Sistemas de produção in vitro de embriões mamíferos muitas vezes requerem que o cultivo embrionário seja realizado de forma individualizada. Entretanto, os resultados obtidos com o cultivo in vitro (CIV) individual são inconstantes e, por vezes, inferiores ao CIV em grupo. Entre os sistemas que requerem o CIV individual, a técnica de handmade cloning (HMC) se destaca por produzir embriões sem zona pelúcida que não podem ser cultivados agrupados em protocolos convencionais de CIV. O objetivo deste experimento foi determinar as taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões bovinos clonados pela técnica de HMC e submetidos a três diferentes sistemas de CIV em micropoços (Well of the well – WOW), sendo um industrial, confeccionado em polidimetilsiloxano (PDMS), que visou à padronização da configuração do sistema de CIV. Após 11 replicações, de 3.876 complexos cumuli-oócito bovinos maturados in vitro, 3.437 (88,6%) oócitos apresentaram a extrusão do 1º corpúsculo polar. Após a digestão da zona pelúcida, 2.992 estruturas foram bisseccionadas manualmente, com a produção de 2.288 hemi-citoplastos. Reconstruiram-se 1.011 embriões pela adesão de dois hemi-citoplastos a uma célula somática (célula-tronco mesenquimal bovina de uma fêmea adulta da raça Nelore), dos quais 751 (74,2%) embriões fusionaram após eletrofusão, sendo 715 ativados quimicamente. Os embriões clonados (n=705) foram então alocados aleatoriamente em três grupos experimentais para o CIV: Grupo 1 (G1) – micropoço modificado (WOW-modificado, FELTRIN et al., 2006a); Grupo 2 (G2) – micropoço convencional (WOW-convencional , VATJA et al., 2000); e Grupo 3 (G3) – micropoço – PDMS (WOW-PDMS) . Como grupo controle (FIV, Grupo 4, G4), 594 oócitos foram colocados em maturação, fecundação e cultivo in vitro, em paralelo aos grupos clonados. Os resultados das taxas de clivagem no Dia 2, de blastocisto no Dia 7 e de prenhez no Dia 30 de desenvolvimento foram analisados pelo teste do χ2 com nível de significância de 5%. Não houve diferença significativa quanto à taxa de clivagem nos diferentes grupos. Entretanto, a taxa de blastocisto (BL) no G1 (99/239; 41,4%) foi significativamente superior à observada no G2 (72/232; 31,0%) e no G3 (68/234; 29,1%), sendo estas últimas semelhantes entre si. A taxa de BL do grupo controle (315/594; 53,0%) foi superior aos três grupos experimentais. Finalmente, o desenvolvimento in vivo até o Dia 30 de prenhez não diferiu entre os grupos G1 (7/15; 46,7%), G2 (7/13; 53,9%) e G3 (6/16; 50,0%). O sistema em micropoço modificado promoveu melhores condições de CIV a embriões clonados por HMC, traduzido por maiores taxas de BL, não se refletindo, entretanto, em diferenças no desenvolvimento in vivo subseqüente à transferência para fêmeas receptoras. / In vitro production systems for mammalian embryos quite often require embryos to be cultured individually. However, results obtained after individual embryo in vitro culture (IVC) are frequently inconsistent and inferior to IVC in groups. The Handmade Cloning (HMC) procedure is among the systems that require individual IVC, since zona-free embryos cannot be grouped for culture by standard IVC protocols. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo development of bovine embryos cloned by HMC, after the IVC in three distinct microwell arrangements, including an industrial chip, manufactured in polydimethylsiloxane (PDMS), which aimed to standardize the pattern of the IVC system. After 11 replications, 3,437 (88.6%) oocytes were selected based on the extrusion of the first polar body, out of 3,876 in vitro-matured bovine cumuli-oocyte complexes. Following zona pellucida digestion, 2,992 structures were manually bisected, generating 2,288 hemi-cytoplasts. A total of 1,011 embryos were reconstructed by the adhesion of two hemi-cytoplasts to a somatic cell (bovine mesenchymal stem cells from an adult Nelore female), with 751 fusing (74.2%) following electrofusion, and 715 being chemically activated. Cloned embryos (n=705) were then randomly allocated to one of three IVC experimental groups: Group 1 (G1) – modified microwells (FELTRIN et al., 2006a); Group 2 (G2) – conventional microwells (VATJA et al., 2000); and Group 3 (G3) – microwells in PDMS. As control group (IVF, Group 4, G4), 594 oocytes were in vitro-matured, fertilized and cultured in parallel to the cloned groups. Cleavage, blastocyst and pregnancy rates evaluated on Days 2, 7 and 30 of development were analyzed by the χ2 test, for a significance level of 5%. No differences in cleavage rates were observed between groups. However, blastocyst rates in G1 (99/239; 41.4%) were significantly higher than in G2 (72/232; 31.0%) and in G3 (68/234; 29.1%), which did not differ between one another. Blastocyst rates in the IVF control group (315/594; 53.0%) were in turn higher than in all cloned experimental groups. Finally, in vivo development to Day 30 of pregnancy was not different between G1 (7/15; 46.7%), G2 (7/13; 53.9%) and G3 (6/16; 50.0%). In summary, the modified microwell system promoted superior development to the blastocyst stage than both the conventional and the DMPS-based microwell systems, with no impact on the subsequent in vivo development after transfer to female recipients.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In vitro cultured bovine embryos are susceptible to oxidative stress caused by high oxygen concentration, that contributes to free radicals formation. Therefore, antioxidant defense systems are needed to neutralize the reactive oxygen species and their harmful effects. The aim of this study was to evaluate the addition of different concentrations (100, 250 and 500μM) of ascorbic acid (AA) antioxidant to in vitro maturation (IVM, 9 replications) or culture (IVC, 8 replications) media of bovine embryos (Chapter 1). The concentration that provided greatest embryonic development rate and better embryo quality was added to in vitro maturation and/or culture media at different gaseous atmospheres (Chapter 2, 10 replications). Media without antioxidant served as control-groups. Cumulus-oocyte complexes obtained from bovine ovaries at the slaughterhouse were randomly distributed in groups and matured in TCM-199 with addition of pFSH, bLH and 10% estrus cow serum (ECS), for 22 to 24h, in an incubator at 39°C and 5% CO 2 in air and saturated humidity. The in vitro production was performed using 20-40 oocytes/group in 400μL of medium in 4-well dishes (Chap. 1) and 13-32 oocytes/group in 200μL drops of medium under mineral oil (Chap. 2). The in vitro fertilization (D0) was performed with Bos taurus taurus frozen semen selected by Swim-up (Chap. 1) and Percoll gradient (Chap. 2) with 1x106 spermatozoa/mL in TALP-Fert with heparin and PHE, for 18 to 22h, at the same IVM conditions. The presumptive zygotes were in vitro cultured in SOFaaci medium with 5% ECS under mineral oil, in the bag system at 5% CO2, 5% O2 and 90% N2 and saturated humidity (Chap. 1 and 2), or in an incubator at 5% CO2 in air and saturated humidity (20% O2 in air; Chap 2). To analyze the percentage of embryos on D2, D7 and D9 a randomized block delineation was used, having as blockade criteria the collection day (Chap. 1). In Chap. 2, the cleavage rate on D2 was analyzed considering the effects of AA addition on maturation and culture and the interaction between the two factors. The embryonic development data on D7 and D9 were analyzed after arc sine square root transformation and considered the effects of AA presence on maturation and culture, the gaseous atmosphere and the interaction among these factors, taking into account the routine day in the analyses model. Blastocyst cell number was obtained after base 10 logarithmic transformation of data, using 8 (Chap. 1) and 10 replications (Chap. 2), with a significance level of 5%. In Chapter 1, the cleavage rate and embryonic development on D7 were similar (P>0.05) among the different AA concentrations added to IVM or IVC. However, the 100μM AA addition to IVC tended (P<0.07) to show higher blastocyst production (32.3%) when compared to the 500μM group (19.7%). The blastocyst production on D9 increased significantly when 100μM AA were added to IVM (P<0.05) compared to control-group (38.7 vs 29.0%), or on IVC (P<0.01) compared to 500μM concentration (28.1 vs 14.1%). The blastocyst cell number was similar (P>0.05) among the different AA concentrations and the control-group. In Chapter 2, there was no effect of interaction (P>0.05) among the factors studied (AA on IVM, AA on IVC and atmosphere of culture) on D2, D7 and D9. Cleavage rate and embryonic development on D7 and D9 did not differ (P>0.05) between groups with and without antioxidant addition, independently of the gaseous atmosphere. However, a greater cell number was observed in hatched blastocysts (P<0.05) when the AA was included in the culture medium. The results indicate that 100μM ascorbic acid concentration can be used during IVM or IVC to increase embryo production, especially on D9, and improve the quality of hatched blastocysts, independently of the culture gaseous atmosphere. / Embriões bovinos cultivados in vitro são susceptíveis ao estresse oxidativo causado pela alta concentração de oxigênio, que contribui para a formação de radicais livres. Por isso, sistemas antioxidantes de defesa são necessários para neutralizar as espécies reativas de oxigênio e seus efeitos prejudiciais. Este estudo teve como objetivo avaliar a adição de diferentes concentrações (100, 250 e 500μM) do antioxidante ácido ascórbico (AA) aos meios de maturação (MIV, 9 repetições) ou cultivo (CIV, 8 repetições) in vitro de embriões bovinos (Capítulo 1). A concentração que propiciou maior taxa de desenvolvimento embrionário e melhor qualidade dos embriões foi adicionada aos meios de maturação e/ou cultivo in vitro em diferentes atmosferas gasosas (Capítulo 2, 10 repetições). Meios sem antioxidante serviram como grupos-controle. Complexos cumulus-oócitos obtidos de ovários de frigorífico foram distribuídos aleatoriamente em grupos e maturados em TCM-199 adicionado de pFSH, bLH e 10% de soro de vaca em estro (SVE), por 22 a 24h, em estufa a 39°C e 5% CO 2 em ar e umidade saturada. Para a produção in vitro foram utilizados 20-40 oócitos/grupo em 400μL de meio em placa de quatro poços (Cap. 1) e 13-32 oócitos/grupo em gotas de 200μL de meio sob óleo mineral (Cap. 2). A fecundação in vitro (D0) foi conduzida com sêmen congelado Bos taurus taurus selecionado por Swim-up (Cap. 1) e gradiente de Percoll (Cap. 2), com 1x106 espermatozóides/mL em TALP-Fert com heparina e PHE, por 18 a 22h, nas mesmas condições da MIV. Os prováveis zigotos foram cultivados in vitro em meio SOFaaci com 5% de SVE sob óleo mineral, no sistema de bolsas gaseificadas (bag system) a 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 e umidade saturada (Cap. 1 e 2), ou em estufa a 5% CO2 em ar e umidade saturada (20% O2 em ar; Cap. 2). Para analisar a porcentagem de embriões no D2, D7 e D9 utilizou-se o delineamento blocos ao acaso, tendo como critério de bloqueio o dia da coleta (Cap. 1). No Cap. 2, para analisar a taxa de clivagem no D2 foram considerados os efeitos da adição do AA na maturação, adição do AA no cultivo e a interação entre os dois fatores. Os dados do desenvolvimento embrionário no D7 e D9 foram analisados após transformação arcoseno raiz quadrada e foram considerados os efeitos da presença do AA na maturação, presença do AA no cultivo, a atmosfera gasosa e a interação entre esses fatores, considerando o dia de realização da rotina no modelo de análise. Para contagem de células dos blastocistos os dados foram analisados após transformação logarítmica de base 10, sendo utilizadas 8 repetições (Cap. 1) e 10 repetições (Cap. 2), com nível de significância de 5%. No Capítulo 1, a taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário no D7 foram similares (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA adicionadas na MIV ou CIV. Entretanto, a adição de 100μM de AA no CIV apresentou tendência (P<0,07) de maior produção de blastocistos (32,3%) quando comparado ao grupo com 500μM (19,7%). A produção de blastocistos no D9 aumentou significativamente quando 100μM de AA foi adicionado na MIV (P<0,05) comparado ao grupo-controle (38,7 vs 29,0%), ou no CIV (P<0,01) comparado com a concentração de 500μM (28,1 vs 14,1%). O número de células por blastocisto foi similar (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA e o grupo-controle. No Capítulo 2, não houve efeito da interação (P>0,05) entre os fatores estudados (AA na MIV, AA no CIV e atmosfera de cultivo) sobre o D2, D7 e D9. A taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário no D7 e D9 não diferiram (P>0,05) entre os grupos com e sem antioxidante, independentemente da atmosfera gasosa. No entanto, maior número de células foi observado nos blastocistos eclodidos (P<0,05) quando o AA foi incluído no meio de cultivo. Os resultados indicam que a concentração de 100μM de ácido ascórbico pode ser utilizada durante a MIV ou CIV para incrementar a produção embrionária, especialmente no D9, além de melhorar a qualidade dos blastocistos eclodidos, independentemente da atmosfera gasosa de cultivo.

Sistemas de produção in vitro de embriões mamíferos muitas vezes requerem que o cultivo embrionário seja realizado de forma individualizada. Entretanto, os resultados obtidos com o cultivo in vitro (CIV) individual são inconstantes e, por vezes, inferiores ao CIV em grupo. Entre os sistemas que requerem o CIV individual, a técnica de handmade cloning (HMC) se destaca por produzir embriões sem zona pelúcida que não podem ser cultivados agrupados em protocolos convencionais de CIV. O objetivo deste experimento foi determinar as taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões bovinos clonados pela técnica de HMC e submetidos a três diferentes sistemas de CIV em micropoços (Well of the well – WOW), sendo um industrial, confeccionado em polidimetilsiloxano (PDMS), que visou à padronização da configuração do sistema de CIV. Após 11 replicações, de 3.876 complexos cumuli-oócito bovinos maturados in vitro, 3.437 (88,6%) oócitos apresentaram a extrusão do 1º corpúsculo polar. Após a digestão da zona pelúcida, 2.992 estruturas foram bisseccionadas manualmente, com a produção de 2.288 hemi-citoplastos. Reconstruiram-se 1.011 embriões pela adesão de dois hemi-citoplastos a uma célula somática (célula-tronco mesenquimal bovina de uma fêmea adulta da raça Nelore), dos quais 751 (74,2%) embriões fusionaram após eletrofusão, sendo 715 ativados quimicamente. Os embriões clonados (n=705) foram então alocados aleatoriamente em três grupos experimentais para o CIV: Grupo 1 (G1) – micropoço modificado (WOW-modificado, FELTRIN et al., 2006a); Grupo 2 (G2) – micropoço convencional (WOW-convencional , VATJA et al., 2000); e Grupo 3 (G3) – micropoço – PDMS (WOW-PDMS) . Como grupo controle (FIV, Grupo 4, G4), 594 oócitos foram colocados em maturação, fecundação e cultivo in vitro, em paralelo aos grupos clonados. Os resultados das taxas de clivagem no Dia 2, de blastocisto no Dia 7 e de prenhez no Dia 30 de desenvolvimento foram analisados pelo teste do χ2 com nível de significância de 5%. Não houve diferença significativa quanto à taxa de clivagem nos diferentes grupos. Entretanto, a taxa de blastocisto (BL) no G1 (99/239; 41,4%) foi significativamente superior à observada no G2 (72/232; 31,0%) e no G3 (68/234; 29,1%), sendo estas últimas semelhantes entre si. A taxa de BL do grupo controle (315/594; 53,0%) foi superior aos três grupos experimentais. Finalmente, o desenvolvimento in vivo até o Dia 30 de prenhez não diferiu entre os grupos G1 (7/15; 46,7%), G2 (7/13; 53,9%) e G3 (6/16; 50,0%). O sistema em micropoço modificado promoveu melhores condições de CIV a embriões clonados por HMC, traduzido por maiores taxas de BL, não se refletindo, entretanto, em diferenças no desenvolvimento in vivo subseqüente à transferência para fêmeas receptoras. / In vitro production systems for mammalian embryos quite often require embryos to be cultured individually. However, results obtained after individual embryo in vitro culture (IVC) are frequently inconsistent and inferior to IVC in groups. The Handmade Cloning (HMC) procedure is among the systems that require individual IVC, since zona-free embryos cannot be grouped for culture by standard IVC protocols. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo development of bovine embryos cloned by HMC, after the IVC in three distinct microwell arrangements, including an industrial chip, manufactured in polydimethylsiloxane (PDMS), which aimed to standardize the pattern of the IVC system. After 11 replications, 3,437 (88.6%) oocytes were selected based on the extrusion of the first polar body, out of 3,876 in vitro-matured bovine cumuli-oocyte complexes. Following zona pellucida digestion, 2,992 structures were manually bisected, generating 2,288 hemi-cytoplasts. A total of 1,011 embryos were reconstructed by the adhesion of two hemi-cytoplasts to a somatic cell (bovine mesenchymal stem cells from an adult Nelore female), with 751 fusing (74.2%) following electrofusion, and 715 being chemically activated. Cloned embryos (n=705) were then randomly allocated to one of three IVC experimental groups: Group 1 (G1) – modified microwells (FELTRIN et al., 2006a); Group 2 (G2) – conventional microwells (VATJA et al., 2000); and Group 3 (G3) – microwells in PDMS. As control group (IVF, Group 4, G4), 594 oocytes were in vitro-matured, fertilized and cultured in parallel to the cloned groups. Cleavage, blastocyst and pregnancy rates evaluated on Days 2, 7 and 30 of development were analyzed by the χ2 test, for a significance level of 5%. No differences in cleavage rates were observed between groups. However, blastocyst rates in G1 (99/239; 41.4%) were significantly higher than in G2 (72/232; 31.0%) and in G3 (68/234; 29.1%), which did not differ between one another. Blastocyst rates in the IVF control group (315/594; 53.0%) were in turn higher than in all cloned experimental groups. Finally, in vivo development to Day 30 of pregnancy was not different between G1 (7/15; 46.7%), G2 (7/13; 53.9%) and G3 (6/16; 50.0%). In summary, the modified microwell system promoted superior development to the blastocyst stage than both the conventional and the DMPS-based microwell systems, with no impact on the subsequent in vivo development after transfer to female recipients.

Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) é uma espécie nativa que ocorre nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil, e é popularmente conhecida por jaborandi. Essa e outras espécies de Pilocarpus encontram-se em risco de extinção devido ao extrativismo (uso como planta medicinal) e ao desmatamento. O cultivo in vitro de P. pennatifolius foi realizado como uma alternativa para a produção de pilocarpina (princípio ativo do jaborandi). A cultura de células foi obtida em meio MS semi-sólido, suplementado com sacarose, como fonte de carbono, e tendo como reguladores de crescimento BAP, IAA e NAA. O tempo de duplicação da cultura de calos foi de 22 dias. A concentração do alcalóide, determinada por técnicas cromatográficas, foi de aproximadamente 0,1 &#181;g/ mg de biomassa. Os ensaios enzimáticos referentes à biossíntese da pilocarpina tiveram como objetivo elucidar a etapa inicial de formação do anel imidazólico, além da localização desta reação na planta. Os experimentos realizados indicaram a presença da enzima histidina amino-transferase (HAT, EC 2.6.1.38) cuja atividade catalítica foi de 46,09 nKat/ mg de proteína, apenas no extrato protéico das raízes de P. pennatifolius. A determinação da composição do óleo essencial por CG e CG/EM indicou como constituintes majoritários os hidrocarbonetos tridecano (56,8 %) e pentadecano (25,5 %). Os sesquiterpenos não oxigenados constituíram cerca de 15 % do óleo obtido. / Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) is a native Brazilian species which is commonly known as jaborandi. This species is endangered due to its exploitation as medicinal plant and the increasingly deforestation. A callus culture of P. pennatifolius was established as an alternative source for pilocarpine production (the active compound of jaborandi). The cell culture was obtained in a semi-solid media, supplemented with sucrose as carbon source and as growth regulators, BAP, IAA e NAA. The doubling time for the callus culture was determined as 22 days. The concentration of the alkaloid, obtained by chromatographic techniques was ca. 0.1 &#181;g/ mg dry weight. The enzymatic assays related to pilocarpine biosynthesis were carried out with the aim to elucidate the imidazole ring formation beyond identify the site were this reaction takes place. The results indicated the presence of the enzyme histidine ammonia transferase (HAT, EC 2.6.1.38) only in the protein extract obtained from the roots of P. pennatifolius. The catalytic activity for this enzyme was 46.09 nKat/ mg protein. Volatile constituents from the leaves were analyzed by GC and GC/MS and the major compounds were determined as the hydrocarbons tridecane (56.8 %) and pentadecane (25.5 %). Almost 15 % of the total composition was constituted of non-oxygenated sesquiterpenes.

Nas abordagens biotecnológicas de propagação de plantas, os meios de cultura devem ter uma composição química adequada à essa finalidade permitindo a otimização da produção. Como a bananeira (Musa sp.) é exigente em potássio, a busca do nível adequado desse macronutriente envolve não somente o comprometimento com o nível dos outros nutrientes (balanço iônico), mas também a relação entre eles. Para acompanhar os efeitos fisiológicos das relações de vários teores de K com os outros macro e micronutrientes é que explantes caulinares dos cvs. Nanica e Prata Anã foram cultivados em meio MS modificado em presença de BAP, sacarose, vitaminas, agar, suplementado com 6 diferentes doses de K: 5, 10, 15, 20, 25 e 30 mM, sendo que a dose 20 mM corresponde à concentração de K existente no MS básico, que foi adotado como controle.Foram feitas análises de massa de matéria seca (MMS),macro e micronutrientes na parte aérea, raiz e plântulas inteiras. Ao final do experimento foi determinado o número de plântulas e calculado o valor das relações N/K, K/P, K/Ca, K/Mg, K/Ca+Mg, K/S, K/Cu, K/Fe, K/Mn, K/Zn.Foram também dosados os teores da diamina putrescina e de poliaminas, e calculada a relação K/putrescina. Todos os parâmetros foram analisados segundo um delineamento experimental inteiramente casualizado. As plântulas que se desenvolveram em baixas concentrações de K apresentaram sintomas visuais de deficiência, como clorose e necrose das folhas mais velhas. Os cultivares apresentaram diferenças quantitativas entre si tanto em relação aos valores de MMS como em número de plântulas, relacionados às doses de K presentes nos meios de cultura. Em ambos os cultivares foi observada uma relação direta entre o desenvolvimento das plântulas e as concentrações de K com otimização ao redor de K 15 a 20 mM. Os teores de putrescina e de poliaminas foram maiores nos níveis mais baixos de K, atingindo o máximo na dose de K 5 mM. Em K 20 mM ocorreram maiores valores de MMS e em K 15 mM maior número de plântulas regeneradas. O íon K em geral foi mais intensamente absorvido do que os outros macro e micronutrientes sendo que estes tiveram sua absorção diminuída devido provavelmente a um efeito de diluição de seus teores pelo crescimento das plântulas in vitro. Esses resultados, inclusive os obtidos nas demais relações entre K e os outros macro e micronutrientes, as quais sempre foram crescentes (de K 5 a 30 mM), corroboram a essencialidade desse nutriente para os cvs. Nanica e Prata Anã. / Potassium is required in high dosis by the banana plant (Musa sp.) and interacts with other macro and micronutrients present in the medium in which banana tissues are maintained in vitro condition,with consequent modifications in the plant cell metabolism, mainly in nitrogen compounds, such as proteins and amino acids. When K is present in concentrations lower than the required, diamines such as putrescine, and polyamines, such as spermidine and spermine are formed. In order to establish the best dosis of K and follow the physiological consequences of the relationships N/K, K/P, K/Ca, K/Mg, K/Ca+Mg, K/S, K/Cu, K/Fe, K/Mn, K/Zn and K/putrescine, shoot apex of two banana cvs. Nanica and Prata Anã were maintained in asseptic conditions in modified MS media in the presence of 6 different dosis of K: 5, 10, 15, 20, 25 and 30 mM, K 20 mM being the K concentration in basic MS medium, and then transferred to rooting media with the same different K dosis. Dry wt., macro and micronutrients were measured in the shoots, roots and the intire plantlet, and number of plantlets produced determined, the data being analysed estatistically. Putrescine and polyamines were also determined. Visual symptoms of K deficiency such as clorosis and necrosis in the older leaves of all plantlets under low dosis of K were observed. The levels of putrescine and polyamines increased as K decreased in the medium, reaching the maximum value at K 5 mM, both cultivars presenting similar bahavior in relation to the diamine in some K concentrations. Quantitative differences were obtained among the two cultivars pertained to dry wt. values, number of in vitro regenerated banana plantlets and K concentration with optimization around K 15 and 20 mM. In general K absorption was more intense than the other nutrients, the absorption of the later being decreased probably due to a dilution effect of their values as the banana plantlets developed in vitro. These results, including those pertained to the relationships between K and the other nutrients, which always were high (from K 5 to 30 mM), corroborate the importance of potassium ion to the banana cvs. Nanica and Prata Anã.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this work was to characterize the potato genotypes for phosphorus efficiency evaluated in in vitro and in hydroponics growth systems. Experiments were conducted in in vitro with potato genotypes grown at two P levels, 5 and 50% concentration of MS medium, 1.935 mg P L-1 and 19.346 mg P L-1, respectively. The hydroponic experiment consisted of seven potato genotypes and two doses of P, 5 and 50% of the strength of the nutrient solution developed for soilless cultivation of potatoes (ANDRIOLO, 2006), called as a low (2.32 mg P L-1) and high (23.2 mg P L-1) levels of P. The plants were evaluated in in vitro at 40 days after inoculation and in hydroponic culture at 18, 39 and 62 days after planting. The direct and indirect effects of each variable on the efficiency of utilization of P in potato genotypes are dependent on the condition of cultivation (hydroponic or in vitro), the P concentration and the harvest time. Taken together the efficiency indexes of P utilization, it was possible to characterize that the potato genotypes responded differently to P deficiency in each growth system, with the exception of the SMIJ 319-1 genotype which in the two systems presented efficient in utilization and response to P. The in vitro culture system is not appropriate for the selection of potato genotypes with regard to determining the efficiency of utilization and response to P. / O objetivo deste trabalho foi caracterizar genótipos de batata quanto à eficiência nutricional para fósforo avaliada em sistemas de cultivo in vitro e em hidroponia. Para tanto, foram realizados experimentos in vitro com genótipos de batata crescidos em duas doses de P, 5 e 50% da concentração padrão do meio MS, as quais correspondem a 1,935 mg de P L-1 e 19,346 mg de P L-1, respectivamente. O experimento em hidroponia consistiu de sete genótipos de batata e duas doses de P, 5 e 50% da concentração padrão da solução nutritiva desenvolvida para o cultivo sem solo de batata (ANDRIOLO, 2006), chamados neste trabalho de baixo (2,32 mg P L-1) e alto (23,2 mg P L-1) níveis de P. As plantas in vitro foram avaliadas aos 40 dias após a inoculação e as em cultivo hidropônico aos 18, 39 e 62 dias após o plantio. Os efeitos diretos e indiretos de cada variável sobre a eficiência de utilização do P nos genótipos de batata são dependentes da condição de cultivo (in vitro ou hidropônico), da dose de P e da época de coleta. Pela união dos índices de eficiência de utilização ao P, foi possível caracterizar que os genótipos de batata responderam de modo diferenciado à deficiência de P em cada sistema de cultivo, com exceção do genótipo SMIJ 319-1 que nos dois sistemas se apresentou como eficiente na utilização e responsivo ao P. O sistema de cultivo in vitro não é adequado para a seleção de genótipos de batata quanto à eficiência de utilização e resposta ao P.

Malgré le succès de l’Aide Médicale à la Procréation (AMP), des données récentes suggèrent un lien entre le recours à l’AMP et des pathologies liées à des erreurs épigénétiques. Afin d’évaluer l’impact des procédés in vitro de l’AMP sur la méthylation de l’ADN, nous avons analysé : 1) le profil de méthylation de 2 locus soumis à empreinte, H19DMR et KvDMR1, dans des ovocytes recueillis immatures, vitrifiés, puis mûris in vitro après réchauffement. Nous avons montré pour la première fois que le procédé vitrification/MIV pouvait constituer une alternative prometteuse pour préserver le potentiel procréatif des femmes avant un traitement anticancéreux, puisqu’il n’altérait pas l’empreinte parentale. 2) le profil de méthylation de H19DMR dans des embryons humains en retard de développement ainsi que dans les gamètes des géniteurs. Nous avons mis en évidence des anomalies de l’empreinte dans ces embryons, sans lien apparent avec les indications d’ICSI mais liées à des altérations survenues soit au cours de l’ovogenèse, soit au cours du développement précoce. 3) le profil de méthylation des promoteurs d’OCT4 et NANOG, gènes essentiels à l’expression de la pluripotence, dans des embryons bloqués après culture prolongée. Nous avons montré que le promoteur d’OCT4 était significativement hyperméthylé dans les embryons bloqués, en particulier dans la population de couples présentant uniquement une infertilité masculine, alors que le promoteur de NANOG était hypométhylé / Despite the success of Assisted Reproductive Technologies (ART), recent data suggest a link between the use of ART and diseases related to epigenetic errors. To evaluate the impact of ART on DNA methylation, we analyzed: 1) the methylation profile of 2 imprinted loci, H19DMR and KvDMR1, in immature oocytes which were vitrified and matured in vitro after warming. We have shown for the first time that vitrification/IVM process did not alter the imprinting. Then, this new technology could be a promising alternative to preserve the procreative potential of women before cancer treatment. 2) the methylation profile of H19DMR in human embryos with developmental anomalies and in the gametes of the parents. We have shown that imprinting errors in these embryos have no apparent link with ICSI indications, but were related to alterations in H19DMR occurring either during oogenesis or early development. 3) the methylation profile of the promoters of OCT4 and NANOG, essential genes for the expression of pluripotency in arrested embryos after prolonged culture. We have shown that the promoter of OCT4 was highly methylated in arrested embryos particularly in the population of couples with male infertility only, whereas the NANOG promoter was hypomethylated

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2016-08-24T20:52:09Z No. of bitstreams: 1 Disserta??o Final_Fl?via_PPGRGV (2).pdf: 1857571 bytes, checksum: 967f2b7d728622a11a98a803f13ff0de (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-24T20:52:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??o Final_Fl?via_PPGRGV (2).pdf: 1857571 bytes, checksum: 967f2b7d728622a11a98a803f13ff0de (MD5) Previous issue date: 2015-03-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Hyptis ramosa Pohl ex Benth (Lamiaceae) is native and endemic to the semi-arid northeast, with its unknown phytochemical constitution so far. Considering the pharmacological importance of the species of this family, the development of forms of propagation and in vitro culture can contribute to the inclusion of these species in sustainable production systems and the conservation of the same. Thus, the objective of this work was to study the in vitro propagation of the species H. ramosa, through direct organogenesis and callus formation, and the biochemical characterization of the obtained calluses, thus allowing the establishment of strategies for their conservation and sustainable use. To this, H. ramosa seeds were disinfected and established in medium MS / 2 culture. In the multiplication phase was tested the influence of cytokinins BAP, CIN and TDZ on different explants. The obtained shoots were individualized and transferred to MS / 2 medium containing different concentrations of auxin IBA and activated carbon for rooting them. Regenerated and rooted in vitro microplants were subjected to pre-acclimatization in different cultivation container closure and then were transferred to ex vitro conditions in commercial substrate Plantmax? being quantified plant survival rate at 30 days after transfer. For callus induction, we used explants and different concentrations of 2,4-D and BAP, determining the growth curve from the fresh weight of callus until the 28th day of cultivation, at intervals of seven days. Concurrent with obtaining the growth curve it is quantified in calluses obtained the total soluble sugar content, reducing sugar and crude protein. The in vitro propagation of H. ramosa is possible using the nodal segment as a source of explants in MS medium supplemented with BAP. In vitro rooting occurs, even in free auxin. The species showed survival of 100%, regardless of the day of pre-acclimatization phase. For callus induction the best explant is the nodal segment, and the combination of 2.4-D and BAP favor the formation of the same. The callus growth curve showed quadratic behavior with two different phases and biochemical analysis showed the maximum level of total soluble sugars, reducing sugars and crude protein at 14 ?, 21 ? and 14 ? days, respectively. / Hyptis ramosa Pohl ex Benth (Lamiaceae) ? uma esp?cie nativa e end?mica do semi?rido nordestino, sendo sua constitui??o fitoqu?mica desconhecida at? o momento. Considerando a import?ncia farmacol?gica das esp?cies dessa fam?lia, o desenvolvimento de formas de propaga??o e cultivo in vitro poder? contribuir para a inser??o dessas esp?cies em sistemas de produ??o sustent?veis e a conserva??o das mesmas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi estudar a propaga??o in vitro da esp?cie H. ramosa, atrav?s de organog?nese direta e calog?nese, bem como a caracteriza??o bioqu?mica dos calos obtidos, permitindo assim o estabelecimento de estrat?gias para a sua conserva??o e explora??o sustent?vel. Para isso, sementes de H. ramosa foram desinfestadas e estabelecidas em meio de cultura MS/2. Na fase de multiplica??o foi testada a influ?ncia das citocininas BAP, CIN e TDZ sobre diferentes explantes. As brota??es obtidas foram individualizadas e transferidas para meio MS/2 contendo diferentes concentra??es da auxina AIB e de carv?o ativo para o enraizamento das mesmas. As microplantas regeneradas e enraizadas in vitro foram submetidas ? pr?-aclimatiza??o em diferentes tipos de fechamento do recipiente de cultivo e, posteriormente, foram transferidas para a condi??o ex vitro em substrato comercial Plantmax?, sendo quantificada a taxa de sobreviv?ncia das plantas aos 30 dias ap?s a transfer?ncia. Para a indu??o de calos utilizou-se diferentes explantes e concentra??es de 2,4-D e BAP, determinando-se a curva de crescimento a partir da mat?ria fresca dos calos at? o 28o dia de cultivo, em intervalos de sete dias. Concomitante com a obten??o da curva de crescimento quantificou-se nos calos obtidos o teor de a??cares sol?veis totais, a??cares redutores e prote?na bruta. A propaga??o in vitro de H. ramosa ? poss?vel utilizando-se o segmento nodal como fonte de explante, em meio de cultura MS suplementado com BAP. O enraizamento in vitro ocorre, mesmo em meio isento de auxina. A esp?cie apresentou sobreviv?ncia de 100%, independentemente da realiza??o da fase de pr?-aclimatiza??o. Para indu??o de calos o melhor explante ? o segmento nodal, sendo a combina??o de 2.4-D e BAP favor?vel a forma??o dos mesmos. A curva de crescimento de calos mostrou comportamento quadr?tico com duas fases distintas e a an?lise bioqu?mica evidenciou o teor m?ximo de a??cares sol?veis totais, a??cares redutores e prote?na bruta aos 14?, 21? e 14? dias, respectivamente.

Um die Erhaltung und Nutzung der beiden gefährdeten, hochwertigen Baumarten Pyrus pyraster und Sorbus torminalis zu fördern, wurden Methoden der in vitro Kultur und der Kryokonservierung evaluiert und optimiert. Kryokonservierung von Sorbus torminalis wird erstmalig beschrieben. Als Explantatquellen dienten Winterknospen, überwiegend von selektierten Bäumen aus Nachkommenschaftsprüfungen. Von den geprüften Faktoren Nährmedienzusammensetzung, Kulturgefäß, Schneidetechnik, Temperatur, Pikiertermin und physiologischer Zustand der Explantate erwies sich letzterer als entscheidend. Die Reiser mit den Winterknospen wurden in zwei aufeinander folgenden Jahren im November, Dezember, Januar, Februar und März geerntet und sowohl direkt als auch nach 2-monatiger Lagerung bei +5°C bearbeitet. Bei Pyrus führte Ernte im März zu den besten Ergebnissen der in vitro Kultur. Die besten Ergebnisse der Kryokonservierung wurden von Ernten im November bis Januar erzielt. Bei Sorbus differierten die Ergebnisse der in vitro Kultur zwischen den Jahren so stark, dass keine Aussage möglich war. Bei der Kryokonservierung waren die Erntetermine Dezember und Januar erfolgreich. Zur Kryokonservierung von in vitro Material wurden die Alginat-Einkapselung und die Droplet-Technik geprüft. Mit Pyrus wurden mit der Droplet-Technik Vitalitätsraten zwischen 7 und 13% erzielt, wenn eine bisher unveröffentlichte Kombination von Vorbehandlungen und PVS2-Vitrifizierung eingesetzt wurden. Die Kryokonservierung wirkte sich im Vergleich weder positiv noch negativ auf Wachstum und Entwicklung aus. Die Diskrepanz zwischen der Nutzung der tiefen Dormanz der Knospen und des damit verbundenen natürlichen Frostschutzes für die Kryokonservierung einerseits und der Vermeidung von tiefer Dormanz bei Etablierung von in vitro Kulturen wegen der damit verbundenen Wachstumshemmung andererseits wird diskutiert. / To facilitate conservation and utilization of the endangered valuable tree species Pyrus pyraster and Sorbus torminalis methods of in vitro culture and cryopreservation were evaluated and optimized. Cryopreservation of Sorbus torminalis is described for the first time. The explant sources were dormant winter buds, mainly from selected trees from progeny trials. The evaluation of media composition, culture vessel, cutting technique, date of pricking and physiological state proved the latter to be crucial. Twigs with winter buds were harvested in two subsequent years in November, December, January, February and March and were processed immediately and after two months of storage at +5°C. With Pyrus, the best results in in vitro culture were obtained after harvest in March while for cryopreservation harvest in November to January proved to be best. With Sorbus, the results in in vitro culture differed between the years and no conclusion could be drawn. Cryopreservation was successful after harvest in December and January. Encapsulation in alginate and the droplet-technique were evaluated for the cryopreservation of in vitro material. Vitality rates of 7 to 13% were achieved with Pyrus using the droplet-technique with a combination of pre-treatments and PVS2-vitrification not published so far. In comparison, cryopreservation was of neither positive nor negative influence on growth and development. The discrepancy between deep dormancy of buds being useful for cryopreservation because of its natural frost protection and the need to avoid it because it impedes in vitro culture is discussed.

[ES] El calcio (Ca2+) es un catión esencial que juega un papel fundamental en todos los organismos vivos. Desde el punto de vista funcional, el Ca2+ actúa como un segundo mensajero que regula distintos procesos celulares. Trabajos anteriores indican que la señalización mediante Ca2+ podría estar implicada en las primeras etapas de la inducción de la embriogénesis in vitro de las plantas, pero el verdadero papel del Ca2+ en este proceso es aún desconocido. Por eso, el principal objetivo de la presente Tesis es el estudio del papel del Ca2+ en la embriogénesis in vitro mediante dos sistemas in vitro: la embriogénesis somática y la embriogénesis de microsporas. Para determinar la importancia de la homeostasis del Ca2+ en la inducción de la embriogénesis y las dinámicas de los niveles de Ca2+ durante la inducción y el establecimiento de embriones somáticos y derivados de microsporas, se utilizaron tratamientos químicos y se detectaron los niveles de Ca2+ mediante sondas fluorescentes y sensores cameleon codificados genéticamente, visualizados con microscopía fluorescente y confocal. Observamos que el aumento de Ca2+ es un marcador temprano en la inducción de la embriogénesis in vitro y que los niveles de Ca2+ durante la embriogénesis in vitro son dinámicos en todos los sistemas estudiados. Además, las oscilaciones en los niveles de Ca2+ podrían estar relacionadas con los procesos de diferenciación que ocurren en las células inducidas una vez une el Ca2+ a la calmodulina. Mostramos que un aumento de Ca2+ dentro de un rango definido de concentración tiene un efecto positivo, dependiendo del sistema, en la producción de embriones, siendo más sensibles aquellos sistemas basados en suspensiones de células aisladas que aquellos que usan tejidos como explantes. Finalmente, estudiamos el papel de la calosa durante la embriogénesis somática, observando que la inhibición de la deposición de calosa impide el desarrollo embrionario, lo que sugiere una relación entre la formación de una barrera de calosa y el establecimiento de la identidad embrionaria en las células somáticas. / [CAT] El calci (Ca2+) és un catió essencial que juga un paper fonamental en tots els organismes vius. Des del punt de vista funcional, el Ca2+ actua com a un segon missatger que regula diferents processos cel·lulars. Treballs anteriors indiquen que la senyalització mitjançant el Ca2+ podria estar implicada en les primeres etapes de la inducció de l'embriogènesi in vitro de les plantes, però el paper real del Ca2+ en aquest procés encara és desconegut. Per això, el principal objectiu de la present Tesi és l'estudi del paper del Ca2+ en l'embriogènesi in vitro mitjançant dos sistemes in vitro: l'embriogènesi somàtica i l'embriogènesi de micròspores. Per tal de determinar la importància de l'homeòstasi del Ca2+ en la inducció de l'embriogènesi i les dinàmiques dels nivells de Ca2+ durant la inducció i l'establiment d'embrions somàtics i derivats de micròspores, es van utilitzar tractaments químics i es van detectar els nivells de Ca2+ mitjançant sondes fluorescents i sensors de cameleon codificats genèticament, visualitzats amb microscòpia fluorescent i confocal. Vam observar que l'augment de Ca2+ és un marcador primerenc en la inducció de l'embriogènesi in vitro i que els nivells de Ca2+ durant l'embriogènesi in vitro són dinàmics en tots els sistemes estudiats. A més, les oscil·lacions en els nivells de Ca2+ podrien estar relacionades amb els processos de diferenciació que tenen lloc en les cèl·lules induïdes una vegada uneix el Ca2+ a la calmodulina. Vam mostrar que un augment de Ca2+ dins d'un rang definit de concentració té un efecte positiu, depenent del sistema, en la producció d'embrions, essent més sensibles aquells sistemes basats en suspensions de cèl·lules aïllades que aquells que usen teixits com a explants. Finalment, vam estudiar el paper de la cal·losa durant l'embriogènesi somàtica, i vam observar que la inhibició de la deposició de cal·losa impedeix el desenvolupament embrionari, la qual cosa suggereix una relació entre la formació d'una barrera de cal·losa i l'establiment de la identitat embrionària en les cèl·lules somàtiques. / [EN] Calcium (Ca2+) is an essential cation that plays fundamental roles in all living organisms. From a functional point of view, Ca2+ acts as a second messenger that regulates different cellular processes. Previous works point to the fact that Ca2+ signaling may be involved in the early stages of induction of in vitro plant embryogenesis, but the actual role of Ca2+ in this process remained unveiled. Thus, the main goal of the present Thesis is to study the role of Ca2+ in in vitro embryogenesis using two in vitro systems: somatic embryogenesis and microspore embryogenesis. Chemical treatments and detection of Ca2+ with fluorescent probes and genetically-encoded cameleon sensors imaged by fluorescence and confocal microscopy were performed to determine the importance of Ca2+ homeostasis for induction of embryogenesis and the dynamics of Ca2+ levels during the induction and establishment of somatic and microspore-derived embryos. We observed that Ca2+ increase is an early marker of induction of in vitro embryogenesis and Ca2+ levels during in vitro embryogenesis are dynamic in all the systems we studied. Moreover, Ca2+ oscillations might be related to the differentiation processes that take place in the induced cells upon binding to calmodulin. We showed that Ca2+ increase within a defined range has system-specific positive effects in embryo yield, being more sensitive those systems using isolated cell suspensions rather than those using tissues as explants. Finally, we studied the role of callose during somatic embryogenesis, and we observed that inhibiting callose deposition prevents embryo development, which suggests a relationship between the formation of a callose barrier and the establishment of embryo identity in somatic cells. / Calabuig Serna, A. (2023). Multidisciplinary study of the role of calcium in plant in vitro embryogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196022