As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígeno do sistema imune. No entanto, trabalhos têm demonstrado seu envolvimento na manutenção da tolerância imunológica. As células T CD4+CD25+Foxp3+ possuem a capacidade de suprimir respostas imunes. Neste estudo avaliamos as alterações ocorridas na população de células T CD4+CD25+Foxp3+ após co-cultura de células de linfonodo com DCs. Nossos resultados demonstram que após a co-cultura há um aumento da população de células CD4+CD25+Foxp3+ de maneira independente do estado de ativação das DCs ou da presença de antígenos exógenos. No entanto, o aumento observado é maior quando DCs imaturas são incubadas com antígenos exógenos. Notamos ainda que há presença de TGF-ß em todas as condições experimentais em que observamos aumento da população de células CD4+CD25+Foxp3+. Nossos dados sugerem ainda que este aumento se deve à proliferação das células T CD4+CD25+Foxp3+. / Dendritic cells (DCs) are the most important antigen-presenting cells of the immune system. However, DCs have also been implicated in maintaining immunologic tolerance. CD4+CD25+Foxp3+ T lymphocytes are known as cells with regulatory properties. In this study we evaluated the changes in the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population after co-culture of lymph-node cells with DCs. Our results show an increase in the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population after co-culture and occurs regardless of the activation state of DCs and the presence of exogenous antigens; however it is greater when immature DCs are previously pulsed with exogenous antigen. We also noticed that TGF-? is present in all cultures conditions in which the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population increases. Our data also suggests that the increase of the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population may be due to the proliferation of these cells.

Um grupo especial de indivíduos transplantados renais mantém a função do enxerto estável após a total retirada da terapia imunossupressora, alcançando um estado imunológico chamado de Tolerância operacional. Ainda não há marcadores moleculares e celulares que discriminem a tolerância no transplante humano, e os seus mecanismos estão sendo investigados. O perfil de peptídeos presentes na urina pode trazer informações importantes sobre o estado fisiopatológico renal. Nós investigamos se a tolerância operacional apresenta um perfil diferencial de peptídeos urinários, potencialmente, relevante para diagnóstico deste estado imunológico, assim como para a compreensão de seus mecanismos. Realizamos análises qualitativas do extrato de peptídeos da urina de indivíduos dos diferentes grupos do estudo: saudáveis (SA, n=6), tolerantes operacionais (TO, n=5), rejeição crônica (RC, n=8) e estável sob terapia imunossupressora convencional (EST, n=5), utilizando a abordagem proteômica de Shotgun. Identificamos um total de 15283 diferentes peptídeos em todos os grupos, correspondentes a 646 proteínas distintas, distribuídas nos diferentes grupos: TO = 189, RC = 296, EST = 205 e no grupo SA 219 proteínas. Observamos proteínas exclusivas dos diferentes grupos: TO teve 87 proteínas exclusivas, RC 168, EST 106 e SA 108 proteínas. Apesar das proteínas exclusivas não terem sido compartilhadas por todos os indivíduos do mesmo grupo, a totalidade dos indivíduos de cada grupo apresentou várias dessas proteínas (cada indivíduo apresentou em média 15% das proteínas exclusivas de seu grupo). Das 646 proteínas identificadas, apenas 2,3% foram classificadas pelo Gene ontology como relacionadas ao sistema imune e os compartimentos celulares mais frequentes foram: núcleo 36% e citoplasma 23%. Destacamos algumas proteínas relacionadas à resposta imune, exclusivas de alguns grupos, como no grupo TO, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) e Endothelin-1 e no grupo RC, a beta 2 microglobulina. Essas moléculas podem ter relevância nos mecanismos imunológicos desses estados clínicos. A abordagem proteômica aplicada neste trabalho permitiu a identificação de um perfil diferencial de peptídeos na urina de cada grupo diferente de estudo. Os peptídeos urinários diferenciais e suas respectivas proteínas podem ter relevância funcional ou como biomarcadores - em relação ao estado fisiológico e às diferentes evoluções clínicas no transplante renal / A special group of renal transplant recipients maintain stable graft function after the complete withdrawal of immunosuppression, achieving a state called operational tolerance. To date, there are no cellular or molecular biomarkers to discriminate human transplantation tolerance and the underlying mechanisms are being investigated. The profile of urinary peptides may provide important information about different renal physiopathological statuses. We investigated whether operational tolerance displays a differential urinary peptide profile, potentially relevant as biomarkers or for the understanding of mechanisms involved in tolerance. We performed qualitative analysis of peptide urinary extracts in individuals from different study groups: healthy (HI, n=6), operational tolerance (OT, n=5), chronic rejection (CR, n=8) e stable under conventional immunosuppression (Sta, n=5), using Shotgun proteomics. Altogether, we identified 15283 different peptides, corresponding to 646 distinct proteins, distributed in all groups: OT = 189, CR = 296, Sta = 205, and 219 proteins in HI. Several proteins were exclusively detected in specific groups: OT showed 87 exclusive proteins, CR 168, Sta 106 and HI 108 proteins. Although the exclusive proteins were not shared by all individuals from that specific group, all individuals from each group presented several of the group-exclusive proteins (each individual presented an average of 15% of the proteins exclusive to his group). Of the 646 proteins identified, only 2.3% were classified in Gene Ontology as related to the immune system and the most frequent cellular compartments were: 36% from nucleus and 23% cytoplasmic. Of notice, some proteins related to the immune response were also group-exclusive, such as, in OT, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) and Endothelin-1, and beta 2 microglobulin in CR. These proteins may display relevant roles in the mechanisms involved in these clinical statuses. In conclusion, the proteomic approach used in this study allowed the identification of a differential urinary peptide profile in each different study groups. The differential urinary peptides and their corresponding proteins may display a relevant role functional or as biomarkers - in the state of homeostasis and in different clinical outcomes in renal transplantation

INTRODUÇÃO: As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas presentes em todos os seres vivos. Elas possuem dupla atividade imunológica, induzindo tanto respostas proinflamatórias quanto imunorreguladoras. Em nosso grupo, estudamos os efeitos imunológicos dos peptídeos da HSP60 nos sistemas humano e murino. OBJETIVOS: Identificar peptídeos da HSP60 potencialmente imunorreguladores no sistema murino, visando a indução de tolerância no contexto do alotransplante. MÉTODOS: Analisamos a capacidade dos diferentes peptídeos de modificar, in vitro a expressão de genes predominantemente imunorreguladores (Foxp3, Gata-3, IDO, IL-4, IL-10, TGF?) ou inflamatórios (T-bet, IL-12p35, IL-12p40, IL-17) por PCR de tempo real, em esplenócitos murinos de animais naive. Consideramos as modificações induzidas pelos peptídeos como REGULA (?expressão de genes imunorreguladores ou ?expressão de genes inflamatórios) ou INFLAMA (?expressão de genes imunorreguladores ou ? expressão de genes inflamatórios). Selecionamos peptídeos que induziram predomínio de modificação da expressão gênica do tipo REGULA, mais promissores como imunorreguladores para ensaios in vivo de indução de tolerância ao aloenxerto de pele murino. RESULTADOS: Os peptídeos mais promissores foram N7, C4, N6, I8, N2 e N3. O peptídeo N7(n=9) induziu uma razão REGULA/INFLAMA=2,71 e induziu a redução da expressão gênica relativa de IL-17 e IL-12p40. O peptídeo C4 (n=6) induziu razão REGULA/INFLAMA=1,63 e induziu redução da expressão gênica relativa de IL-17 e IL-12p40. O peptídeo N6 (n=8) induziu uma razão REGULA/INFLAMA=1,60, induziu a redução da expressão gênica relativa de T-bet e IL-12p40 e aumentou a expressão de IL-10. O peptídeo I8 (n=5) induziu razão REGULA/INFLAMA=1,57 e induziu aumento da expressão gênica relativa de IL-17. O peptídeo N2 (n=8) induziu razão REGULA/INFLAMA=1,32 e induziu redução da expressão gênica relativa de IL-17 e aumento da expressão de IL-10, IL-4 e T-bet. O peptídeo N3 (n=7) induziu razão REGULA/INFLAMA=1,25 e não teve destaques na modificação gênica induzida. O peptídeo N7 foi testado em protocolos para indução de tolerância do alotransplante de pele murino. Não houve diferença estatística entre os diferentes grupos, a despeito do aumento de sobrevida do aloenxerto de 7 dias no protocolo em combinação com o anticorpo ?CD3 (p=0,38, n=5). DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: O forte impacto imunorregulador de alguns peptídeos da HSP60 na expressão gênica de moléculas imunológicas indica que eles podem ser explorados em imunoterapias. Apesar da existência de variabilidade individual, o peptídeo N7 da HSP60 parece ser um promissor peptídeo imunorregulador. O discreto aumento da sobrevida do aloenxerto de pele induzida pelo peptídeo N7 sugere que a sua combinação com imunossupressores em outros protocolos de indução de tolerância, pode ser uma estratégia útil para aumentar a sobrevida do aloenxerto / INTRODUCTION: Heat shock proteins (HSPs) are proteins present in all living beings. They have dual immunologic functional activity inducing both proinflammatory and regulatory responses. In our group, we study the immunological effects of HSP60 peptides in human and mice. OBJECTIVES: To identify potentially immunoregulatory HSP60 peptides in mice, aiming at tolerance induction in the context of alotransplantation. METHOD: We analyzed the capacity of different HSP60 peptides to modify in vitro the expression of predominantly immunoregulatory genes (Foxp3, Gata-3, IDO, IL-4, IL-10, TGF?) or inflammatory (T-bet, IL-12p35, IL-12p40, IL-17) by Real Time PCR, in naive mice splenocytes. We considered gene modifications induced by the peptides as REG (?expression of immunoregulatory genes or ?expression of inflammatory genes) or INFLAMMA (?expression of immunoregulatory genes or ? expression of inflammatory genes). We selected some promising peptides that induced predominantly REG gene expression modifications as immunoregulatory peptides, to perform in vivo assays of tolerance induction to murine skin allograft. RESULTS: More promising peptides were N7, C4, N6, I8, N2 and N3. The N7 peptide (n=9) induced a REG/INFLAMMA ratio=2,71 and induced gene expression reduction of IL-17 and IL-12p40. The C4 peptide (n=6) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,63 and induced gene expression reduction of IL-17 and IL-12p40. The N6 peptide (n=8) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,60, induced gene expression reduction of T-bet and IL-12p40, and increased expression of IL-10. The I8 peptide (n=5) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,57 and induced increased gene expression of IL-17. The N2 peptide (n=8) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,32 and induced gene expression reduction of IL-17 and increase expression of IL-10, IL-4 and T-bet. The N3 peptide (n=7) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,25 and induced no gene expression modification highlights. The N7 peptide was tested in tolerance mice allograft induction protocols. There was no statistical difference between different groups, despite the 7-day increase in allograft survival with the protocol in combination with the ?CD3 antibody (p=0,38, n=5). DISCUSSION AND CONCLUSION: The strong immunoregulatory impact of some HSP60 peptides in the gene expression of immune molecules indicate that they may be explored for immune therapy. Despite the existence of some interindividual variability, the N7 HSP60 peptide seems to be a promising imunorregulatory peptide. The slight increase in graft survival with the N7 peptide suggests that the combination of HSP60 peptides with other immunosupressors and different tolerance induction protocols may be a way to improve graft survival.

A Leucose Enzoótica dos Bovinos (LEB) é uma enfermidade neoplásica, infectocontagiosa, pluri-sintomática, de evolução crônica, que compromete os órgãos linfopoiéticos e está associada ao desenvolvimento de linfocitose persistente (LP) e linfossarcoma. Acarreta diminuição na produção, quer por seus efeitos danosos diretos, quer pelos indiretos. No entanto, seu efeito na função e na quantidade das diferentes subpopulações de linfócitos, assim como seu papel no estabelecimento de outras doenças oportunistas, ainda não está claro. O presente estudo avaliou a resposta imunitária de bovinos da raça Holandês Preto e Branco naturalmente infectados pelo vírus da LEB (VLB), após desafio antigênico fornecido por vacinação contra o vírus da febre aftosa. Para tal, foram coletadas amostras sanguíneas antes do desafio e, após o desafio, semanalmente, por sete semanas, de dez vacas soropositivas, sem LP; de dez vacas soropositivas, manifestando LP; e de dez vacas soronegativas. Foram avaliadas as alterações quantitativas das diferentes subpopulações de leucócitos circulantes; a função dos linfócitos B, por meio da quantificação de diferentes isotipos de imunoglobulinas (Ig) séricas; os índices de proliferação linfocitária; os índices de morte celular por apoptose ou por necrose; e as concentrações séricas de interleucina-10 (IL-10), IL-12, inteferon- (IFN-&gamma;) e fator de necrose tumoral-&alpha; (TNF-&alpha;). Foi verificada a normalidade da distribuição dos resultados obtidos, utilizando-se do teste de Anderson-Darling, e sua homoscedasticidade, utilizando-se do teste F (para dados que apresentaram distribuição normal) ou do teste de Lavene (para dados que não apresentaram distribuição normal). Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, de acordo, respectivamente, com a ocorrência ou não de homoscedasticidade, foram feitos, para dados com distribuição normal, os testes de análise de variância (One-way ANOVA), seguida do teste de Tukey-Kramer ou o teste t; e, para dados que não apresentaram distribuição normal, o teste de Mann-Whitney ou o teste de Kruskal-Wallis. Para todos os resultados, foram consideradas significantes as análises que apresentaram p&le;0,05. Verificou-se que não houve diferença nas concentrações séricas de IgG1, de IgM e de IgA, tanto entre os tempos de coleta, quanto, a cada tempo, entre animais pertencentes aos diferentes grupos. As concentrações séricas de IgG2 aumentaram, após a vacinação, em todos os animais (p<0,05). Todavia, 17 dias após o desafio antigênico, as concentrações séricas de IgG2, em animais manifestando LP foram, a cada tempo de coleta, menores (p<0,01) que aquelas verificadas nos animais pertencentes aos demais grupos, indicando que animais com LP apresentam resposta humoral menos intensa e menos duradoura. Observou-se que ocorreu um aumento no índice de proliferação de linfócitos sanguíneos (p<0,01), 24 dias após a vacinação contra o vírus da febre aftosa, independente da presença de infecção pelo VLB. A partir deste momento, ocorre um aumento na porcentagem de linfócitos &gamma;&sigma; circulantes (p<0,05) e posterior diminuição nas concentrações séricas de IgG2 (p<0,05), indicando regulação desta resposta humoral por linfócitos &gamma;&sigma;. Em bovinos com LP, o aumento na porcentagem de linfócitos circulantes foi maior (p<0,05), ocasionando diminuição mais intensa e mais precoce nas concentrações séricas de IgG2. Constatou-se que a LP ocorre em decorrência de menor índice de apoptose, posto que as porcentagens de leucócitos sofrendo processo de apoptose foram menores (p&le;0,001) entre as células obtidas de animais manifestando LP, do naquelas coletadas dos animais pertencentes aos demais grupos. Verificou-se que as concentrações séricas das citocinas de perfil Th1, IL-12 e IFN-&gamma;, são maiores em amostras sangüíneas de animais infectados pelo VLB, alinfocitóticos (p<0,01), ao passo que as concentrações séricas das citocinas de perfil Th2, IL-10 e TNF-&alpha;, são maiores em amostras sangüíneas de animais infectados manifestando LP (p<0,01), indicando que alterações no perfil sérico de citocinas podem ser causa ou consequência da LP. Em resposta ao desafio vacinal, ocorre uma elevação nas concentrações séricas de IL-10 (p<0,01), de TNF-&alpha; (p=0,005) e de IFN-&gamma; (p<0,01), três dias após o desafio, e de IL-12 (p<0,001), dez dias após o desafio. A elevação na concentração sérica de IL-10 perdura até 31 dias após o desafio e pode ser responsável pelo maior índice de proliferação de linfócitos &gamma;&sigma; verificado a partir de 31 dias após a vacinação. Foi observado que a maioria dos linfócitos B circulantes, em bovinos, consiste de linfócitos B1 e, em animais infectados pelo VLB, a LP ocorre em decorrência de um aumento na porcentagem de linfócitos B1a (p<0,05). Além disso, em animais infectados pelo VLB, apresentando LP, as relações entre linfócitos T auxiliares e citotóxicos são menores (p<0,01) e a porcentagem de linfócitos &gamma;&sigma; é maior (p<0,01), indicando atividade viral nas células infectadas. Assim, os resultados permitem-nos concluir que animais infectados pelo VLB, manifestando LP, apresentam alterações na resposta imunitária frente vacinação contra o vírus da febre aftosa. / Enzootic Bovine Leukosis (EBL) is an infectious, multi-symptomatic, chronic, neoplastic disease, which undermines the lymphopoietic organs and is associated with the development of persistent lymphocytosis (PL) and lymphosarcoma. Infected animals present a decrease of production, either by its direct or its indirect harmful effects. However, its effect on the function and quantity of different lymphocyte subpopulations, as well as its role in the establishment of other opportunistic diseases, are unclear. This study evaluated the immune response of Holstein dairy cattle naturally infected with Bovine Leukosis Virus BLV, after antigen challenge provided by vaccination against foot and mouth disease (FMD) virus. To this end, blood samples were collected before challenge and after challenge, weekly, for seven weeks, from ten seropositive cows without PL, from ten seropositive cows expressing PL, and from ten seronegative cows. We evaluated the quantitative changes of different subpopulations of leukocytes; the function of B lymphocytes, through the quantification of different isotypes of immunoglobulins (Ig) serum concentration; the rate of lymphocyte proliferation; the rate of cell death by apoptosis or necrosis; and the serum concentrations of interleukin-10 (IL-10), IL-12, inteferon-&gamma; (IFN-&gamma;), and tumor necrosis factor-&alpha; (TNF-&alpha;). It was verified the normality of distribution of the results using the Anderson-Darling test, and their homoscedasticity, using the F test (for data with normal distribution) or the Levene test (for data without normal distribution). For the evaluation of differences between the average results, according respectively to the presence or absence of homoscedasticity, we used, for data with normal distribution, One-way ANOVA test, followed by the Tukey-Kramer test or the t test, and, for data without normal distribution, the Mann-Whitney test or the Kruskal-Wallis test. Results with p&le;0.05 were considered statistically significant. There were no differences related to serum IgG1, IgM, and IgA concentrations, both among sampling time and, every time, among animals belonging to different groups. IgG2 serum concentrations increased after vaccination in all animals (p<0.05). However, in animals expressing PL, each collection time, 17 days after antigen challenge, IgG2 serum concentration was lower (p<0.01) than those observed in animals belonging to other groups, indicating that animals with PL present less intense and less enduring humoral response. It was observed that there was an increase in the rate of lymphocyte proliferation (p<0.01) 24 days after vaccination against FMD virus, irrespective of the presence of infection by BLV. From this moment, there was an increase in the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes (p<0.05) and a subsequent decrease in serum IgG2 (p<0.05), indicating regulation of this humoral response by &gamma;&sigma;-lymphocytes. In cattle with PL, the increase in the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes was higher (p<0.05), leading to more intense and earlier decrease in IgG2 serum concentration. It was found that PL is due to a lower rate of apoptosis, since the percentage of leukocytes undergoing apoptosis was lower (p&le;0.001) among cells obtained from animals expressing PL, when compared to those collected from animals from the other groups. It was found that serum concentrations of Th1 cytokines, specifically IL-12 and IFN-&gamma;, were higher in blood samples from nonlymphocytotic infected animals (p<0.01), whereas serum concentrations of Th2 cytokines, particularly IL-10 and TNF-&alpha;, were higher in blood samples from infected animals expressing LP (p<0.01), indicating that changes in serum cytokines profile may be a cause or a consequence of PL. IL-10 (p<0.01), TNF-&alpha; (p=0.005), and IFN-&gamma; (p<0.01) serum concentrations increased three days after the challenge, and IL-12 serum concentration increased (p<0.001), ten days after the challenge. The increase in IL-10 serum concentration lasts until 31 days after the challenge and may account for the higher rate of &gamma;&sigma;-lymphocyte proliferation found from 31 days after vaccination. It was observed that the majority of circulating B lymphocytes in cattle consists of B1 lymphocytes and that, in BLV-infected animals, PL occurs due to an increase in the percentage of B1a lymphocytes (p<0.05). Moreover, in lymphocytotic BLV-infected animals, the rate between helper and cytotoxic Tlymphocytes are smaller (p<0.01) and the percentage of &gamma;&sigma;-lymphocytes is greater (p<0.01), indicating viral activity in infected cells. Thus, results allow us to conclude that lymphocytotic BLV-infected animals show changes in the immune response after vaccination against FMD virus.

Introdução: Os linfócitos T regulatórios CD4+CD25+Foxp3+ (Tregs) desempenham um papel fundamental na manutenção da tolerância aos antígenos próprios e no controle da magnitude da resposta imunológica. Alterações quantitativas ou funcionais foram descritas em diversos distúbios auto-imunes. O pênfigo foliáceo endêmico (PFE) é uma doença bolhosa cutânea de natureza auto-imune, que compartilha características clínicas e imunopatológicas com o pênfigo foliáceo clássico, mas apresenta achados epidemiológicos próprios. Auto-anticorpos circulantes e teciduais da classe IgG dirigidos contra caderinas desmossômicas (desmogleína 1), levam à perda de adesão entre os queratinócitos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar se a perda de tolerância é associada com alterações quantitativas nos linfócitos Tregs CD4+CD25+Foxp3+ na pele de pacientes com PFE. Métodos: Amostras de pele de 22 pacientes e 10 controles saudáveis foram submetidos à análise imunoistoquímica com anti-CD4, anti-CD25 e anti-Foxp3. Fotomicrografias foram obtidas de campos consecutivos ao longo de toda epiderme e derme. A seguir, foi realizada quantificação dos linfócitos Foxp3+, CD4+, CD25+, CD4+Foxp3+ e CD25+Foxp3+ em cada compartimento, considerando-se a respectiva área de cada campo (m2). Valores significantemente estatísticos foram considerados como p<0,05. Resultados: Encontramos um infiltrado epidérmico aumentado de linfócitos imunomarcados CD25+(p=0,003), Foxp3+(p=0,04) e CD25+Foxp3+ (p=0,007), em comparação com os controles. O infiltrado dérmico exibiu uma maior expressão de linfócitos CD4+ (p<0,001) e CD25+ (p=0,008) em amostras de pele de pacientes com PFE, quando comparados aos controles. Conclusões: Nossos achados sugerem que a quebra de tolerância imunológica periférica nos pacientes com PFE não se correlaciona com uma diminuição dos linfócitos T reg CD4+CD25+Foxp3+ na pele afetada. Entretanto, uma maior expressão de linfócitos CD25+Foxp3+ no infiltrado epidérmico poderia representar outra população de linfócitos com atividade regulatória, a ser definida. / Background: CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) play a crucial role in the maintenance of self tolerance and control of the magnitude of the immune response. Their quantitative or functional impairment has been reported in several autoimmune disorders. Endemic pemphigus foliaceus (EPF) is an autoimmune organ-specific blistering skin disorder that shares many clinical and immunopathological features with classic pemphigus foliaceus, but with unique epidemiological features. Circulating and tissue-bound IgG auto-antibodies react against desmosomal cadherins (desmoglein 1), causing loss of adhesion between keratinocytes. Aims: The purpose of this study was to evaluate whether the loss of tolerance is associated with impairment of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs in the skin of EPF patients. Methods: Skin samples from 22 patients and 10 controls were submitted to immunohistochemistry with anti-CD4, CD25 and Foxp3. Photomicrographs were obtained from consecutive fields along epidermis and dermis; quantification of Foxp3+, CD4+, CD25+, CD4+Foxp3+ and CD25+Foxp3+ cells were performed in each compartment, taking into account the respective field area (m2). Significance was set at p<0.05. Results: We found an enhanced epidermal infiltrate of CD25+(p=0.003), Foxp3+(p=0.04) and CD25+Foxp3+(p=0.007) immunostained T cells in EPF patients, when compared to controls. Dermal infiltrate exhibited a higher expression of CD4+ (p<0.001) and CD25 p=0.008) T cells in EPF skin samples than in controls. Conclusions: Our findings suggest that the break of peripheral immunologic tolerance in EPF patients did not correlate with an impairment of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells present in the affected skin. However, higher expression of CD25+Foxp3+ cells in the epidermal infiltrate could be a counterpart of a diverse population of T cells, previously described as exerting a regulatory activity, yet to be defined

INTRODUÇÃO: A indução de tolerância oral atenua a resposta inflamatória e a produção de anticorpos anafiláticos secundários presentes em quadros alérgicos pulmonares tanto em humanos quanto em modelos experimentais. Nestas situações, a modulação do remodelamento brônquico e o papel do óxido nítrico não foram previamente estudados. OBJETIVOS: 1. Desenvolver dois modelos de tolerância oral em cobaias com inflamação crônica pulmonar caracterizando: mecânica pulmonar, hiper-responsividade a metacolina, óxido nítrico exalado (NOex), anticorpos IgG1, inflamação brônquica e eosinofilopoiese. 2. Avaliar o remodelamento brônquico e a expressão da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) no epitélio brônquico nestes animais. MÉTODOS: As cobaias receberam inalações de ovoalbumina ou soro fisiológico durante 15 minutos ou até que apresentassem desconforto respiratório (este tempo foi denominado tempo de inalação). O protocolo foi repetido duas vezes por semana durante quatro semanas. Para a indução da tolerância foi administrada ovoalbumina a 2% por via oral e oferecida ad libitum, sendo formados os grupos: 1. TO1 (recebeu ovoalbumina oral a 2% a partir da primeira inalação com ovoalbumina); 2. TO2 (recebeu ovoalbumina oral a 2% a partir da quarta inalação com ovoalbumina); 3. SAL (recebeu água ad libitum e inalações com soro fisiológico); 4. OVA (recebeu água ad libitum e inalações com solução de ovoalbumina). Após os animais serem anestesiados e ventilados, foram avaliados: 1. mecânica pulmonar basal e após inalação com ovoalbumina (30mg/ml) ou soro fisiológico, 2. hiper-responsividade brônquica à metacolina, 3. coletado o NOex. Ao final do experimento, os fragmentos pulmonares foram retirados e corados com hematoxilina e eosina, com a técnica histoquímica cianeto resistente para peroxidase eosinofílica (células EPO+), com a técnica imunoistoquímica para a detecção da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e com resorcina-fucsina, resorcina-fucsina oxidada e picro-sírius. A medula óssea foi retirada e corada com hematoxilina e eosina. O índice de edema peribrônquico, as células EPO+, os mononucleares e os polimorfonucleares brônquicos e os eosinófilos da medula óssea foram avaliados por morfometria. As células epiteliais brônquicas nNOS+ e as fibras elásticas e colágenas foram avaliadas por densitometria óptica. Os anticorpos IgG1 foram detectados por anafilaxia cutânea passiva. A análise estatística foi feita com o programa SigmaStat e considerado significante um P<0,05. RESULTADOS: Nos grupos TO1 e TO2 houve aumento no tempo de inalação, diminuição na resposta máxima de elastância do sistema respiratório após desafio antigênico e com metacolina, diminuição do edema peribrônquico, dos eosinófilos, dos polimorfonucleares, das fibras elásticas e colágenas, da eosinofilopoiese e dos títulos de IgG1 (P < 0,05). Os mononucleares, a resposta máxima de resistência do sistema respiratório depois do desafio antigênico, e a metacolina diminuíram em TO2 (P < 0,05). O NOex e a percentagem de células epiteliais nNOS+ não foram alterados nos grupos tolerizados. CONCLUSÕES: A indução de tolerância oral concomitante ao início da sensibilização ou depois de estabelecida a resposta alérgica foi capaz de atenuar a inflamação eosinofílica, os títulos de IgG1 e o remodelamento brônquico presentes neste modelo de inflamação crônica pulmonar. A redução dos linfomononucleares e da hiper-responsividade brônquica foi mais efetiva quando a indução de tolerância foi feita em animais previamente sensibilizados. A dissociação entre o controle da inflamação eosinofílica e a avaliação do NOex e da expressão da nNOS no epitélio brônquico sugere um mecanismo novo ativado pela indução de tolerância oral / INTRODUCTION: The oral tolerance induction attenuates the inflammatory response and the production of secondary anaphylactic antibodies present in pulmonary allergy pictures in humans as well as in experimental models. In these situations, the bronchial remodeling modulation and the role of nitric oxide have not been previously studied. OBJECTIVES: 1. To develop two models of oral tolerance in guinea pigs with chronic pulmonary inflammation, characterizing: pulmonary mechanics, hyperreponsiveness to methacholine, exhaled nitric oxide (NOex), IgG1 antibodies, bronchial inflammation and eosinophylopoiesis. 2. To evaluate the bronchial remodeling and the expression of the neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) in bronchial epithelium of these animals. METHODS: The guinea pigs were submitted to ovalbumin or saline solution inhalation for 15 minutes or until they presented respiratory stress (this time period was called inhalation time). The protocol was repeated twice a week for 4 weeks. Oral tolerance induction was carried out by the administration of 2% oral ovalbumin, offered ad libitum, and the following groups were formed: 1. OT1 (received 2% oral ovalbumin from the first ovalbumin inhalation; 2. OT2 (received 2% oral ovalbumin from the fourth ovalbumin inhalation; 3. SAL (received water ad libitum and saline solution inhalations; and 4. OVA (received water ad libitum and ovalbumin solution inhalations). After being anesthetized, the animals were ventilated and evaluated regarding: 1. basal pulmonary mechanics and after ovalbumin (30mg/ml) or saline solution inhalation; 2. bronchial hyperresponsiveness to methacholine; and 3. NOex was collected. At the end of the experiment, the pulmonary fragments were removed and stained with hematoxylin-eosin, with the cyanide-resistant eosinophilic peroxidase histochemical technique (EPO+ cells), with the immunohistochemical technique for the detection of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and with Resorcin-fuchsin, Resorcin-fuchsin with oxidation and Picrosirius. The bone marrow was removed and stained with hematoxylin-eosin. The index of peribronchial edema, the EPO+ cells, the bronchial mononuclear and polymorphonuclear cells and the eosinophils from the bone marrow were evaluated by morphometry. The epithelial bronchial nNOS+ cells and the elastic and collagen fibers were evaluated by optical densitometry. IgG1 antibodies were detected by Passive Skin Anaphylaxis. Statistical analysis was performed with the SigmaStat software program and a P value < 0.05 was considered significant. RESULTS: The OT1 and OT2 groups showed increased inhalation time, decrease in the maximum elastance response of the respiratory system after the antigenic challenge and with methacholine, decrease of peribronchial edema, eosinophils, polymorphonuclear, elastic and collagen fibers, eosinophylopoiesis, and IgG1 titers (P < 0.05). The mononuclear cells, the maximum resistance response of the respiratory system after the antigenic challenge and methacholine decreased in OT2 (P < 0.05). NOex and the percentage of nNOS+ epithelial cells were not altered in the tolerized groups. CONCLUSIONS: The oral tolerance induction concomitant to the start of sensitization or after the allergic response has been established, was capable of attenuating the eosinophilic inflammation, IgG1 titers and the bronchial remodeling present in this model of chronic pulmonary inflammation. The decrease in lymphomononuclear cells and bronchial hyperresponsiveness was more effective when the tolerance induction was carried out in animals that had been previously sensitized. The dissociation between the eosinophilic inflammation and NOex evaluation and the expression of nNOS in the bronchial epithelium suggests a new mechanism activated by the oral tolerance induction

A administração de Ags solúveis via mucosas, antes da sensibilização com o mesmo Ag, leva a tolerância. Na presente tese estudou-se o efeito do LPS i.n. durante a indução de tolerância nasal a ovalbumina (OVA). A maioria dos modelos murinos de asma utilizam a OVA como alérgeno, desse modo também utilizamos o extrato de Blomia tropicalis (Bt), um ácaro prevalente em pacientes asmáticos. Características da Bt impedem o estabelecimento de tolerância e evidências experimentais indicam que a tolerância a um Ag pode induzir tolerância a um Ag não relacionado (tolerância cruzada). Assim, avaliamos se a tolerância a OVA ou lizozima de ovo (HEL) poderia induzir tolerância cruzada a Bt. Observou-se que o LPS i.n. durante a indução de tolerância a OVA previne o estabelecimento da tolerância, resultando em neutrofilia pumonar, IgG2a, diminuição de IgE com aumento de IgG1 anafilática. Observou-se também que a tolerância nasal, a HEL ou OVA, não é eficaz em induzir tolerância cruzada para as respostas contra Bt. Já, a tolerância oral com OVA induziu tolerância cruzada para Bt. / Mucosal administration of soluble Ags, before the sensitization with the same Ag, leads to mucosal tolerance. We studied the effect of i.n. LPS during the induction of ovalbumin (OVA) nasal tolerance. The majority of murine models of asthma used OVA as allergen,thus, we also used Blomia tropicalis (Bt) extract, a mite more common in asthmatic patients. Features of Bt block the nasal tolerance establishment and experimental data indicates that tolerance towards an Ag can promote tolerance to another not related Ag (cross-tolerance). Therefore, we evaluated if OVA or hen-egg white lisozyme (HEL) tolerance could result in cross-tolerance to the Bt. Our data showed that i.n. LPS during induction of tolerance to OVA prevents the establishment of this tolerance, resulting in neutrophil migration, IgG2a production, decreased levels of IgE and increased anaphylactic IgG1. We verify that nasal tolerance to HEL or OVA is not capable in induce cross-tolerance against the Bt. We also observed that OVA oral tolerance is able to induce cross-tolerance against Bt.

As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígeno do sistema imune, e há evidências da participação na tolerância imunológica. Neste estudo avaliamos as alterações ocorridas na população de células CD4+CD25+Foxp3+ após co-cultura de células de linfonodo com BMDCs, na presença de timócitos alogênicos ou singênicos em apoptose. Após cultura na presença de células alogênicas a população de Tregs mostra-se aumentada, e essa expansão é dependente de contato entre a DC e o linfócito T, já que o isolamento das culturas diminuiu a expressão destes marcadores. A internalização de células em apoptose foi induziu caráter tolerogênico nas DCs com baixa expressão de moléculas co-estimuladoras e resistência à maturação por LPS. As células CD4+CD25+ geradas in vitro foram capazes de conter a proliferação de esplenócitos de camundongos BALB/c estimulados por esplenócitos de C57BL/6 irradiados, anti-CD3 e OVA. No ensaio in vivo, as Tregs geradas in vitro também foram capazes de suprimir a proliferação de células CD25- quando transferidas para animais Nude, impedindo também o infiltrado inflamatório no estômago, cólon, fígado e rins, sendo assim capazes de suprimir a resposta imune in vitro e in vivo. / The dendritic cell (DC) plays a very important role in antigen presentation in the immune system and recent articles have shown the involvement in maintaining peripheral tolerance. Here we evaluated the changes in the CD4+CD25+Foxp3+ after co culture of DCs with lymph node cells. BMDCs were pulsed with apoptotic cells and co-cultured with lymph-node cells. Our results show an increase of CD4+CD25+Foxp3+ T cells after co-culture with DCs pulsed with apoptotic cells. Furthermore, the DCs did not change the pattern of co-stimulatory molecules expression due to phagocytosis of syngeneic or allogeneic apoptotic cells and further stimulation with LPS. The CD4+CD25+ cells sorted from the in vitro culture were able to suppress the proliferation of splenocytes in vitro in a specific and non-specific manner. As expected, the co-transfer of CD4+CD25- and CD4+CD25+, both sorted from the in vitro culture, was able to control the cell infiltrates in the target organs and the total cell count in the lymph-nodes. Thus, the Tregs expanded in vitro are able to suppress the immune response in vitro and in vivo assays.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-10-10T10:45:14Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-10-16T13:33:10Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-10-16T13:33:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2018-06-29 / A Artrite Reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crônica, caracterizada por inflamação das articulações e associada à incapacidade motora e laboral dos pacientes. Tendo em vista que as estratégias atuais para o tratamento da AR podem apresentar sérios efeitos colaterais e nem sempre resultam em melhora clínica, a terapia com laser de baixa potência (LLLT) surgiu como alternativa para o tratamento da artrite, devido às suas propriedades anti-inflamatórias e de regeneração tecidual. Entretanto, os mecanismos anti-inflamatórios da LLLT nos tecidos biológicos ainda não são completamente conhecidos. Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar os mecanismos imunológicos e a participação das metaloproteinases de matriz (MMP) e seu inibidor (TIMP2), na resolução do processo inflamatório articular após o tratamento com LLLT. Para isso, um processo inflamatório foi induzido nas articulações talocrural e subtalar dos membros posteriores de camundongos C57BL/6, através da administração de zymosan na região periarticular. Os animais foram divididos em 4 grupos (n = 8): (ZY) artrite induzida por zymosan e não tratado, (ZY + 3Jcm-2) artrite induzida por zymosan + LLLT em 3Jcm-2, (ZY + 30Jcm-2) artrite induzida por zymosan + LLLT em 30Jcm-2 e (ZY + DEXA) artrite induzida por zymosan e tratado com dexametasona. As condições da LLLT foram: 830nm, 10mW e densidades energéticas de 3Jcm-2 e 30Jcm-2, no modo contínuo de emissão. A irradiação foi realizada durante 4 dias consecutivos, iniciando 5 horas após a indução da inflamação. Os animais foram eutanasiados 24h após a última aplicação da LLLT e as seguintes análises foram realizadas no tornozelo: morfológica, níveis relativos de mRNA de quimiocinas, citocinas, MMPs e TIMP2 por RT-qPCR, quantificação de citocinas por ELISA e quantificação da expressão tecidual de MMP13 e TIMP2 por imunohistoquímica. No linfonodo poplíteo foi realizada análise de citometria de fluxo para identificação e quantificação das populações de leucócitos. As análises morfológicas revelaram a presença de infiltrado celular no tecido conjuntivo adjacente à região periarticular, após a administração de zymosan. Foi observada diminuição dos níveis teciduais de citocinas após LLLT e alteração nos níveis de mRNA de citocinas e quimiocinas com importância na fisiopatologia da AR, diferentemente, dependendo da densidade de energia utilizada. O grupo ZY + 3Jcm-2 demonstrou aumento na maioria das populações de leucócitos analisadas, bem como na expressão de proteínas co-estimulatórias em macrófagos e células dendríticas do linfonodo proximal à inflamação. Adicionalmente, foi observado maior população de células Treg nos grupos LLLT, e no grupo ZY + 30Jcm-2, mais células Treg CD8+ expressando níveis elevados de CD25. Embora LLLT tenha diminuído os níveis de mRNA da maioria das MMPs analisadas e aumentado de TIMP2, foi observado aumento da expressão tecidual de MMP13 e TIMP2 na região inflamatória do grupo ZY + 3Jcm-2. Tendo em vista a totalidade dos resultados, o LLLT em ambas as densidades de energia, apresentou efeitos anti-inflamatórios positivos para o tratamento da AR, uma vez que diminuiu os níveis da maioria das citocinas, quimiocinas e MMPs nos tecidos inflamados, além de modificar o quantitativo e o fenótipo dos leucócitos linfonodais, especialmente de células Treg. / Rheumatoid Arthritis (AR) is a chronic inflammatory disease, characterized by joint inflammation and associated with motor and labor incapacity. Since treatment strategies could present a serious side effects and not always achieved clinic improvement, the Low Level Laser Therapy (LLLT) have being considered as an alternative to arthritis treatment, due to its anti-inflammatory and healing abilities. However, LLLT anti-inflammatory mechanisms in biological tissues is not completely understood. Then, this study aimed to evaluate immunological mechanisms and contribution of matrix metaloproteinases (MMPs) and its inhibitor (TIMP) on inflammation resolution process induced by LLLT. Arthritis was induced in C57BL/6 mice by zymosan injection into periarticular region. Experimental animals were divided in 4 groups (n=8): (ZY) arthritis induced by zymosan and untreated; (ZY + 3Jcm-2) arthritis induced by zymosan and treated with LLLT at 3Jcm-2; (ZY + 30Jcm-2) arthritis induced by zymosan and treated with LLLT at 30Jcm-2; (ZY + DEXA) arthritis induced by zymosan and treated with dexamethasone. LLLT parameters were: 830nm, 10mW energy densities at 3 Jcm-2 e 30 Jcm-2, in continuous wave emission mode. Irradiation sections and dexamethasone treatment were carried out 4 days consecutively, starting 5 hours after arthritis induction. Animals were euthanized 24h after the last treatment section and the following analysis were procedure at ankle: morphological, cytokine mRNA relative levels, chemokines, MMPs and TIMP2 by RT-qPCR, quantification of cytokines tissue expression by ELISA and MMP13 and TIMP2 by imunohistochemistry. In popliteal lymph node, leukocytes populations were identificated and quantificated by flow cytometry. Morphological analysis showed inflammatory infiltration at adjacent connective tissue of joints, after zymosan injection. After LLLT, it was observed cytokines tissue expression decrease and mRNA levels alteration of important cytokines and chemokines in pathophisiology of AR, depending of energy density used. The ZY + 3Jcm-2 group showed an increase leukocytes populations, as well as, higher expression of costimulatory proteins in macrophages and dendritic cells of popliteal lymph node. Additionally, it was observed higher Treg population in LLLT groups than ZY group. More, ZY + 30Jcm-2 showed higher Treg CD8+ population presenting CD25high. LLLT decreased mRNA levels of almost MMPs analyzed and increased of TIMP2, except for ZY + 3Jcm-2 group in which was observed MMP13 and TIMP2 tissue expression increase. Taken togheter, all results showed that LLLT, at both energy densities used, presente positive anti-inflammatory effects for RA treatment, since it decreases the levels of cytokines, chemokines and MMPs at inflammed tissues. LLLT could also alter number and phenotype leukocytes in lymph node, especially Treg cells.

A galectina-1 (Gal-1) pertence a uma família de lectinas endógenas que reconhecem ß-galactosídeos e atuam em vários processos biológicos. A Gal-1 pode modular a resposta imunológica por vários mecanismos incluindo o controle da liberação de citocinas pró e anti-inflamatórias e o direcionamento dessa resposta para um padrão do tipo TH2. Apesar da Gal-1 participar de vários processos fisiopatológicos, na literatura não existe relatos sobre o papel dessa lectina em infecções fúngicas. O objetivo deste trabalho foi investigar o impacto biológico da Gal-1 no modelo experimental de histoplasmose murina. Os camundongos (Gal-1-/- e Gal-1+/+) foram inoculados, por via intratraqueal, com uma carga fúngica sub-letal (5x105 leveduras) e a sobrevida desses animais foi avaliada até o 30o dia de infecção. Considerando que o início da mortalidade dos animais ocorreu após duas semanas de infecção, as demais análises foram realizadas em amostras obtidas no 15o dia. O grau de disseminação do H. capsulatum foi analisado pela contagem do número de unidades formadoras de colônia, em partes de pulmões ou baços dos animais infectados. Os cortes de pulmões foram corados por hematoxilina eosina ou por prata (GMS), para investigação histopatológica e quantificação de neutrófilos ou fungos, respectivamente. Nos fluídos bronco-alveolares (BAL) foram realizadas contagens globais e diferenciais de leucócitos. As dosagens de citocinas e de prostagladina E2 foram feitas por ELISA, em homogeneizados de pulmões. A coloração por tetróxido de ósmio foi usada na avaliação da capacidade da Gal-1 de induzir ou modular a formação de corpúsculos lipídicos, in vitro, por componentes do fungo. Nos soros dos animais de experimentação foi determinada a concentração total de nitrito, como indicador da produção de óxido nítrico. A análise dos resultados de sobrevivência indicou que 100% dos animais Gal-1+/+ resistiram à infecção por H. capsulatum; ao contrário, apenas 33% dos animais Gal-1-/- sobreviveram. Os números médios de unidades formadoras de colônias recuperadas no pulmão e no baço de camundongos Gal-1-/- foram de 2,7 e 3,8 vezes maiores do que os obtidos de animais Gal-1+/+, respectivamente. De modo semelhante, os números médios de neutrófilos e fungos no pulmão de animais Gal-1-/-, foram superiores aos valores encontrados nos pulmões de animais grupo Gal-1+/+. Curiosamente, nos homogeneizados pulmonares dos e o dobro da concentração de nitrito total sérico. Além disso, nos homogeneizados de pulmão dos animais Gal-1desafiados com o fungo, detectou-se elevadas concentrações de citocinas do tipo T1 e inflamatórias (IFN-, IL-1 e IL-12) em comparação com amostras de animais selvagens. Em ensaios in vitro, esta lectina não foi capaz de induzir corpúsculos em células do lavado peritoneal de camundongos Gal-1e Gal-1, entretanto inibiu parcialmente a formação induzida por F1 e -glucana. Finalmente, sugerimos que a Gal-1 pode participar da montagem de uma resposta imunológica protetora contra o Histoplasma capsulatum, por modular a liberação de citocinas inflamatórias, síntese de eicosanóides, geração de óxido nitrito; e por controlar a migração e/ou as funções de leucócitos. Além disso, os dados obtidos desse trabalho poderão auxiliar no melhor entendimento da fisiopatologia da histoplasmose e no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas envolvendo o reconhecimento de carboidratos na resposta imunológica. / Galectin-1 (Gal-1) belongs an endogenous lectins family that recognizes -galactoside and participates of various biological activities. This lectin can modulate the innate and adaptative immune responses. Although, Gal-1 participates of various pathophysiological processes, in literature we did not find reports related to the participation of Gal-1 in fungal infections. The aim of this work was to investigate the biological impact of Gal-1 in the experimental histoplasmosis. The mice (GAL-1-/- and GAL-1+/+) were injected (i.t.) with 5 x 105 yeast cell and at 15 days post-infection, BALF cells and lungs cytokine and PGE2 were measured by ELISA. The Recovery of H. capsulatum was made in lung and spleen and the fungal burden was assessed as the CFU per organ. The lung slices were stained by hematoxiline eosin or with Gomoris methanemine silver (GMS) and submitted to histopathological investigation and quantification of neutrophil or fungus, respectively. Total and differential cell counts of the bronchoalveolar lavage (BAL).were performed using diluting solution in Neubauer chamber and Rosenfeld-stained smear. The capacity of Gal-1 to induce or modulate the lipids bodies formation by fungus components was analyzed by staining treated cells with osmium tetroxide. The total nitrite (NO2) concentration in the animals serum was measured by Griess reaction. All H. capsulatum-infected wild type mice survived until 30 days post-infection, whereas only 33% of the Gal-1-/- infected mice died during of this period of observation. At 15 days post-infection, CFU were found to be higher in the spleens or lung from infected-Gal1-/- mice. The number of neutrophils in the lung of the infected-Gal-1-/- mice higher than infected Gal-1+/+ animals. Curiously, H. capsulatum infected Gal-1-/- mice, presented higher levels of PGE2 and TH1 inflammatory cytokines (IFN-, IL-1 e IL-12) in comparison with wild type infected-mice. Adherent peritoneal cells peritoneal derived from Gal-1+/+ and Gal-1-/- mice and treated with Gal-1 did not induce lipid bodies. However, the capacity of F1 e -glucan to induce lipid bodies on the peritoneal cells was inhibited by gal-1 treatment. We suggest that the Gal-1 could participate of the development of a protective immune response to H. capsulatum.