphorous neurotoxins. The different polyelectrolyte solutions were characterized by the technique of surface plasmon resonance, and simultaneously, self-assembled monolayers were formed on the surface of a glassy carbon electrode. The enzymes activity was analyzed by cyclic voltammetry for the different concentrations of the solutions used. The results showed that the surface plasmon resonance characterization promote the control of electrostatic adsorption. The variation of the surface plasmon resonance angle corresponds the intensity and saturation of electrostatic interactions between the layers. Biosensors developed with solutions of higher concentration, consequently, widened the detection limits, and increased the resolution of the electrical signal. In applications to measure low concentrations of analyte, adequate control of the concentrations of polyelectrolytes solutions reduces costs in the development of biosensors especially, the cost of isolated enzymes.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 401022.pdf: 970049 bytes, checksum: 1fc17227f3815a94113f9cadc1efc0e4 (MD5) Previous issue date: 2008-03-19 / Fosfodiesterase (PDE) ? uma super fam?lia de enzimas respons?veis pela degrada??o dos segundos mensageiros intracelulares adenosina monofosfato c?clico (AMPc) e guanosina monofosfato c?clico (GMPc). Como reguladoras essenciais na sinaliza??o de segundos mensageiros c?clicos com diversas fun??es fisiol?gicas as PDEs s?o alvo de drogas para o tratamento de diversas doen?as. Dentre estas est?o insufici?ncia card?aca, depress?o, asma, inflama??o e disfun??o er?til. Dentre as 11 fam?lias de genes de PDE, a fosfodiesterase 5 (PDE5) ? espec?fica para GMPc, sendo respons?vel pela atividade de hidr?lise que sofre o GMPc dentro dos tecidos dos corpos cavernosos penianos dos homens. A PDE5 ? amplamente conhecida por ser alvo de diversas drogas utilizadas no tratamento da disfun??o er?til, como por exemplo, o sildenafil (Viagra?). Este trabalho tem por objetivo a s?ntese da regi?o codificante, clonagem, express?o e purifica??o do dom?nio catal?tico da PDE5 humana. A s?ntese da regi?o codificante do polipept?deo alvo foi realizada atrav?s da t?cnica de overlap, utilizando 24 oligonucleot?deos que foram unidos atrav?s da rea??o em cadeia da polimerase (PCR). A constru??o foi clonada em vetor pCRBlunt? e sequenciada para confirmar sua identidade e a aus?ncia de muta??es. O fragmento foi subclonado em vetor de express?o pET23a(+) com s?tios de restri??o NdeI e BamHI, para o N terminal e C terminal, respectivamente. C?lulas eletrocompetentes de E. coli Rosetta (DE3) foram transformadas com o plasm?deo recombinante, a regi?o que codifica para o dom?nio catal?tico da PDE5 foi expressa em sua forma sol?vel e ativa na presen?a de 0,1 mM do indutor IPTG. Quando o dom?nio catal?tico da PDE5 foi isolado, um rendimento de 2,39 mg.mL-1 foi obtido atrav?s de 3 passos de purifica??o. O dom?nio catal?tico da PDE5 puro permitir? a realiza??o de uma triagem de extratos vegetais oriundos da biodiversidade brasileira. Com o intuito de buscar novos compostos que possam se tornar poss?veis inibidores de PDE5, e assim serem utilizados no tratamento da disfun??o er?til.

A metagenômica trouxe novas perspectivas ao estudo de comunidades microbianas no ambiente, permitindo explorar tanto a diversidade taxonômica de microrganismos ainda não-cultivados, como o acesso direto a genes e vias metabólicas. Neste trabalho, foram construídas bibliotecas metagenômicas a partir de amostras de sedimentos de mangue da Baía de Guanabara (RJ), impactadas com hidrocarbonetos de petróleo e metais pesados. Proteobacteria (33,3%), bactérias afiliadas a redutoras-de-sulfato (29,7%) e Firmicutes (20%) representaram os grupos principais nas amostras ambientais, baseado em análises filogenéticas de rDNA 16S, ao passo que isolamentos seletivos utilizando diesel e naftaleno permitiram a recuperação preferencial de delta-Proteobacteria e actinomicetos. Bibliotecas metagenômicas dos sedimentos enriquecidos com óleo diesel, com insertos entre 25 e 35 Kb clonados em fosmídeos, foram triadas para detecção de genes catabólicos de monoxigenases (alkB1) e expressão de epóxido-hidrolases, esterases, lipases e monoxigenases em ensaios de alto desempenho (HTS, high throughput screening). Clones reativos a alkB1 foram detectados, porém não foram funcionais nas condições de HTS testadas. Nas bibliotecas de fosmídeos triadas, vários clones apresentaram atividade enzimática, sendo que dois apresentaram atividade de lipase-esterase com alta seletividade, elevada taxa de conversão de substratos e excesso enantiomérico (ee >99%). Os resultados de HTS comprovaram a eficiência do uso da clonagem direta de DNA ambiental na expressão de vias metabólicas de interesse com potencial de aplicação biotecnológica. / Metagenomics brought a new perspective to the study of microbial communities in the environment, enabling access to the taxonomic diversity of uncultured microorganisms, as well as direct access to genes and metabolic pathways. In the current study, metagenomic libraries were constructed from mangrove sediment samples of the Guanabara Bay (RJ, Brazil), impacted with oil hydrocarbons and heavy metals. Proteobacteria (33.3%), sulfate-reducing affiliated bacteria (29.7%) and Firmicutes (20%) represented the main groups in the environmental samples based upon 16S rDNA phylogenetic analysis, whereas selective isolation using diesel and naphtalene yielded delta-Proteobacteria and actinomycetes. Metagenomic libraries of diesel-enriched sediment samples, with 25 to 35 Kb fosmid inserts, were screened for detecting monooxigenase genes (alkB1) and expression of epoxide hydrolases, esterases, lipases and monooxigenases in high throughput screening (HTS) assays. Clones reactive to the alkB1 probe were detected, but were not functional under the HTS conditions used. Several functional clones were detected in the clone library, and two showed lipase-esterase activity with high rates of substrate conversion and enantiomeric ratio (ee >99%). The results obtained on HTS showed the efficiency of the direct cloning of environmental DNA for the expression of metabolic pathways with potential biotechnological application.

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-05-25T18:55:01Z No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-30T12:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Metagenomics studies allow the direct analysis of a genetic material in an environmental sample and when linked to bioinformatics it gives a powerful tool to explore the role of new genes and proteins not studied before. Constant decreases in the quantity of fossil fuels and their effects in the global economy and natural environment has accelerated researches in alternative fuels such as the second generation ethanol, which can be produced by vegetation biomass. However, this process demands previous hydrolysis of the lignocellulolytic material by hydrolytic enzymes to provide fermentable sugar. β-glucosidases are enzymes which plays an important role at the final step of cellulose breakdown to glucose, thus being considered the rate limiting enzyme in this process of biomass degradation. Many β-glucosidases are already known, however there is an interest to find new enzymes which are tolerant to glucose inhibition and which exhibits high activity at lower temperatures. In this study we searched for β-glucosidases (GH1) using sequences from a metagenomics database from rivers and lakes in the Amazon region developed in our laboratory. We found 3 complete open reading frames (ORFs) related to β-glucosidases and one of them was selected to be produced in E.coli in a heterologous way and to be biochemically characterized. The coding sequence of the protein named AmBgl1-LP was cloned in the plasmid pET-28a and produced an enzyme which has a molecular mass of 53,7 kDa. The enzymatic assays showed that the enzyme was active with an optimum pH of 5.5, optimum temperature of 35 °C and had a Ki for glucose of 23 mM. The enzyme does not apparently perform transgycosylation, according to the assays for pNPβGlu substrate. Supposedly, AmBgl1-LP suffers inhibition by pNPβGlu on concentrations higher than 10 mM. The enzyme showed to be capable of hydrolyzing cellobiose, pNPβGal and pNPβFuc. Thus, the enzyme is promising for use in cocktails for degradation of biomass. / A metagenômica permite estudar diretamente o material genético presente em uma amostra ambiental e quando aliada à bioinformática possibilita explorar o papel de novos genes e proteínas. A constante diminuição na quantidade de combustíveis fósseis e seus efeitos na economia global e no meio ambiente têm acelerado as pesquisas sobre combustíveis alternativos como, por exemplo, o etanol de segunda geração, o qual pode ser obtido a partir de biomassa vegetal. No entanto, o processo necessita que o material lignocelulolítico seja hidrolisado previamente por enzimas, para o fornecimento de açúcares fermentescíveis. As β-glicosidases são enzimas que participam da etapa final de degradação de celulose em glicose e são, portanto, consideradas passo limitante no processo. Muitas β-glicosidases já foram descritas, entretanto ainda há o interesse em encontrar enzimas que sejam resistentes à inibição por glicose e que exerçam sua atividade em temperaturas mais baixas. Neste sentido, o presente trabalho tratou da busca por β-glicosidases da família GH1 utilizando sequências obtidas a partir de um estudo metagenômico de rios e lagos da Amazônia, realizado em nosso laboratório. Foram encontradas 3 fases abertas de leitura (ORFs) correspondentes à esta classe de enzimas e uma delas foi selecionada para ser produzida em E.coli de forma recombinante e ser caracterizada bioquimicamente. A sequência que codifica a proteína denominada AmBgl1-LP foi clonada em vetor pET-28a e expressa em E.coli, rendendo uma enzima com massa molecular de 53,7 kDa. Os ensaios de atividade enzimática revelaram que a enzima é ativa em pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 35 °C. Além disso, a enzima possui um Ki para glicose de 23 mM. A enzima aparentemente não realiza transglicosilação, frente aos ensaios com o substrato pNPβGli. Aparentemente a enzima sofre inibição por este substrato em concentrações maiores que 10 mM. A AmBgl1-LP mostrou-se capaz de hidrolisar celobiose, além de pNPβGal e pNPβFuc. Desta forma, a enzima mostra-se promissora para utilização em coquetéis para degradação de biomassa.