Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos amplamente utilizados devido às suas propriedades ansiolíticas e sedativas, mediadas pelo complexo GABAA no Sistema Nervoso Central (SNC). Além destes receptores centrais, os BDZ possuem afinidade por receptores do tipo periféricos (PBR) os quais estão presentes em células do sistema imune, como linfócitos e macrófagos, em células tumorais e em glândulas adrenais. O presente trabalho avaliou os efeitos do diazepam, um BDZ freqüentemente utilizado, sobre o crescimento tumoral e a imunidade de animais portadores do Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE). Mais especificamente, este trabalho avaliou os seguintes parâmetros da resposta imune: atividade de macrófagos, populações de linfócitos B, T helper e citotóxicos esplênicos, citotoxicidade de células Natural Killer (NK). Além disso, a marcação para PBR em células do TAE e avaliação de possíveis efeitos do diazepam ou Ro5-4864 in vitro sobre o ciclo celular do TAE foram avaliadas. Os resultados mostraram os seguintes efeitos do tratamento com diazepam in vivo (3,0 mg/kg): (1) aumento do crescimento do TAE; sem modificação das fases do ciclo celular do tumor, após 7 dias, (2) diminuição do número de leucócitos da cavidade peritoneal, da produção de NO e do índice de espraiamento; mas sem interferência com a produção de peróxido de hidrogênio e o índice de fagocitose, após 2 dias (3) não modificou o peso relativo do baço e a porcentagem de linfócitos esplênicos, após 2 dias ou 7 dias (4) aumento da citotoxicidade de células NK, após 3 dias (5) diminuição da porcentagem de células do TAE marcadas para PBR, após 7 dias. O tratamento in vitro com diazepam ou Ro5-4864 mostrou um aumento da proliferação de células do TAE. Já o tratamento in vivo com diazepam em doses menores (0,3 mg/kg e 1mg/kg) não modificou o crescimento do TAE, após 7 dias. Desta forma, sugere-se que o diazepam na dose de 3,0 mg/kg tenha aumentado o crescimento do TAE e diminuído a resposta imune inata, observada por meio da diminuição da atividade dos macrófagos peritoneais. Parece-nos plausível excluir de nossos resultados a participação de linfócitos B, T helper e citotóxicos. Por outro lado, não foi possível precisar a relevância das células NK para o desenvolvimento do tumor. Além disso, pode-se afirmar que há expressão de PBRs em células do TAE e que o tratamento in vitro com diazepam ou Ro5-4684 aumentou a proliferação destas células. Desta forma, os resultados dos dois últimos experimentos sugerem que a existência de efeitos do diazepam sobre crescimento tumoral in vivo pode também ser atribuída, ao menos em parte, a uma ação direta deste fármaco sobre células do TAE / Benzodiazepines (BDZ) are drugs widely used due to their anxiolytic and sedative properties, acting on specific sites coupled to GABAA complex in the Central Nervous System (CNS). Besides these central receptors, BDZ have affinity for peripheral-type receptors (PBR), which have been found in immune cells, such as lymphocytes and macrophages, in tumor cells and in the adrenal glands. The present study evaluated the effects of diazepam, a commonly used BDZ, on tumor growth and immunity of mice bearing Ehrlich Ascitic Tumor (EAT). Specifically, this study evaluated the following parameters of the immune system: macrophage activity, populations of B, helper and cytotoxic T lymphocytes, and Natural Killer (NK) cells cytotoxicity. Furthermore, the evaluation of PBR expression in EAT cells and possible in vitro effects of diazepam or Ro5-4864 on EAT cell cycle were performed. Results showed the following diazepam effects in vivo (3.0 mg/kg per day): (1) increased tumor growth without changes in cell cycle, after 7 days; (2) decreased the number of leucocytes in the peritoneal cavity, the production of NO and the spreading index, but did not modify the production of hydrogen peroxide and the phagocytosis index, after 2 days; (3) did not modify the relative spleen weight and the population of lymphocytes after 2 or 7 days, (4) increased NK cytotoxicity after 3 days; (5) reduced the percentage of EAT cells expressing PBR after 7 days. Experiments performed in vitro showed that diazepam or Ro5-4864 increased the proliferation of EAT cells. Diazepam treatment in vivo using lower doses (0.3 mg/kg and 1mg/kg) did not modify tumor growth. Therefore, diazepam in the dose of 3.0 mg/kg increased the growth of EAT and reduced innate immunity, probably through the decrease in the activity of peritoneal macrophages. A role of B and helper or cytotoxic T lymphocytes in our experiments seems unlikely since the population of these cells types remained unchanged. On the other hand, it was not possible to determine the relevance of NK cells cytotoxicity on tumor development. The expression of PBR in EAT cells and the increase of their proliferation induced by in vitro treatment with diazepam or Ro5-4684 were observed. The results of these two last experiments suggest that the increase on tumor growth following diazepam treatment in vivo can be attributed, at least in part, to a direct action of this drug on EAT cells

Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos amplamente utilizados devido às suas propriedades ansiolíticas e sedativas, mediadas pelo complexo GABAA no Sistema Nervoso Central (SNC). Além destes receptores centrais, os BDZ possuem afinidade por receptores do tipo periféricos (PBR) os quais estão presentes em células do sistema imune, como linfócitos e macrófagos, em células tumorais e em glândulas adrenais. O presente trabalho avaliou os efeitos do diazepam, um BDZ freqüentemente utilizado, sobre o crescimento tumoral e a imunidade de animais portadores do Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE). Mais especificamente, este trabalho avaliou os seguintes parâmetros da resposta imune: atividade de macrófagos, populações de linfócitos B, T helper e citotóxicos esplênicos, citotoxicidade de células Natural Killer (NK). Além disso, a marcação para PBR em células do TAE e avaliação de possíveis efeitos do diazepam ou Ro5-4864 in vitro sobre o ciclo celular do TAE foram avaliadas. Os resultados mostraram os seguintes efeitos do tratamento com diazepam in vivo (3,0 mg/kg): (1) aumento do crescimento do TAE; sem modificação das fases do ciclo celular do tumor, após 7 dias, (2) diminuição do número de leucócitos da cavidade peritoneal, da produção de NO e do índice de espraiamento; mas sem interferência com a produção de peróxido de hidrogênio e o índice de fagocitose, após 2 dias (3) não modificou o peso relativo do baço e a porcentagem de linfócitos esplênicos, após 2 dias ou 7 dias (4) aumento da citotoxicidade de células NK, após 3 dias (5) diminuição da porcentagem de células do TAE marcadas para PBR, após 7 dias. O tratamento in vitro com diazepam ou Ro5-4864 mostrou um aumento da proliferação de células do TAE. Já o tratamento in vivo com diazepam em doses menores (0,3 mg/kg e 1mg/kg) não modificou o crescimento do TAE, após 7 dias. Desta forma, sugere-se que o diazepam na dose de 3,0 mg/kg tenha aumentado o crescimento do TAE e diminuído a resposta imune inata, observada por meio da diminuição da atividade dos macrófagos peritoneais. Parece-nos plausível excluir de nossos resultados a participação de linfócitos B, T helper e citotóxicos. Por outro lado, não foi possível precisar a relevância das células NK para o desenvolvimento do tumor. Além disso, pode-se afirmar que há expressão de PBRs em células do TAE e que o tratamento in vitro com diazepam ou Ro5-4684 aumentou a proliferação destas células. Desta forma, os resultados dos dois últimos experimentos sugerem que a existência de efeitos do diazepam sobre crescimento tumoral in vivo pode também ser atribuída, ao menos em parte, a uma ação direta deste fármaco sobre células do TAE / Benzodiazepines (BDZ) are drugs widely used due to their anxiolytic and sedative properties, acting on specific sites coupled to GABAA complex in the Central Nervous System (CNS). Besides these central receptors, BDZ have affinity for peripheral-type receptors (PBR), which have been found in immune cells, such as lymphocytes and macrophages, in tumor cells and in the adrenal glands. The present study evaluated the effects of diazepam, a commonly used BDZ, on tumor growth and immunity of mice bearing Ehrlich Ascitic Tumor (EAT). Specifically, this study evaluated the following parameters of the immune system: macrophage activity, populations of B, helper and cytotoxic T lymphocytes, and Natural Killer (NK) cells cytotoxicity. Furthermore, the evaluation of PBR expression in EAT cells and possible in vitro effects of diazepam or Ro5-4864 on EAT cell cycle were performed. Results showed the following diazepam effects in vivo (3.0 mg/kg per day): (1) increased tumor growth without changes in cell cycle, after 7 days; (2) decreased the number of leucocytes in the peritoneal cavity, the production of NO and the spreading index, but did not modify the production of hydrogen peroxide and the phagocytosis index, after 2 days; (3) did not modify the relative spleen weight and the population of lymphocytes after 2 or 7 days, (4) increased NK cytotoxicity after 3 days; (5) reduced the percentage of EAT cells expressing PBR after 7 days. Experiments performed in vitro showed that diazepam or Ro5-4864 increased the proliferation of EAT cells. Diazepam treatment in vivo using lower doses (0.3 mg/kg and 1mg/kg) did not modify tumor growth. Therefore, diazepam in the dose of 3.0 mg/kg increased the growth of EAT and reduced innate immunity, probably through the decrease in the activity of peritoneal macrophages. A role of B and helper or cytotoxic T lymphocytes in our experiments seems unlikely since the population of these cells types remained unchanged. On the other hand, it was not possible to determine the relevance of NK cells cytotoxicity on tumor development. The expression of PBR in EAT cells and the increase of their proliferation induced by in vitro treatment with diazepam or Ro5-4684 were observed. The results of these two last experiments suggest that the increase on tumor growth following diazepam treatment in vivo can be attributed, at least in part, to a direct action of this drug on EAT cells

Orientador: Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T05:00:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariano_FlaviaSammartino_D.pdf: 1316630 bytes, checksum: 3bee505697040431f6e2914628397cd8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Dentre os mecanismos da imunidade inata, os quais são importantes para a proteção da cavidade oral, podemos citar os peptídeos antimicrobianos e células fagocíticas como os neutrófilos. Os peptídeos antimicrobianos, LL-37 e ?-defensinas ou peptídeos de neutrófilos humanos (HNP 1-3) são produzidos por neutrófilos e têm ampla atividade contra bactérias, fungos e vírus envelopados, um mecanismo microbicida independente de oxigênio. Contudo, os neutrófilos também executam atividade antimicrobiana através da produção de óxido nítrico (NO) durante a fagocitose. Adicionalmente, estas células produzem diferentes citocinas em resposta aos patógenos. Sendo assim, os neutrófilos tornam-se importantes na resposta contra a doença periodontal, mas, não está bem descrito se há diferenças funcionais entre os neutrófilos de pacientes com periodontite e os de indivíduos saudáveis após estimulação destes com lipopolossacarídeo (LPS) de periodontopatógenos. Dessa forma, avaliamos os níveis de LL-37, HNP1-3, NO e citocinas no sobrenadante das culturas de neutrófilos de voluntários com e sem periodontite e estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis (Pg) e Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) e Escherichia coli (Ec), bem como analisamos a expressão de RNAm, para esses peptídeos e citocinas nessas células. Nossos resultados demonstraram que neutrófilos de voluntários com periodontite estimulados com LPS de Aa expressaram maiores níveis de RNAm de LL-37, HNP 1-3 e IFN- ?, bem como produziram maiores quantidades de IL-12 e IFN-_ quando comparados aos saudáveis. LPS de Pg e Ec aumentaram significativamente a expressão de HNP 1-3, IFN-? e IL-8, bem como a produção de LL-37, IL-12 e IFN-?. Em contrapartida, neutrófilos de pacientes com periodontite produziram níveis reduzidos de NO e nenhuma diferença foi observada na expressão de IL-12 e na produção de HNP 1-3 entre ambos os grupos de voluntários estudados. Estes dados permitem concluir que neutrófilos de pacientes com periodontite respondem de forma mais intensa aos estímulos de LPS de bactérias periodontopatogênicas em comparação aos neutrófilos de voluntários com periodonto saudável. / Abstract: Among the innate mechanisms, which are essential for the oral cavity protection, we can include antimicrobial peptides and phagocytic cells such as neutrophils, as a major. Antimicrobial peptides, LL-37 and ?-defensins or human neutrophil peptides (HNP 1-3) are produced by neutrophils and have broad activity against bacteria, fungi and enveloped viruses, an oxygen-independent microbicidal mechanism. However, neutrophils also do antimicrobial activity through nitric oxide (NO) production in phagocytosis. Also, neutrophils produce special cytokines against pathogens. Thus, neutrophils are central in the periodontal disease response, but is unclear the functional differences between neutrophils from periodontitis and healthy volunteers pos-stimulation with periodopathogens lipopolossacarideo (LPS). Then, we studied of LL-37, HNP1-3, NO and cytokines levels in culture supernatants of cells from volunteers with or without periodontitis post Porphyromonas gingivalis (Pg), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) and Escherichia coli (Ec) LPS. We analyzed also peptides and cytokines expression in these cells. We show that neutrophils from periodontitis volunteers cultured with Aa LPS expressed higher LL-37, HNP 1-3 and IFN-? mRNA and produced more IL-12 and IFN- ? levels as the controls. Pg and Ec LPS notably improved the HNP1-3, IFN-? and IL-8 expression and the LL-37, IL-12 and IFN- ? secretion. But, neutrophils from periodontitis patients produced low NO levels and similar IL-12 mRNA and HNP 1-3 production in both the volunteers groups studied. Briefly, we can conclude that neutrophils from periodontitis patients respond more strongly than healthy neutrophils when stimulated with LPS periodontopathic bacterias. / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Orientador: Lício Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T06:28:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AndressaCoopedos_D.pdf: 9572929 bytes, checksum: ce4c4fb2095c6ffe99868ec77f19d5b3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A ativação da sinalização através do toll-like receptor-4 (TLR4) e a indução de estresse de retículo endoplasmático (ERE) são importantes mediadores da resistência à insulina na obesidade e em outras situações nas quais há um excesso de ácidos graxos saturados. Em um estudo recente, demonstrou-se que sinalização através de TLR4 pode, per se, induzir a ativação de ERE, sugerindo que a ativação do TLR4 é o evento inicial para a indução do estresse celular que contribui para o aumento da expressão de genes de resposta inflamatória. No entanto, os mecanismos que conectam essas duas vias distintas são desconhecidos. As chaperonas GRP78 e GRP94 exercem uma função importante no processamento das moléculas recém-traduzidas do TLR4. Além disso, a chaperona GRP94 é responsável por sua translocação e conteúdo na superfície celular. Durante uma ativação prolongada da via de sinalização do TLR4, a demanda por novas moléculas sintetizadas aumenta, e consequentemente, a demanda por novas chaperonas. Por esta razão, nós aventamos a hipótese de que sob uma ativação extrema da via do TLR4, a síntese de proteínas sobrepujaria a expressão de chaperonas, dessa forma induzindo ERE. Para testar essa hipótese, monócitos da linhagem THP-1 foram incubados com LPS e foi avaliada a expressão e ativação de proteínas responsivas ao ERE por real-time PCR, citometria de fluxo, imunoprecipitado e western blot. Em alguns experimentos, as células foram privadas de glicose ou tratadas com siRNA para aumentar ou diminuir, respectivamente, a expressão das chaperonas. Experimentos de time-course revelaram que o LPS induz um aumento de 2,5 vezes na expressão do TLR4, iniciando após 8 h, com um pico após as 24 h e permanecendo significantemente aumentado após 48 h. A expressão de GRP78 foi aumentada em três vezes com um aumento acentuado após 24 h sem aumento às 8 h, enquanto o GRP94 aumenta apenas 1,5 vezes com um pico após 2 h que retorna aos valores basais após 8 h do estímulo. Não houve aumento da expressão protéica das chaperonas após 48 h. A indução de ERE por LPS foi detectada antes de 4 h do estímulo observado pela avaliação da via da PERK/eIF2a, IRE1 e ATF6 e se mantém ativado após 48 h. Adicionalmente, a privação de glicose em células THP-1 aumenta a expressão de GRP94 e GRP78 em 2,5 e 11 vezes, respectivamente. Na ausência de glicose, o tratamento com LPS não induz ERE. A inibição da expressão das chaperonas por siRNA anula o efeito da privação de glicose em proteger as células do desenvolvimento de ERE induzido por LPS. Portanto, a hiperexpressão das chaperonas GRP78 e GRP94 protegem as células do ERE induzido por LPS. Assim, defeito na expressão das chaperonas induzido por TLR4 é um mecanismo envolvido na integração da sinalização do TLR4 e ERE / Abstract: TLR4 activation and the induction of endoplasmic reticulum stress (ERS) are two of the most important mechanisms connecting excessive fat with insulin resistance. Recently, it was shown that activation of TLR4 can, per se, induce ERS, suggesting that TLR4 is a primary event in the induction of the cellular stress that contributes to increased inflammatory gene expression. However, the mechanisms linking these molecular events are unknown. The chaperones GRP78 and GRP94 play an important role during the assembly of newly translated TLR4 molecules. In addition, the chaperone GRP94 escorts the protein to the cell membrane. Under prolonged activation, the demand for newly synthesized TLR4 molecules increases, and thus, the demand for new chaperones. Therefore, we hypothesized that under increased activation of TLR4, the synthesis of the protein would not be matched by the expression of chaperones, thus, triggering ERS. To test this hypothesis, the monocyte cell line THP-1 was incubated with LPS and the expression/activation of proteins involved in ERS was determined by real-time PCR, flow-cytometry, immunoprecipitation and immunoblot. In some experiments, cells were deprived of glucose or treated with siRNA to increase or decrease, respectively, the expression of the chaperones. Time-course experiments revealed that LPS led to a 2.5-fold increase of TLR4 expression starting as early as 8h, peaking after 24h and remaining significantly increased after 48h. The expression of GRP78 underwent a 3-fold increase with a sharp rise at 24h (no increase at 8h), while GRP94 increased by only 1.5-fold with a peak at 2h and an early return to base-line levels. None of the chaperones were increased after 48h. LPS-induced ERS was detected as early as 4h after stimulus as detected by the evaluation of PERK/eIF2?, IRE1 and ATF6 pathways. Strong signals of ERS were still present after 48h. The pre-incubation of THP-1 in glucose-deprived medium produced 2.5 and 11-fold increases of GRP94 and GRP78, respectively. Upon glucosedeprivation, LPS could no longer induce ERS. Inhibition of chaperone expression by siRNA completely abrogated the effect of glucose deprivation to protect cells from LPS-induced ERS. Thus, the hyperexpression of GRP78 and GRP94 protect cells from LPS-induced ERS. Defective TLR4-induced chaperone expression is a mechanism involved in the integration of TLR4 signaling and ERS / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

A transmissão vertical mãe-recém-nato é a principal fonte de infecção pediátrica. O tratamento antirretroviral vem reduzindo a transmissão vertical, mas também tem elevado o número de infantes expostos não infectados, os quais vêm mostrando maior risco de morbidade e mortalidade. Este dado salienta a importância de avaliar as características imunológicas, relacionadas à resposta inata no binômio mãe e recém-nato. A proposta do trabalho foi avaliar a expressão de fatores antivirais em células mononucleares (CMN), tecido placentário e no colostro de mães infectadas por HIV e cordão umbilical (RN), comparadas com mães-RN controle não infectadas. Os dados mostram que há uma ativa expressão dos fatores antivirais, sejam constitutivos ou induzíveis por IFN, nas mães infectadas por HIV e nos RN expostos. No sítio de interface materno-fetal, decídua e face fetal da placenta, foi detectado um perfil alterado de expressão dos fatores antivirais, especialmente da proteína APOBEC3G. Apesar da relativa imaturidade imunológica dos RNs, a infecção materna por HIV gerou um perfil semelhante de expressão dos fatores antivirais nos RN, por uma complexa interação de fatores relacionados a gestação e a infecção. / Vertical transmission mother-newborn is the main source of pediatric infection. The antiretroviral therapy has reduced vertical transmission, but also has increased the number of exposed uninfected infants, which have shown increased risk of morbidity and mortality. This finding emphasizes the importance of evaluating the immunological characteristics, related to innate response in both the mother and newborn. The purpose of this study was to evaluate the expression of antiviral factors in mononuclear cells (MNC), placental tissue and colostrum of HIV-infected mothers and umbilical cord (RN), compared with control mothers-uninfected infants. The data show that the active expression of antiviral factors, are constitutive or inducible by IFN in HIV-infected mothers and newborns exposed. At the site of maternal-fetal interface, decidua and placental villi, a profile was detected altered expression of antiviral factors, especially the APOBEC3G protein. Despite the relative immunological immaturity of the newborn, maternal HIV infection generated a similar profile of expression of antiviral factors in RN, by a complex interaction of factors related to pregnancy and infection.

Um modelo de indução de estresse/ansiedade é a separação materna. Sabe-se, a este respeito, que o desenvolvimento do comportamento emocional normal em mamíferos jovens depende da interação entre a mãe e o filhote. Além disso, eventos estressantes na infância e interrupções no cuidado materno podem levar a efeitos deletérios na resposta imune e na resistência a doenças ao longo da vida. Buscamos neste trabalho estudar os efeitos da separação materna sobre o comportamento, imunidade inata e crescimento tumoral de uma prole de camundongos machos adultos. Nossos resultados mostraram que a separação materna, em camundongos A/J, (1) não produziu alterações robustas no comportamento e em parâmetros hematológicos (antes e após o crescimento tumoral), (2) aumentou a atividade de neutrófilos sanguíneos e macrófagos alveolares (antes e após o crescimento tumoral), (3) aumentou os níveis estriatais de serotonina, seu metabólito 5-HIAA e o turnover de dopamina, (4) diminuiu os níveis séricos de corticosterona e (5) não influenciou a incidência tumoral. Em camundongos C57BL/6, a separação materna produziu um comportamento ansioso e um aumento na atividade de neutrófilos sanguíneos. Tomados em seu conjunto, parece-nos possível afirmar que a separação materna tenha produzido alterações na atividade neuroimune dos animais, modificando, nos mesmos a atividade do eixo HPA e essas alterações foram influenciadas pelas características individuais das linhagens. / Maternal separation is one model of stress/anxiety induction. We know about it that the mammals normal emotional behavior development depends on the interaction between mother and younglet. Beside this, early life stressed events can induce deletery effects in immune response and to illness resistance for all life long. In this work we searched for the maternal separation effects on the behavior, innate immunity and tumor growth in an adult male mice offspring. Our results showed that the maternal separation, in A/J mice (1) had no big effects in the behavior and in the hematological parameters (before and after the tumor growth), (2) increased the neutrophil and alveolar macrophages activity (before and after the tumor growth), (3) increased the serotonin striatum levels, the 5-HIAA metabolite and the dopamine turnover (4) decreased the corticosterone serum levels and (5) had no effects on tumor incidence. In the C57BL/6 mice, the maternal separation induced an anxiety behavior and increased the neutrophil activity. These results suggest that the maternal separation could have produced alterations in neuroimmune activity, modifying the HPA axis activity and these alterations could be influenced by individual strains characteristics.

Evidências experimentais sugerem que uma variedade de estressores ativa o controle hipotalâmico das respostas neuroendócrinas e autonômicas que estão envolvidas na produção de células do sangue e na liberação destas células da medula óssea para a circulação. A alga Chlorela vulgaris (CV) exibe várias atividades imunomoduladoras como, por exemplo, a capacidade de estimulação das células hematopoéticas e de ativação de leucócitos maduros. No presente trabalho analisamos o efeito imunoprotetor da CV em animais submetidos aos estressores físicos (estresse por choque escapável - CE e inescapável - CI) e ao estressor psicogênico (grupo de animais que testemunhou a exposição ao choque inescapável - T) e inoculados com a bactéria Listeria monocytogenes (LM). Os parâmetros imunológicos observados foram: 1) Crescimento e diferenciação de progenitores hematopoéticos para granulócitos e macrófagos (CFU-GM) da medula óssea; 2) Atividade funcional (burst e fagocitose) de neutrófilos circulantes avaliados por citometria de fluxo; 3) Sobrevida de animais inoculados com dose letal de LM e/ou submetidos aos estressores físicos e psicogênico. Nos grupos CI e T observamos uma redução no número de CFU-GM na medula óssea. Por outro lado, não houve redução deste parâmetro nos animais do grupo CE quando comparado ao medido no grupo controle. Observamos uma maior susceptibilidade do organismo a infecção por LM quando o estresse foi aplicado previamente à inoculação com dose subletal desta bactéria. No entanto, o tratamento com 200 mg/Kg/dia de CV por 5 dias consecutivos mostrou uma ação protetora, restabelecendo a mielossupressão induzida pelo choque inescapável ou pelo estressor psicogênico e/ou pela infecção. A aplicação de choques escapáveis não alterou significativamente o perfil da resposta hematopoética produzida pela infecção. O estudo da eficácia terapêutica de alga, avaliada pelo tratamento de animais infectados com dose letal de LM, demonstrou uma sobrevida de 50% no grupo infectado e de 20% nos grupos infectados e submetidos aos diferentes tipos de estresse, inclusive naquele exposto ao estresse escapável. Ao considerarmos os efeitos dos estressores sobre a atividade funcional de neutrófilos sanguíneos, observamos uma redução na capacidade de fagocitose nos grupos CI e T, e um aumento do burst induzido pela fagocitose. No grupo CE houve um aumento na capacidade de fagocitose destas células, enquanto que o burst não foi alterado. O estudo dos efeitos da CV sobre a atividade funcional de neutrófilos demonstrou uma capacidade da alga de impedir a redução da fagocitose produzida pelo estresse físico por choque inescapável e psicogênico, sem interferir com o burst oxidativo, que estava aumentado nestes grupos. Impediu também o aumento da capacidade de fagocitose verificado no grupo CE. Esses resultados sugerem que a CV possua propriedades protetoras contra os efeitos induzidos pelo diferentes tipos de estressores sobre a série granulocítica/macrofágica, a atividade funcional de neutrófilos e sobre a sobrevida de animais estressados e infectados com dose letal de LM. / Evidence suggests that a variety of stressors can activate the hypothalamic control of the neuroendocrine and autonomic responses involved in the production´s control of blood cells and their release from bone marrow to circulation. The algae Chlorella vulgaris (CV) has several imunomodulatory activities, as the stimulation of hematopoietic cells and the activation of mature leukocytes. The present study evaluated the mieloprotective effects of CV in rats exposed to physical stressors (inescapable - CI and escapable footshock - CE) and to psychogenic stressors (animals that witnessed the inescapable shock application - T), which were inoculated or not with a sublethal dose of the bacterium Lysteria monocytogenes (LM). The immunologic parameters observed were: 1) The growth and differentiation of bone marrow progenitors into granulocytes and macrophages (CFU-GM); 2) the functional activity (oxidative burst and phagocytosis) of blood neutrophils, using flow citometric methods; 3) The rate of survival of animals infected with lethal dose of LM and submitted or not to the stressors. The CI and T groups were mielossupressed. On the other hand, in the CE group, no differences in the number of CFU-GM were observed, when compared to controls. An increase in the susceptibility of the organism was observed when the animals received the inescapable shock application and the psychogenic stressor before the inoculatium of sublethal dose (7,8x108) of the 15 bacterium. However, this mielopoietic response was recovered with the pre-treatment with 200 mg/Kg/day for 5 consecutive days of CV, reestablishing the mielossupression caused by the stress and the infection. The escapable shock didn´t produce any significant difference in the hematopoetic response observed in the infection. The study of the survival rate of rats infected with the letal dose of LM showed that the pre-treatment with CV protected 50% of the animals that were only infected with LM, whereas in the group previously stressed the protection was of 20%. Here, the same response was observed in the animals submitted to the different types of stressors evaluated in this work. To assess the effect of CV treatment in the response of mature blood cells, we considered the functional activity of neutrophils of animals submitted to the stressors. We observed a reduction in phagocytosis in the CI and T groups, and an increase in the oxidative burst induced by the phagocytosis. In the CE group there was an increase in the blood neutrophil phagocytosis, while the production of oxidative burst remained equal to that of control group. The treatment with CV reestablished the changes in phagocytosis to normal values in all the groups, but it produced no changes in the respiratory burst, which was increased in the circunstances of the inescapable shock and of the psychogenic stressor, when compared to the values of control group. Considering our results, we suggest that CV has protective properties against the effects produced by the different types of stressors on the CFU-GM, the functional activity of neutrophils and on the rate of survival of animals stressed and infected with lethal dose of LM.

As b-defensinas são pequenos peptídeos catiônicos com estrutura rica em folhas b pregueadas e seis cisteínas conservadas. São bastante estudadas em mamíferos, mas pouco em serpentes. Utilizando a PCR foram descritos 13 genes b-defensina-símiles em serpentes do gênero Bothrops e Lachesis . Eles se organizam em três éxons e dois íntrons; há alta similaridade no éxon1, íntron 1 e 2, mas os éxons 2 e 3 estão sob evolução acelerada. A análise filogenética por máxima parcimônia revelou que o gene ancestral de b-defensina-símile pode ter três éxons em vertebrados e sua evolução ocorreu de acordo com o modelo de nascimento-e-morte. Peptídeos b-defensina-símiles reduzidos, testados por ensaio de inibição de crescimento em meio líquido, apresentaram atividade inibitória contra Escherichia coli, Citrobacter freundii, Micrococcus luteus e Staphylococcus aureus. A crotamina reduzida foi mais ativa que a forma nativa. Os resultados indicam que a carga líquida era a característica bioquímica mais importante na atividade antibiótica dos peptídeos b-defensina-símiles. / b-defensins are small basic cationic peptides with b-sheet-rich fold plus six conserved cysteines. They are fully studied in mammals, but scarce in snakes. Using a PCR approach, we described 13 b-defensin-like sequences in Bothrops and Lachesis snakes. They are organized in three exons and two introns; they show high similarities in exon 1, intron 1 and intron 2, but exons 2 and 3 have undergone accelerated evolution. Phylogenetic analysis was done using maximum parsimony indicate that the ancestral b-defensin-like gene may have three exons in vertebrates and that their evolution occurred according to a birth-and-death model. Reduced b-defensin-like peptides were tested by microbroth dilution assay, showed inhibitory activity against Escherichia coli, Citrobacter freundii, Micrococcus luteus e Staphylococcus aureus. The reduced form of crotamine was more active than native. The results indicate that the positive net charge is the most important biochemical characteristic of b-defensin-like peptides to antibiotic activity.

Orientador: Ana Carolina de Souza Chagas / Resumo: Nematódeos gastrintestinais são um grande obstáculo na produção de ovinos. A seleção para resistência tem sido uma abordagem eficiente e factível para lidar com esse problema. A utilização e investigação de marcadores genéticos para características de resistência poderiam acelerar o melhoramento genético e levar ao melhor entendimento dos mecanismos moleculares de resistência. O objetivo desse estudo foi verificar a possibilidade de seleção para características de resistência e resiliência em cordeiros da raça Morada Nova, estimar as potenciais respostas correlacionadas e avaliar se cinco polimorfismos de base única (SNPs, OAR2_14765360, OAR6_81718546, OAR11_62887032, OAR12_69606944 and OAR15_59871543) estão associados às características de resistência e resiliência. Um total de 287 cordeiros e 131 matrizes foram submetidas a dois desafios parasitários consecutivos e independentes por infecção oral com 4.000 larvas infectantes (L3) de Haemonchus contortus. Contagem de ovos por grama de fezes (OPG), volume globular (VG) e peso corporal vivo (PV) foram monitorados a cada uma ou duas semanas para 42 dias em cada desafio. Amostras de DNA de 287 cordeiros, 131 matrizes e 4 reprodutores machos foram amplificados por ARMS-PCR ou PCR-RFLP e os genótipos foram determinados. Estimativas de parâmetros genéticos foram obtidas para dias individuais de coleta, e para a característica como um todo com medidas repetidas, utilizando modelos animais mistos. A análise de variância (ANOVA) foi u... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Gastrointestinal nematodes are a major constraint in sheep production. Breeding for resistance has proven to be an effective and feasible approach to address this problem. The use and investigation of genetic markers for resistance traits could accelerate genetic progress and lead to a better understanding of underlying molecular mechanisms. The aim of this study was to verify the possibility of selection for resistance and resilience traits in Morada Nova lambs, to estimate potential correlated responses and to evaluate if five single nucleotide polymorphisms (SNPs) (OAR2_14765360, OAR6_81718546, OAR11_62887032, OAR12_69606944 and OAR15_59871543) are associated with resistance and resilience traits. A total of 287 lambs and 131 ewes were submitted to two consecutive independent parasite challenges by oral infection with 4,000 infective larvae (L3) of Haemonchus contortus. Faecal egg counts (FEC), packed cell volume (PVC) and body weight were measured every one or two weeks for 42 days in each trial. DNA samples from 287 lambs, 131 ewes and 4 rams were amplified by ARMS-PCR or PCR-RFLP and genotypes were determined. Estimates of genetic parameters were obtained for individual records as well as for overall traits with repeated measures, using mixed animal models. Analysis of variance (ANOVA) was used for association analyses between SNP genotypes and phenotypes. In case of significant association, the allele substitution effect was calculated based on a linear model. Heritabi... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-28. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:49Z : No. of bitstreams: 1 000864246_20170424.pdf: 489469 bytes, checksum: c19a08a315ad19ed3168af383d6f2c4c (MD5) Bitstreams deleted on 2017-04-24T11:16:42Z: 000864246_20170424.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-04-24T11:17:27Z : No. of bitstreams: 1 000864246.pdf: 2233958 bytes, checksum: ab77439a6a7146a93b82b0e490020b02 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A prematuridade é a principal causa de mortalidade neonatal e os riscos de complicações decorrentes são inversamente proporcionais à idade gestacional na qual o parto ocorre. Diversos estudos na literatura demonstram o papel da resposta imune inata e dos receptores Toll-like (TLRs) durante a gestação normal e na presença de complicações gestacionais. A expressão de TLRs vem sendo avaliada principalmente nos tecidos da interface materno-fetal e os resultados de tais estudos são conflitantes. A investigação da expressão de TLRs em tecidos gestacionais é de grande importância para o entendimento da participação da imunidade inata em gestações normais e com desfechos gestacionais adversos, porém tais tecidos permitem análise somente após a resolução da gestação. Nesse contexto, uma possível fonte de estudo para análise de TLRs no decorrer da gestação em curso são as células do sangue periférico materno, uma vez são facilmente obtidas por punção venosa, além de possuírem papel fundamental na reposta imune inata e expressarem diversos tipos de TLRs. Objetivo: Traçar o perfil de expressão gênica e proteica de receptores Toll-like 1, -2, -4 e -6 em células mononucleares (PBMCs) e em neutrófilos do sangue periférico materno ao longo da gestação normal e na prematuridade. Materias e métodos: Foram incluídas no estudo 119 gestantes normais, as quais foram subdivididas em trimestres de acordo com sua idade gestacional. Além disso, foram avaliadas 20 gestantes em trabalho de parto pré-termo e 18 gestantes de termo. A análise de expressão gênica foi realizada por PCR em tempo real e a avaliação da expressão proteica por citometria de fluxo. Para a análise dos dados foram empregados os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney através do software SigmaStat 3.1. Resultados: Em relação às PBMCs, não foram observadas diferenças significativas nas expressões gênica e... / Introduction: Prematurity is the leading cause of neonatal mortality and serious neonatal morbidity worldwide and the risk is inversely proportional to gestational age at birth. Several studies demonstrate the role of innate immune response and Toll-like receptors (TLRs) in normal and complicated pregnancies, however most studies have focused on the tissues of the maternal-fetal interface. Research of the expression of TLRs in gestational tissues is of great importance for understanding the involvement of innate immunity in normal pregnancies and adverse pregnancy outcomes, but the analysis of these tissues allows for results only after the complete resolution of gestation. In this scenario, a potential biological sample of interest for analysis of TLRs in the ongoing gestation are maternal peripheral blood cells, since they play a crucial role in the immune system and express high levels of many of the TLRs. Main: Evaluate the profile of gene expression of TLR-1, -2, -4 and -6 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and polymorphonuclear cells (PMNs) and compare these expressions between preterm and term pregnancies. Materials and methods: 119 normal pregnant women were included in the study, subdivided into three groups according to the gestational trimester. In addition, 20 pregnant women in preterm labor and 18 pregnant women at term were evaluated. Gene expression analysis was performed by real-time PCR and protein expression evaluation by flow cytometry. Statistical analyses were performed using the nonparametric Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests by SigmaStat 3.1 software. Results: Regarding PBMCs, there were no significant differences in gene and protein expressions of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 among the trimesters. The same was observed when comparing PBMCs of preterm and term pregnancies. In relation to neutrophils, gene and protein expressions of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 remained unchanged throughout normal ...