L’objectif général du travail de thèse a donc été d’analyser le rôle respectif du volume tumoral et des paramètres pharmacocinétiques dans la réponse au rituximab en utilisant des moyens d’imagerie adaptés aux modèles murins et à la cancérologie. Dans une première partie nous avons utilisé une lignée lymphomateuse T (El4) syngénique de souris C57Bl6J, transduite par le CD20 humain et transfectée avec le gène de la luciférase. Dans une seconde partie une seule injection de rituximab a été réalisée et la concentration a été évaluée par une méthode ELISA. L’analyse des concentrations au cours du temps nous a permis de montrer une très grande variabilité d’exposition au rituximab semblable à l’observation faite chez l’homme. Nous avons pu modéliser les concentrations de rituximab et la progression des foyers tumoraux par la construction d’un modèle concentration/effet nous permettant de démontrer l’existence d’une relation entre l’efficacité du rituximab et le volume tumoral. Enfin dans un troisième volet nous avons utilisé le modèle cellulaire afin d’évaluer in vitro l’usage de particules d’oxydes de gadolinium ou de bore. / The overall objective of this work of thesis was to analyze the respective role of tumor burden and pharmacokinetic parameters in the response to the rituximab by using systems of imagery adapted to murine models and to cancerology. In a first part of development of the model we used a T lymphoma cell line (El4) syngenic of mouse C57Bl6J, transduted by the human CD20 and transfected with luciferase gene. In a second part, one injection of rituximab was carried out and the circulating concentration was evaluated by an ELISA method. The analysis of the rituximab concentrations in the course of time enabled us to show a very important variability of exposure to the rituximab similar to the observation made for the human. We realized a model of the rituximab concentrations and of the tumors evolution by the construction of a concentration/effect model allowing us to show the existence of a relation between the effectiveness of the rituximab and tumor burden before treatment. Finally in a third part we used the cellular model El4-huCD20-Luc in order to evaluate in vitro the use of gadolinium oxide particles or boron and gadolinium oxide particles.

Trois bactéries du genre Yersinia sont pathogènes pour l’homme : Yersinia pestis (bacille de la peste), et les bactéries entéropathogènes Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia enterocolitica. Yersinia pestis est responsable de plus de 20 000 cas humains de peste déclarés à l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) ces dix dernières années dans différents foyers en Afrique, Asie et Amériques. Considérée aujourd’hui à tort comme une maladie du passé, elle est au contraire classée parmi les maladies réémergentes Même si elle ne se présente plus sous la forme d’épidémies massives, elle pose encore au monde actuel d’importants défis de par son extrême gravité, sa rapidité de dissémination, une apparition de résistances aux antibiotiques et une éventuelle utilisation terroriste du bacille. Dans ce contexte, l’immunothérapie contre Y. pestis pourrait être une bonne alternative pour traiter la peste bubonique et pulmonaire. Un des objectifs de cette thèse était de produire des anticorps monoclonaux murins contre trois protéines de l’injectisome (YscF, YscC et LcrV), un facteur de virulence clé des Yersinia. Les anticorps obtenus ont été caractérisés et pour certains leurs épitopes identifiés. Par la suite, en collaboration avec Elisabeth Carniel à l’Institut Pasteur, leur pouvoir neutralisant a été évalué in vivo dans un modèle murin de peste bubonique. Ces mêmes anticorps monoclonaux, produits contre les protéines de l’injectisome sont en cours d’évaluation pour la mise au point d’un test de diagnostic rapide de Y. pestis dans différents fluides et échantillons biologiques. Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia enterocolitica sont présentes dans le monde entier et sont transmises par contamination à partir de viande de porc mal cuite, de lait ou produits laitiers et de végétaux, ou par contact avec des animaux porteurs sauvages ou domestiques. Une transmission interhumaine par voie fécale-orale est également possible. Ces bactéries sont responsables très fréquemment d’infections entériques. Cependant leur recherche dans les coprocultures n’est pas réalisée de façon systématique en laboratoires d’analyses médicales du fait de leur croissance lente et difficile sur les milieux usuels, ce qui rend leur isolement à partir de fèces difficile. De plus, les procédures de routine sont coûteuses et longues. Cela entraine probablement une sous-estimation de l’incidence des infections à Yersinia entéropathogènes, la prescription de traitements non adaptés et la réalisation d’appendicectomies non nécessaires, d’où la nécessité de développer des tests de diagnostic rapides, spécifiques, sensibles et faciles à utiliser. Un des objectifs de cette thèse était de produire un panel d‘anticorps monoclonaux murins contre les principaux biotypes et sérotypes pathogènes de Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica pour le développement de tests de diagnostic immunologiques (ELISA et tests bandelettes) répondant aux caractéristiques recherchées et utilisables directement avec des échantillons biologiques humains. / Three bacteria of the genus Yersinia are pathogenic for the human: Yersinia pestis (the plague bacillus) and the enteropathogenic bacteria: Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica. Yersinia pestis is responsible for more than 20,000 human cases of plague declared to the World Health Organization (WHO) during the ten last years in different areas from Africa, Asia and America. Mistakenly considered today as a disease from the past, on the contrary, the plague is re-emerging. Even if it doesn’t occur as a massive epidemic, it still lays down a challenge to the world for its important severity, its quick spreading, the appearance of antimicrobial resistance and a potential use for terrorism. Under the circumstances, the immunotherapy against Y. pestis could be a good option to treat bubonic and pneumonic plague. One the aims of this thesis was to produce murine monoclonal antibodies against the three proteins of the injectisom (YscF, YscC, LcrV), a key virulence factor of Yersinia. The obtained antibodies were characterized and for certain, the epitopes were identified. Then, in collaboration with Elisabeth Carniel from Institut Pasteur, their therapeutic effect was evaluated in vivo with a bubonic plague model in mice. The antibodies generated against the proteins from the injectisom are now evaluated in a diagnosis test for a fast detection of Y. pestis in different biological samples. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis, the two enteropathogenic Yersinia species for humans, have a worldwide distribution and are among the most frequent agents of human diarrhea in temperate and cold countries. However, research of enteropathogenic Yersinia is not consistently performed in medical laboratories because of their specific growth characteristics, which makes their isolation from the stool samples difficult. Moreover, current procedures for isolation are expensive and time consuming, which leads to underestimation of the incidence of yersiniosis and prescriptions of inappropriate antibiotic treatments. One the aims of this thesis was to produce different murine monoclonal antibodies against the main pathogenic biotypes and serotypes of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica for the development of fast, sensitive, specific and easy-to-use immunoassays (ELISA and dipsticks), useful for both human and veterinary diagnosis.

Cette thèse a pour objectif d’identifier et caractériser des biomarqueurs liés aux traitements d’immunothérapie allergénique (ITA). En particulier, le travail s’est porté sur les biomarqueurs prédictifs de l’efficacité du traitement : leur estimation avant la prise médicamenteuse permettrait d’évaluer les bénéfices cliniques à l’issue de l’ITA. À partir d’échantillons de sérum collectés avant ITA et provenant de patients inclus dans une étude clinique contrôlée, randomisée et dirigée contre les pollens de graminées, une méthode d’analyse protéomique différentielle (la 2D-DIGE) a permis d’identifier une protéine comme candidat biomarqueur prédictif de l’efficacité de l’ITA. Dans un premier temps, les variants moléculaires de la protéine identifiée ont été caractérisés. L’analyse en spectrométrie de masse de la protéine a permis d’identifier les modifications post-Traductionnelles associées aux isoformes plus abondants dans le sérum des patients pour lesquels une réponse positive à l’ITA est observée. Une approche protéomique de quantification relative a été mise en œuvre par LC-MS/MS sans marquage, et a permis d’identifier des peptides de la protéine d’intérêt, portant des modifications post-Traductionnelles spécifiques, associés à un bénéfice clinique accru en fin d’ITA. Dans un deuxième temps, l’implication de la fétuine-A dans la physiopathologie de l’allergie a été étudiée. Des modèles cellulaires humains ont mis en évidence le caractère essentiel des acides sialiques portés par la protéine pour l’activation de la voie TLR4, dans les mécanismes de l’immunité innée initiant la réaction allergique. In vivo, les modèles murins d’asthme allergique développés ont en revanche montré la fonction anti-Inflammatoire de la protéine. La fétuine-A a donc un rôle ambivalent, mais est indubitablement liée à la régulation de l’inflammation allergique. La validation des candidats biomarqueurs peptidiques de la protéine dans d’autres cohortes cliniques représente une future étape clé, qui permettrait d’envisager l’usage de ces marqueurs en clinique, pour améliorer la sélection des patients les plus susceptibles de répondre à l’ITA. / This thesis aimed at identifying and characterizing predictive biomarkers associated with allergen-Specific immunotherapy (AIT) efficacy. In particular, we were focused on biomarkers predictive of AIT efficacy: quantifying such markers before treatment would allow estimating the final clinical benefit. For this purpose, serum samples were collected before AIT from patients included in a double-Blind, placebo controlled clinical study against grass pollen allergy. Their analysis by means of differential proteomics (2D-DIGE) pointed out a protein, named fetuin-A, as a candidate biomarker predictive of AIT efficacy. First, the protein fetuin-A isoforms were extensively characterized by mass spectrometry, and specific post-Translational modifications (PTMs) were associated to the isoforms more abundant in sera from patients positively responding to AIT. A second proteomic approach allowed identifying fetuin-A peptides, differentially expressed among groups of patients. Some peptides from the candidate protein, bearing specific post-Translational modifications (PTMs), are associated with an increased clinical benefit at the end of the treatment. In a second part, we studied the involvement of the fetuin-A during the course of allergic inflammation. Human cellular assays highlighted that sialic acids on the protein PTMs are essential to activate the TLR4 pathway, and inducing innate immune mechanisms linked to allergy. In vivo, murine models of allergic asthma showed an opposite anti-Inflammatory function of the protein. Thus, the protein fetuin-A is still ambivalent, but is undoubtedly linked to the regulation of allergic inflammation. Validation of peptides candidate biomarkers in larger clinical cohorts is of utmost interest, since using such biomarkers in clinics would improve patients’ selection and therefore clinical benefit from the treatment.

Les cellules Natural Killer (NK) sont de grands lymphocytes granuleux capables de rapidement éliminer des cellules tumorales et des cellules infectées par des virus sans immunisation au préalable. Au cours de ma thèse, j’ai analysé plusieurs paramètres impliqués dans la reconnaissance et la lyse des cellules de mélanome par les NK. J’ai montré à partir d’analyses ex vivo que les NK sanguines de patients atteints de mélanome métastatique (stade III-IV) présentent un faible potentiel lytique. Cependant, de telles NK provenant de patients mélanomes de tout stade clinique activées in vitro par de l’IL-2 lysent efficacement des lignées de mélanome métastatique. L’analyse du phénotype de NK circulantes de patients stade IV a montré une diminution de l’expression du récepteur activateur NKp46/NCR1 comparé aux NK de donneurs sains. J’ai également montré une corrélation positive entre l’expression du NKp46 à la surface des NK et la durée du stade IV. Pour caractériser les NK infiltrant le mélanome, J’ai analysé ex vivo les NK infiltrant des ganglions métastatiques (GG) provenant de 25 patients en stade III. Les GG de patients mélanomes contiennent une population unique de NK CD56brightCD16+ représentant 50% des NK dans ces GG qui expriment fortement les récepteurs NK NCR, NKG2D, KIRs et produisent une plus forte proportion de perforin comparée aux NK CD56brightCD16- ganglionnaires. Les NK immunsélectionnées à partir de GG et activées avec de l’IL-2 ou de l’IL-15 lysent rapidement et efficacement des lignées cellulaires de mélanome. Elles sont caractérisées par des capacités lytiques supérieures aux NK sanguines. De plus, afin d’évaluer l’impact des NK au cours du mélanome, j’ai analysé in situ les NK infiltrant des ganglions sentinelles positive et négatif ainsi que des tumeurs cutanées primaires. Les NK sont faibles dans les GS ; cependant nous avons montré que le nombre de NK infiltrant ces ganglions sentinelles est associé à une plus forte rechute à cinq ans des patients. Les cellules NK infiltrant les tumeurs cutanées sont présentes préférentiellement dans la zone peritumorale et sont très rares dans la tumeur.Chez les patients atteints de mélanome, les NK sanguines et infiltrant les tumeurs ont des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles différentes. Une meilleure compréhension de telles différences doit être prise en compte, ainsi la biologie des NK et de leur modulation au cours du cancer est nécessaire pour développer une stratégie thérapeutique à base de cellules NK efficace. / Cytotoxic immune effectors can control the development and growth of certain solid tumours. Among these cytotoxic effectors, NK cells are capable of rapidly eliminating tumour cells and virus-infected cells without prior immunization.The objectives of my thesis were to evaluate the potential role of NK cells in the immune response against melanoma. First, I have characterized the functional status of blood NK cells from melanoma patients at different stages of the disease. I showed that ex vivo NK cells from most advanced stage III-IV patients display low lytic potential. However, IL-2-activated NK cells from patients efficiently lyse melanoma cells and that independently to the clinical stage. Moreover, the expression of the activating receptor NKp46/NCR1 by blood NK cells was decreased in stage IV patients compared to healthy donors, and a positive correlation between NKp46 expression by NK cells and the duration of stage IV was found. I have also characterized ex vivo NK cells infiltrating metastatic lymph nodes (M-LN) from stage III melanoma patients. I have identified in M-LN a unique subpopulation of mature CD56brightCD16+ NK cells that expressed higher NCR, NKG2D, KIRs, and perforin levels than CD56brightCD16- NK cells counterpart. NK cells from M-LN activated with IL-2 or IL-15, rapidly lysed metastatic melanoma cell lines with higher efficiency than autologous blood NK cells. Finally, to determine if NK cells display a prognostic value, I analysed by immunohistochemistry NK cells and other immune cells infiltrating positive and negative sentinel lymph nodes (SLN). SLN are characterized by high densities of macrophages and endothelial cells, even higher in SLN+. Few NK cells and Granzyme B+ cells infiltrate SLNs while CD8+ T cells are numerous. Moreover, numbers of NK cells in SLN correlated with higher rate of 5 year-relapse of patients. Compared to SLN, primary cutaneous melanomas contain high numbers of NK cells that are preferentially localized in the periphery of the tumour and are not related to the Breslow. My findings showed that in melanoma patients, circulating and tumour infiltrating NK cells display unique phenotypic and functional characteristics, indicating that tumour may alter their function. However, they respond to cytokine activation and acquire antitumor lytic potential. In the new landscape of melanoma treatment, NK cells are worthy to be considered for combined treatment with BRAF inhibitors.

Problème de santé mondial, le cancer tue chaque année des milliers de personnes en France, malgré de réels progrès dans les traitements médicaux. Parmi ceux-ci, l'immunothérapie qui vise à stimuler le système immunitaire afin qu'il reconnaisse et élimine les cellules tumorales, fait l'objet de nombreuses études, notamment depuis la découverte de lymphocytes T spécifiques d'antigènes tumoraux.<br />Bien que les premiers essais d'activation de lymphocytes T cytotoxiques réalisés in vitro et in vivo chez l'animal avec des peptides tumoraux ou des cellules tumorales aient été encourageants, les essais cliniques de vaccination qui ont succédé ont globalement échoué. Un nouvel axe de recherche est apparu avec l'amélioration des connaissances sur la biologie des cellules dendritiques myéloïdes (mDC), dont le rôle est primordial. En effet, les mDC sont capables d'initier les réponses immunes spécifiques car elles peuvent activer les lymphocytes T naïfs et restimuler les lymphocytes mémoires avec une grande efficacité. Les mDC sont, dès lors, devenues les candidates idéales pour l'immunothérapie anti-tumorale et les essais se sont multipliés. A nouveau, alors que les expériences réalisées in vitro et in vivo chez l'animal étaient très encourageantes, les essais cliniques ont été décevants ; l'injection de mDC chargées avec des antigènes tumoraux sous différentes formes n'induit que peu de réponses cliniques. Notre hypothèse est que l'efficacité de la vaccination anti-tumorale pourrait être améliorée par une optimisation du ciblage des antigènes tumoraux vers les DC in vivo. Dans ce travail, nous avons développé de nouvelles stratégies visant à vectoriser les antigènes tumoraux pour les délivrer efficacement, voire spécifiquement aux cellules dendritiques.<br />Dans un premier temps, nous avons ciblé le récepteur au mannose, exprimé par les mDC, grâce à un vecteur chimique (le RAFT) qui permet d'accrocher à la fois des résidus mannose et des antigènes tumoraux (melan-A). Nous avons montré que le RAFT(Man)16-melan-A était efficacement endocyté par les mDC et que le peptide tumoral était cross-presenté aux lymphocytes T spécifiques.<br />Dans un second temps, nous avons opté pour une stratégie permettant d'améliorer la stabilité de l'antigène tumoral et de le délivrer dans le cytosol des cellules en utilisant des virosomes. Les virosomes sont des particules dérivées du virus de l'Influenza, dont le matériel génétique a été retiré mais qui ont conservé les protéines membranaires du virus, et qui ont la particularité de pouvoir encapsuler des peptides ou des protéines. Grâce à la présence de l'hémagglutinine, ils peuvent être endocytés et ainsi délivrer leur contenu dans le cytoplasme de la cellule. Nous avons testé un virosome encapsulant le peptide tumoral melan-A et nous avons montré que les mDC étaient capables de présenter l'antigène tumoral aux lymphocytes T et de les activer efficacement. Parallèlement, nous avons réalisé la même étude sur une autre population de cellules dendritiques, les cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDC). Ces cellules, encore largement méconnues, jouent un rôle unique dans l'immunité anti-virale grâce à la sécrétion d'IFN-. Dans ces expériences, réalisées avec une lignée de pDC développée dans notre laboratoire à partir des cellules d'un patient atteint d'une leucémie à pDC (lignée GEN2.2), nous avons montré que les pDC sont également capables de présenter un antigène encapsulé dans un virosome et d'activer efficacement les lymphocytes T spécifiques. <br />Nous avons, par ailleurs, approfondi notre étude sur les fonctions biologiques des pDC dans l'immunité antivirale, notamment leur capacité à cross-présenter des antigènes issus de l'endocytose de cellules traitées par un virus. Dans notre modèle, nous avons montré que des lymphocytes B incubés avec le virus de l'Influenza inactivé étaient phagocytés par les pDC, que les pDC étaient alors activées et que les antigènes viraux cross-présentés activaient des lymphocytes T spécifiques. Cette caractéristique confère un rôle potentiel dans l'initiation des réponses immunes au même titre que son homologue myéloïde, et un rôle intéressant dans l'immunité anti-tumorale.<br />Ainsi, à travers ce travail, nous avons développé des stratégies innovantes de vectorisation d'antigènes sur les cellules dendritiques en utilisant de nouveaux outils chimiques, viraux ou cellulaires. La validation in vitro de ces outils devra permettre, dorénavant, de mettre en place des expérimentations chez l'animal pour démontrer l'efficacité in vivo de ces stratégies.

Les métastases osseuses représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur impact négatif sur la qualité de vie des patients mais également en raison de l’absence de traitements curatif. De nouvelles pistes thérapeutiques sont explorées dont l’immunothérapie anti-cancéreuse. En tant que principales responsables du recrutement leucocytaire, les chimiokines représentent des outils potentiels dans cette approche thérapeutique. La chimiokine fractalkine (CX3CL1) est impliquée dans de nombreux mécanismes physiologiques et pathologiques, dont le métabolisme osseux, la réponse immunitaire anti-tumorale mais également l’adressage et le développement tumoral, et ce de manière différentielle selon la forme considérée de cette chimiokine. En effet, CX3CL1 a la particularité d’exister sous deux formes : membranaire atypique (propriétés d’adhésion cellulaire) et soluble, typique des chimiokines (propriétés de chimioattraction). La mise en place d’un modèle syngénique murin de métastases osseuses expérimentales de carcinome pulmonaire nous a permis d’étudier l’effet de la forme soluble de CX3CL1 sur le développement métastatique en site osseux. L’expression ectopique de CX3CL1 soluble dans les cellules tumorales pulmonaires a conduit à une diminution de leur potentiel tumorigénique, une diminution de la résorption osseuse associée à une modification du ratio OPG/RANKL en faveur d’un phénotype ostéoblastique et à une modification du recrutement leucocytaire intratumoral en faveur d’une réponse immunitaire anti-tumorale. Outre l’importance de CX3CL1 dans le remodelage osseux, ce travail souligne le rôle essentiel du microenvironnement immunitaire dans la progression tumorale. Dans ce contexte, la forme soluble de CX3CL1 pourrait représenter un outil prometteur dans l’arsenal thérapeutique des métastases osseuses / Bone metastases represent a major public health issue due to their negative impact on patient’s quality of life as well as the current lack of curative treatment. New therapeutic leads are being investigated, among which is the anti-cancer immunotherapy. As the main molecules responsible for leukocyte recruitment, chemokines appear as potential tools for this therapeutic approach. The chemokine fractalkine (CX3CL1) is implicated in numerous physiological and pathological mechanisms, including bone metabolism, antitumor immune response as well as tumor homing and proliferation, in a differential manner depending on the considered form of CX3CL1. Indeed, the particularity of CX3CL1 is that it can exist under two forms: an atypical membrane-bound form (strong cellular adhesion) and a chemokine typical soluble form (chemoattraction). The development of a mouse syngeneic model of lung cancer experimental bone metastases allowed us to study the effect of the soluble CX3CL1 on metastatic development in a skeletal location. The ectopic expression of soluble CX3CL1 in the lung cancer cells led to a decrease of their tumorigenic potential, a decrease of bone resorption associated with a shift of the OPG/RANKL ratio toward an osteoblastic phenotype and a modification of leukocyte tumor infiltration in favor of an antitumor immune response. In addition to the importance of CX3CL1 in bone remodeling, this study underlines the essential role of the immune microenvironment in bone tumor progression. In this context, the soluble CX3CL1 could represent a promising tool in the therapeutic arsenal of bone metastases.

La formation et le développement d’une tumeur sont provoqués par une série de défauts qui se produisent à l'intérieur de la cellule cancéreuse et dans son microenvironnement. Ces anomalies permettent à la cellule de développer ses propres stratégies de croissance, de prolifération, de différenciation et de métabolisme.La modification du métabolisme respiratoire, est l'une des stratégies utilisée par les cellules cancéreuses favorisant la fermentation lactique au lieu de la phosphorylation oxydative OXPHOS (respiration). Cette adaptation métabolique porte le nom d’effet Warburg.Nous avons proposé un concept thérapeutique novateur basé sur l'induction de changements métaboliques par l'utilisation de dichloroacétate (DCA) associée avec l'immunothérapie en utilisant les cellules NK activées. Le DCA, molécule inhibitrice de la PDK, induit l'activation de la PDH, responsable de la catalyse de pyruvate en Acétylcoenzyme A (Ac-CoA), favorise alors l’oxydation du glucose dans la mitochondrie. Le DCA a déjà été utilisé depuis longtemps comme traitement hypocholestérolémiant et bloquant l’acidose lactique. Mon équipe a montré auparavant que le changement métabolique permet aux cellules tumorales d'échapper à la réponse immune.Nous avons observé que le traitement par DCA induisait, dépendante du phénotype p53, une forte up-régulation de l'expression du mRNA et des protéines de stress MICA, MICB et ULBP1, ligands spécifiques des récepteurs activateurs NKG2D des cellules NK, et induise alors une réponse cytotoxique contre les cellules tumorale.D'autre part nous avons évalué l'effet de DCA sur l'expression des transporteurs ABC qui interviennent dans l'efflux des agents anticancéreux utilisé dans la chimiothérapie. L'expression des transporteurs ABC était fortement liée aux phénotypes de chimiorésistance. Nous avons bien confirmé que le DCA provoque une diminution de l'expression de ABCB1, ABCC1, ABCC5 et ABCG2 dans les cellules wtp53 alors qu'il induit une augmentation dans les cellules mutantp53 ou nullp53.Les promoteurs des transporteurs et les protéines de stress étudiés comportent également plusieurs sites de liaison spécifique au facteur de transcription MEF2, qui est la cible d’ERK5. Nous avons bien constaté que en plus de ca capacité de changer le métabolisme tumorale, le DCA modifie l'expression ABCB1, ABCC1, ABCC5 et ABCG2 par l'activation de la voie ERK5/MEF2 .Ces résultats sont confirmé dans diverses lignées cellulaires, ainsi que dans des cellules issues de patients et dans un modèle in vivo / Tumorigenesis is caused by a series of defects that occur within the cancer cell and its microenvironment. These abnormalities allow the tumor cell to develop its own strategies for growth, proliferation, differentiation and metabolism. In the last, cancer cells favor lactic fermentation instead of oxidative phosphorylation OXPHOS (respiration). This metabolic adaptation is called the Warburg effect.We proposed an innovative therapeutic concept based on the induction of metabolic changes by the use of dichloroacetate (DCA) and this is associated with immunotherapy using activated NK cells. DCA, a pyruvate dehydrogenase kinase (PDK) inhibitor, induces the activation of pyruvate dehydrogenase (PDH), responsible for the catalysis of pyruvate to acetylcoenzyme A (Ac-CoA), promoting the oxidation of glucose/pyruvate in the mitochondria. DCA has been used for a long time as a cholesterol-lowering and anti-lactic acidosis therapy. My team has previously shown that the metabolic change allows tumor cells to escape the immune response. I have observed that DCA treatment induced a high upregulation of mRNA and protein expression of the stress ligands MICA, MICB and ULBP1. These are recognized by the NK cell activating receptor NKG2D, inducing a NK cell-mediated cytotoxic response against tumor cells. DCA-induced expression of these stress ligands depends on wtp53 expression on the tumor cell.On the other hand, we evaluated the effect of DCA on the expression of ABC carriers, which intervene in the efflux of anticancer agents used in chemotherapy. The expression of ABC carriers is strongly related to drug resistance phenotypes. We observed that DCA causes a decrease in the expression of ABCB1, ABCC1, ABCC5 and ABCG2 in wtp53 cells while it induces an increase in mutantp53 or nullp53 cells. Conversely, DCA-induced accumulation of antitumor drugs, i.e. daunorubicin, and favors chemotherapy-induced tumor death only in wtp53-expressing cancer cells. The promoters of these ABC transporters and the stress proteins presented above contain several binding sites specific to the transcription factor MEF2, which is the target of ERK5. We have found that in addition to the ability to change tumor metabolism, DCA modifies the expression ABCB1, ABCC1, ABCC5 and ABCG2 by activation of the ERK5 / MEF2 pathway. These results are confirmed in various cell lines, in cells derived from patients and in an in vivo model

La famille des Arenaviridae comporte sept virus responsables de fièvres hémorragiques humaines. Ces virus représentent un risque naturel pour les populations vivant dans les zones endémiques, ou y séjournant comme les militaires français déployés. Ce risque peut également toucher des populations vivant en dehors des zones endémiques en raison du risque d'importation d'un patient infecté ou consécutivement à l'utilisation intentionnelle et malveillante de tels virus dans le cadre d'une attaque bioterroriste. Les fièvres hémorragiques humaines causées par les arénavirus sont relativement rares et les premiers symptômes, non spécifiques, sont souvent confondus avec ceux de maladies plus fréquentes dans ces régions, comme le paludisme ou les arboviroses. Par conséquent, le diagnostic clinique est souvent retardé, ce qui réduit l'efficacité du seul traitement étiologique actuellement préconisé, la ribavirine. Dans ce contexte, le développement de solutions prophylactiques similaires au vaccin Candid #1, protégeant contre l'arénavirus Junin, constituent une alternative intéressante. Dans le cadre du développement de candidats vaccins, la première stratégie utilisée dans ce travail a consisté à atténuer la pathogénicité du virus d'intérêt en ciblant une étape clé de la réplication des arénavirus. Nous avons choisi l'étape du bourgeonnement viral, dont l'acteur principal est la protéine Z. Une preuve de concept a été réalisée avec le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV). Pour cela, nous avons conçu un système de génétique inverse qui exprime un segment L viral où le gène de la protéine Z est remplacé par un gène d'intérêt. De manière surprenante, ce virus recombinant était capable de produire en culture cellulaire une progénie à un titre très faible sans l'apport en trans de la protéine Z. Nous avons identifié des domaines tardifs dans la séquence peptidique de la nucléoprotéine, motifs peptidiques permettant le détournement de la machinerie cellulaire impliquée dans la production d'exosomes et présents dans les protéines de matrices virales, comme la protéine Z des arénavirus. Nous avons observé que ces domaines pourraient partiellement compenser l'absence de la protéine Z. Des résultats similaires ont été obtenus avec deux autres arénavirus ayant une importance majeure en santé publique, les virus Lassa et Machupo, tous deux responsables de fièvres hémorragiques humaines. Cette suppression pourrait constituer une stratégie d'atténuation et semblerait prometteuse en vue du développement de candidats vaccins réplicatifs atténués. En effet, elle pourrait être utilisée sur plusieurs arénavirus responsables de pathologies humaines. Une approche complémentaire à cette stratégie vaccinale a été envisagée. Dans le but de développer un traitement d'urgence, utilisant des immunoglobulines équines hautement purifiées, les F(ab')2, selon la méthodologie de la société Fab'entech, deux études préliminaires ont été réalisées. La première a permis de vérifier la capcité des virus à se répliquer dans les cellules immunitaires circulantes de cheval. La seconde a permis l'évaluation du cahier des charges qualité de particules virales en vue de leur utilisation comme source d'antigène afin de produire les F(ab')2. Une seconde stratégie vaccinale a été envisagée, basée sur une modification du nombre de segments génomiques viraux. Des travaux précédents ont montré qu'un arénavirus à 3 segments, au lieu de 2, était viable et atténué, tout en pouvant exprimer 2 gènes d'intérêt supplémentaires. Cette stratégie a été utilisée sur le virus Machupo, responsable de fièvres hémorragiques en Bolivie. Ce virus recombinant devrait exprimer les glycoprotéiques tronquées des virus Chapare et Guanarito. Ce candidat vaccin a été caractérisé en culture cellulaire, et a induit une protection de 50% des animaux lors d'une administration en post-exposition [etc...] / The Arenaviridae family comprises seven viruses responsible for human hemorrhagic fevers. These viruses represent a natural threat to the local populations, healthcare workers and scientists, as well as to the French forces deployed in the regions where these viruses are endemic. This viral threat can also be intentional in case of a bioterrorist attack. Human hemorrhagic fevers caused by arenaviruses are relatively rare and the first symptoms, frequently non-specific, are often confused with more common diseases such as malaria. Therefore, their diagnosis is delayed, which reduces the efficacy of ribavirin, the only etiological treatment currently recommended. ln this context, the development of prophylactic treatments, such as the Candid #1 vaccine targeting the Junin arenavirus, are an interesting alternative. The first strategy developed in this work to produce a vaccine candidate relied on the attenuation of the virus of interest by targeting a key stage of its replication. We chose the egress step, in which the main actor is the Z protein. This work was conducted using the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). We therefore designed a reverse genetic system, and replaced the Z gene by the fluorescent protein eGFP reporter gene. Surprisingly, during its cellular infection, a progeny was detected in absence of the Z protein trans-complementation although the titer remained very low. ln this infectious model, we further identified late motifs in the nucleoprotein genome, comparable to those known in the Z protein. These NP late motifs seemed to play an essential role in the compensation of the absence of the Z protein. Similar results were observed using two others arenaviruses of medical importance, the Lassa and Machupo viruses, responsible of human hemorrhagic fevers. The strong diminution of the resulting vaccine candidate replication suggests that this strategy would render safe enough BSL-4 viruses to be used as a multivalent vaccine platform in humans. A complementary approach has been studied in this work. ln order to develop an emergency treatment, based on the production of highly purified F(ab')2 equine immunoglobulins, according to the Fab'entech technology. Two preliminary studies were carried out. The first one consisted in the study of the replication of arenaviruses in circulating horse's white blood cells. The second tested the specifications of attenuated viral particles that could be used as an antigen source to produce the F(ab')2 under good manufacturing practices. Another vaccine strategy was developed using the previously described duplication of the LCMV S genomic small segment in order to produce a tri-segmented recombinant virus. This genetic modification, known to attenuate the LCMV virus pathogenicity, allows the expression of two genes of interest. This strategy has been applied onto the South American Machupo virus, responsible for hemorrhagic fevers in Bolivia. A recombinant Machupo virus was designed to express the truncated glycoproteins of the Chapare and Guanarito viruses, two other New World mammarenaviruses responsible of human hemorrhagic fevers. This vaccine candidate was characterized in cell culture, and showed a 50% post-exposure protective effect in the animal model used. Taken together this work led to the development of two vaccine strategies and to the identification of a promising source of antigens to be used to produce highly purified F(ab')2 polyclonal immunoglobulin, which is the first step to the development of an emergency treatment

Identification et caractérisation d'une population d'ILC2 associée à la sévérité de la rhinite allergique et de l'asthmeTrois catégories de cellules lymphoïdes innées (innate lymphoid cells, ILC) ont été décrites récemment sur la base de leurs phénotypes et leurs caractéristiques fonctionnelles : les ILC1, ILC2 et ILC3. Les ILC2 semblent avoir un rôle pro-inflammatoire important dans l’allergie en raison de leur capacité à produire de grandes quantités de cytokines TH2.Pour mieux comprendre le rôle de ces cellules dans l’allergie respiratoire, nous avons comparé les ILC sanguines de patients atteints d’une rhinite allergique associée ou non à un asthme, à celles de sujets non allergiques. Cette étude révèle de multiples différences fonctionnelles entre les ILC circulantes de sujets sains et allergiques. Notamment, la fréquence d’ILC2 exprimant le récepteur aux chimiokines CCR10 est augmentée dans le sang de patients asthmatiques sévères.CCR10 pouvant permettre le recrutement des ILC vers les organes cibles, le rôle des ILC2 CCR10+ dans la physiopathologie de l’asthme a été étudié. Leur présence dans les poumons humains a été observée. Des analyses fonctionnelles et phénotypiques ont révélé que cette sous-population cellulaire était peu activée mais présentait une plasticité leur conférant des caractéristiques proches des ILC1. La déplétion de ces cellules dans un modèle murin d’asthme allergique aggrave l’hyperréactivité bronchique.Les travaux de cette thèse documentent le rôle des ILC dans l’asthme. En particulier, la fréquence sanguine d’ILC2 CCR10+ augmente avec la sévérité de la maladie. Les résultats obtenus dans les modèles animaux suggèrent que ces cellules auraient un rôle bénéfique dans le contrôle de l’asthme. La voie du CCR10 pourrait représenter une nouvelle cible pour le développement de traitements innovants contre l’asthme ou une source prometteuse de biomarqueurs. / Identification and characterization of an ILC2 subset linked to allergic rhinitis and asthma severityInnate lymphoid cells (ILCs) have been classified into ILC1, ILC2 and ILC3 subsets based on their respective phenotypes and functions. Considering the strong ability of ILC2s to produce TH2 cytokines, these cells likely play a significant role in allergic diseases.To better understand the role of these cells in respiratory allergies, we compared blood ILCs from allergic patients with or without asthma to non-allergic individuals. Together our results show multiple functional differences between ILC from allergic and healthy subjects. In particular, ILC2s expressing the chemokine receptor CCR10 are specifically enriched in the blood of patients with severe allergic asthma.Considering that CCR10 could allow the recruitment of ILCs to target organs, the role of CCR10+ ILC2s in asthma physiopathology has been studied. This ILC2 subtype is present in human lungs. Functional and phenotypic analyses revealed that these cells are less activated than other ILC2s and show ILC1-like properties. CCR10+ ILC2s depletion in a mouse model of allergic asthma exacerbate airway hyperreactivity.Together, this work documents the role of ILCs in asthma. Specifically, circulating CCR10+ ILC2 frequency increases with asthma severity. The results obtained in mouse models suggest that these cells could have a beneficial role in asthma control. CCR10 pathway could represent a new target to elaborate breakthrough treatments against asthma or a source of promising biomarkers.

Les métastases hépatiques compliquent l'évolution de 50% des cancers colorectaux (CCR). Plus de la moitié des patients présentent une récidive à distance avec métastases occultes pour lesquelles une chirurgie peut être réalisée dans moins de 20% des cas. L'ablation par radiofréquence (RFA) induit une réponse lymphocytaire T qui n'est pas évaluée après une intervention chirurgicale seule. L'immunothérapie combinée à la RFA pourrait potentialiser cet effet conduisant à une réponse tumorale à distance. Nous proposons une approche qui combine la RFA avec hydrogel thermoreversible libérant des agents immunomodulateurs (GMCSF et BCG) sur le site du traitementPremièrement, nous nous sommes intéressés à la sélection et à la caractérisation de la formulation optimale d’hydrogel par des techniques physicochimiques. Les propriétés de l'hydrogel ont été étudiées par rhéologie et des tests de muco-adhésion ont été mis en place. Le temps de résidence de l'hydrogel et de la protéine dans la zone tumorale a été démontré par imagerie optique. De plus, la cinétique de libération et l'intégrité du GMCSF encapsulé ont été déterminées. Ensuite, nous avons démontré l’efficacité de l’association de la RFA avec le dépôt local de l’hydrogel immunomodulatuer sur un modèle murin de cancer colorectal. En effet, nous avons observé une survie améliorée des animaux et régression complète des tumeurs distantes chez les animaux traités par la combinaison complète. Cette réponse est caractérisée par un niveau élevé de sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les cellules T CD4 et TCD8 et une augmentation de l’infiltrat lymphocytaire dans les tumeurs. Ceci a permis d'envisager une association avec l'immunothérapie anti-PD1 dans le traitement de macrométastases échappant au traitement combiné RFA avec l’hydrogel immunomodulateur. En effet, l’immunothérapie dans le traitement du cancer colorectal métastatique présente une efficacité limitée chez les patients. Notre travail propose a démontré que l’efficacité de l’immunomodulation locale dans l’amélioration des réponses immunitaires dans le cancer colorectal. Ces résultats permettent de reconsidérer l’utilisation de l’immunothérapie chez les patients atteints de CCR métastatique non MSI. / Liver metastases complicate the progression of 50% of colorectal cancers (CRC). More than half of the patients have recurrent remissions with occult metastases for which surgery can be performed in less than 20% of cases. Radiofrequency ablation (RFA) induces a T lymphocyte response that is not observed after surgery alone. Combined immunotherapy with RFA may potentiate this effect leading to a distant tumor response. We propose an approach that combines RFA with thermoreversible hydrogel releasing immunomodulatory agents (GMCSF and BCG) at the treatment site.First, we focused on the selection and characterization of the optimal hydrogel formulation by physicochemical techniques. The properties of the hydrogel were studied by rheology and mucoadhesion tests were set up. The residence time of the hydrogel and the protein in the tumor zone was demonstrated by optical imaging. In addition, the release kinetics and integrity of the encapsulated GMCSF were determined. Then, we demonstrated the effectiveness of the combination of RFA with the local deposition of the immunomodulatory hydrogel on a mouse model of colorectal cancer. Indeed, we observed improved survival of animals and complete regression of distant tumors the complete treatment group. This response is characterized by a high level of pro-inflammatory cytokine secreted by CD4 and TCD8 T cells and an increase Lymphocytes infiltrating tumors. The immune escape of large lesions was reversed by association with anti-PD1 immunotherapy Indeed, immunotherapy in the treatment of metastatic colorectal cancer has limited efficacy in patients. Our work has demonstrated the effectiveness of local immunomodulation in improving immune responses in colorectal cancer. These results make it possible to reconsider the use of immunotherapy in patients with non-MSI metastatic CRC.