Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Graziella Nuernberg Back Brito / Banca: Martha Simões Ribeiro / Banca: Célia Regina Gonçalves e Silva / Resumo: Os micro-organismos estão se tornando cada vez mais resistentes aos antimicrobianos e cepas de Candida albicans resistentes aos antifúngicos tem sido isoladas, assim, torna-se importante e necessário a realização de pesquisas que avaliem os efeitos de novos métodos terapêuticos, como a inativação fotodinâmica antimicrobiana (aPDI). Assim, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da inativação fotodinâmica sobre biofilmes de Candida albicans, avaliando seus efeitos sobre a expressão dos genes TEC1 (fator de transcrição), HWP1 (proteína de parede celular das hifas), EFG1 (regulador transcricional relacionado com a morfogênese), BCR1 (regulador da formação de biofilme e da parede celular), CPH1 (regulador transcricional envolvido na morfogênese) e ALS3 (adesina) de C. albicans. Foram avaliadas 30 amostras isoladas de pacientes portadores de HIV e 30 amostras de pacientes com estomatite protética, quanto a produção de biofilme, peso seco e filamentação. Destas, foram selecionadas as amostras mais virulentas de cada grupo que apresentaram melhor capacidade de formação de biofilme e filamentação. Assim, foi utilizada uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente portador de HIV, uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente com estomatite protética e uma cepa padrão ATCC 18804. A quantificação da expressão dos genes foi relacionada à produção desses genes nas amostras clínicas e na cepa de referência utilizando-se ensaio de PCR em tempo real. Para a aPDI, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Micro-organisms are becoming increasingly resistant to antimicrobial agents and Candida albicans resistant strains to antifungal has been isolated, so it is important and necessary to carry out studies that evaluates the effects of new therapeutic methods, such as antimicrobial photodynamic inactivation (aPDI). The objective of this study was verify the effects of aPDI on C. albicans biofilms, evaluating its effects on genes expression: TEC1 (transcription factor), HWP1 (cell wall protein hyphae), EFG1 (transcriptional regulator related to morphogenesis), BCR1 (regulator of biofilm formation and cell wall), CPH1 (transcriptional regulator involved in morphogenesis) and ALS3 (adhesin) of C. albicans. Were evaluated 30 samples isolated from patients with HIV and 30 samples from patients with denture stomatitis, as the production of biofilm, dry weight and filamentation. Of these, the most virulent strains of each group that presented better biofilm formation capacity and filamentation were selected. Therefore, were used a clinical sample of C. albicans isolated from HIV positive patient, a clinical sample of C. albicans isolated from patient with denture stomatitis and a standard strain ATCC 18804. The quantification of gene expression was related to the production of these genes in clinical samples and in the reference strain using PCR assay in real time. For aPDI, were used the photosensitizer methylene blue at 300 uM and erythrosine at 400 uM, sensitized with low power laser... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-14T17:46:21Z No. of bitstreams: 1 DissLMS.pdf: 2276370 bytes, checksum: ee5f91507ba780836a4577a021cc883c (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:21:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLMS.pdf: 2276370 bytes, checksum: ee5f91507ba780836a4577a021cc883c (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:21:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLMS.pdf: 2276370 bytes, checksum: ee5f91507ba780836a4577a021cc883c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T19:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLMS.pdf: 2276370 bytes, checksum: ee5f91507ba780836a4577a021cc883c (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The Aedes aegypti mosquito is the main responsible for the transmission of dengue. Among numerous alternatives to combat vector, we can cite the use of photosensitizers (PSs) as inactivating of Aedes aegypti larvae. These compounds are able to interact with the light in a specific wavelength, so the cause highly reactive cytotoxic oxygen, resulting in the oxidation of biological targets. The present study had as main objective to analyze the phototoxic effects of PSs: Photogem® and turmeric, in three molecular variations (curcumin, curcuminoids pigment mixture (curcumin, desmethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin) and curcumin in sucrose), against Aedes aegypti larvae under different conditions of delivery of the PSs and lighting. The experiments of this study were divided into two stages: i) Photogem® and the three compositions of turmeric were applied in trials of photodynamic inactivation (PDI) in solution. The groups that received the Photogem®, were also fed with two different types of food, in order to verify the influence of these foods on larval mortality. ii) in a second step the three compositions of turmeric were incorporated in pet food, where it obtained a lyophilized powder, which was subsequently offered to the larvae for scanning. After the receipt of the PSs in solution as in the form of freeze-dried powder, the larvae were irradiated with two sources of light: artificial and natural. In addition to the trials of mortality, other studies were performed, such as checking the time of degradation of PSs when exposed to light, the anatomical location of accumulation of FSs in the larvae, and characterization studies of the product obtained in the form of lyophilized powder. On PDI with the Photogem® comparing the foods, exposed to artificial lighting, one of the foods introduced a higher mortality, indicating the importance of this on effectiveness of PDI. Already on PDI with variations of turmeric, mortality rates varied according to the molecular forms of this compound, showing high mortality for curcumin and curcumin in sucrose. In conditions involving sunlight, high mortality rates were obtained for all FSs delivered solution, featuring in various conditions 100% mortality in 8 hours from exposure to light. For IFD using the freeze-dried powder of three variations of turmeric and sunlight, mortalities in the order of 80% were achieved in lighting 16 hours. The analysis of the fluorescence image obtained by confocal microscope showed that both the three variations of turmeric, such as Photogem®, after an incubation period of 12 hours, accumulated throughout the alimentary canal of the larvae. The Photogem®, as well as turmeric showed potent photodynamic activity being more effective in conditions with higher light intensities. Regarding the delivery conditions of the PS, we observe that the highest values of mortality were obtained through the application of PSs in solution, when compared with the mortality studies using the freeze-dried powder. These results indicate that PDI can be a promising technique in the control of vectors as the Aedes aegypti. / O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor responsável pela transmissão da dengue. Dentre as inúmeras alternativas de combate ao vetor, podemos citar o uso de fotossensibilizadores (FSs) como inativadores de larvas do Ae. aegypti. Esses compostos são capazes de interagir com a luz, num comprimento de onda específico, de modo a originar espécies altamente reativas de oxigênio citotóxico, resultando na oxidação de alvos biológicos. O presente estudo teve como principal objetivo analisar os efeitos fototóxicos dos FSs: Photogem® e cúrcuma, em três variações moleculares (curcumina, mistura de pigmentos curcuminóides (curcumina, demetoxicurcumina e bis-demetoxicurcumina) e curcumina em sacarose), contra larvas do Ae. aegypti sob diferentes condições de entrega dos FSs e de iluminação. Os experimentos deste estudo foram divididos em duas etapas: i) tanto o Photogem® quanto as três composições de cúrcuma foram aplicados nos ensaios de inativação fotodinâmica (IFD) em solução. Os grupos que receberam o Photogem® foram também alimentados com dois diferentes tipos de ração, com a finalidade de verificar a influência desses alimentos na mortalidade larval. ii) em uma segunda etapa as três composições de cúrcuma foram incorporadas nas rações, onde obteve-se um pó liofilizado, que foi posteriormente ofertado às larvas para a verificação da mortalidade. Após o recebimento dos FSs, tanto em solução como na forma de pó liofilizado, as larvas foram irradiadas com duas fontes de luz: artificial e natural. Além dos ensaios de mortalidade, outros estudos foram realizados, como a verificação do tempo de degradação dos FSs quando expostos à luz, o local anatômico de acumulação dos FSs nas larvas, e estudos de caracterização do produto obtido na forma de pó liofilizado. Na IFD com o Photogem® comparando as rações, expostas à iluminação artificial, uma delas apresentou uma mortalidade superior, indicando a importância desta na efetividade da IFD. Já na IFD com as variações de cúrcuma, as porcentagens de mortalidade variaram de acordo com as formas moleculares deste composto. Nas condições envolvendo luz solar, foram obtidas altos valores de mortalidade para todos os FSs entregues em solução, apresentando em diversas condições 100% de mortalidade em 8 horas de exposição à luz. Nos ensaios de IFD utilizando o pó liofilizado das três variações de cúrcuma e luz solar, mortalidades da ordem de 80% foram atingidas em 16 horas de iluminação. As análises das imagens de fluorescência obtidas por microscópio confocal mostraram que tanto as três variações de cúrcuma, como o Photogem®, após um período de incubação de 12 horas, acumularam-se em todo o canal alimentar das larvas. O Photogem®, assim como a cúrcuma apresentaram atividade fotodinâmica potente, sendo mais efetivos em condições com maiores intensidades de luz. Com relação às condições de entrega do FS, observamos que as maiores mortalidades foram obtidas através da aplicação dos FSs em solução, quando comparadas com os estudos de mortalidade utilizando o pó liofilizado. Esses resultados indicam que IFD pode ser uma técnica promissora no controle de vetores como o Ae. aegypti.

Devido ao uso excessivo de antibióticos houve e ainda há um crescimento no número de cepas resistentes aos medicamentos existentes. Por causa desse crescimento de bactérias multirresistentes, o número de pesquisas que procuram alternativas terapêuticas antibacterianas tem aumentado, e dentre elas está a terapia fotodinâmica antimicrobiana ou inativação fotodinâmica (IFD). A inativação fotodinâmica, utilizada no controle biológico de microrganismos, envolve a ação de um fotossensibilizador (FS), ativado por um comprimento de onda específico, no intuito de oxidar substratos biológicos, resultando em efeito citotóxico. A cúrcuma ou curcumina natural, conhecida como açafrão da terra, consiste em mistura de três curcuminóides: curcumina, demetoxicurcumina e bis-demetoxicurcumina. A curcumina apresenta várias propriedades farmacológicas, no entanto, possui solubilidade extremamente baixa em soluções aquosas, que dificulta a sua utilização como agente terapêutico. O presente estudo propôs desenvolver nanopartículas poliméricas de PLGA contendo curcumina natural a fim de melhorar sua solubilidade e estabilidade, e também verificar sua eficácia na inativação fotodinâmica de microrganismos. As nanopartículas PLGA-CURC sintetizadas através da nanoprecipitação resultaram em três sistemas diferentes, com tamanho médio e eficiência de encapsulamento de 172 nm e 70% para PLGA-CURC1, 215 nm e 80% para PLGA-CURC2, e 242 nm e 80% para PLGA-CURC3. Testes de estabilidade mostraram proteção do polímero contra a degradação precoce da curcumina natural. Os ensaios microbiológicos in vitro com a solução de curcumina natural, as PLGA-CURC1 e PLGA-CURC2 foram eficientes na inativação da bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus, e do fungo Candida albicans. Porém, a solução apresentou toxicidade no escuro em altas concentrações, ao contrario das nanopartículas. O sistema PLGA-CURC2 com sua carga superficial modificada, gerou o sistema PLGA-CURC3, que inativou efetivamente a bactéria Gram-negativa Escherichia coli. Assim, concluiu-se que foi possível deixar a curcumina natural solúvel em água através do encapsulamento em nanopartículas de PLGA, certificar a melhora na estabilidade em meio aquoso (estocagem), além de inativar bactérias e fungo. / Due to excessive over use of antibiotics there was and still are growth in the number of bacterial strains resistant to existing drugs. Because of the growth of multiresistant bacteria, the number of searches looking for alternatives antibacterial therapeutic has increased, and among them is the antimicrobial photodynamic therapy or photodynamic inactivation (PDI). The photodynamic inactivation used in biological control of microorganisms, involves the action of a photosensitizer (PS), activated by a specific wavelength in order to oxidize organic substrates, resulting in cytotoxic effect. Turmeric or natural curcumin, consists of a mixture of three curcuminoids: curcumin, demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin. Curcumin has various pharmacological properties, however, has extremely low solubility in aqueous solutions, which makes the use as therapeutic agent harder. The present study aims to develop polymeric PLGA nanoparticles containing natural curcumin in order to improve their solubility and stability, and also verify its efficacy in photodynamic inactivation of microorganisms. The PLGA-CURC nanoparticles was synthesized by nanoprecipitation, resulting in three different systems, with an average size of 172 nm and 70% encapsulation efficiency for PLGA-CURC1, 215 nm and 80% for PLGA-CURC2, and 242 nm and 80 % for PLGA-CURC3. Stability tests showed the polymer protected the natural curcumin against premature degradation. Microbiological tests in vitro with the natural curcumin solution, the PLGA-CURC1 and PLGA-CURC2 were efficient in the inactivation of Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus, and fungus Candida albicans. However, the solution presented dark toxicity at high concentrations, unlike the nanoparticles. The PLGA-CURC2 system with a modified surface charge, gave the PLGA-CURC3 system, which effectively inactivated Gram-negative bacterium Escherichia coli. Thus, it was concluded that it was possible to let curcumin water soluble by encapsulation in PLGA nanoparticles, to ensure improved stability in aqueous medium (storage), and to inactivate bacteria and fungus.

A epigenética aborda o controle da expressão gênica através de diversos fatores que agem sob a cromatina, os melhor estudados são a metilação do DNA e a acetilação em histonas, relacionadas à repressão e ativação gênica, respectivamente. Em mamíferos, existem dois fenômenos epigenéticos interessantes: a inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas, que garante o equilíbrio transcricional gênico entre os sexos, e o imprinting genômico, caracterizado pela expressão monoalélica dependente da origem parental. No presente estudo, propusemos verificar a manutenção do controle epigenético em células humanas normais e transformadas em condições semelhantes de hipometilação do DNA e hiperacetilação em histonas (após uso das drogas 5-aza-2-\'deoxicitidina (5-aza-dC) e ácido valproico, respectivamente), através do monitoramento da expressão alelo-específica pelo uso de polimorfismos de única base presentes em regiões codificadoras. Em células normais houve manutenção da ICX e do imprinting genômico, enquanto que em células transformadas hipometiladas foram observadas indução de XIST, e perda de imprinting dos genes IGF2, H19 e PEG10. Observamos que ambas as drogas podem diminuir a expressão de DNMT1, e 5-aza-dC altera o equilíbrio entre acetilação e desacetilação da histona H4. Ainda, a ordem de adição dos reagentes ocasionou diferenças no nível de acetilação da histona H4 e na expressão gênica de XIST e PEG10. Nossos dados sugerem que: células humanas normais apresentam maior estabilidade do controle epigenético comparadas às células humanas transformadas, genes submetidos à ICX e \"imprintados\" não apresentam diferenças na rigidez do controle de expressão, e a cascata de reação seguida após perturbação de marcas epigenéticas pode ser alterada dependendo da modificação inicial. / Epigenetics refers to mechanisms related to gene activity through conformational modifications in DNA without changes in the nucleotide sequence. Key players in the epigenetic control are DNA methylation and histone acetylation, which are related to gene activation and repression, respectively. Two striking epigenetic phenomena in mammalians are X chromosome inactivation (XCI) and genomic imprinting. XCI triggers the transcriptional silencing of all but one X chromosome in each female cell, while genomic imprinting is a process that leads to mono-allelic gene expression based on parental origin. In the present study, we intended to verify the maintenance of epigenetic control in normal and transformed human cells under the same conditions of epigenetic disturbance. For this purpose, 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-aza-dC) and valproic acid (VPA) were used to cause DNA hypomethylation and histone hyperacetylation, respectively. By monitoring allelic-specific expression using single nucleotide polymorphisms present in coding regions, we were able to check the effects of the modifications in the expression pattern of imprinted or subjected to XCI genes. While in female normal cells XCI and genomic imprinting were not affected by VPA or 5-aza-dC treatments, transformed male cells showed XIST activation and loss of imprinting of PEG10, IGF2 and H19 genes in the hypomethylation scenario. In addition, both drugs can decrease the expression of DNMT1, and 5-aza-dC alters the balance between acetylation and deacethylation of histone H4. Furthermore, we could see different degrees of histone H4 acetylation levels and of XIST and PEG10 expression, depending on which of the drugs was added first. Our data suggest that the epigenetic control in normal human cells is more stable when compared to transformed human cells. In addition, both XCI and genomic imprinting are epigenetic features equally hard to disturb. Finally, depending on the initial epigenetic modification (global demethylation or acethylation), it will induce different epigenetic control networks, with consequence to the final status of gene expression.

Leite integral de búfala foi experimentalmente contaminado com Mycobacterium fortuitum e Listeria monocytogenes. Foi feita a análise quantitativa dos agentes imediatamente antes e depois de dois tratamentos térmicos: pasteurização (do leite) e filagem (da Mozzarella). Na análise da Listeria, foi empregada metodologia adaptada para a obtenção do NMP, usando os meios UVM, Fraser e Palcam como pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo e isolamento, respectivamente. O Mycobacterium foi semeado em placas com meio Löwenstein-Jensen modificado. Os resultados mostraram que a pasteurização do leite reduziu em média 6,0 log NMP/mL de Listeria sp e 4,0 log UFC/mL de Mycobacterium sp. A filagem da coalhada reduziu em média 8,37 log NMP/g de Listeria sp e 6,3 log UFC/g de Mycobacterium sp. Concluiu-se que a filagem da Mozzarella foi mais eficiente que a pasteurização do leite na redução do inóculo de Listeria monocytogenes e Mycobacterium fortuitum em cerca de 2 logaritmos de cada agente. / Whole buffalo milk was experimentally contaminated with Mycobacterium fortuitum and Listeria monocytogenes. The quantitative analysis of the agents was made immediately before and after two thermal treatments: pasteurization (of milk) and stretching (of Mozzarella). In the analysis of the Listeria, methodology adapted for the attainment of the MPN was used, employing UVM, Fraser and Palcam as not selective enrichment, selective enrichment and isolation, respectively. The Mycobacterium was plated onto modified Löwenstein-Jensen. The results had shown that the pasteurization of milk reduced 6,0 log MPN/mL Listeria sp on average, and 4,0 log CFU/mL de Mycobacterium sp. The stretching of the curd reduced 8,37 log MPN/g de Listeria sp on average, and 6,3 log CFU/g de Mycobacterium sp. It has been concluded that the stretching of Mozzarella was more efficient than the pasteurization of milk in the reduction of Listeria monocytogenes inoculum and Mycobacterium fortuitum in about 2 logarithms of each agent.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:48:04Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Danyllo Felipe de Oliveira.pdf: 2356321 bytes, checksum: 65e8ae7586ecebdf70bf8d998cba93d3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:48:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Danyllo Felipe de Oliveira.pdf: 2356321 bytes, checksum: 65e8ae7586ecebdf70bf8d998cba93d3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / CAPES / Entende-se por Deficiência Intelectual (DI), conforme a mais recente versão do Código Internacional de Doenças (CID-10), como sendo uma “parada do desenvolvimento ou desenvolvimento incompleto do funcionamento intelectual”. Essa alteração se dá essencialmente durante o desenvolvimento do indivíduo e afeta, principalmente, “funções cognitivas, de linguagem, motricidade e do comportamento social”. Ainda segundo as definições teóricas do CID-10, a DI pode ser subdividida de acordo com o grau de severidade de comprometimento intelectual, sendo este medido pelo nível do quociente de inteligência (QI) obtido dos pacientes em testes de neuropsicologia A deficiência intelectual é uma característica bastante recorrente, e tem sido extensivamente estudada do ponto de vista genético desde a identificação da trissomia do cromossomo 21 como um fator etiológico para a Síndrome de Down. Posteriores investigações usando técnicas citogenéticas de bandeamento cromossômico e hibridização in situ, contribuíram para melhor compreender a base molecular da DI, através da descrição de perdas e ganhos de grandes fragmentos cromossômicos além de microdeleções e microduplicações. Estas alterações têm sido crescentemente descritas para a Síndrome de Cri Du Chat, Smith-Magenis, Wolf- Hischhron, entre outras. Dentre as condições genéticas onde DI é encontrada, as cujo padrão de herança está ligado ao cromossomo X representam de 10 a 15 % dos casos. Em face disso, a deficiência mental de herança ligada ao cromossomo X (DMLX) apresenta-se como um complexo grupo de mais de mais de 200 entidades nosológicas, com uma considerável heterogeneidade genética, uma vez que mais de 100 genes têm sido identificados até o momento. Entretanto, a despeito da grande quantidade de genes envolvidos, mais de 50 % das famílias identificadas com deficiência mental ligada ao X possuem uma etiologia genética desconhecida. Duas famílias com um provável padrão de herança ligado ao cromossmo X, originárias do Estado de Pernambuco foram avaliadas do ponto de vista clínico e molecular. A família 1 apresentou quatro afetados, sendo três homens e uma mulher, que eram portadores de deficiência mental grave. O indivíduo probando, cuja idade é 29 anos, apresenta além da DI, um perímetro cefálico abaixo do segundo percentil. Nenhuma outra alteração dismórfica foi evidenciada nos outros indivíduos, embora entre os afetados haja o registro de crises convulsivas. A segunda família, com três afetados, sendo dois deles gêmeos univitelinos, apresenta indivíduos com deficiência intelectual grave, com nenhum outro sinal dismórfico aparente. A análise por Southern blotting de ambas famílias para a verificação das expansões do gene FMR1, associado à síndrome do cromossomo X frágil, revelou que o probando da família 1 apresentava a pré-mutação (fragmentos de 3 kb), assim como a sua genitora e a irmã desta. O outro afetado, filho desta última portadora da pré-mutação, apresentou a mutação completa (fragmentos de 6 , 6,3 e 8kb). O último indivíduo afetado e sua respectiva genitora apresentaram fragmentos correspondentes ao de indivíduos normais (2,8 e 5,2 kb). Tais dados levam ao diagnóstico da Síndrome do cromossomo X frágil para a primeira família. A segunda família foi semelhantemente testada, mas os indivíduos e sua genitora são normais para o teste do gene FMR1. O estudo do teste de desvio de inativação do cromossomo X na mãe dos afetados da família 2 revelou que este indivíduo apresenta um desvio total de inativação (100:0), um indicativo do padrão de herança ligado ao cromossomo X. A hibridização genômica comparativa (array CGH) não identificou nenhuma alteração cromossômica microestrutural que pudesse explicar o fenótipo.

Orientadores: Carlos Francisco Sampaio Bonafé, Cláudio Chrysostomo Werneck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:27:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_RicardoDuraesde_M.pdf: 7651307 bytes, checksum: 3194190cf6a33de3b0cdc4ddb7424afd (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A exposição à alta pressão é um método eficiente na inativação bacteriana, o qual é importante para a esterilização de alimentos. Neste trabalho, examinamos a inativação por alta pressão hidrostática em Aeromonas hydrophila AH 191, produtora de aerolisina, a qual possui atividades citotóxica, enterotóxica e hemolítica. Trinta min a 250 MPa (25 °C em PBS 0,1 M, pH 7,4), resultou em 9 log de UFC/mL de inativação bacteriana (a partir de 109 UFC/mL para <10 UFC/mL), porém, os tratamentos não alteraram a atividade hemolítica, enterotóxica e citotóxica produzidas por A. hydrophila AH 191. O sobrenadante de cultura bacteriana e o leite contaminado por A. hydrophila AH 191, pressurizado ou não, foram aplicados sobre células Vero e CaCo2, suspensões de hemácias humanas e de carneiro, e injetadas por via oral gástrica em camundongos Swiss, reproduzindo o ensaio de Dean. Os resultados mostram que os títulos das toxinas em amostras pressurizadas permaneceram iguais aos do controle, assim como as toxinas presentes nos sobrenadantes de cultura e no leite foram capazes de produzir acúmulo de líquidos no intestino de camundongos recém-nascidos. Estes resultados indicam a relevância do estudo na inativação de bactérias para a segurança alimentar e realça a importância de cautela no uso de alta pressão para a esterilização de alimentos, pois embora as bactérias possam ser inativadas, as toxinas produzidas por este micro-organismos podem continuar ativas, representando uma ameaça à saúde humana / Abstract: Exposure to high pressure is an efficient method for bacterial inactivation, which is important for the food sterilization. We examine the inactivation by high hydrostatic pressure in A. hydrophila AH 191, producer of aerolysin, which has cytotoxic, enterotoxic and hemolytic activities. A 30 min treatment at 250 MPa (25 °C in 0.1 M PBS, pH 7,4) resulted in 9 log CFU/mL of bacteria inactivation (from 109 CFU/mL to <10 CFU/mL). However, the treatment did not inactivate the hemolytic, enterotoxic and cytotoxic activities produced by A. hydrophila AH 191. The supernatant of bacterial culture and milk contaminated with A. hydrophila AH 191 pressurized or not were applied to Vero and CaCo2 cells, suspensions of human and sheep erythrocytes, and injected into mice via oral gastric Swiss reproducing the Dean test. The results show that evidence of toxins in samples pressurized remained similar to that of control, and the toxins in culture supernatants and milk were able to produce fluid accumulation in the intestine of suckling mouse. These results indicate the relevance of the study for bacteria inactivation to food security and enhance the importance for caution in the use of high prssure in foods sterilization, since although the bacteria can be inactivated, the toxins produced by micro-organisms continue to be active, representing a human health threat / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes-Cendes, Ivan de Godoy Maia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:04:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_TiagoCampos_D.pdf: 3895694 bytes, checksum: d999bfc92e9a2e2c757db34bbfc7d7fa (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes-Cendes, Rovilson Gilioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T01:47:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grippo_MariangelaCarnivalli_D.pdf: 1241429 bytes, checksum: 5f05623ad1e884a0014d2eca9109fb9a (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A interferência do RNA (RNAi) pode ser usada como uma ferramenta eficaz no silenciamento gênico específico mediado por moléculas de dupla fita de RNA (dsRNAs). Nesse contexto possui uma variedade de aplicações biológicas, incluindo o combate a patógenos infecciosos de importância biomédica. O objetivo do estudo foi determinar a eficiência e a especificidade da técnica de RNAi em eliminar o vírus da hepatite murina tipo 3 (MIN-3) in vitro. MHVs são vírus envelopados, cujo genoma é formado por uma cadeia de RNA fita simples (+) pertecentes a família Coronaviridae. Seu genoma codifica quatro proteínas estruturais: S (proteína da espícula); M (glicoproteína da transmembrana), N (proteína do nucleocapsídeo) e E (proteína associada à membrana) . Neste trabalho foi escolhido como alvo para o silenciamento gênico a proteína N, tendo sido produzidas moléculas de dsRNA complementares a sua seqüência genômica (GenBank AF 201929). Foram obtidas duas moléculas siRNAs transcritas por T7 RNA polimerase e uma terceira molécula interferente sintetizada comercialmente. Foi observado que os siRNAs produzidos pela transcrição in vitro, induziram uma resposta antiviral não específica. Além disso demonstrou-se que este efeito foi mediado através de substâncias secretadas no meio de cultura celular, provavelmente interferons (IFNs). Este efeito foi eficientemente eliminado após tratamento dos siRNAs com fosfatase alcalina. Observou-se também que a técnica de RNAi in vitro, tendo como alvo a proteína N de MHV-3, foi um tratamento eficaz e específico na infecção viral, confirmados através de estudos fenotípicos e moleculares. Desse modo, concluímos que experiências que utilizam RNAi contra alvos virais devem ser cuidadosamente monitoradas devido aos efeitos não específicos que podem ser induzidos por moléculas de dsRNA / Abstract: RNA Interference (RNAi) can be used as a powerful tool for post transcriptional gene-silencing mediated by double stranded RNA (dsRNAs) molecules. RNAi has a variety of biological applications including the combat against pathogens of biomedical importance. The objective of our study was to determine the efficiency and specificity of this new technique in eliminating mouse hepatitis virus type 3 (MIN-3) in vitro. MIN-3 is a subtype of enveloped viroses with a large plus-stranded RNA genome belonging to the Coronavirus family. Its genome codifies four structural proteins: S (spike protein); M (membrane protein); E (transmembrane glycoprotein); N (nucleocapsid protein). In the present study we target protein N by designing and producing dsRNA molecules complementary to its genomic sequence (GenBank AF 201929). We obtained three small interfering RNAs (siRNA) by in house T7 polymerase in vitro transcription and a fourth siRNA molecule that was commercially synthetized. We identified that siRNAs produced by in vitro transcription triggered a potent and sequence-unspecificied antiviral response. In addition, we demonstrated that this antiviral effect was mediated through molecules that were secreted in medium culture, probably interferons (IFNs). This unspecific effect was efficient1y suppressed when siRNAs were treated with aIkaline phosphatase prior to in vitro experiments. We also observed that RNAi targeting the N protein ofMIN-3 was a potent and specific treatment against in vitro infection, showing significant phenotypic protection and molecular evidence of specific gene-silencing. We concluded that experiments using RNAi against viral targets, although efficient, must be carefully controlled and monitored against possible sequence-unspecific effects triggered by dsRNA molecules / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Júlio Cézar de Mattos Cascardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AnaCristinaCaribedos_D.pdf: 6201793 bytes, checksum: ec32c93bb2e8f1111e029a6a82d77abd (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O fungo Moniliophthora perniciosa, agente causal da doença "vassoura-de-bruxa" (VB) do cacaueiro (Theobroma cacao L.) é responsável pela diminuição da produção de cacau no Brasil e em outras regiões da América do Sul e Central. Esse decréscimo está diretamente associado a graves problemas sociais e ambientais, particularmente nas regiões amazônica e Sul da Bahia. A interação cacau-M. perniciosa envolve mecanismos genéticos complexos e pouco estudados em nível molecular. Portanto, este trabalho objetivou estabelecer uma metodologia de silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) em M. perniciosa, visando análises funcionais de genes relacionados à sua patogenicidade. RNAi é uma eficiente ferramenta para reprimir a expressão gênica experimentalmente, portanto, uma alternativa tecnológica muito promissora. Devido ao fato de RNAi ser um mecanismo pós-transcricional que promove o silenciamento de genes com alta especificidade e de modo sistêmico é considerado uma ferramenta versátil para o estudo de fungos filamentosos heterocarióticos. O trabalho foi conduzido em três etapas integradas: 1) estabelecimento e avaliação das condições adequadas para eletroporação e regeneração de protoplastos de M. perniciosa, como método alternativo para a transfecção de DNA e de dsRNAs nos experimentos de transformação e de silenciamento do fungo, respectivamente; 2) produção de uma linhagem transgênica de M. perniciosa que expresse o gene heterólogo gfp e o estabelecimento da metodologia de silenciamento por RNAi, usando o gene gfp como modelo; 3) silenciamento mediado por dsRNAs de dois genes endógenos de M. perniciosa, vinculados a detoxificação de ROS e a produção de corpos de frutificação. Os parâmetros que promoveram a maior freqüência de regeneração dos protoplastos eletroporados foram a aplicação de um pulso de 1.5 kV. Em relação à transformação de M. perniciosa, o gene repórter gfp foi estavelmente introduzido no genoma do fungo e posteriormente silenciado por transfecção de gfpdsRNA sintetizado in vitro, comprovando a operacionalidade do mecanismo de RNAi em M. perniciosa. Em adição, os genes endógenos MpPRX1 e MpHYD que codificam para peroxiredoxina e hidrofobina, respectivamente, foram silenciados, usando dsRNAs específicos e apresentaram níveis reduzidos de mRNAs que variaram de 18% a 98% quando comparados aos controles. O silenciamento dos genes gfp e MpPRX1 foi corroborado pela redução da fluorescência de GFP e da atividade da peroxidase, bem como da sobrevivência do micélio submetido a H2O2, respectivamente. O silenciamento de gfp e de MpPRX1 persistiu por aproximadamente quatro meses, indicando silenciamento sistêmico. O estabelecimento da técnica de silenciamento gênico por RNAi em M. perniciosa abre novos caminhos para explorar funcionalmente o genoma deste fitopatógeno, bem como o desenvolvimento de mecanismos que bloqueiem ou diminuam a ação deste / Abstract: The fungus Moniliophthora perniciosa, causal agent of cacao (Theobroma cacao L.) witches' broom (WB) disease, is responsible for the decrease in cacao production in Brazil and other regions of South and Central America. This decrease is directly associated to severe social and ecological problems, particularly in the Amazon and Southern Bahia regions. The cacao-M. perniciosa interaction involves complex genetic mechanisms little studied at the molecular level. Therefore, this study aimed to establish a methodology of gene silencing by RNA interference (RNAi) in M. perniciosa, aiming functional analyses of genes related to his pathogenicity. RNAi is a powerful tool to experimentally suppress or regulate gene expression, therefore, a very promising technological alternative. Because RNAi is a post-transcriptional event that promotes gene silencing with high specificity and in a systemic way, it is considered a versatile tool for the study of heterokaryotic fungi. The work was conducted in three integrated steps: 1) establishment and evaluation of appropriate conditions for electroporation and regeneration of M. perniciosa protoplasts, as an alternative method for transfection of transgenic DNA and dsRNAs in transformation and fungus silencing experiments, respectively; 2) production of a transgenic strain of M. perniciosa that expresses the heterologous gene gfp and the establishment of methodology for silencing by RNAi, using the gfp gene as a model; 3) silencing mediated by dsRNAs of two endogenous M. perniciosa genes linked to detoxification of ROS and the production of fruiting bodies. The parameters that promoted the highest frequency of regeneration of electroporated protoplasts were the application of one pulse of 1.5 kV. Regarding M. perniciosa transformation, the gfp reporter gene was stably inserted into the genome of the fungus and subsequently silenced by transfection of gfpdsRNA synthesized in vitro, demonstrating the operationality of the RNAi mechanism in M. perniciosa. In addition, the endogenous genes MpPRX1 and MpHYD, coding for peroxiredoxin and hydrophobin, respectively, were silenced using specific dsRNAs showing reduced levels of mRNAs ranging from 18% to 98% when compared to controls. Silencing of gfp and MpPRX1 was validated by experiments that showed correlation between reduced levels of GFP fluorescence and peroxidase activity, as well as survival of mycelium subjected to H2O2, respectively. The silencing of gfp and MpPRX1 persisted for approximately four months, indicating systemic silencing. The establishment of the gene silencing technique by RNAi in M. perniciosa opens new paths to functionally explore the genome of this pathogen and the development of mechanisms that block or decrease his action / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular