Os receptores vanilóides VR1 estão presentes em grandes quantidades no sistema nervoso periférico (SNP) e têm sido amplamente estudados como integradores de estímulos nocivos. A detecção desse sistema vanilóide também no sistema nervoso central (SNC), leva ao questionamento de qual seria o papel fisiológico dos receptores VR1 localizados no encéfalo. No presente estudo, abordamos a função desses receptores no hipocampo, estrutura essencial para a formação de memórias aversivas. Foram estudados os efeitos da administração bilateral intrahipocampal de capsaicina, um agonista vanilóide endógeno e de capsazepina, um antagonista dos receptores vanilóides VR1 sobre a etapa de consolidação da memória avaliando 3 parâmetros comportamentais (a) a tarefa de Esquiva Inibitória (b) a tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto, e (c) o Labirinto em Cruz Elevado. Nossos resultados mostram que o antagonista VR1, a capsazepina, na concentração de 10µM prejudicou a consolidação da memória somente na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto. Não foram observados efeitos na tarefa da Esquiva Inibitória e tampouco no Labirinto em Cruz Elevado, sugerindo que o sistema vanilóide participa nos processos de memória envolvendo componentes mais aversivos e que os fármacos utilizados não produziram efeito sobre a ansiedade ou atividade locomotora dos animais. As evidências sugerem um envolvimento do sistema vanilóide endógeno na modulação da consolidação de memórias com um maior grau de aversividade.

O peptídeo liberador da gastrina (gastrin-releasing peptide, GRP), pertencente à família dos peptídeos semelhantes à bombesina, e seus receptores estão presentes em todo o sistema nervoso central, em particular em áreas límbicas cerebrais como o hipocampo e a amídala, as quais estão envolvidas de forma importante na regulação emocional, na função cognitiva e em transtornos neuropsiquiátricos e neurodegenerativos. Há estudos sugerindo que receptores GRP podem ter um papel na regulação da plasticidade sináptica, de respostas emocionais e da formação da memória. Apesar disso, esse sistema tem sido relativamente pouco estudado quanto a seu papel na função cerebral e não são conhecidos os mecanismos celulares envolvidos na transdução de sinal ativada por receptores GRP no sistema nervoso. Estudos em outros tipos de células sugerem que a ativação de receptores GRP pode levar a uma ativação das vias de transdução de sinal mediadas por proteína cinase C (protein kinase C, PKC) e pela proteína cinase ativada por mitógeno (mitogen-activated protein kinase, MAPK). O envolvimento da via da adenilato ciclase/AMPc/proteína cinase A (protein kinase A, PKA) é controverso. Por outro lado, já está estabelecido que as vias de sinalização da PKC, MAPK e PKA estão envolvidas de forma crucial na formação da memória emocional na área CA1 do hipocampo dorsal. Assim, é possível que a ativação de receptores GRP module a memória através da ativação de uma ou mais dessas vias. No presente trabalho, propomos uma abordagem farmacológica de investigação, utilizamos para isso, um modelo bem estabelecido de memória emocional em roedores, para analisar as interações entre receptores GRP e os eventos biológicos que se seguem à ativação do receptor, ou seja, a ativação de cascatas de sinalização neuronal mediadas por proteínas cinases, na região CA1 do hipocampo dorsal. Ratos Wistar machos foram tratados com uma infusão bilateral de agonista do GRPR, bombesina, no hipocampo dorsal imediatamente após o treino em esquiva inibitória. Doses intermediárias de bombesina induziram uma facilitação, enquanto doses mais altas prejudicaram a retenção da memória medida 24 horas após o treino. A facilitação da memória induzida pela bombesina foi prevenida por infusões pré-treino de um antagonista GRP ou de inibidores de PKC, MAPK ou PKA, mas não por um antagonista do receptor de neuromedina B (NMB). Os resultados indicam que a modulação da consolidação da memória por GRPRs hipocampais depende das vias da PKC, MAPK e PKA. / Gastrin-releasing peptide (GRP), a bombesin-like peptide, and their receptors are gifts in all the central nervous system, particular in cerebral limbic areas as hippocampus and amigdala, which are involved in an important way in the emotional regulation, cognitive function and neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. Studies suggest that GRPR can act in synaptic plasticity regulation, emotional answers and memory formation. Although this, this system has been relatively little studied how much its paper in the cerebral function and the involved cellular mechanisms in the transdução of signal are not known activated for receivers GRP in the nervous system. Studies in other cell types suggest that activation of GRPR can active signal transduction pathways mediated by protein cinase C (protein kinase C, PKC) and mitogen-activated protein kinase (MAPK). The envolvement of protein kinase A (PKA) pathways are controversial. Already it is established that PKC, MAPK and PKA signal pathways are involved of crucial form in emotional memory formation in CA1 area of dorsal hippocampus. Thus, it is possible that the activation of GRPR modulates the memory through the activation of one or more than these ways. In present study, we propose an pharmacological investigation, using an established emotional memory model in rodents, to analyze the interactions between GRPRs and the biological events following to the receptores activation in other words, the neuronal sign cascades activation mediated by proteins kinases, in CA1 hippocampus area. Male Wistar rats received bilateral infusions of the GRPR agonist bombesin into the dorsal hippocampus immediately after inhibitory avoidance training. Intermediate doses of bombesin enhanced, whereas a higher doses impaired 24-h memory retention. The bombesin-induced memory enhancement was prefented by pretraining infusions of a GRPR antagonist or inhibitors of PKC, MAPK and PKA, but not a neuromedin B (NMB) antagonist. We conclude that memory modulation by hippocampal GRPRs is mediated by the PKC, MAPK and PKA pathways.

As memórias não são armazenadas em sua forma definitiva logo após sua aquisição. Para que isso ocorra, há a necessidade de um longo processo de estabilização conhecido como consolidação, que requer a indução de expressão gênica e de síntese proteica em várias regiões do cérebro, dentre elas o hipocampo, estrutura de importância capital para a formação de memórias declarativas. Após a consolidação, as memórias tornam-se novamente instáveis logo após a evocação, e para persistirem necessitam ser reestabilizadas através de um processo denominado reconsolidação, que também envolve a ativação de síntese proteica no hipocampo. Dentro deste cenário, até o momento da realização deste trabalho, não havia nenhum estudo disponível sobre o efeito da inibição da transcrição gênica sobre a consolidação e reconsolidação de memórias espacias, um tipo de memória declarativa dependente do hipocampo para ser formada e armazenada. Portanto, visando contribuir para o esclarecimento desta questão, no presente trabalho foi investigado o efeito da inibição pós-treino e pós-evocação da síntese de mRNA hipocampal sobre a retenção de uma memória espacial, utilizando dois distintos inibidores da síntese de mRNA. Nós mostramos que a inibição da expressão gênica no hipocampo dorsal de ratos, durante uma restrita janela temporal pós-treino ou pós-teste, prejudica a retenção da memória espacial de longa duração para a tarefa do labirinto aquático de Morris, sem afetar a memória de curto prazo, o aprendizado não-espacial, ou a funcionalidade do hipocampo. Nossos resultados indicam que a consolidação de uma memória espacial induz a ativação da maquinaria transcricional hipocampal, e sugere a existência de um processo de reconsolidação dependente de expressão gênica que funciona no hipocampo dorsal no momento da evocação para estabilizar o traço mnemônico reativado.

O enriquecimento ambiental pode ser considerado uma condição que proporciona aumento da estimulação sensorial, cognitiva e motora, que levaria, a curto e longo prazos, a mudanças comportamentais importantes. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da exposição ao enriquecimento ambiental (1) na ansiedade e memória aversiva, ambos no labirinto em cruz elevado, (2) na memória operacional espacial no labirinto aquático de Morris, e (3) na neurogênese hipocampal, em ratos. Os animais foram expostos ao enriquecimento ambiental a partir do desmame (22 dias), onde permaneceram até o último dia de teste (17º mês). Nesse período, foram submetidos ao Labirinto em Cruz Elevado (LCE) no 3º e 15º mês, e ao Labirinto Aquático de Morris (LAM) no 9º e 16º mês. Uma semana antes da exposição ao labirinto aquático, receberam uma injeção intraperitonal de bromodeoxyuridina (BrdU). Vinte e quatro horas e trinta dias após essa injeção grupos independentes de animais foram sacrificados e seus encéfalos processados imunohistoquímicamente para revelar o BrdU. O enriquecimento ambiental produziu um efeito ansiolítico em animais jovens, mas não nos idosos. A memória aversiva de animais jovens e idosos não se alterou. No labirinto aquático, enquanto os animais expostos ao ambiente enriquecido por 9 meses apresentaram uma estratégia mais eficiente de busca em relação aos respectivos controles, os animais expostos ao ambiente enriquecido por 15 meses apresentaram mais flexibilidade para se adaptar as novas situações; no entanto, o enriquecimento ambiental parece não alterar diretamente o desempenho na memória operacional espacial. Em relação a neurogênese hipocampal, o enriquecimento foi capaz de aumentar cerca de 2 vezes o número de novas células; no entanto, a exposição ao labirinto aquático foi capaz de aumentar a taxa de sobrevivência de novos neurônios / Environmental enrichment in laboratory animals is a housing condition that provides enhanced sensorial, motor and social stimulation as compared to maintenance in standard laboratory cages. It has been claimed that this kind of stimulation improves cognition. The aim of this study was to investigate the effects of exposure to environmental enrichment on anxiety and aversive memory in the elevated plus maze, spatial working memory in the Morris\' water maze, and hippocampal neurogenesis. The animals were subjected to environmental enrichment from weaning (22 days) up to the last test (17 months). During this period, they were tested in the 3rd and 15th months of life in the elevated plus maze, and in the 9th and 16th months of life in the Morris\' water maze. A week before exposure to the water maze, the animals received an intraperitoneal injection of BrdU. Twenty-four hours and 30 days after the injection independent groups of animals were sacrificed for performing immunohistochemistry. Exposure to the enriched environment rendered young animals, but not elderly, less anxious. In addition, the aversive memory of both groups remained unchanged along aging. In the Morris\' water maze, animals exposed to the enriched environment showed a more effective searching strategy to find the hidden platform on the first trial than the controls, when tested at 9 months. In addition, the flexibility to deal with novel situations at 15 months was greater for animals exposed to the enriched environment. Even though, exposure to the enriched environment did not alter performance of spatial working memory. Environmental enrichment doubled hippocampal neurogenesis, and the survival of the new neurons was greater when the subjects were exposed to the Morris\' water maze task

Orientador: Benito Pereira Damasceno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T22:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_AndreaAlessioVieira_M.pdf: 6987542 bytes, checksum: d044046169aba9683f8fa0cae5fcf70f (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A epilepsia do lobo temporal (LT), por envolver muitas vezes o sistema hipocampal costuma acompanhar-se de alterações de memória. Entretanto, na maior parte dos estados, a influência do foco epileptogênico e da atrofia hipocampal e/ou alteração de sinal na ressonância magnética (RM) compatível com esclerose medial temporal (EMT) está confundida com outras variáveis, como o efeito da lateralidade das alterações em RM, da história prévia de convulsão febril prolongada na infância e de estado de mal epiléptico, da idade de início das crises, da duração da epilepsia, da frequência de crises e das drogas anticonvulsivantes. Como tentativa de elucidar tais influências, estudamos 20 pacientes com ELT e alterações compatíveis com EMT nas imagens de RM e 15 pacientes com ELT e exames de neuroimagem normais, de ambos os sexos e idade entre 16 e 50 anos. A avaliação neuropsicológica incluiu: Teste de Percepção de Cores, Teste de Percepção de Formas, Wechsler Adult Intelligence Scale -Revised (WAIS-R)- subtestes Vocabulário e Cubos, Teste de Dominância Manual, Teste de Discriminação Auditiva, Teste de Audição Dicótica, Boston Naming Test, Teste de Fluência Verbal, Teste de Vigilância, Trail Making Test, Wisconsin Card Sorting Test e Wechsler Memory Scale- Revised (WMS-R). A avaliação neurológica incluiu: Eletrencefalogramas (EEG) seriados, Vídeo-EEG, Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT) e RM. A EMT se correlacionou com história prévia de estado de mal epiléptico (p=0.01), idade precoce de início das crises (p<0.01), longa duração da epilepsia (p<0.01), alta freqüência de crises (p<0.01), medicação anticonvulsivante utilizada (p<0.01), redução de QI (p<0.01), distúrbios de nomeação (p=0.05) e produção espontânea de palavras (p<0.01) e défietts de memória gerai (p<0.01), memória verbal (p<0.01) e evocação tardia (p<0.01), mas não com história prévia de convulsão febril na infância (p=0.60), atenção e concentração, funções executivas ou memória visual (p=0.44). Os déficits de memória se correlacionaram com idade de início precoce das crises, longa duração da epilepsia, alta frequência de crises e medicação anticonvulsivante utilizada, mas não com história prévia de convulsão febril (p=1.00) ou estado de mal epiléptico (p=0.30). A lateralização do foco epileptogênico e da atrofia hipocampal a esquerda se correlacionou com déficits de memória verbal (p=0.04 e p=0.03, respectivamente), não sendo o mesmo verdadeiro para lateralização do foco e da atrofia a direita e déficits de memória visual (p=0.74 e p=0.28, respectivamente). Esses achados confirmaram nossas hipóteses sobre (1) a contribuição da etiologia (EMT), idade de início precoce das crises, longa duração da epilepsia, alta frequência de crises e politerapia para os déficits de memória e (2) a estreita relação entre lateralização do foco epileptogênico e da atrofia hipocampal a esquerda e alterações de memória verbal / Abstract: Temporal lobe epilepsy (TLE) is usually accompanied by memory deficits due to engagement of hippocampal system. In most studies, however, the influence of epileptogenic focus and the hippocampal atrophy and/or signal changes in magnetic resonance imaging (MRI) compatible with medial temporal sclerosis (MTS) is confounded with other variables such as the effect of lateralization of MRI changes, previous history of prolonged febrile convulsions in infancy and grand mal status, age of seizure debut, duration of epilepsy, seizure frequency and anticonvulsivant drugs. As an attempt to elucidate this question, we have studied 20 patients with TLE and MRI changes compatible with MTS and 15 TLE patients without such changes. The patients age varied from 16 to 50 years. Neuropsychological evaluation included tests for perception of colors and forms, Vocabulary and Block Design subtests of the Wechsler Adult Intelligence Scale - Revised (WAIS-R), Edinburgh Handedness Inventory, Auditory Discrimination and Dichotic Listening, Boston Naming Test (BNT), Verbal Fluency (Animals Category), Strub and Black Vigilance Test, Trait Making Test (TMT), Wisconsin Card Sorting Test (WCST) and Wechsler Memory Scale - Revised (WMS-R). Neurological investigation consisted of serial Eletrencephalograms (EEG), Video-EEG, SPECT Tomography and MRI. The MTS was correlated with with previous grand mal status (P=0.01), early debut of seizures (p<0.01), long duration of epilepsy (p<0.01), high seizure frequency (p<0.01), anticonvulsivant drugs (p<0,01), lower IQ (p<0.01), difficulties in naming (p=0.05) and finding words (p<0.01) and deficits of general memory (p<0.01), verbal memory (p<0.01) and delayed recall (p<0.01), but if was not correlated with previous history of febrile convulsions in infancy (p=0.60), attention and concentration, executive functions and visual memory (p=0.44). Memory deficits were correlated with early seizures debut, long duration of epilepsy, high seizures frequency and anticonvulsivant drugs, but not with previous fbrile convulsions (p=1.00) or grand mal status (p=0.30). The lateralization of the epileptogenic focus and hippocampal atrophy to the left was associated with déficits of verbal memory. However, as regard the lateralization of epilptic focus and atrophy to the right and deficits of visual memory, there was no correlation. This findings have confirmed our hypothesis (1) on the contributions of etiology (MTS), early debuto f seizures, long duration of epilpsy, high seizure frequency and politherapy to the defiicits of memory and (2) the colse relationship between deficits of verbal memory and lateralization of epileptogenic focus and hippocampal atrophy to the left side / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Doctor en Farmacología / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de tesis, hasta enero de 2017 / La Serotonina (5-HT) es un neurotransmisor detectado tempranamente durante el desarrollo del sistema nervioso central y recientemente se ha descrito su papel sobre los procesos de migración y morfología neuronal. Mediante la inhibición farmacológica de la síntesis de 5-HT durante el desarrollo embrionario, se ha determinado que la reducción en este neurotransmisor produce efectos a largo plazo reflejado en una disminución del peso del cerebro, alteración en la maduración neuronal y una disminución de la complejidad dendrítica. La 5-HT ejerce sus acciones a través de sus receptores ionotrópicos (5HT3) y metabotrópicos (5HT1, 5HT2, 5HT4-5HT7). Algunos de ellos se expresan tempranamente durante el desarrollo embrionario y más aún puede variar su distribución y/o niveles en forma dinámica durante el desarrollo pre y posnatal. Para efectos de esta Tesis se destacan los receptores 5HT1A y 5HT7 los cuales están presentes en estructuras cerebrales como el hipocampo. Interesantemente, el 5HT1A-R se expresa tempranamente durante el desarrollo embrionario; por lo cual se postula que la 5-HT tendría un efecto modulador sobre la migración, diferenciación y viabilidad celular. En cambio, solo se ha descrito una expresión dinámica del 5HT7-R durante el desarrollo posnatal; lo que sugiere una acción de este receptor en estadíos bien definidos. La sobre-expresión de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 en líneas celulares, ha permitido estudiar su acoplamiento a distintas cascadas transduccionales. Se ha descrito el acoplamiento a diversas proteínas G que permiten la activación o inhibición de proteínas efectoras como AC, fosfolipasas, regulación de canales iónicos y activación de las vías MAPK y PI3K-Akt, entre otras. Estas vías participan promoviendo la formación de neuritas y dendritas y han sido involucradas con la regulación de la plasticidad sináptica. En contraste, los efectores de estos receptores descritos en líneas celulares no han sido bien definidos en neuronas. Si bien existen algunos antecedentes que apoyan la idea de que la 5-HT regula la morfología neuronal, no se ha establecido la participación de un subtipo de receptor en particular. La activación del 5HT1A-R induce un aumento en el número y largo de neuritas en neuroblastoma de ratón. En relación a estos cambios morfológicos, se ha descrito que la vía de las Rho GTPasas regula el citoesqueleto a través de la modulación de la cofilina, importante regulador del citoesqueleto de actina. Se ha demostrado un acoplamiento entre el 5HT7-R y Gα12 y el aumento del crecimiento de neuritas en neuronas hipocampales, aunque no se ha dilucidado cuáles son sus efectores río abajo. De acuerdo a estos antecedentes se postuló la siguiente hipótesis: “Agonistas de los receptores 5HT1A y 5HT7 activan vías transduccionales que modulan el citoesqueleto, efectos que se asocian a cambios morfológicos de neuronas hipocampales en cultivos”. Los objetivos fueron: 1) Determinar en neuronas hipocampales con distinta madurez, el efecto de agonistas de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 sobre proteínas que participan en vías transduccionales, que tienen como blanco el citoesqueleto de microtúbulos y de actina, como Akt-GSK-3β, ERK y cofilina, respectivamente. 2) Determinar el efecto de agonistas de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 sobre la morfología de neuronas hipocampales con distinta madurez. Estos objetivos se desarrollaron utilizando antagonistas específicos para los receptores 5HT1A (WAY-100635) y 5HT7 (SB269970). En esta tesis se demostró que la distribución del receptor 5HT1A experimenta una polarización a mayor madurez del cultivo, encontrándose tempranamente en el soma y más tardíamente con una localización somato-dendrítica, sin variar el nivel del receptor. En contraste, la distribución somato-dendrítica del 5HT7-R fue independiente de la madurez del cultivo. A su vez, se detectaron las isoformas 5HT7a-R y 5HT7b-R y cuya relación no varió durante los días del cultivo in vitro (DIV). No obstante, ambas isoformas aumentan significativamente entre los 2 y 14 DIV. El 8OH-DPAT, agonista de los receptores 5HT1A (Ki 10 nM) y 5HT7 (Ki 52 nM), promueve la activación de la vía Akt-GSK-3β a los 2 DIV, efecto que involucraría la participación del 5HT7-R y, probablemente al 5HT1A-R. Adicionalmente, el 8OH-DPAT en neuronas más maduras (7 DIV), aumentó la activación de la Akt, efecto independiente de los receptores 5HT1A y 5HT7. Estos resultados sugieren que este agonista puede activar a otros receptores, lo que plantea una reevaluación de su acción como agonista selectivo del 5HT1A. Por otra parte, a pesar de la activación de la Akt, no se observaron cambios en la fosforilación de la GSK-3β, sugiriendo una disociación de ambas quinasas a este estadío. Adicionalmente, el 8OH-DPAT ó la 5-HT no modificaron significativamente el estado de fosforilación de las ERK1/2. La estimulación durante 24 horas con 8OH-DPAT en neuronas con 2 DIV aumentó significativamente el número de las neuritas primarias, acompañado de un aumento en el largo neurítico total; efectos no asociados a los receptores 5HT1A y 5HT7. Estos resultados sugieren que el 8OH-DPAT activa un receptor que incrementa el número de neuritas sin afectar su largo. Interesantemente, se observó que la estimulación con 8OH-DPAT disminuyó significativamente la fosforilación inactivante de la cofilina en Ser3; efecto insensible a la acción de los antagonistas de los receptores 5HT1A y 5HT7. Similarmente, a los 7 DIV se observó una disminución significativa de los niveles fosforilados de cofilina luego de la estimulación con 5-HT, efecto no asociado a los receptores 5HT1A y 5HT7, sugiriendo la participación de un receptor serotoninérgico desconocido sobre la dinámica de actina. Adicionalmente, la activación del 5HT7-R con 8OH-DPAT y 5HT a los 2 DIV durante 24 h disminuye el número de las dendritas primarias pero promueve el crecimiento. A este mismo estadío neuronal, la 5-HT a través de 5HT1A-R y 5HT7-R aumentó el crecimiento de dendritas secundarias. Por otro lado, se demostró a los 8 DIV que la 5-HT aumenta el número de dendritas primarias más cortas a través de un receptor serotoninérgico desconocido. Adicionalmente, los cambios inducidos por la 5-HT a los 8 DIV, indican que el 5HT1A-R promueve una reducción en el largo de las dendritas primarias, fenómeno observado por la reducción en el número de las dendritas primarias más largas (> 40 μm); efecto también observado en las secundarias más largas (> 20 μm). En apoyo, el análisis de Sholl muestra una disminución de la complejidad neuronal asociada a este receptor. Es decir, el 5HT1A-R inhibe el crecimiento y la complejidad dendrítica, probablemente al frenar el crecimiento o elongación de éstas, quedando por establecer los mecanismos moleculares asociados. En apoyo a este hallazgo, se ha descrito recientemente en hipocampo de ratón adulto que el 5HT1A-R produce una disminución de las dendritas terciarias. En contraste, a los 8 DIV el 5HT7-R promueve un aumento del crecimiento de dendritas primarias y secundarias, siendo este último efecto también observado por la estimulación del 5HT1A-R. En resumen, el 5HT1A-R promueve una disminución de la complejidad dendrítica, en contraste al efecto positivo de la activación del 5HT7-R observado a nivel de las neuritas y dendritas; sugiriendo que estos receptores pueden modular la morfología neuronal de forma diferencial dependiendo de la madurez del cultivo. Además, por primera vez se involucra la participación de los receptores 5HT1A y 5HT7 sobre la morfología neuronal en cultivo primario de hipocampo de rata. Además, este estudio muestra los efectos de agonistas serotoninérgicos sobre vías transduccionales relacionadas a la modulación del citoesqueleto y cambios en la morfología que depende de la madurez de neuronas hipocampales. / Serotonin (5-HT) is a neurotransmitter found early during development of the central nervous system and recently it has been involved in cell migration and neuronal morphology. The pharmacological inhibition of 5-HT synthesis during embryonic development suggests that its reduction produces long-term effects reflected as decreased brain weight, altered neuronal maturation and reduction of dendritic complexity. The 5-HT exerts its actions through ionotropic (5HT3) and metabotropic (5HT1, 5HT2, 5HT4-5HT7) receptors. Some of these receptors are expressed early during embryonic development and their distribution or levels can change dynamically during pre-and postnatal development. This thesis focuses on 5HT1A and 5HT7 receptors, which are present in brain structures such as the hippocampus. Interestingly, the 5HT1A-R is expressed early during embryonic development, suggesting that 5-HT could have a modulating effect on cell migration, differentiation and viability. In contrast, a dynamics expression of 5HT7-R has been described during postnatal development, suggesting a role in well-defined neuronal stages. Overexpression of 5HT1A and 5HT7 serotonin receptors in cell lines has allowed studying their coupling to several transduction pathways. These receptors are coupled to several G protein allowing the activation or inhibition of effector proteins such as AC, phospholipases, regulation of ion channels and activation of MAPK and PI3K-Akt, among others. These pathways promote neurites and dendrites formation, and have been implicated in the regulation of synaptic plasticity. In contrast, the effectors of these receptors described in cell lines have not been well defined in neurons. Although some evidences support the idea that 5-HT regulates neuronal morphology, it has not been established which serotonergic receptors are involved. The 5HT1A-R activation induces an increase in both the number and length of neurites in mouse neuroblastoma. In relation to these morphological changes, it has been described that Rho GTPases pathway regulates the cytoskeleton through the modulation of cofilin, an important regulator of actin dynamics. Additionally, a link between 5HT7-R, activation of Gα12 and the increase of neurite outgrowth in hippocampal neurons has been described, but it has not been elucidated the transduction pathway involved. According to these evidences, the following hypothesis was proposed: “Agonists of 5HT1A and 5HT7 receptors activate pathways that modulate the cytoskeleton, effects that are associated with morphological changes in cultured hippocampal neurons." The aims were to: 1) Determine, the effect of 5HT1A-R and 5HT7-R agonist on proteins involved in transduction pathways, targeting microtubule and actin cytoskeleton like Akt-GSK- 3β, ERK and cofilin, respectively, on hippocampal neurons with different maturity. 2) Determine the effect of 5HT1A-R and 5HT7-R agonist on morphology of hippocampal neurons with different maturity. These objectives were developed using specific antagonists of 5HT1A (WAY-100635) and 5HT7 (SB269970) receptors. In this thesis it was shown that the distribution of 5HT1A receptor undergoes a polarization during the maturity of neurons, being early found in the soma and late with a somato-dendritic distribution but without changes on receptor levels. In contrast, the somato-dendritic distribution of 5HT7-R was independent of neuronal maturity. Besides, the isoforms “a” and “b” of 5HT7-R were detected without changes in their ratio during days in vitro (DIV). Nonetheless, both isoforms increased significantly from 2 to 14 DIV. The 8OH-DPAT, a 5HT1A (Ki 10 nM) and 5HT7 (Ki 52 nM) receptor agonist, promotes the activation of the Akt-GSK-3β pathway at 2 DIV, effect which involves the participation of 5HT7-R and probably the 5HT1A-R. Additionally, in more mature neurons (7 DIV) stimulation with 8OH-DPAT increased activation of Akt, an effect independent of 5HT1A and 5HT7 receptors. These results suggest that this agonist may activate other receptors, and hence demands a reconsideration of its action as selective 5HT1A agonist. Moreover, in spite of Akt activation, no changes were observed in the phosphorylation levels of GSK-3β, suggesting dissociation of both kinases at this stage. Additionally, neither 8OH-DPAT nor 5-HT altered the phosphorylation levels of ERK1/2. Stimulation for 24 hours with 8OH-DPAT at 2 DIV significantly increased the number of primary neurites, accompanied by an increase in the overall length of neurites; effects which are not related to 5HT1A and 5HT7 receptors. These evidences suggest that 8OH-DPAT targets an unknown receptor whose activation increases the number of neurites without affecting their length. Interestingly, it was observed that stimulation with 8OH-DPAT significantly decreased the inactivating phosphorylation of cofilin in Ser3; an effect insensitive to the antagonists of the 5HT1A and 5HT7 receptors. Similarly, a significant decrease of phosphorylated cofilin levels after stimulation with 5-HT was observed at 7 DIV; effect not associated to 5HT1A and 5HT7 receptors, suggesting the participation of an unknown serotonin receptor modulating actin dynamics. Additionally, the 5HT7-R activation with 8OH-DPAT and 5-HT at 2 DIV during 24 h decreases the number of primary dendrites but promotes its growth. At this neuronal stage, 5-HT stimulates secondary dendrite growth through both 5HT1A-R and 5HT7-R. Furthermore, this thesis demonstrated at 8 DIV that 5-HT increases the number of short primary dendrites via an unknown serotonergic receptor. Additionally, the changes induced by 5-HT at 8 DIV, indicate that 5HT1A-R promotes a reduction in the length of the primary dendrites, a phenomenon observed as reduction in the number of longer primary dendrites (> 40 um); effect also observed in longer secondary dendrites (> 20 um). In accordance, Sholl analysis shows a decrease in neuronal complexity associated with this receptor. Thus, 5HT1A-R inhibits primary dendritic growth and complexity, probably by slowing the growth or elongation, and the molecular mechanisms associated remains to be explained. In support of this finding, it has been recently described in adult mouse hippocampus, that 5HT1A-R promotes a decrease of tertiary dendrites. In contrast, this Thesis described that 5HT7-R induces an increased growth of primary and secondary dendrites at 8 DIV; being the latter effect also observed by 5HT1A-R stimulation. To summarize, the 5HT1A promotes a reduction of dendritic complexity in contrast to the positive effect of 5HT7 receptors observed in both neurites and dendrites; suggesting that these receptors differentially modulate the neuronal morphology depending on neuron maturity. Furthermore, we described for first time the participation of 5HT1A and 5HT7 on neuronal morphology in primary culture of rat hippocampal neurons. Additionally this study shows the effects of serotonergic agonists on transduction pathways related to cytoskeleton modulation and morphological changes depending on maturity of hippocampal neurons. / Conicyt

Orientador : Gilberto D'Assunção Fernandes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:37:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_HeloisaHelenadeAraujo_M.pdf: 4240166 bytes, checksum: 531bf942014691e1a6c9d8b99878df85 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: O presente trabalho compreende o estudo de alterações na resposta imune decorrentes de modificações neuroendócrinas e endócrinas causadas pelo estresse e por lesão no hipocampo dorsal.o objetivo desta pesquisa foi a investigação da importância do hipocampo na modulação do SI pelo SNC, tendo-se em consideração sua estreita relação com os mecanismos endócrinos que modulam a RI e que são desencadeados pelo estresse. Os resultados obtidos permitem as seguintes conclusões: 1 - A lesão na região do hipocampo processada em nossos experimentos não foi efetiva em causar modificações nos níveis basais de corticosterona plasmática, pelo fato de ter destruído áreas inespecíficas para determinação de influências diferenciadas no eixo HHA. 2 - A diminuição do peso do timo decorrente da lesão no hipocampo não foi em conseqüência do mecanismo de ação da corticosterona e estudos pormenorizados são necessários para identificar outros fatores envolvidos neste mecanismo. 3 - A lesão no hipocampo não influenciou os níveis de corticosterona plasmática logo após o estresse e sim na manutenção destes até o quinto dia, sugerindo, nesta ocasião, uma ausência de percepção ao estímulo estressante. 4 - o hipocampo dorsal exerce papel importante na modulação do SI pelo SNC desde que a lesão desta estrutura causou um aumento da resposta imune. 5 - A lesão no hipocampo e a alteração da resposta imunológica ao estresse, confirma os dados da literatura baseados em estudos neuroendócrinos de que o hipocampo é via moduladora para expressão de resposta aos estímulos p-stressantes. 6 - O aumento de resposta imune nos ratos lesados no hipocampo, submetidos ou não à contenção, pode ser atribuído, dentre outros fatores, à diminuição dos níveis de corticosterona e, portanto, de seus efeitos imunossupressivos. A ausência de percepção do estímulo estressante após cinco dias nestes ratos, evidenciado por baixos níveis de corticosterona e aumento da RI, reforça esta noção / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes Cendes, André Schwambach Vieira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-28T00:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MoratodoCanto_Amanda_M.pdf: 2477839 bytes, checksum: f2e9db3a96d271cc686d6d66697b0e59 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O uso de modelos animais para estudo de doenças humanas é importante para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos destas doenças. Particularmente, os modelos que reproduzem a Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) em roedores, apresentam uma epileptogenicidade similar à encontrada em tecidos "epilépticos" humanos quando estudados ex vivo. A ELT afeta cerca de 40% dos pacientes adultos, e é caracterizada clinicamente por um desenvolvimento progressivo de crises epilépticas com foco no lobo temporal. Pacientes que apresentam ELT normalmente não respondem aos tratamentos. Destas, a Epilepsia do Lobo Temporal Mesial (ELTM) e a mais comum e se caracteriza pelo acometimento das estruturas mesiais do lobo temporal, como o caso da Esclerose Hipocampal. A proteômica dispõe de ferramentas poderosas que nos permitem elucidar mecanismos biológicos complexos, encontrar proteínas alteradas em todo o organismo e descrever padrões de expressões proteicas em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Portanto, é relevante analisar esse padrão de expressão no hipocampo de modelos animais de ELTM usando técnicas de proteômica, a fim de gerar informações que nos auxiliem no entendimento dos mecanismos envolvidos na epileptogênese desses modelos. No presente estudo, as proteínas identificadas podem nos indicar novas vias envolvidas com a epileptogênese. Além disso, nossos dados demonstram que uma complexidade molecular adicional pode ser observada quando analisamos as diferentes sub-regiões do hipocampo separadamente. Portanto, acreditamos que a integração dos dados de proteômica com dados obtidos por outras "ômicas" podem gerar dados ainda mais informativos sobre esses processos neuronais / Abstract: Studies about human diseases using animal models are really important to our understanding about the physiopathology mechanisms from those diseases. Particularly, the models that reproduce the Temporal Lobe Epilepsy (TLE) in rodents, presents epileptogenicity similar to that found in ex vivo human tissues. The TLE affects around 40% of the adult patients and it is clinic characterized by a progressive development of seizures with temporal lobe focus, caused by an unbalance between the excitatory and inhibitory neurotransmission. Patients who present that type of epilepsy normally don¿t respond well to the treatments. Of this type of epilepsy, the Mesial Temporal Lobe Epilepsy (MTLE) is the most common one and it is characterized by the commitment of the mesial temporal lobe structures, such as in the Hipocampal Sclerosis. To realize these studies the proteomics has many powerful tools that allow us to elucidate complex biological mechanisms, to find altered proteins in the whole organism and describe protein expression patterns in different physiological and pathological conditions. Therefore, it¿s relevant to study this protein expression pattern in the hippocampus of animal models of MTLE using proteomics techniques, searching for informative data that lead us to the understanding of the involved mechanisms in the epileptogenicity. In this study we identified proteins that can indicate new pathways involved in the epileptogenesis processes. Furthermore, our data demonstrate that additional molecular complexity could be observed as hippocampal subfields were analyzed separately. We believe that the further integration of the proteomic data with other "omics" approaches could generate even more informative data about those neuronal processes / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

A administração sistêmica da peçonha bruta da cascavel Sul-Americana (Crotalus durissus terrificus, Cdt) induz prejuízos de memória espacial em ratos, sugerindo a ocorrência de dano hipocampal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas In vivo e In vitro, a fim de testar os potenciais efeitos centrais do veneno de Cdt e da crotoxina (CTX), principal neurotoxina componente da peçonha bruta da serpente. Foram investigados (1) efeitos comportamentais da administração sistêmica e intrahipocampal do veneno de Cdt e da CTX envolvendo diferentes versões do labirinto aquático de Morris; (2) a morte neuronal, o curso temporal e a ação protetora do soro anticrotálico à exposição de culturas organotípicas de hipocampo a doses crescentes (0,05-1 &mu;g/mL) do veneno bruto de Cdt e de CTX, por meio da coloração fluorescente por Iodeto de propídeo (PI) (que reflete a morte neuronal); e (3) alguns dos possíveis mecanismos fisiopatológicos do envenenamento experimental em culturas de hipocampo utilizando o antagonista de receptores AMPA de glutamato, NBQX, à administração de 0,05 &mu;g/mL do veneno bruto de Cdt, para avaliar a possível participação do glutamato e seus receptores na morte neuronal. A administração sistêmica e intrahipocampal do veneno bruto de cascavel em ratos promoveu marcados prejuízos de memória espacial de referência e operacional. Diferentemente, a CTX promoveu prejuízos comportamentais apenas quando a administração foi intrahipocampal. As culturas expostas ao veneno bruto apresentaram dano sobretudo nas células piramidais de CA1, enquanto as culturas incubadas com CTX não apresentaram danos. Essa seletividade em relação ao CA1 foi mais proeminente nas doses baixas. O soro anticrotálico preveniu a morte neuronal quando administrado até uma hora após a exposição do veneno. O NBQX preveniu parcialmente o dano em CA1 indicando a participação de receptores AMPA de glutamato na cascata de eventos que subjazem os danos a estas células causados pela peçonha bruta de Cdt. Estes achados podem contribuir para a tanto para elucidação dos mecanismos quanto para a conduta utilizada durante o envenenamento crotálico / Systemic administration of the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus, Cdt) venom in rats permanently disrupts performance in hippocampus-dependent spatial memory tasks, thus indicating the occurrence of damage to this brain area. In vivo and In vitro approaches were employed in the present study to investigate the effects of the venom and its main compound, crotoxin (CTX). We investigated (1) behavioral effects after both systemic and intrahipocampal administration of either venom or CTX in rats on performance in different versions of the Morris\' water maze task; (2) neuronal death, evaluated by the intensity of propidium iodide (PI) fluorescence (neurotoxicity of the venom and of CTX, and the protection by the antivenom, on organotypic hippocampal slice cultures, were evaluated by comparing slices exposed to venom and (1) slices treated only with vehicle - negative control - and (2) slices incubated with 1 mM glutamate - positive control for maximal neuronal death), and the time course of neurotoxic effects of 0.05-1 &mu;g/mL of crude Cdt venom and CTX, and the Brazilian anticrotalid serum on organotypic hippocampal slice cultures; and (3) provide an initial screening of the mechanisms underlying the venom action on cultured hippocampal slices, using the AMPA receptor antagonist NBQX and the crude venom at 0.5 &mu;g/mL dose, to test whether the neuronal damage is mediated by glutamate following the experimental envenomation. Both systemic and intrahippocampal administration of Cdt venom induces permanent disruption of spatial reference memory and spatial working memory in rats. In contrast, CTX only promoted behavioral effects when administered intrahippocampally. Slices exposed to Cdt venom, but not to CTX, exhibited substantial neuronal damage. This effect was particularly prominent in the CA1 sub-field at lower concentrations of the venom. The antivenom prevented damage when applied until 1 hour after the exposure of the venom. The NBQX partially prevented damage to CA1, thus indicating that AMPA receptors play a role in the damage caused by the Cdt venom. These findings may be helpful in the elucidation and management of rattlesnake envenomation

O presente estudo avaliou (1) a memória espacial de ratas Wistar expostas a diferentes formas de experiência maternal [primiparidade (PRIM), sensibilização maternal pela exposição a filhotes adotivos (SENS) e primiparidade com privação de contato com os filhotes por 6 horas diárias (PRIV), em comparação com a nuliparidade (NUL)] em tarefas espaciais de memórias de referência e operacional no labirinto aquático de Morris. Os resultados revelaram ausência de diferenças quando os animais são avaliados após o desmame dos filhotes, enquanto que o período de contato com os mesmos resultou em comportamentos relacionados à ansiedade em ratas SENS. Adicionalmente, ratas PRIV exibiram melhor desempenho no teste de memória operacional, possivelmente devido a um efeito de enriquecimento ambiental pela exposição intermitente e contínua aos filhotes durante o período de lactação. Ainda, comparou- se (2) o desempenho de ratas PRIM e NUL das linhagens Wistar (W) e Sprague-Dawley (SDW) nas mesmas tarefas comportamentais no labirinto aquático. As ratas PRIM-SDW exibiram melhores desempenhos em relação às NUL-SDW e também em relação às PRIM-W no teste de memória de referência, enquanto que no teste de memória operacional, as ratas PRIM-SWD exibiram um desempenho superior em relação às PRIM-W. Adicionalmente, ratas SWD, independentemente da experiência maternal, exibiram estratégias de busca mais eficientes para cumprir a tarefa. Por fim, (3) avaliou-se o desempenho de ratas PRIM e NUL da linhagem SWD expostas a um ambiente enriquecido (AE) em comparação com ratas PRIM e NUL mantidas em gaiolas comuns de laboratório (STD) em tarefas de localização e reconhecimento de objetos, bem como as taxas de neurogênese hipocampal desses animais. Os resultados mostraram que as ratas PRIM-AE foram mais sensíveis à alteração na disposição espacial de um objeto familiar em comparação com as NUL-AE. Adicionalmente, as ratas NUL e STD exibiram mais comportamentos relacionados com ansiedade e estresse. Os resultados anatômicos mostraram que a experiência maternal e a exposição ao AE por 45 dias não geraram alterações na neurogênese hipocampal em ratas SWD. Estes resultados mostram que diferentes formas de experiência maternal exercem alterações distintas sobre o comportamento de ratas, de forma dependente do momento em que os animais são avaliados e da linhagem de ratas utilizadas. Adicionalmente, mostram que o AE gera alterações de memória espacial e produz efeitos ansiolíticos, particularmente em ratas PRIM. / Maternal experience in rats induces changes in brain and behavior. This study compared (1) spatial memory performances of primiparous (PRIM), pup-induced maternal behaviors (SENS), 6h/daily pup-deprived primiparous (DEP) and nuliparous (NUL) Wistar rats in the reference and working memory versions of the Morris water maze task. No differences were found when the animals were tested after pup\'s weaning/exposure. On the other hand, lactation/pup exposure period induced anxiety-like behaviors in SENS rats when tested during this period. In addition, DEP rats showed better performances in the working memory task, which may be an \"environmental enrichment effect\" due the intermittent exposure to the offspring during lactation. We also compared (2) spatial performances of PRIM and NUL rats from 2 different strains, e, Wistar (W) and Sprague-Dawley (SDW) in the same tasks described in the first experiment. The results showed better performances of PRIM-SDW groups relative to both NUL-SWD and PRIM-W in the reference memory task, while PRIM-SWD outperformed PRIM-W rats in the working memory task. Additionally, SWD rats, regardless their reproductive status, showed better performance in relation to their search strategies to find the hidden platform. Lastly, we (3) evaluated performances of PRIM and NUL Sprague-Dawley rats exposed to an enriched environment (EE) compared to NUL and PRIM rats housed in standard laboratory cages (STD) in an object placement and object recognition task. All groups were injected with BrdU in order to assess hippocampal cell proliferation, differentiation/migration, and cell survival in these animals. In the place object task, PRIM-AE rats exhibited better performances compared to NUL-AE rats. In addition, NUL and STD rats showed more anxiety and stress-related behaviors. The anatomical data showed no differences among all groups, indicating that enriched environment in a regimen of 45 days exposure or maternal experience had no influence on the hippocampal neurogenesis in Sprague-Dawley rats. Taken together, these data show that different forms of maternal experience in rats induce different effects on behavior, in a time and strain-dependent manner. Also, the results showed that exposure to an enriched environment induced spatial memory alterations and anxyolitic effects, mainly in PRIM rats.