Neste trabalho, anticorpos anti-IgGh foram conjugados às nanopartículas de prata (NPAg) para detectar imunoglobulina G humana (IgGh). Um imunoensaio colorimétrico baseado na diminuição da agregação devido ao aumento da repulsão eletrostática após a interação ligante-alvo. A agregação é induzida pela variação da força iônica e uma mudança da coloração da suspensão coloidal de amarelo para vermelho pode ser observada. Na presença de IgGh, a agregação é inibida e a coloração da suspensão coloidal não se altera. As nanopartículas foram obtidas por meio de cinco procedimentos diferentes e caracterizadas por espectroscopia UV-Vis, espalhamento dinâmico de luz, difração de raios-X e microscopia eletrônica. Glicose e borohidreto de sódio foram utilizados como agentes redutores, enquanto CTAB e β-ciclodextrina foram utilizados como estabilizantes. Citrato de sódio foi utilizado como agente redutor e/ou estabilizante. Nanoesferas de carbono foram obtidas por tratamento hidrotérmico de uma solução aquosa de glicose e também foram utilizadas no preparo das nanopartículas. As nanopartículas foram funcionalizadas com ácido mercaptossuccínico e a conjugação ocorreu devido à interação entre grupos aminas e grupos carboxílicos ionizados, presentes no anticorpo e agente de acoplamento, respectivamente. A estabilidade dos conjugados e o efeito da adição de IgGh foram avaliados para todos os sistemas preparados. As nanopartículas de prata preparadas com borohidreto de sódio e citrato de sódio foram selecionadas para serem aplicadas no desenvolvimento do imunoensaio e as condições experimentais foram avaliadas. Em condições ótimas, observou-se uma correlação linear entre a diminuição da agregação do sistema (NPAg-anti-IgGh) e a concentração de IgGh (0 a 200 ng mL-1). O limite de detecção foi estimado em 25 ng mL-1. O método colorimétrico apresentou boa seletividade para a detecção de IgGh. Além disso, foi obtido um resultado satisfatório ao aplicar o método para determinação do fator IX de coagulação. Foi desenvolvido também um método para determinação de ATP baseado na agregação de nanopartículas de ouro. Aptâmeros foram utilizados como elemento de reconhecimento. Em princípio, o método pode ser aplicável à determinação de outros analitos, por meio da substituição do aptâmero utilizado neste trabalho pelo oligonucleotídeo específico para o alvo de interesse. / In this work, antibodies to human immunoglobulin G (anti-IgGh) were used in combination with silver nanoparticle (NPAg) to detect IgGh. A colorimetric immunoassay based on the decrease of aggregation due to increased electrostatic repulsion upon ligand-target interaction. Aggregation was induced by varying the ionic strength and the solution of NPAg-anti-IgGh shows obvious visible color change from yellow to red. In the presence of IgGh aggregation the nanoparticle is inhibited and coloration of the colloidal solution does not change. The nanoparticles were obtained using five different procedures and they were characterized by UV-Vis spectroscopy, dynamic light scattering, X-ray diffraction and electron microscopy. Glucose and sodium borohydride were used as reducing agent, as CTAB and β-cyclodextrin reagents were used as stabilizers. Sodium citrate was used as reducing and stabilizing agent. Carbon nanospheres were prepared by hydrothermal treatment of glucose and used in the preparation of NPAg. The nanoparticles were functionalized with dimercaptosuccinic acid and their conjugation occurred due to the interaction of positively charged amine groups and anionic groups (-COO-) present on the antibody and coupling agent. The stability of conjugates and the variation of aggregation in the presence of IgGh were evaluated for all systems. The NPAg prepared by sodium borohydride were selected for use in the immunoassay and the optimum conditions of the assay were investigated. Under the optimal conditions, the ration between the absorbance at 396 nm and 564 nm was linearly proportional to the IgGh concentration on a range from 0 to 200 ng mL-1, with a detection limit of 25 ng mL-1. The colorimetric method showed good selectivity for IgGh detection. It was possible to adapt the method to the determination of other proteins, such as factor IX. In another approach, anti-aptamer ATP was used to develop a colorimetric method for the determination of ATP based on stabilization of gold nanoparticles provided by strands of DNA.The strategy was based on stabilization of nanoparticles due to interaction with single strands of DNA, and the change of the stability of the nanoparticles provided by the conformational change of the aptamer following recognition. This method could in principle be used to detect analytes by substituting the aptamer used in this study by the specific aptamer for the target of interest

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2017-05-24T12:09:41Z No. of bitstreams: 1 THAIANA DE OLIVEIRA SACRAMENTO.pdf: 2144147 bytes, checksum: da22bfec1bea19a06b5a5c97d15831fa (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-24T12:09:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 THAIANA DE OLIVEIRA SACRAMENTO.pdf: 2144147 bytes, checksum: da22bfec1bea19a06b5a5c97d15831fa (MD5) / A esclerose múltipla é uma doença que afeta preferencialmente o sistema nervoso central de mulheres jovens, causando-lhes graus variáveis de incapacidades física e cognitiva. Etiologicamente associa fatores ambientais, biológicos, sócioeconômicos e genéticos, como por exemplo genes do MHC classe II, especialmente os alelos HLADRB1* 15. Seu diagnóstico é bastante difícil, mas níveis solúveis de IgG podem sugerir atividade da doença. Objetivo:Determinar a frequência dos alelos HLA DRB1* na população baiana em geral e em portadores de esclerose múltipla atendidos no centro de referência do CHUPES, UFBA, no período de outubro de 2014 a abril de 2015 e associá-las aos níveis séricos de IgG. Metodologia: Estudo do tipo caso-controle, aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de medicina da Universidade Federal da Bahia (CAAE: 3517134.0.0000.5577), que envolveu uma amostra de conveniência composta por 197 indivíduos, cujos dados sócioclínico-demográficos foram coletados através de questionário desenvolvido para a pesquisa. A genotipagem dos alelos HLADRB1* foi realizada através da técnica “HLA-DR SSO Genotyping Test” e a determinação dos níveis séricos de IgG por nefelometria. Resultados: A análise quantitativa revelou um perfil genotípico do tipo HLA-DRB1*15 (20,5%) em mulheres (83,0%) das raças negra ou parda (75,0%), com faixa etária entre 30 e 39 anos (28,0%), que desenvolveram a forma surtorremissiva da doença (76,0%), nas fases mais avançadas da vida (55,0%), sem permanência de sequela clínica (70,0%) e que usavam algum tipo de Interferon (58,0%). O IgG sérico para o grupo de doentes alcançou valor médio de 1.410 ± 323 mg/dL, e nos controles, esta média foi de 1.532 ± 310 mg/dL. A análise qualitativa indicou maiores frequências, nas formas progressivas de esclerose múltipla dos grupos alélicos HLA-DRB1*12 (22,0%), e dos alelos HLA-DRB1*13 (12,6%) e HLA-DRB1*15 (22,0%) naqueles indivíduos com a forma surto-remissiva. Negros e pardos demonstraram maior prevalência do alelo HLA-DRB1*15 (24,0%), enquanto que nos brancos maior frequência do alelo HLA-DRB1*07 (20,0%) foi encontrada. Negros e pardos portadores da doença tenderam a apresentar maiores níveis séricos médios de IgG (25,4%). Conclusão: Houve forte associação entre as frequências alélicas encontradas e as variáveis raça/etnia e forma clínica da doença. Nesta população, os níveis séricos de IgG não parecem servir como marcadores de progressividade.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000001.pdf: 706994 bytes, checksum: 3b1be365e85a6cde721c1c20730d3ac6 (MD5) Previous issue date: 2006 / (...) Sabe-se que a resposta de isotipos específicos tem sido associada às manifestações clínicas da doença de Chagas. Assim, nos propomos a pesquisar as subclasses de IgG no soro de indivíduos chagásicos frente a dois antígenos específicos do Trypanosoma cruzi, visando a obtenção de um perfil isotípico que seja capaz de discriminar as formas clínicas cardíaca (CARD), mista (MIS) e indeterminada (IND). Para isso, coletamos sangue para obtenção de soro de 60 pacientes chagásicos (CARD= 33, MIS= 7 e IND= 20), (...). Todos os pacientes foram avaliados clinicamente para caracterização das formas clínicas e realizaram exames confirmatórios para infecção pelo T. cruzi. Além disso, também coletamos sangue de 40 indivíduos sadios (indivíduos não-chagásicos= 20 e controles negativos para o cut-off= 20) que apresentaram sorologia negativa para infecção pelo T. cruzi. (...) Os antígenos recombinantes (Ags-Recs) Cytoplasmic Repetitive Antigen (CRA) e Flagellar Repetitive Antigen (FRA) foram analisados através de SDS-PAGE, seguido por colorações pela prata e pelo ácido periódico de Schiff, ficando comprovada a integridade dos Ags-Recs e ausência de contaminações bacterianas. As concentrações ideais dos Ags-Recs e dos anti-isotipos foram estabelecidas após titulação dos mesmos. Para detecção dos isotipos utilizamos a metodologia do ELISA indireto, onde as placas de ELISA foram sensibilizadas com os Ags-Recs CRA ou FRA. As amostras de soro foram depositadas em duplicata nos poços. A ligação dos anticorpos específicos foi detectada pela incubação dos anti-isotipos (anti-IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 e anti-IgG4) conjugados à biotina, seguida da incubação de estreptavidina conjugada à peroxidase. A quantificação da reação foi determinada através do leitor de ELISA a 490 nm. Os resultados foram analisados através de um índice de reatividade, onde as densidades ópticas das amostras foram divididas pelo cut-off (média dos controles negativos adicionada de dois desvios-padrão) de suas respectivas placas. Verificamos que a resposta imune humoral gerada pelos pacientes frente aos Ags-Recs foi bastante variada, com produção de quase todas as subclasses de IgG. Entretanto, apenas o isotipo IgG2 específico contra o Ag-Rec FRA foi capaz de diferenciar pacientes chagásicos portadores da forma CARD daqueles portadores da forma IND, podendo, após um estudo prospectivo, servir como marcador de evolução clínica para a forma cardíaca ....

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:02:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:38:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-26T13:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-09-18 / Leishmaniasis are a group of endemic diseases in 98 countries, with an estimated incidence up to 1.6 million cases per year (0.7-1.2 million of cutaneous leishmaniasis and 0.2 to 0.4 million visceral leishmaniasis). The criteria for the cure of american tegumentary leishmaniasis adopted nowadays is the complete healing of the lesion. IgG3 subclass anti-leishmania antibodies decrease faster than the total IgG antibodies in cured patients. This study was aimed to identify differences in the recognition pattern of L. (V.) braziliensis protein by total IgG or IgG3 antibodies obtained from cutaneous leishmaniasis infected patients’ serum before and after treatment. Sera of 15 patients infected with L. braziliensis attended at the Tropical Diseases Hospital Anuar Auadi were tested by ELISA against crude extracts of L. braziliensis. When all patients were analyzed, it was observed that anti-leishmania IgG3 absorbance levels measured by ELISA were similar to the controls levels at 6 month. The absorbance levels of total antibodies in control and infected patients reached similarity only at 12/18 months. After split patients into group A: healing of the lesion before one month and B: healing of the lesion after one month, it was observed that absorbance levels in ELISA for IgG3 in group A was similar to the controls levels at the time of diagnosis. It was also observed, by Western Blotting, that the IgG3 reactivity of IgG3 to 49 kDa protein waspresent mainly for group B patients. The 28 kDa protein showed IgG3 reactivity mainly in group B the healing os lesions and the 14 kDa protein showed IgG3 reactivity in some controls our data suggest that the use of 49 kDa protein in ELISA may be useful for diagnosis and following up of patients and the 14kDa protein may be important in false-positive results. / As leishmanioses constituem um grupo de doenças endêmicas em 98 países, com uma incidência estimada de até 1,6 milhões de casos por ano (0,7-1,2 milhão de leishmaniose tegumentar e 0,2 a0,4 milhão de leishmaniose visceral). O critério de cura da leishmaniose tegumentar americana adotado hoje é a cura completa da lesão. Anticorpos anti-Leishmania da subclasse IgG3 decaem mais rapidamente que os anticorpos IgG totais em pacientes curados. O presente trabalho tem objetivo de identificar diferenças no reconhecimento de proteínas de L. (V.) braziliensis por anticorpos IgG totais ou IgG3 obtidos de soro de pacientes com leishmaniose tegumentar americana antes e após o tratamento. Soros de 15 pacientes infectados com L. braziliensis atendidos no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad foram testados por ELISA contra extratos brutos de L. braziliensis. Quando analisados todos os pacientes, foi possível observar que as absorbâncias no ELISA para a subclasse IgG3 anti-Leishmania ficou semelhante aos controles com 6 meses, o que só aconteceu para anticorpos totais com 12/18 meses. Com a separação dos pacientes em A: pacientes com cura clínica antes de um mês e grupo B: pacientes com cura clínica após um mês, observou-se que as absorbâncias no ELISA para IgG3 no grupo A era semelhante à dos controles no momento do diagnóstico. Identificamos, pelo Western Blotting, que a reatividade à proteína de 49 kDa pela IgG3 de pacientes era presente principalmente no grupo B. A proteína de 28 kDa reagiu com IgG3 de pacientes do grupo B antes da cura clínica e a proteína de 14 kDa reagiu com IgG3 de três soros controles. Nossos dados sugerem que a proteína de 49 kDa pode ser usada em ELISA para o diagnóstico e acompanhamento dos pacientes portadores de LTA e que a proteína de 14kDa pode ser responsável por reações falso positivas.

Orientador: Sônia Maria Alves Bueno / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-17T11:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bresolin_IgorTadeuLazzarotto_D.pdf: 3279874 bytes, checksum: b2f9ab93ce7e5036f95f0da584a42017 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Dentre os hemoderivados disponíveis comercialmente, as imunoglobulina do isotipo G (IgG) recebem destaque pelo seu uso em aplicações terapêuticas. Por esta razão são requeridas com elevado grau de pureza. Várias técnicas vêm sendo investigadas para a purificação de IgG a partir do soro ou plasma humano, desde a precipitação até métodos mais seletivos, como os cromatográficos. Neste trabalho, investigou-se o efeito de agentes quelantes de IMAC (cromatografia por íons metálicos imobilizados) como Tris-2(aminoetil)amina (TREN) e o-fosfoserin (OPS) como grupos ionogênicos (sem íon metálico imobilizado), além do aminoácido L-Lisina e seu polímero poli-L-Lisina (PLL) como ligantes visando a purificação de IgG a partir do soro humano. Para tanto, foram realizados experimentos de adsorção em diferentes sistemas tamponantes. A seletividade dos adsorventes foi verificada por eletroforese SDS-PAGE e análise nefelométrica. As melhores condições, para cada caso, foram utilizadas em experimentos de curvas de ruptura e isotermas de adsorção de albumina de soro humano (HSA) e IgG. No caso dos ligantes TREN e PLL, 73% e 86% da IgG alimentada foi recuperada nas frações não-retidas (cromatografia negativa) apresentado pureza superior a 90%. Quando o ligante OPS foi utilizado, por sua vez, a recuperação de IgG ocorreu nas frações retidas juntamente com IgM. Experimentos de curva de ruptura mostraram que um fator de purificação de 4.9 foi atingido, sendo a IgG recuperada com pureza de 88%. Este ligante se mostrou eficiente quando se deseja purificar IgG humana que possui pontos isoelétricos na faixa de 7,8 a 8,5. Para todos os ligantes, a recuperação de IgG a partir soro humano pode ser alcançado sob condições brandas de pH, baixa força iônica, e temperatura ambiente. De um ponto de vista de processo em larga escala, todos os ligantes apresentados neste trabalho apresentam potencial para serem usados como uma das etapas em um processo industrial de recuperação e purificação de IgG / Abstract: Among the commercially available hemoderivatives or blood products, the immunoglobulin G (IgG) is highlighted by its use in therapeutic applications, which need high purity IgG. Several techniques are being investigated aiming at the purification of IgG from human serum or plasma, usually starting with precipitation and then using more selective methods such as chromatography. In this study, we evaluated the effect of Tris-2 (aminoethyl) amine (TREN) and o-phosphoserine (OPS) - two chelating agents used in immobilized metal ion chromatography (IMAC) - as ionogenic groups (without immobilized metal ion), and the amino acid L-lysine and its polymer poly-L-lysine (PLL) as ligands aiming at the purification of IgG from human serum. For this purpose, adsorption experiments were performed using different buffering systems. The selectivity of the adsorbents was checked by SDS-PAGE and nephelometric analysis. The best conditions for each adsorbent were used in experiments of breakthrough curves and adsorption isotherms of human serum albumin (HSA) and IgG. In the case of TREN and PLL, 73% and 86% of IgG fed was recovered in the non-retained fractions (negative chromatography) with purity higher than 90%. When the ligand OPS was used, IgG was recovered in retained fractions. Experiments of breakthrough curve showed that a purification factor of 4.9 was reached, and IgG was recovered with a purity degree 88% (with IgM). This ligand is efficient when it is desired to purify human IgG with isoelectric points ranging from 7.8 to 8.5. For all ligands, the recovery of IgG from human serum was achieved under mild conditions of pH, low ionic strength and temperature. All ligands presented in this study have potential to be used in an industrial downstream processing of IgG from human serum / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Maria Esther de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T09:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AndersonPachecodos_M.pdf: 3380754 bytes, checksum: 9736aa6f219de1691e4d55d474a7d293 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As zonas endêmicas de leishmanioses e doença de Chagas, duas grandes endemias causadas por cinetoplastídeos, sobrepõe-se na América do Sul, especialmente na região Sudeste do Brasil, o que pode gerar casos de co-infecção entre Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. Ocorrem reações cruzadas, mesmo com baixos títulos, em inquéritos sorológicos de pacientes infectados com os parasitas, o que leva a falsas estimativas de prevalência de ambas as infecções. Este trabalho tem o objetivo de observar o efeito de um diluente de amostra proposto para reduzir a ocorrência de reações cruzadas em testes sorológicos para doenças causadas por cinetoplastídeos e outros parasitas. Foram selecionadas 585 amostras de sangue provenientes de quatro regiões do Estado de São Paulo, entre litoral e planalto, colhidas no período compreendido entre 1996 a 2003, durante atividades do Programa de Controle da Doença de Chagas. As análises das amostras foram feitas através das Reações de Imunofluorescência (RIFI) e do ensaio imunoenzimático (ELISA). Com as amostras reagentes (onze no total), para doença de Chagas e leishmaniose em ambas as técnicas, foi realizado o teste ELISA alta avidez, que utiliza um diluente com caotrópico, que demonstrou redução nos títulos da reação positiva falsa, restando apenas uma amostra sem redução significativa do seu título, que sugeriu ser um caso de co-infecção de doença de Chagas e leishmaniose, epidemiologicamente factível dada a existência de ambas as infecções na área estudada. O uso deste diluente em estudos clínicos e epidemiológicos pode aprimorar o diagnóstico para a identificação de soropositivos em regiões de sobreposição de endemias causadas por cinetoplastídeos / Abstract: Leishmaniases and Chagas disease are endemic in extensive areas of the American Continent. These parasitic diseases can occur together in South America, particularly in southwestern regions of Brazil, which poses a serious epidemiological problem due to the observed serological cross-reactivity between Leishmania spp. and Trypanosoma cruzi, even at low titers. As false prevalence estimates of these agents are critically misleading, we designed an experiment aiming at analyzing the effect of a diluent intended to reduce the chances of false positive tests resulting from serological cross-reactivity between these kinetoplastids and other parasites. As a part of the activities of the Program for the Control of Chagas disease, we selected 585 blood samples collected, during the period from 1996 to 2003, from residents in four regions situated between the seacoast and the plateau of the State of São Paulo. The serological tests used (IFAT and ELISA) produced a total of eleven positive reactions. Lower false positive titers resulted from the use of high avidity ELISA plus a chaotropic diluent. The only serological result in which titers corresponding to both infections were not significantly reduced was suggestive of mixed infection, on the basis of the fact that it was connected to a patient evidently exposed to both agents. This experiment suggests that the use of a chaotropic diluent can be a useful tool to reduce the proportion of such false parasitic mixed infection results as those investigated by us / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Neste trabalho, anticorpos anti-IgGh foram conjugados às nanopartículas de prata (NPAg) para detectar imunoglobulina G humana (IgGh). Um imunoensaio colorimétrico baseado na diminuição da agregação devido ao aumento da repulsão eletrostática após a interação ligante-alvo. A agregação é induzida pela variação da força iônica e uma mudança da coloração da suspensão coloidal de amarelo para vermelho pode ser observada. Na presença de IgGh, a agregação é inibida e a coloração da suspensão coloidal não se altera. As nanopartículas foram obtidas por meio de cinco procedimentos diferentes e caracterizadas por espectroscopia UV-Vis, espalhamento dinâmico de luz, difração de raios-X e microscopia eletrônica. Glicose e borohidreto de sódio foram utilizados como agentes redutores, enquanto CTAB e β-ciclodextrina foram utilizados como estabilizantes. Citrato de sódio foi utilizado como agente redutor e/ou estabilizante. Nanoesferas de carbono foram obtidas por tratamento hidrotérmico de uma solução aquosa de glicose e também foram utilizadas no preparo das nanopartículas. As nanopartículas foram funcionalizadas com ácido mercaptossuccínico e a conjugação ocorreu devido à interação entre grupos aminas e grupos carboxílicos ionizados, presentes no anticorpo e agente de acoplamento, respectivamente. A estabilidade dos conjugados e o efeito da adição de IgGh foram avaliados para todos os sistemas preparados. As nanopartículas de prata preparadas com borohidreto de sódio e citrato de sódio foram selecionadas para serem aplicadas no desenvolvimento do imunoensaio e as condições experimentais foram avaliadas. Em condições ótimas, observou-se uma correlação linear entre a diminuição da agregação do sistema (NPAg-anti-IgGh) e a concentração de IgGh (0 a 200 ng mL-1). O limite de detecção foi estimado em 25 ng mL-1. O método colorimétrico apresentou boa seletividade para a detecção de IgGh. Além disso, foi obtido um resultado satisfatório ao aplicar o método para determinação do fator IX de coagulação. Foi desenvolvido também um método para determinação de ATP baseado na agregação de nanopartículas de ouro. Aptâmeros foram utilizados como elemento de reconhecimento. Em princípio, o método pode ser aplicável à determinação de outros analitos, por meio da substituição do aptâmero utilizado neste trabalho pelo oligonucleotídeo específico para o alvo de interesse. / In this work, antibodies to human immunoglobulin G (anti-IgGh) were used in combination with silver nanoparticle (NPAg) to detect IgGh. A colorimetric immunoassay based on the decrease of aggregation due to increased electrostatic repulsion upon ligand-target interaction. Aggregation was induced by varying the ionic strength and the solution of NPAg-anti-IgGh shows obvious visible color change from yellow to red. In the presence of IgGh aggregation the nanoparticle is inhibited and coloration of the colloidal solution does not change. The nanoparticles were obtained using five different procedures and they were characterized by UV-Vis spectroscopy, dynamic light scattering, X-ray diffraction and electron microscopy. Glucose and sodium borohydride were used as reducing agent, as CTAB and β-cyclodextrin reagents were used as stabilizers. Sodium citrate was used as reducing and stabilizing agent. Carbon nanospheres were prepared by hydrothermal treatment of glucose and used in the preparation of NPAg. The nanoparticles were functionalized with dimercaptosuccinic acid and their conjugation occurred due to the interaction of positively charged amine groups and anionic groups (-COO-) present on the antibody and coupling agent. The stability of conjugates and the variation of aggregation in the presence of IgGh were evaluated for all systems. The NPAg prepared by sodium borohydride were selected for use in the immunoassay and the optimum conditions of the assay were investigated. Under the optimal conditions, the ration between the absorbance at 396 nm and 564 nm was linearly proportional to the IgGh concentration on a range from 0 to 200 ng mL-1, with a detection limit of 25 ng mL-1. The colorimetric method showed good selectivity for IgGh detection. It was possible to adapt the method to the determination of other proteins, such as factor IX. In another approach, anti-aptamer ATP was used to develop a colorimetric method for the determination of ATP based on stabilization of gold nanoparticles provided by strands of DNA.The strategy was based on stabilization of nanoparticles due to interaction with single strands of DNA, and the change of the stability of the nanoparticles provided by the conformational change of the aptamer following recognition. This method could in principle be used to detect analytes by substituting the aptamer used in this study by the specific aptamer for the target of interest

Orientador: Sônia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T14:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tsai_YuanMing_M.pdf: 3416327 bytes, checksum: d37231cf12f3af7bab5f7826907d5180 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo principal, o estudo comparativo dos agentes quelantes CM-Asp e IDA no processo da purificação de IgG humana por cromatografia de afinidade por íon metálico cobalto imobilizado em diferentes sistemas tamponantes na presença e ausência do sal NaCl. Observou-se, para todos os sistemas tamponantes estudados, a adição de sal foi desfavorável em termos de capacidade e seletividade de adsorção de IgG para ambos os agentes quelantes. De acordo com eletroforeses SDS-PAGE e análises nefelométricas, os melhores resultados foram observados em presença de Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 para o quelato CM-Asp-Co2+ e fosfato de sódio 25 mmol/L com imidazol 2 mmol/L, pH 7,0 para o quelato IDA-Co2+, obtendo-se fatores de purificação de 8,1 e 4,1 e pureza de 100% e 96%, respectivamente. Foram determinadas as curvas de ruptura por meio de experimentos cromatográficos realizados a diferentes diluições do soro humano, os resultados obtidos evidenciaram uma maior eficiência em termos da capacidade de adsorção nas diluições a 5 e 10 vezes (0,89 e 1,03 mg de proteína total/mL gel) comparado a soro diluído a 2,5 vezes (0,40 mg de proteína total/mL gel), tendo estes demonstrado comportamentos similares ao apresentado em etapa cromatográfica. Os dados de adsorção de IgG foram bem representados pelo modelo de Langmuir-Freundlich, a 25ºC, fornecendo valor de Qm igual a 94,44 mg IgG/mL gel e constante de dissociação de 8,18 x 10-5 mol/L, ordem de grandeza característica para ligantes pseudobioespecíficos / Abstract: In this work, we targeted the comparative study between chelating ligands agarose-CM-Asp and agarose-IDA in the purification of human IgG by Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography (IMAC) with immobilized cobalt ion in different buffering systems in the presence or absence of salt. For all buffering systems the addition of salt was unfavorable in terms of adsorption capacity of IgG for both chelating ligands. The best results were obtained in the absence of salt. According to SDS-PAGE electrophoresis and nephelometric analysis, the best conditions observed were Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 for the agarose-CM-Asp and sodium phosphate 25 mmol/L with imidazole 2 mmol/L for the agarose-IDA (purification factor of 8,1 and 4,1 and purity of 100% and 96%, respectively). Chromatographic experiments were carried out with different dilutions of human serum to determine the breakthrough curves. The results showed a higher efficiency in terms of adsorption capacity at dilutions of 5 and 10 times (0.89 and 1.03 mg of protein Total / mL gel) compared to serum diluted 2.5 times (0.40 mg total protein / mL gel), these results had similar behaviors as those showed in the chomatografic stage. The adsorption data of IgG at 25ºC were well represented by Langmuir-Freundlich model. Values of Qm equal 94,44 mg of IgG/mL gel and dissociation constant of 8,18 x 10-5 mol/L, characteristic magnitude of pseudospecific ligands / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Mateus José Rodrigues Paranhos da Costa / Resumo: Objetivou-se avaliar a eficácia do uso do colostro comercial em pó como substituto do colostro de vaca na primeira mamada de bezerras. Foram utilizadas 31 bezerras mestiças Holandês (H) x Gir (G), provenientes dos grupos genéticos 3/4HG, 5/8HG, 7/8HG e LA, divididas em dois grupos experimentais: G1 (n=15) 2L de colostro de vaca e G2 (n=16) 470g de colostro comercial em pó (SCCL, Saskatoon, SK, Canadá) diluídos em 1,5L de água morna, ambos fornecidos nas primeiras três horas de vida, e posteriormente recebendo mais 2L de colostro de vaca em até 12 horas após o nascimento. As concentrações de IgG presentes (p=0,006) foram maiores no colostro comercial em pó, enquanto as médias da β- caseína (p<0,0001), haptoglobina (p<0,0001) e α1-glicoproteína ácida (p=0,002) foram maiores nos colostros de vaca. As concentrações séricas de PT (G1 = 7,70 ± 1,00g/dL e G2 = 6,73 ± 0,65g/dL; p=0,003) e IgG (G1 = 2110,25 ± 595,03mg/dL e G2 = 1567,6 ± 418,25mg/dL; p=0,004) demonstraram diferenças estatísticas entre os grupos de manejo, com maiores médias para o G1. Houve diferenças significativas para a concentração de albumina sérica (p=0,005), com maiores médias para o G1 (4660,7 ± 384,61mg/dL). Não ocorreu diferença significativa para a haptoglobina sérica (p=0,29), porém suas concentrações médias se apresentaram bem mais altas em ambos os grupos de manejo (G1 = 33,86 ± 4,90 e G2 = 29,31 ± 5,63mg/dL). As enfermidades com maior ocorrência foram diarreia e pneumonia, sendo registrados também casos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The purpose of this study was value the effectiveness in commercial colostrum powder using as a cow colostrum substitute in the first calf suckling. Twenty-one Holstein (H) x Gir (G) crossbred calves from 3/4HG, 5/8HG, 7/8HG and LA genetic groups were divided into two experimental groups: G1 (n = 15) 2L of cow colostrum and G2 (n = 16) 470g of commercial powdered colostrum (SCCL, Saskatoon, SK, Canada) diluted in 1.5L of warm water, both supplied within the first three hours of life, and subsequently receiving an additional 2L of cow colostrum in up to 12 hours after birth. Present IgG concentrations (p = 0.006) were higher in commercial powdered colostrum, while mean β-casein (p < 0.0001), haptoglobin (p <0.0001) and α1-acid glycoprotein (p = 0.002) were higher in cow colostrums. Serum concentrations of PT (G1 = 7.70 ± 1.00 g/dL and G2 = 6.73 ± 0.65 g/dL; p = 0.003) and IgG (G1 = 2110.25 ± 595.03 mg/dL and G2 = 1567.6 ± 418.25 mg/dL; p = 0.004) demonstrated statistical differences between management groups, with higher means for G1. There were significant differences in serum albumin concentration (p = 0.005), with higher means for G1 (4660.7 ± 384.61mg / dL). There was no significant difference for serum haptoglobin (p = 0.29), but its mean concentrations were much higher in both management groups (G1 = 33.86 ± 4.90 and G2 = 29.31 ± 5.63 mg/dL). The most common diseases were diarrhea and pneumonia, with cases of parasitic sadness and omphalitis, and two deaths in G2. Althou... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: José Jurandir Fagliari / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a transferência de imunidade passiva em bezerros bubalinos saudáveis e avaliar a influência das concentrações séricas de imunoglobulina G (IgG) às 24 horas no desempenho produtivo nos primeiros 90 dias de idade dos bezerros. Amostras de colostro de novilhas (sem parto prévio), primíparas e pluríparas; e amostras de sangue de seus respectivos bezerros foram coletadas no nascimento, antes da ingestão de colostro, e 24h, 48h e 72h após o nascimento para determinação das atividades séricas de gamamaglutamiltransferase (GGT) e fosfatase alcalina (ALP); e concentrações séricas de proteína total (PT), imunoglobulinas A (IgA) e G (IgG) e lactoferrina. As concentrações de imunoglobulinas de amostras de colostro de búfalas e amostras de sangue de bezerros foram determinadas pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). O peso foi medido a cada semana após o nascimento até os três meses de idade. Os resultados da transferência de imunidade passiva foram analisados como medidas repetidas no tempo e o peso e o ganho de peso diário (GPD) foram avaliados por regressão linear simples. As diferenças foram consideradas significativas quando P ≤ 0,05. Os búfalos nasceram hipogamaglobulinêmicos (4,23±0,33 mg/mL), e às 24 horas as concentrações séricas de IgG foram de 34,5±1,48 mg/mL, a transferência de imunidade passiva foi considerada bem-sucedida. As concentrações séricas de PT são recomendadas como parâm... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the passive immunity transfer on healthy buffalo calves and evaluate the influence of serum concentrations of immunoglobulin G (IgG) at 24hs on productive performance on the first 90 days of age of Murrah buffalo calves. Colostrum samples from heifers (without previous calving), primiparous and pluriparous dams; and blood samples from their respective calves, were taken at birth, before colostrum ingestion, and at 24h, 48h, and 72h after birth for determination of serum activities of gamma-glutamyltransferase (GGT) and alkaline phosphatase (ALP); and serum concentrations of total protein (TP), immunoglobulins A (IgA) and G (IgG) and lactoferrin. The concentrations of immunoglobulins of colostrum samples from buffaloes and blood samples from calves were determined by sodium dodecyl sulfate-containing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) technique. Weight was measured following each week after birth until three months of age. The passive immunity transfer results were analyzed as repeated measures and weight and average daily gain (ADG) were evaluated by simple linear regression. Differences were considered significant when P≤0.05. As buffalo calves were born hypogammaglobulinemic (4.23±0.33 mg/mL), and at 24h serum concentrations of IgG were of 34.5±1.48 mg/mL, passive immunity transfer was successful. Serum concentrations of TP at 24h is recommended as reliable indirect parameter to evaluate passive immunity transfer on buffalo c... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor