As Doenças inflamatórias intestinais (DII) são multifatoriais e sua etiologia envolve susceptibilidade genética, fatores ambientais, disbiose e ativação exacerbada do sistema imunológico no intestino. Essas doenças também tem sido relacionadas a baixos níveis de dehidroepiandrosterona (DHEA), um hormônio precursor de diversos esteroides e relacionado à modulação das respostas imunes. Porém, os mecanismos precisos que relacionam as ações deste hormônio com a proteção ou susceptibilidade à doença de Crohn ou colite ulcerativa ainda não são totalmente conhecidos. Sendo assim, este projeto buscou entender o papel imunomodulador do DHEA exógeno in vitro e in vivo durante a inflamação intestinal experimental induzida por dextran sulfato de sódio (DSS) em camundongos C57BL/6. Inicialmente, in vitro, DHEA inibiu a proliferação de células do baço de forma dose dependente nas concentrações de 5?M, 50?M ou 100?M, com diminuição da produção de IFN-?. Este hormônio não foi tóxico para células de linhagem mieloide, embora tenha causado necrose em leucócitos nas doses mais elevada (50 ?M e 100?M), o que pode ter influenciado a diminuição das citocinas in vitro. Nos ensaios in vivo, os camundongos tratados com DHEA (40 mg/Kg) foram avaliados na fase de indução da doença (dia 6) e durante o reparo tecidual, quando os animais expostos ao DSS e ao DHEA por 9 dias foram mantidos na ausência destas drogas até o dia 15. Houve diminuição do escore pós-morte, melhora no peso e nos sinais clínicos da inflamação intestinal, com redução de monócitos no sangue periférico com 6 dias e aumento de neutrófilos circulantes na fase de reparo tecidual (15 dias). Ainda, a suplementação com DHEA levou à redução da celularidade da lâmina própria (LP) e ao restabelecimento do comprimento normal do intestino. O uso deste hormônio também diminuiu a expressão do RNAm de IL-6 e TGF-?, enquanto aumentou a expressão de IL-13 no colón dos animais durante a fase de indução da doença, o que provavelmente ajudou na atenuação da inflamação intestinal. Além disso, houve acúmulo de linfócitos CD4+ e CD8+ no baço e diminuição apenas de linfócitos CD4+ nos linfonodos mesentéricos (LNM), indicando retenção das células CD4+ no baço após uso do DHEA. O tratamento foi também capaz de aumentar a frequência de células CD4 produtoras de IL-4 e diminuir CD4+IFN-?+ no baço, além de reduzir a frequência de CD4+IL-17+ nos LNM, sugerindo efeito do DHEA no balanço das respostas Th1/Th2/Th17 relacionadas à colite. Em adição, as células de baço dos animais tratados com DHEA e expostos ao DSS se tornaram hiporresponsivas, como visto pela diminuição da proliferação após re-estímulos in vitro. Finalmente, DHEA foi capaz de atuar no metabolismo dos camundongos tratados, levando à diminuição de colesterol total e da fração LDL no soro durante a fase de indução da doença, sem gerar quaisquer disfunções hepáticas. Com isso, podemos concluir que o DHEA atua por meio do balanço das respostas imunes exacerbadas, minimizando os danos locais e sistêmicos causados pela inflamação intestinal induzida por DSS. / Inflammatory bowel diseases (IBD) are multifactorial diseases whose etiology involves genetic susceptibility, environmental factors, dysbiosis and exacerbated activation of the immune system in the gut. These diseases have also been associated to lower levels of dehydroepiandrosterone (DHEA), a precursor of various steroid hormones, related to modulation of immune responses. However, the precise mechanisms that link the actions of this hormone with protection or susceptibility to Crohn\'s disease or ulcerative colitis are still not fully understood. Thus, this project aimed to understand the immunomodulatory role of exogenous DHEA in vitro and in vivo in experimental intestinal inflammation induced by dextran sodium sulfate (DSS) in C57BL/6 mice. Initially, in vitro, DHEA inhibited the proliferation of spleen cells in a dose dependent way on the concentrations of 5?M, 50?M and 100?M, with decreased production of IFN-?. This hormone was not toxic to myeloid lineage cells, although it caused necrosis of leukocytes at the highest doses (50?M and 100?M), which may have influenced the decrease of the cytokines in vitro. Mice treated with DHEA (40 mg / kg) were evaluated at the induction phase of the disease (day 6) and during tissue repair, when animals exposed to DSS and DHEA for 9 days were maintained in the absence these drugs until the day 15. There was decrease of postmortem score, improved weight and clinical signs of intestinal inflammation, besides reduced peripheral blood monocytes on day 6, together with an increase in circulating neutrophils in tissue repair phase (15 days). Supplementation with DHEA also led to a reduction in cellularity of the lamina propria (LP) and to the restoration of normal length of the gut. The use of this hormone also decreased the expression of of IL-6 and TGF-? mRNA, while IL-13 was augmented in the colon of mice during the induction phase of the disease, a fact probably related to attenuation of intestinal inflammation. Furthermore, there was accumulation of CD4+ and CD8+ cells in the spleen along with decreased CD4+ leukocytes in mesenteric lymph nodes (MLN), indicating retention of CD4+ cells in the spleen after use of DHEA. The treatment was also able to increase the frequency of CD4+ cells producing IL-4 and decrease CD4+IFN-?+ in spleen, with reduced frequency of CD4+IL-17+ in the MLN, suggesting a role for DHEA on the balance of Th1/Th2/Th17 responses related colitis. In addition, splenocytes of mice treated with DHEA and exposed to DSS became hiporresponsives as seen by decreased proliferation after re-stimulation in vitro. Finally, DHEA was able to act on the metabolism of treated mice, leading to decreased total cholesterol and LDL cholesterol in serum during the induction phase of the disease, without generating any liver dysfunction. Thus, we concluded that DHEA acts by balancing the exacerbated immune responses, minimizing local and systemic damages caused by intestinal inflammation induced by DSS.

Leucotrienos e prostaglandinas são metabólitos do ácido araquidônico que, além de mediadores da inflamação são importantes imunomoduladores da liberação de citocinas, nas respostas imune inata e adquirida. Embora estes mediadores apresentem potencial para serem utilizados como adjuvantes ou imunomoduladores da resposta imune, eles são altamente instáveis, dificultando o uso in vivo. Por esta razão, estas substâncias foram incorporadas em um sistema polimérico microestruturado. Este foi constituído de microesferas de quatro a seis micrômetros de diâmetro, contendo leucotrieno B4 (LTB4) ou prostaglandina E2 (PGE2) incorporados na matriz polimérica (PLGA). A caracterização in vitro das microesferas de PLGA, contendo LTB4 ou PGE2, foi feita através da determinação da morfologia e medida dos diâmetros médios, taxa de encapsulação e perfil de liberação in vitro dos mediadores. Além disso, foi avaliada a preservação da atividade biológica do LTB4 liberado das microesferas, através do efeito do mesmo sobre a expressão de moléculas de adesão Mac-1 por citometria de fluxo. Também foram avaliadas a preservação da atividade biológica do LTB4 e da PGE2 liberados do interior das microesferas, através de estudos com microscopia intravital e a ativação de células endoteliais humanas (HUVECs e HUAECs). Realizamos ainda, ensaio de fagocitose com as microesferas contendo os dois mediadores encapsulados, utilizando macrófagos peritoneais murinos, além da avaliação da sobrevivência dos animais tratados intranasalmente com microesferas contendo LTB4 ou PGE2 durante a infecção pelo H. capulatum. Nestes animais, avaliamos a reação inflamatória pulmonar, o número de UFCs recuperadas dos pulmões e a modulação da resposta imune, através da quantificação de citocinas inflamatórias. Os estudos abordados neste trabalho revelaram achados interessantes e importantes quanto ao uso de microesferas biodegradáveis contendo mediadores lipídicos em situação de terapia, especialmente quando estes estão envolvidos em processos inflamatórios e/ou infecciosos. / Leukotrienes and prostaglandins are arachidonic acid metabolites, which participate in the inflammatory response and modulate cytokines release in both adaptive and innate immune responses. However, some physicochemical characteristics of these mediators, such as poor solubility in water and chemical instability, make them difficult to administer in vivo. In this sudy, we developed a polymeric microparticulate system for the encapsulation of lipid mediators. Regarding the in vitro characterization of the microspheres, we determined their diameters, evaluated the in vitro release of the mediators and the microspheres uptake by peritoneal macrophages. To assess the preservation of the biological activities of these mediators, we conducted intravital microscopy studies and determined the effect of LTB4 and PGE2-loaded biodegradable microspheres on inflammatory mediators release by murine peritoneal macrophages and human endothelial cells. In mice infected by H. capsulatum, we investigated the effects of intranasal administration of the microspheres on pulmonary inflammatory response. In this context, we analyzed the inflammatory cells recruited to the bronchoalveolar space, the mice survival and the number of CFUs recovered from the lungs after the administrations. We also assessed the cytokines release by the lung cells after the treatment with microspheres during the course of the infection. In conclusion, our findings showed that biodegradable microspheres could preserve the biological activity of the encapsulated mediators indicating their use as a new strategy to modulate cell activation, especially in the innate immune response.

Orientador: Luiz Henrique de Araújo Machado / Resumo: A dermatite atópica canina (DAC) apresenta uma complexa relação entre a inflamação e a barreira cutânea. O envolvimento de resposta imunológica do tipo Th2 e Th1, bem como produção de citocinas pró inflamatórias têm sido relacionadas com o padrão inflamatório, sinais clínicos e a gravidade da doença. As células-tronco mesenquimais (CTM) possuem características imunomoduladoras, sendo altamente sugeridas para reduzir a produção de citocinas inflamatórias e melhorar a qualidade de vida de animais atópicos. Visando comparar o efeito das CTM em cães atópicos, realizamos um estudo randomizado, simples-cego, com período inicial de placebo em seis cães. Foram comparados os perfis séricos inflamatórios por ELISA, além de resposta clínica por CADESI-04 e escala analítica de prurido. Ao final do estudo, os cães melhoraram significantemente o padrão clínico por CADESI-04 (p < 0,001) e pela escala de prurido (p < 0,05), contudo não houve mudança no perfil inflamatório das citocinas. Foi observado reações adversas em dois animais do estudo. Concluindo, o uso de CTM pode ser eficaz na melhora da sintomatologia relacionada a doença. / Abstract: Canine atopic dermatitis (CAD) presents a complex relationship between inflammation and cutaneous barrier. The involvement of Th2 and Th1 type immune responses, as well as the production of proinflammatory cytokines have been related to inflammatory pattern, clinical signs and severity of disease. Mesenchymal stem cells (MTCs) have immunomodulatory characteristics and are highly suggested to reduce the production of inflammatory cytokines and to improve quality of life of atopic animals. In order to compare effects of MTCs on atopic dogs, we performed a randomized, simple-blind, placebo-controlled study in 6 dogs. Inflammatory serum profiles were compared by ELISA, in addition to clinical response by CADESI-04 and analytical pruritus scale. At the end of the experiment, dogs significantly improved the clinical standard for CADESI-04 (p <0.001) and pruritus scale (p <0.05), however, there was no change in the inflammatory cytokine profile. Adverse reactions were observed in two study animals. Concluding that the use of CTM may be effective in improving symptoms related to disease / Mestre

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-12-28T14:33:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Camile Lima de Souza Alves.pdf: 1042299 bytes, checksum: 5aaf05233a6b1fe4cb13aa5b18df9088 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-28T14:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Camile Lima de Souza Alves.pdf: 1042299 bytes, checksum: 5aaf05233a6b1fe4cb13aa5b18df9088 (MD5) / CAPES;FAPESB;CNPq / A prevalência das doenças alérgicas no Brasil está entre as maiores do mundo. Dentre essas patologias destaca-se a asma como uma das mais importantes. A asma é caracterizada como uma doença inflamatória crônica, associada à hiperresponsividade das vias aéreas, no qual diversos fatores podem interagir e influenciar seu desenvolvimento. Entre os fatores ambientais, os ácaros da poeira doméstica destacam-se como os principais agentes desencadeadores de hipersensibilidade tipo I. Os ácaros mais frequentes na poeira doméstica, em países tropicais são as espécies Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis (B. tropicalis). Quanto á predisposição genética, os indivíduos são classificados como atópicos e não atópicos, sendo os atópicos aqueles que produzem anticorpos IgE, de forma exagerada, mesmo que a exposição aos alérgenos seja muito baixa, que o torna mais suscetíveis ás doenças alérgicas. Várias pesquisas demonstraram que existem fatores que levam a redução dos sintomas das doenças alérgica, dentre essas, pode-se destacar as infecções helmínticas, devido ao tipo de resposta imune que o hospedeiro produz. Esse efeito protetor depende da espécie do helminto, da idade do indivíduo, fase da infecção e da carga parasitária. Dentre os helmintos estudados observou-se que o Schistosoma mansoni é um dos parasitos encontrados com maior ação protetora contra as doenças alérgicas. Moléculas desse helminto têm sido avaliadas na tentativa de identificar quais estão envolvidas no efeito imunomodulatório do parasito sobre estas enfermidades. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo avaliar a capacidade das proteínas recombinantes Sm200, Sm10.3, Sm147730 e Quimera B de S. mansoni, de induzir imunomodulação in vitro, em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos atópicos e não atópicos, estimuladas ou não com extrato de B. tropicalis. Após cultivo das células, seus sobrenadantes foram coletados e ensaiados pela técnica de ELISA sanduíche para determinar a concentração das citocinas IL-10, IL-4, IL-5 e IFN-. Observou-se que as proteínas rSm200 e rS147730 se destacaram por seu potencial imunomodulador, estimulando a produção de IL-10, citocina que tem importante papel na regulação inflamatória. Quando essas proteínas foram associadas ao extrato de B. tropicalis, foi reduzida a proliferação de IL-5, com diferença estatisticamente significativa entre células estimuladas, em indivíduos não atópicos. Além disso, a rSm147730 associada ao extrato de B. tropicalis também estimulou a produção de INF-, citocina que suprime a resposta imune Th2. Como descrito, as proteínas rSm200 e rSm147730 apresentaram atividade imunomodulatória em PBMC de humanos, atópicos e não atópicos. Esses resultados proporcionam, portanto um maior conhecimento da atividade dos antígenos do S. mansoni nas doenças alérgicas, sendo que após os resultados in vitro essas moléculas serão utilizadas para os ensaios in vivo o que futuramente possibilitará o desenvolvimento de arsenais profiláticos no tratamento da asma e das patologias alérgicas.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-22T16:01:34Z No. of bitstreams: 1 Thaís Silva Peleteiro. Ausência de... 2012..pdf: 1334643 bytes, checksum: 7f6e0513fc52b940cf9cdb87c6d33f1f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T16:01:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thaís Silva Peleteiro. Ausência de... 2012..pdf: 1334643 bytes, checksum: 7f6e0513fc52b940cf9cdb87c6d33f1f (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Introdução: As doenças respiratórias alérgicas, tais como rinite e asma, afetam elevada proporção da população brasileira. Estima-se que mais de 58 mil pessoas foram afetadas por alguma destas condições no Brasil em 2002-2003. Estudos realizados em humanos e animais sugerem que a exposição ambiental ao Mycobacterium tuberculosis ou imunização com o M. bovis (vacina BCG), podem estar relacionadas à proteção contra doenças alérgicas. Objetivo: Investigar a influência da resposta Th1 a antígenos micobacterianos sobre a modulação da resposta do tipo Th2 ao ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Derp). Métodos: O estudo compreendeu duas fases. Para avaliar o efeito da resposta à revacinação com o BCG sobre a modulação de uma resposta do tipo Th2 ao Derp, foi realizado um estudo de intervenção randomizado com coorte prospectiva, e os voluntários que participaram compuseram a Amostra 1. Para avaliar o efeito da resposta à infecção latente com M. tuberculosis sobre a modulação de uma resposta do tipo Th2 ao Derp, foi feito um estudo de caso-controle e os voluntários que participaram compuseram a Amostra 2. A população foi composta por adultos jovens com idade entre 19 a 33 anos. Todos responderam ao questionáro ISAAC, modificado. Foi feita coleta de sangue para quantificação da IgE total, IgE específica ao D. pteronyssinus e citocinas das respostas Th1/Th2/inflamatória. Resultados: Não houve diferenças, quanto à produção de citocinas, IgE total e específica ao Derp, entre os grupos controle e revacinados ou entre os indivíduos infectados e não infectados. Isso foi verificado pela ausência de diferenças na produção de citocinas ou nos níveis de IgE total e específica ao Derp entre os grupos atópicos e não atópicos das duas amostras avaliadas. Conclusões: Não houve influência da resposta Th1 ao M. bovis (BCG) ou da resposta Th1 ao M. tuberculosis sobre a modulação da resposta do tipo Th2 ao ácaro D. pteronyssinus, indicando que o contato com micobactérias não parece afetar a resposta alérgica pré-estabelecida em indivíduos adultos jovens. / ntroduction: Allergic respiratory diseases such as asthma and rhinitis, affecting a high proportion of the Brazilian population. More than 58.000 people have been affected by some of these conditions in Brazil in 2002-2003. Studies in humans and animals suggest that environmental exposure to Mycobacterium tuberculosis or immunization with Mycobacterium bovis (BCG), may be related to protection against allergic diseases. Objective: To investigate the influence of Th1 response to mycobacterial antigens on the modulation of Th2-type response to aeroallergen Dermatophagoides pteronyssinus (Derp). Methods: The study comprised two phases. To evaluate the effect of the response to revaccination with BCG on the modulation of a Th2-type response to Derp, we conducted a randomized intervention study with prospective cohort, and the volunteers composed the Sample 1. To evaluate the effect of latent response to infection with M. tuberculosis on the modulation of a Th2-type response to Derp, a study was made of case-control and the volunteers composed the Sample 2. The population consisted of young adults aged 19 to 33 years. All responded to questionnaire ISAAC modified. Blood sampling was performed for quantification of total IgE, specific IgE to D. pteronyssinus and cytokine responses Th1/Th2/inflamatória. Results: No significant differences in cytokine production or levels of total and specific IgE to Derp between atopic and non-atopic groups of the two samples. Conclusions: There were no differences regarding cytokine production, total and specific IgE to Derp, between the control group and revaccinated or between infected and uninfected individuals indicating that contact with mycobacteria not seem to affect the allergic response in adults young.

Submitted by Jamila Cristina Baptistella null (34429876878) on 2016-09-04T21:07:38Z No. of bitstreams: 1 Capa doutorado Pdf pronto.pdf: 2482721 bytes, checksum: 505b73636d8fa1498b06642b2343ed60 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-06T19:50:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 baptistella_jc_dr_araca.pdf: 2482721 bytes, checksum: 505b73636d8fa1498b06642b2343ed60 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-06T19:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 baptistella_jc_dr_araca.pdf: 2482721 bytes, checksum: 505b73636d8fa1498b06642b2343ed60 (MD5) Previous issue date: 2016-08-01 / A possibilidade para o isolamento de células mesenquimais multipotentes de anexo fetal bovino é uma perspectiva interessante devido potencial para utilização destas células em aplicações biotecnológicas. No entanto, ainda há pouco conhecimento disponível sobre as características destas células progenitoras na espécie bovina. Proliferando a morfologia das células, a partir de três fases da gestação, tipicamente apareceu forma de fuso do tipo fibroblastos, apresentando o mesmo número e viabilidade. Além disso, a capacidade proliferativa das células T em resposta a um estímulo mitogénico foi suprimida quando as células da geléia de Wharton foram incluídas na cultura. Multilinhagens foram confirmadas pela sua capacidade adipogênica, condrogénica e diferenciação neurogênica. O presente estudo demonstrou que células tronco mesenquimais colhidas a partir da geléia de Wharton do cordão umbilical de bovino em todas as fases da gestação mostraram capacidade proliferativa, potencial privilegiado e imunológico. / The possibility for isolating bovine mesenchymal multipotent stromal cells from fetal adnexa is interesting prospect because of the potential for these cells to be used for biotechnological applications. However, little knowledge is available about the characteristics of these progenitor cells in the bovine species. Proliferating cell morphology, from three stages of pregnancy, typically appeared fibroblast-like spindle shape, presenting the same viability and number. Moreover, the proliferative capacity of T cells in response to a mitogen stimulus was suppressed when Wharton’s jelly mesenchymal stem cells were included in the culture. Multilineage properties were confirmed by their ability to undergo adipogenic, chondrogenic and neurogenic differentiation. The study demonstrated that Wharton’s jelly mesenchymal stem cells harvested from bovine umbilical all pregnancy stages showed proliferative capacity, privileged and stem ness potential.

Submitted by Aline Parisoto Missio null (alinepm@ibb.unesp.br) on 2016-10-07T00:28:57Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Aline Missio repositório.pdf: 2424232 bytes, checksum: be4408bb8a9f5dfa38690910cec793fd (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-10-13T14:18:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 missio_ap_m_bot.pdf: 2424232 bytes, checksum: be4408bb8a9f5dfa38690910cec793fd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-13T14:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 missio_ap_m_bot.pdf: 2424232 bytes, checksum: be4408bb8a9f5dfa38690910cec793fd (MD5) Previous issue date: 2016-08-30 / A vitamina D (VitD) ativa possui várias funções importantes incluindo efeitos imunomoduladores na imunidade inata e na específica. A deficiência desta vitamina já alcançou proporções epidêmicas em várias regiões e por isto sua suplementação tem sido sugerida em algumas doenças. Diferentes linhagens de camundongos têm sido utilizadas para avaliar os efeitos imunomoduladores da VitD. O estudo dos efeitos da deficiência e da suplementação com VitD tem sido realizado em seres humanos e também em linhagens isogênicas de camundongos. Neste trabalho comparamos o efeito da suplementação com 0,1 µg de VitD e de paricalcitol nas linhagens murinas C57BL/6 e DBA/1J. Estes animais foram injetados com 0,1 µg de VitD ou paricalcitol durante 15 dias, em dias alternados. O peso corporal foi avaliado diariamente e sangue e baço foram coletados 24 horas após a última dose. Na linhagem C57BL/6 a VitD diminuiu o peso corporal e aumentou a concentração de cálcio sérico. Em relação aos parâmetros imunológicos, houve diminuição da produção de citocinas por células esplênicas e maior expressão de MHC II nas células dendríticas. O paricalcitol não afetou o peso corporal e o nível de cálcio sérico, mas diminuiu a produção de citocinas nesta linhagem. Com exceção do peso corporal que diminuiu, os demais parâmetros não foram afetados pela VitD ou pelo paricalcitol nos camundongos DBA/1J. A suplementação com 0,2 µg de VitD nos animais DBA/1J desencadeou a diminuição de peso corporal, queda na produção de IL-2, IFN-γ e IL-5 por células esplênicas mas não afetou a expressão de moléculas co-estimuladoras. Esta mesma dose elevada de paricalcitol nesta linhagem aumentou a produção de TNF-α, mas não determinou outros efeitos significativos. Analisados de forma conjunta estes resultados mostram que camundongos C57BL/6 e DBA/1J diferem na resposta à suplementação com VitD e paricalcitol, sendo a linhagem DBA/1J mais resistente ao seu efeito. / Active vitamin D (VitD) has a relevant role in many body functions, including effects on innate and adaptive immunity. However, as VitD deficiency already reached epidemic proportions worldwide, its supplementation has been used in various diseases. Different mice strains have been widely employed to investigate VitD immunomodulatory properties. In this work, we compared the effect of VitD and paricalcitol supplementation in C57BL/6 and DBA/1J. The mice were treated with 0.1 µg of VitD or paricalcitol, every other day, during 15 days. Body weight was assessed daily and blood and spleen cells were collected 24 hours after the last dose. In the C57BL/6 strain, VitD decreased body weight and also increased serum calcium concentration. Additionally, VitD decreased cytokine production by the spleen and increased the level of MHC II expression in dendritic cells. Paricalcitol did not affect body weight and serum calcium levels but it decreased cytokine production in this mice strain. Except body weight that was downregulated by VitD, the other parameters were not altered by VitD or paricalcitol in the DBA/1J strain. An increased dose (0.2 µg) of VitD decreased body weight, downregulated IL-2, IFN-γ and IL-5 production by spleen cells but did not affect the other cytokines neither the expression of costimulatory molecules in dendritic cells in DBA/1J mice. This higher dose of paricalcitol significantly increased TNF-α but had no other significant effects. Together, these results show that C57BL/6 and DBA/1J mice strains differ in their response to VitD and paricalcitol supplementation, being DBA/1J more resistant to their effects.

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca:Marcos Antonio Maioli / Banca:Roberto Gameiro de Carvalho / Banca:Marcos Roberto Bonuti / Banca:Luiz Eduardo Correa Fonseca / Resumo: A possibilidade para o isolamento de células mesenquimais multipotentes de anexo fetal bovino é uma perspectiva interessante devido potencial para utilização destas células em aplicações biotecnológicas. No entanto, ainda há pouco conhecimento disponível sobre as características destas células progenitoras na espécie bovina. Proliferando a morfologia das células, a partir de três fases da gestação, tipicamente apareceu forma de fuso do tipo fibroblastos, apresentando o mesmo número e viabilidade. Além disso, a capacidade proliferativa das células T em resposta a um estímulo mitogénico foi suprimida quando as células da geléia de Wharton foram incluídas na cultura. Multilinhagens foram confirmadas pela sua capacidade adipogênica, condrogénica e diferenciação neurogênica. O presente estudo demonstrou que células tronco mesenquimais colhidas a partir da geléia de Wharton do cordão umbilical de bovino em todas as fases da gestação mostraram capacidade proliferativa, potencial privilegiado e imunológico. / Abstract: The possibility for isolating bovine mesenchymal multipotent stromal cells from fetal adnexa is interesting prospect because of the potential for these cells to be used for biotechnological applications. However, little knowledge is available about the characteristics of these progenitor cells in the bovine species. Proliferating cell morphology, from three stages of pregnancy, typically appeared fibroblast-like spindle shape, presenting the same viability and number. Moreover, the proliferative capacity of T cells in response to a mitogen stimulus was suppressed when Wharton's jelly mesenchymal stem cells were included in the culture. Multilineage properties were confirmed by their ability to undergo adipogenic, chondrogenic and neurogenic differentiation. The study demonstrated that Wharton's jelly mesenchymal stem cells harvested from bovine umbilical all pregnancy stages showed proliferative capacity, privileged and stem ness potential. / Doutor

A microencapsulação tem sido utilizada promissoramente para melhorar a viabilidade de probióticos. Porém, pouco se sabe sobre o impacto desta na manutenção da funcionalidade do probiótico in vivo. Este trabalho teve como objetivo avaliar duas cepas de lactobacilos, encapsular essas cepas por um sistema envolvendo partículas lipídicas recobertas por interação eletrostática de polímeros e avaliar o efeito da encapsulação na manutenção da capacidade imunomoduladora das cepas. Na primeira etapa do estudo L. rhamnosus 64 e L. paracasei BGP1 foram avaliados quanto à resistência à lisozima e aos fluidos gastrointestinais simulados, perfil de hidrofobicidade da parede celular, susceptibilidade a antibióticos, atividade antagonista contra patógenos e capacidade de utilização de prebióticos. Em etapa seguinte as cepas foram encapsuladas e as microcápsulas avaliadas quanto à morfologia, tamanho e distribuição de partículas, umidade, atividade de água e efeito do pH e temperatura em sua estabilidade. Para avaliar a susceptibilidade dos microrganismos ao processo de encapsulação e estresse tecnológico, investigou-se o impacto do efeito da homogeneização com Ultra-Turrax, tolerância à temperatura, salinidade, diferentes pH e fluidos gastrointestinais simulados na viabilidade das bactérias. A viabilidade dos microrganismos durante a estocagem também foi estudada. Por fim, avaliou-se a manutenção da capacidade imunomoduladora dos microrganismos microencapsulados por meio da dosagem de citocinas pró e anti-inflamatórias e determinação da capacidade protetora contra infecção de Salmonella entérica sorovar Typhimurium em modelo animal. Os microrganismos demonstraram resistência à lisozima, com taxas de sobrevivência superiores a 80%. O perfil de hidrofobicidade da parede celular, foi baixo, entre 8,47 e 19,19%. Demonstraram resistência apenas à vancomicina (35 &micro;g) e eritromicina (15 &micro;g). As duas cepas foram capazes de antagonizar o crescimento de Escherichia coli V517, Salmonella enteritidis OMS-Ca, Staphylococcus aureus 76 e Listeria monocytogenes ATCC 15313. Quanto à capacidade de utilização de prebióticos, os microrganismos apresentaram comportamentos inversos, utilizaram preferencialmente inulina, raftilose 95 e lactulose. Nos testes de resistência aos fluidos gastrointestinais simulados constatou-se declínio significativo de células viáveis, com subtração de até 3,37 log UFC/mL. As cápsulas obtidas apresentaram formato típico e tamanhos médios de 80,12 &plusmn; 1,89 e 83,92 &plusmn; 1,70 &micro;m. Condições de pH extremos (1,5 e 9,0) e temperatura superior a 50 °C comprometeram a estabilidade das cápsulas. A encapsulação melhorou significativamente a tolerância dos microrganismos à altas concentrações de sal e elevação de temperatura. Além disso, favoreceu a resistência dos microrganismos frente aos fluidos gastrointestinais simulados. A estabilidade dos microrganismos durante o período de estocagem também foi favorecida, após 120 dias de estocagem a 7 e 25 °C a concentração de microrganismos viáveis permaneceu superior a 7,0 log UFC/g. Nos testes in vivo para avaliação da manutenção da capacidade de imunomodulação constatou-se através de dosagem de citocinas (IL-2, IL-6, IL-10 e TNF-&alpha;) e IgA secretora, que a encapsulação não alterou a resposta imunológica provocada pelas cepas estudas. Concluiu-se que os microrganismos apresentaram comportamento in vitro de acordo com o desejado para candidatos ao uso de probióticos. A microencapsulação foi bem-sucedida, proporcionando as duas cepas maior resistência frente às condições adversas e de estresse tecnológico. / Microencapsulation has been used successfully to improve the viability of probiotics microorganisms. The aim of this work was to evaluate two strains of lactobacilli, to encapsulate these strains by a system involving lipid particles coated by electrostatic interaction of polymers and to evaluate the effect of encapsulation in the maintenance of immunomodulatory capacity of these strains. In the first stage of the study L. rhamnosus 64 and L. paracasei BGP1 were evaluated for resistance to lysozyme and simulated gastrointestinal fluids, cell wall hydrophobicity profile, susceptibility to antibiotics, antagonist activity against pathogens and prebiotic utilization capacity. In the next step, the strains were encapsulated and the microcapsules evaluated regarding morphology, particle size and distribution, moisture, water activity and pH and temperature. The tolerance to temperature, salinity, different pH and simulated gastrointestinal fluids in the viability of the bacteria were also evaluated. The probiotics viability during the storage period was also studied. Finally, the maintenance of the immunomodulatory capacity of the encapsulated microorganisms was evaluated by means of the dosage of pro and anti-inflammatory cytokines and IgA. L. rhamnosus 64 and L. paracasei BGP1 demonstrated resistance to lysozyme, with survival rates above 80%. The hydrophobicity profiles of the cell wall were from 8.47 to 19.19%. Susceptibility to antibiotics also corroborated the literature, demonstrating resistance only to vancomycin (35 &micro;g) and erythromycin (15 &micro;g). The two strains were able to antagonize the growth of Escherichia coli V517, Salmonella enteritidis OMS-Ca, Staphylococcus aureus 76 and Listeria monocytogenes ATCC 15313. As far as the capacity of using prebiotics the two strains of lactobacilli presented inverse behaviors, they used preferably inulin, raftilose 95 and lactulose. In the tests of resistance to the simulated gastrointestinal fluids it was verified a significant decline of viable cells, with subtraction of up to 3.37 log CFU / mL, justifying the application of encapsulation technology. In the encapsulation step the capsules were produced with gum arabic, porcine gelatin and vegetable fat. The obtained capsules presented a typical format and average sizes of 80.12 &plusmn; 1.89 and 83.92 &plusmn; 1.70 &micro;m. Extreme pH conditions (1.5 and 9.0) and temperature above 50 ° C compromised the stability of the capsules. The encapsulation significantly improved the tolerance of microorganisms to high salt concentrations and elevation of temperature. In addition, it favored the resistance of the microorganisms to the simulated gastrointestinal fluids. The stability of the microorganisms during the storage period was also favored, after 120 days of storage at 7 and 25 ° C the concentration of viable microorganisms remained higher than 7.0 log CFU / g. In the in vivo tests for evaluation of the maintenance of the immunomodulation capacity, the cytokines (IL-2, IL-6, IL-10 and TNF-&alpha;) and secretory IgA were determined, that encapsulation did not alter the immunological response by the strains of lactobacilli studied. It was concluded that the microorganisms presented in vitro behavior in accordance with the one desired for probiotic candidates. Microencapsulation was successful, giving both strains greater resistance to adverse conditions and technological stress.

O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), doença endêmica na América Latina. A partir do reconhecimento de componentes fúngicos, macrófagos são ativados e adquirem propriedades que favorecem a eliminação do patógeno. Essas células produzem citocinas responsáveis pelo direcionamento da resposta adaptativa, sendo que o perfil Th1 é associado a proteção. Lectinas são proteínas que se ligam seletiva e reversivelmente a açúcares. Sua interação com glicanas da superfície de células da imunidade pode resultar em ativação e produção de citocinas, o que pode culminar em imunomodulação de efeito anti-infectivo. Nosso grupo trabalha com uma lectina de P. brasiliensis, denominada de Paracoccina (PCN) que se liga a N-acetilglicosamina. Assim, no presente trabalho objetivamos a produção de paracoccina recombinante (rPCN) expressa em Pichia pastoris e análise do papel ativador da rPCN em macrófagos. Demonstramos que esse organismo transformado secreta rPCN para o meio de cultura, com baixa contaminação de proteínas endógenas, o que possibilita o isolamento da proteína recombinante através de etapa cromatográfica única. Verificamos que a preparação obtida reproduz características da proteína nativa obtida de leveduras de P. brasiliensis e tem massa molecular aparente de 27 kDa. Demonstramos que rPCN estimula macrófagos murinos a produzirem citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-) e óxido nítrico (NO). Macrófagos estimulados com rPCN polarizam-se em direção ao perfil M1, como indicado pela maior expressão relativa de mRNA para iNOS2, SOCS3 e STAT1. Verificamos que TLR2 e TLR4 medeiam a ativação de macrófagos por rPCN, uma vez que a ausência de cada um desses receptores, com destaque para TLR4, afeta a produção de mediadores inflamatórios estimulada pelo componente fúngico. TLR4 é também responsável pela polarização de macrófagos em direção ao perfil M1, pois na ausência desse receptor não se detecta mensagem para iNOS2. Concluímos que o método de produção de rPCN via P. pastoris é eficiente e que a preparação obtida ativa macrófagos, levando-os a produzirem mediadores pró-inflamatórios e se polarizarem em direção ao perfil M1. Esses processos são essencialmente mediados por TLR4. Postula-se que paracoccina seja um agonista de TLR4 capaz de desencadear respostas que, sabidamente, conferem proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / The dimorphic fungus Paracoccidioiddes brasiliensis (P. brasiliensis) is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. From the recognition of fungal components, macrophages are activated and acquire properties that favor the elimination of the pathogen. These cells produce cytokines that are responsible for directing the adaptive response, wherein Th1 immunity is protective. Lectins are proteins that bind selectively and reversibly to sugars. Their interaction with glycans in the surface of immune cell can result in activation and cytokine production, which may result in immunomodulatory anti-infective effect. Our group has been working with a lectin from P. brasiliensis called paracoccin (PCN) which binds to N-acetylglucosamine. In the present work we aimed to produce recombinant paracoccin (rPCN) expressed in Pichia pastoris and analysis of the role of rPCN in macrophages activation. We have demonstrated that this transformed organism secret rPCN to the culture medium and presents low contamination with endogenous proteins, which allows the isolation of recombinant protein by a single chromatography step. We found that the obtained preparation reproduces characteristics of the native protein from P. brasiliensis yeast and has apparent molecular mass of 27 kDa. We demonstrated that rPCN stimulates murine macrophages to produce pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-12 p40, and TNF-) and nitric oxide (NO). Macrophages stimulated with rPCN polarize toward the M1 profile, as indicated by increased relative expression of iNOS2, SOCS3, and STAT1. We found that TLR2 and TLR4 mediate macrophage activation by rPCN, since the absence of each of these receptors, especially TLR4, affects the production of inflammatory mediators stimulated by the fungal component. TLR4 is also responsible for macrophage polarization toward the M1 profile, because in the absence of this receptor, the message to iNOS2 is not detected. We conclude that the method used to rPCN production, by P. pastoris, is efficient and that the obtained preparation is able to active macrophage, inducing them to produce pro-inflammatory mediators and polarize into the M1 profile. These processes are primarily mediated by TLR4. It is postulated that Paracoccin corresponds to a TLR4 agonist, able to trigger responses that are known to provide protection against infection with P. brasiliensis.